Immunológia II GY 2018.03.23. Bajtay Zsuzsa
5. Antigén ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek II. A kapcsolódást követő másodlagos reakciókon alapuló kódszerek; precipitáció, agglutináció, komplement mediált lízis. A komplement rendszer vizsgálata.
10.4. ábra Az Ig molekula általános szerkezeti felépítése - kb.160 Kd-os glikoprotein - 2 könnyű lánc (L light chain) - 2 nehéz lánc (H heavy chain) diszulfid hidakkal és nem-kovalens kötésekkel összekötve - domén szerkezet: Ig domén
Az immunkomplex (IK, IC) kialakulása antigén
Poliklonális immunválasz különböző antigéndeterminánsok
A másodlagos (szerológiai) reakciók Az ag-ea elsődleges kapcsolódását másodlagos reakció követi, ami lehet: 1. precipitáció (folyadékfázisban, gél közegben) 2. agglutináció 3. komplement függő lízis A reakció kialakulása függ: - az antigén természetétől, méretétől, epitópok számától - ellenanyag osztályától, alosztályától, térháló képző képességétől - antigén-ellenanyag aránytól
[Ag]+[Ea] [AgEa] Precipitációs görbe Precipitáció: oldott antigén + specifikus ellenanyag az IK az oldatból kiválik Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis antigéntúlsúly ekvivalencia ellenanyagtúlsúly csapadék O.D. 280 nm 0,5 100 200 300 bemért ellenanyag ( mg)
1. Gél közegben végzett precipitációs reakciók Kétdimenziós egyszerű immundiffúzió Kétdimenziós kettős immundiffúzió antigén antigén ellenanyag Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis ag agarba kevert ellenanyag antigén antigén ea ellenanyag Machini-módszer Mancini Agaróz gél ellenanyag Ouchterlonz/m=dsyer Ouchterlony módszer Agar gél 1/128 Ea 1/2 1/128 Ag 1/2 Titer: az adott vizsgálati módszerre vonatkozik 1/64 1/32 Ag 1/16 1/8 1/4 1/64 1/32 Ea 1/16 1/8 1/4 Precipitációs titer: Az az ellenanyag hígítás, amely még precipitációs reakciót eredményez
1. Gél közegben végzett precipitációs reakciók Kétdimenziós egyszerű, radiális immundiffúzió Mancini módszer Ag koncentráció Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis ellenanyag a gélbe keverve X St1 St2 St3 St4 antitest az agarba keverve 50 40 30 20 10 az antigén hígításai 5 2 St 1 St 2 St 3 St 4 X A precipitációs gyűrű átmérőjének négyzete
https://www.youtube.com/watch?v=4vgyrt0u7s8
1. Kettős immundiffúzió - Ouchterlony módszer hu μ-lánc hu IgM Nyúl anti-hu IgM
Immunelektroforézis: elektroforézis (A) és immundiffúzió (B) A B antigén prealbumin albumin -glikoprotein antiszérum Anti-humán savó (AHS) -lipoprotein -antitripszin Gc-globulin x -glikooprotein Cöruloplazmin Haptoglobulin -makroglobulin -mlipoprotein Hemopexin Transzferrin C3 IgA IgM IgG Antigén C nigg AHS mielómás beteg széruma
Immunelektroforézis: elektroforézis (A) és immundiffúzió (B) A B antigén prealbumin albumin -glikoprotein antiszérum Anti-humán savó (AHS) -lipoprotein -antitripszin Gc-globulin x -glikooprotein Cöruloplazmin Haptoglobulin -makroglobulin -mlipoprotein Hemopexin Transzferrin C3 IgA IgM IgG Antigén C - Normál humán IgG (higg) nigg AHS - Anti-humán savó (AHS) mielómás beteg széruma - Mielómás beteg széruma
Korpuszkuláris antigének 2. Agglutináció (vörösvérsejtek, baktériumok, latex vagy pl. polisztirén gyöngyök) Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis ellenanyaggal reagálva összecsapzódnak, agglutinálódnak. direkt inidrekt passzív IgM
1. direkt 2. Agglutináció 2. indirekt Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis Rh + vörösvértest anti-d IgG anti-hu Ig pl. AB0 vércsoport fő vércsoport antigének kimutatása 3. passzív pl. Rh + vvt D antigénre specifikus ellenanyag kimutatása (Coombs teszt) Rh + vvt + vizsgálandó szérum + anti-hu Ig partikulumhoz kötött antigén pl. saját antigént felismerő autoantitest vagy kórokozó antigént felismerő ellenanyag kimutatása
2. Agglutináció Agglutináció végezhető V furatú mikrotitráló lemezen + Reakció - Reakció Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis ellenanyag hígítás vörösvértest ellenanyag A B C D E F G H + - kontroll vörösvérsejt hígítás Agglutinációs titer : az ellenanyagnak az a hígítása, amely még agglutinációt vált ki
3. Komplement függő lízis - ellenanyag termelő sejtek kimutatása plakk módszerrel Cunningham féle plakk módszer vörösvértesttel immunizált állat lépsejtjei antigént hordozó vörösvértestek Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis komplement ellenanyaggal kapcsolt vvt komplement mediált lízise Plakk
3. Komplement függő lízis - a HLA tipizálás szerológiai módszere Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis alvadásgátolt Leukocita szeparálás vér komplement forrás (friss nyúlsavó) HLA allél-specifikus savók festék élő / pusztult sejtarány a megfelelő HLA specificitású ellenanyag hozzákötődik a sejtekhez és aktiválja a komplementrendszert ez a sejtek oldásához, pusztulásához vezet.
