A fluoreszcenci kioltásánk egy speciális módj Fluoreszcenci Rezonnci Energitrnszfer (FRET) Röntgen diffrkció, szerkezet meghtározás Nyitri Miklós; 2010 március 2. Biofizik Röntgen diffrkció, szerkezet meghtározás A röntgendiffrkció rendezett, kristályos felépítésű nygok szerkezetének meghtározásár lklms módszer. Azon lpszik, hogy megfelelő körülmények lklmzás esetén kristályszerkezetek lkulónk ki. Diffrkciós eljárás, szerkezet meghtározás. Mi diffrkció, és mi z eredménye? Interferenci képek. Mi z interferenci feltétele? Mi kristály? Az erősítés vgy kioltás geometrii feltételei. Geometrii lpok Az úthosszkülönbségre vontkozó feltétel: H beeső sugár nem merőleges =k λ k=0, 1, 2, λ Az úthosszkülönbség: = cos és 0 = ( cos cos 0 ) = k λ Fent késik. Lent késik. A különbséget számoljuk. 1
A számolás lpji; Lue egyenletek Hogyn számolhtó szerkezet? Az erősítés feltétele tehát: = (cos -cos 0 ) = k λ De ez csk egy dimenzió! Három dimenzióbn: = (cos -cos 0 ) = k λ = b (cos β -cos β 0 ) = l λ = c (cos γ -cos γ 0 ) = m λ De négy ismeretlen vn! Ezekből képekből mtemtiki műveletekkel következtetni lehet kristály szerkezetére. Ahhoz, hogy fehérje polipeptidláncot vgy nukleinsv polinukleotidláncot felépítő tomok elrendezésének részleteit megismerjék egy kis fehérjemolekul esetén is leglább tízezer felvételt kell készíteni, és kiértékelni. cos 2 + cos 2 β + cos 2 γ ) = 1 Miért röntgen sugrkt lklmzunk? A fehérjeszerkezetek megjelenítése Szlg modell Gömb (térkitöltő) modell Rácsállndó vs. hullámhossz; diffrkció feltétele. Péld lklmzásr: 9-Anthroylnitrile kötése miozin S1-hez 9-nthroylnitrile (ANN) kötése miozin S1-hez ANN-el potenciálisn jelölhető 12 db szerin minosv (donor) 12 szerinből 1 jelölhető fluorofórrl miozin S1-en belül? Melyik? Akceptorrl jelölhető, ismert pozíciójú minosvk 2
ANN kötése miozin S1-hez Összefogllás A módszer lpji; Az lklmzás feltételei; A számítások lpegyenletei; Fehérjeszerkezetek. A Ser-181-hez kpcsolódott fluorofór! Történelem, előzmények W. K. Röntgen (1845 1923) Wife s hnd Roslind Frnklin Ezekből képekből csk nehezen tudtk bonyolultbb molekulákt meghtározni, ngyon sok bonyolult számításr volt hozzá szükség. Ilyen módszerrel vizsgált z 1950-es években Roslind Frnklin ngol kristályszkértő DNS molekulák lkját, szerkezetét. Roslind Frnklin (1920-1958) 3
1953; DNS 1958; z első fehérjeszerkezet (6 Angström felbontásbn) R. Frnklin tpsztlti lpján két biokémikus Jmes D. Wtson és Frncis Crick próbálták megépíteni DNS modelljét. Az eredmény lesújtó volt, több dtr lett voln szükségük. Az első fehérje, minek sikerült megállpítni szerkezetét mioglobin ( hemoglobinhoz hsonló, izombn tlálhtó) volt, Kendrew és munktársi áltl: A hemoglobin szerkezete Kendrew A mi technikánk köszönhetően gépek számítógépekkel vnnk összekötve, minek segítségével sokkl egyszerűbb, gyorsbb különböző fehérjék szerkezetének meghtározás. A DNS szerkezete 4
Az RNS-polimeráz II trnszkripciós pprátus Az RNS-polimeráz II szerkezete 2.8-A felbontássl (3500 minosv, 28000 nem-hidrogén tom) Alegységek Móltömeg szám (kd) RNS polimeráz II 12 515 Trnszkripciós fktorok 26 1560 Mediátor 21 1005 Preiniciációs komplex 58 3080 Kornberg, Roger D. (2007) Proc. Ntl. Acd. Sci. USA 104, 12955-12961 Copyright 2007 by the Ntionl Acdemy of Sciences Az RNS-polimeráz II szerkezete trnszkripció közben, közel tomi felbontássl A centrifugálás történetének mérföldkövei 1926, Svedberg: első nlitiki ultrcentrifug; 1935, Pickels és Bems: preprtív utrcentrifug; 1951, Brkke: növényi vírus izolálás szhróz grádiens centrifugálássl; 1957, Meselson, Sthl és Vinogrd: nukleinsvk izolálás egyensúlyi CsCl sűrűséggrádiens centrifugálássl. Kornberg, Roger D. (2007) Proc. Ntl. Acd. Sci. USA 104, 12955-12961 Copyright 2007 by the Ntionl Acdemy of Sciences Az elektroforézis történetének mérföldkövei 1933, Tiselius: fehérjék szétválsztás elektroforézissel; 1955, Smithies: szérumfehérjék szétválsztás keményítőelektroforézissel; 1959, Rymond: polikrilmid gél bevezetése; 1966, Mizel: SDS bevezetése; 1975, O'Frrel: kétdimenziós elektroforézis (IEF + SDS-PAGE); 1975, Southern: DNS blottolás. 5