Ph.D. TÉZISEK. A timociták szelekciós lépéseit befolyásoló szolubilis molekulák és sejtes interakciók modell vizsgálata. Dr.

Átírás

1 Ph.D. TÉZISEK A timociták szelekciós lépéseit befolyásoló szolubilis molekulák és sejtes interakciók modell vizsgálata Dr. Pálinkás László Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központ Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Témavezetı: Dr. Berki Timea A-139 Az Immunológia alapjai Programvezetı: Dr. Németh Péter 2009

2 TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÓ... 4 ABSTRACT BEVEZETÉS T-SEJTEK ÉS JELENTİSÉGÜK A TMUSZ A TIMOCITÁK ÉRÉSE A TMUSZBAN THYMIC EDUCATION A T-sejt érés korai szakaszai A timociták pozitív szelekciója A timociták negatív szelekciója T-sejtek vándorlása a másodlagos nyirokszervekhez TIMOCITÁK ÉRÉSÉT BEFOLYÁSOLÓ MOLEKULÁK A T-SEJT RECEPTOR T-sejtek antigén felismerésében résztvevı ko-receptorok A CD3 komplex szerkezete és funkciója A TCR antigén kötését követı jelátviteli folyamatok A GLUKOKORTIKOID HORMON A glukokortikoid receptor A glukokortikoid különbözı hatásmódjai Membrán GCR szerepe TIMOCITÁK APOPTÓZISA T-sejt receptor mediálta apoptózis Glukokortikoid hormon indukálta apoptózis Kölcsönös antagonizmus modell CÉLKITŐZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK EGÉR MODELLEK VEGYSZEREK ÉS PUFFEREK MONOKLONÁLIS ANTITESTEK ÁLLATOK OLTÁSA ÉS TIMOCITA PREPARÁLÁS TIMOCITÁK CMX-ROS FESTÉSE TIMOCITÁK SEJTFELSZNI JELÖLÉSE TIMOCITÁK INTRACELLULÁRIS JELÖLÉSE TIMOCITÁK INTRACELLULÁRIS SZABAD KÁLCIUMSZINTJÉNEK MEGHATÁROZÁSA ANNEXIN V ÉS PI KOMBINÁLT JELÖLÉS ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁS MÉRÉS ÉS ANALZIS STATISZTIKAI ANALZIS EREDMÉNYEK BALB/C ÉS AND EGÉR TMUSZÁNAK SEJTES ÖSSZETÉTELE GCR EXPRESSZIÓ MEGHATÁROZÁSA TIMOCITA ALCSOPORTOKBAN GCR expresszió a különbözı timocita alcsoportokban Ismételt in vitro DX kezelés indukálta változások az egyes timocita alcsoportok GCR expressziójában Egyszeri nagy dózisú DX kezelés hosszútávú hatása a timocita populációk GCR expressziójára AND transzgenikus egér timocita alcsoportjainak GCR expressziója In vivo DX és PCC antigén, illetve anti-cd3 kezelés hatása AND transzgenikus egér timocitáinak GCR expressziójára GLUKOKORTIKOID HORMON HATÁSA A TIMOCITA ALCSOPORTOK TCR INDUKÁLTA AKTIVÁCIÓJÁRA Szabad intracelluláris kálcium szintek a nyugvó (alap) timocita alcsoportokban