módszer érzékenység ( g/ml ) jelzéses technikák ELISA < 0,001 RIA < 0,0001 immunfluoreszcencia < 1,0 precipitációs módszerek kettős immundiffúzió 1,0 10,0 ellenelektroforézis 0,1 1,0 immunelektroforézis 5,0 50,0 radiális immundiffúzió 1,0 10,0 rakéta elektroforézis 0,1 1,0 agglutinációk indirekt - direkt 0,01 1,00 passzív 0,005 0,1 agglutináció gátlás 0,001 0,01 komplement kötés 0,01 0,1
A komplementrendszer aktivitásának vizsgálata
Komplementfehérjék koncentrációja a szérumban: 2 332 g/ml
Összkomplement-titrálás Ca,Mg Mg
Klasszikus út mérése - D faktor mentesített szérumból Alternatív út (ACH 50 ) aktivációjának mérése - ellenanyag nélkül - EGTA + Mg ++ - nyúl vvs
Komplement vizsgálati módszerek avóból: komplementrendszer pillanatnyi állapota, komponensek zérumoncentrációja, aktiváltsága, aktiválhatósága jellemzésésre: - össz-komplement titrálás - egyes komponensek aktivitása - komponensek koncentrációja - in vivo aktiváció kimutatása - komplementfehérjével fedett immunkomplexek kimutatása yógykészítmények komplement aktiváló képességének in vitro vizsgálata omplementreceptor expresszió mérése sejteken omplement lerakódás kimutatása szövetekben omplementfehérjék polimorfizmusának genetikai vizsgálata
Mintavétel a komplementrendszer vizsgálatához - savó - frissen használni (szobahőmérsékleten néhány óra) vagy - egyszer lefagyasztva -70 o C tárolni - Hőinaktiválás: 56 o C, 30 perc
Össz-komplement titrálás módszerek A vvs vvs ellenes antitest (hemolizin) + savó (amiben mérjük a + komplement aktivitást) Hemolitikus teszt hemolízis Hemoglobin meghatározás B liposzóma G6PDH Liposzóma membrán ellenes antitest + savó + (amiben mérjük a komplement aktivitást) lipolízis Liposzóma immunesszé G6PDH meghatározás C aggregált Ig + savó (amiben mérjük a komplement aktivitást) C aktiváció CH50 ekvivalens ELISA sc5b-9 meghatározás
Össz-komplement titrálás hemolitikus módszerrel Funkcionális teszt: a komplementaktiváció együttes biológiai aktivitását méri vvt + vvt ellenes antitest (hemolizin) + savó (amiben mérjük a komplement aktivitást) hemolízis Hemoglobin meghatározás (405 nm, spektrofotometria)
Össz-komplement titrálás hemolitikus módszerrel Emberi savó normál CH50 = 40-120 Eltérések: 0 - C1-C8 örökletes hiánya 10-20 - C9 hiány 40-120 - normális, de lehet D faktor hiány csökken - H, I faktor hiány Emberi savó vizsgálatához szükséges: birka vörösvértest, birka vvt. specifikus nyúl ellenanyag (hemolizin) standardizált hígítás, térfogat és inkubációs idő VBS (Ca-Mg tartalmú veronál puffer) hemolízis mértéke = szérum összkomplement tartalom/aktivitás CH50 : a vvs-ek 50%-ának líziséhez szükséges savó mennyisége
Össz-komplement titrálás hemolitikus módszerrel CH50 1 ml savóra vonatkozó hemololítikus egység meghatározása: van Krogh egyenlet OD(405nm) - reagens kontroll(rk): szérum nélkül - lízis kontroll(lk): desztillált víz - mintából(m) hígítási sor Hemolízis 100% E M E RK /E LK = y y * 100 = lízis % y/1-y 50% ml szérum 1 0,1 x x x x ml szérum CH50/ml = 1 ml / x ml
Komplementkomponensek egyedi vizsgálata 1. Hemolitikus módszer (funkcionális) A rendszer tartalmazza a targetsejt lízishez szükséges valamennyi komponenst - kivéve a mérendő komponenst a lízis mértékét a vizsgált komponens határozza meg a kaszkád-szerű működés miatt 2. Másodlagos vagy jelzéses módszerek - Mancini teszt - ELISA
Komplementfehérjék mennyiségi meghatározása Mancini ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
Komplement mérések a klinikai gyakorlatban 1. Diagnózis : deficienciák mikor vizsgáljuk? - gennykeltő fertőzésekre való hajlam, - csalánkiütés, - ödéma hajlam. 2. Betegség aktivitás, terápia hatékonyság követése, szövődmény előrejelzés Hipokomplementémia: genetikai ok, SLE, RA, szeptikus sokk, akut hepatitis, pancreatitis... Hiperkomplementémia: fertőzések, krónikus gyulladás, infarktus, trauma, rosszindulatú daganatok In vivo aktiváció: SLE, RA, égés, szepszis, dialízis...