3 4.4 GLUKOKORTIKOID HORMON ÉS TCR AKTIVÁCIÓ HATÁSA A TIMOCITA ALCSOPORTOK APOPTÓZISÁRA BALB/c egér timocita számának és tímusz sejtes összetételének változása különbözı dózisú ismételt DX kezelés hatására In vivo glukokortikoid analóg, anti-cd3, illetve kombinált kezelés hatása BALB/c timociták apoptózisára Egyszeri, nagy dózisú DX kezelés hatásának idıfüggése BALB/c egérben GC indukálta apoptózis mechanizmusának vizsgálata: glukokortikoid receptor antagonista kezelés hatásai AND egér tímuszának sejtes összetétele egyszeri glukokortikoid hormon és/vagy PCC kezelés, illetve direkt TCR stimuláció után Korai apoptotikus markerek megjelenése transzgenikus AND egér DP és CD4 SP timocitáiban in vivo antigén és glukokortikoid kezelést követıen Mitokondriumok funkcióvesztésének detektálása apoptotikus sejtekben TCR aktiváció és GC hatása DP és CD4 SP timociták Bcl-2 expressziójára Aktivált Caspase-3 szint a DP populációban GLUKOKORTIKOID HORMON HATÁSÁNAK IN VITRO VIZSGÁLATA In vitro glukokortikoid hatások tímusz szövetkultúra sejtjeinek túlélésére In vitro Caspase inhibitor Z-VAD-fmk kezelés hatása a timociták túlélésére Z-VAD-fmk kivédi a spontán és DX indukálta Caspase-3 aktivációt TIMOCITÁK POZITV SZELEKCIÓJÁNAK MODELLEZÉSE BALB/c egér DP timocitáinak CD69 expresszió változása glukokortikoid és glukokortikoid receptor antagonista kezelés hatására DX, anti-cd3, illetve kombinált kezelés hatása BALB/c timocita alcsoportok CD69 expressziójára AND TCR transzgenikus egér DP és CD4 SP sejtjeinek CD69 pozitivitása DX, PCC antigén és kombinált kezelés után MEGBESZÉLÉS KÖSZÖNETNYILVÁNTÁS RÖVIDTÉSEK JEGYZÉKE PUBLIKÁCIÓS LISTA A TÉZIS ALAPJÁT KÉPEZİ PUBLIKÁCIÓK EGYÉB PUBLIKÁCIÓK REFERENCIÁK MELLÉKLETEK

4 ÖSSZEFOGLALÓ A timociták tímuszbeli érése celluláris és humorális faktorok által irányított bonyolult folyamat, melynek minden részlete még nem teljesen tisztázott. A pozitív és negatív szelekció során a tímuszban eliminálódnak a funkcióképtelen és a veszélyes autoreaktív T sejtek, mielıtt elérnék a perifériát. A humorális szabályozók közül a tímusz epithel sejtek által termelt glukokortikoid hormon (GC) módosítja a T-sejt receptor (TCR) jelátvitelét a CD4/CD8 kettıs pozitív (DP) timocitákban és hatással van ezeknek a sejteknek a túlélésére. Több tanulmány bizonyította már, hogy a négy fı timocita alcsoport közül a DP timociták a legérzékenyebbek az in vivo GC hatásra, ugyanakkor a kölcsönös antagonizmus modell szerint a külön-külön apoptózist okozó TCR jel és GC hatás, ha együtt éri a DP sejtet, az a sejt túléléséhez vezet. Ezért munkánkban a GC hatást önállóan és paralell TCR stimulálással együtt vizsgáltuk in vivo és in vitro BALB/c, illetve AND TCR transzgenikus egértörzsek timocitáiban. Az AND TCR transzgenikus egértörzs egy átrendezıdött TCR gént (Vβ3/Vα11) hordoz, mely a galamb citokróm C (PCC) antigénre specifikus TCR-t kódolja. A GC hatás modellezéséhez szintetikus dexamethasone (DX) kezelést, TCR stimulációhoz anti-cd3 monoklonális antitestet, illetve az AND egértörzsben PCC antigént használtuk. Az AND transzgenikus TCR egértörzs tímuszának sejtes összetétele eltér a BALB/c tímuszétól: a DP sejtek mellett fıleg egyszeresen pozitív CD4 (SP) timocitából áll. A négy timocita csoport sejtjei eltérı kinetikájú és amplitúdójú szabad Ca ++ szint növekedéssel reagáltak in vitro TCR stimulációra. A GC és az intracelluláris glukokortikoid receptor (GCR) timocita érésben betöltött szerepének tisztázására megvizsgáltuk a két egértörzs timocitáiban a GCR expresszióját a különbözı timocita alcsoportokban. A CD4/CD8 kettıs negatív (DN) és az érett SP populációkhoz viszonyítva a GCR szint a DP populációban volt a legalacsonyabb, noha ez a populáció a legérzékenyebb a GC hatásra. Eredményeink szerint a GC hatására kialakuló apoptózis a DP sejtekben 4 órával a DX kezelést követıen kezdıdik és 24 óra után is tart. A kölcsönös antagonizmus modellt alátámasztják azok a megfigyeléseink, melyek szerint önálló GC hatás és TCR aktiváció után mind a korai és késıi apoptózis kimutatására alkalmas Annexin V/PI jelöléssel, mind a mitokondriumok funkcióképességét detektáló CMX-Ros festékkel nagyobb arányú apoptotikus DP sejtet találtunk, mint a kombinált kezeléseket követıen. Az együtt alkalmazott GC hatás és TCR aktiváció után azonban nagyobb arányban voltak az anti-apoptotikus Bcl-2 pozitív DP timociták, melyekben kisebb mértékben aktiválódott a pro-apoptotikus Caspase-3 fehérje. A kombinált kezelések hatására nagyobb arányban találtunk CD69+ DP és érett CD4 SP sejtet, mely arra utal, hogy az együttes GC hatást és TCR jelet a kisebb apoptózis mellett a DP sejtek kiérése is követi. 4

5 ABSTRACT Thymocyte maturation in the thymus is a complex, controversial procedure controlled by stromal and humoral components. Positive and negative selection steps in the thymus prevent non-functional or harmful T cells from reaching the periphery. Among the humoral regulators locally produced glucocorticoids (GC) seem to have a key role in the selection of thymocytes. Positive and negative selection steps in the thymus prevent non-functional or harmful T cells from reaching the periphery. GC production by thymic epithelial cells influences T cell receptor (TCR) signaling in CD4/CD8 double positive (DP) thymocytes and modifies their survival. Several studies have shown that the DP thymocytes are the most sensitive to in vivo GC-induced apoptosis among the four major thymocyte subsets. According to the mutual antagonism model GC and TCR signaling alone induce apoptois of DP cells but when the two signs reach thymocytes together, they will survive. In the present work, we focused on exploring details of GC effects on thymocyte with or without parallel TCR activation in vivo and in vitro in BALB/c and AND transgenic mice, carrying rearranged TCR (Vβ3/Vα11) specific only for pigeon cytochrome C (PCC). We used the GC agonist dexamethasone (DX) and anti-cd3 monoclonal antibody or PCC, the specific antigen for AND transgenic mice as TCR activator. The thymocyte subpopulations of AND TCR transgenic mice showed a striking difference compared to BALB/c mice: high frequency of mature single positive CD4 SP cells were found instead of the overwhelming dominance of DP cells. The four thymocyte subpopulations after in vitro TCR stimulation showed different pattern of free intracellular Ca ++ level increase both in its kinetic and its amplitude. To examine the role of GC hormone and its intracellular receptor (GCR) in thymocyte development we measured the GCR expression in the different thymocyte subpopulations of the two mice strains. DP thymocytes showed the lowest GCR expression compared to CD4/CD8 double negative (DN) and mature SP cells while this subpopulation is the most sensitive to GC. Our results showed that signs of the apoptosis in DP cells can be detected after 4 hours in vivo DX administration and this apoptotic process outlasts after 24 hours. Our observations supports the mutual antagonism model since comparing to the effects of parallel activation after GC administration or TCR stimulation alone we could find more early and late apoptotic DP cells with Annexin V/PI and more cells with functionless mitochondria with CMX-Ros staining. After combined treatments we also found more anti-apoptotic Bcl-2 positive and less activated pro-apoptotic Caspase-3 positive DP cells. Combined GC administration and TCR stimulation resulted in higher rates of CD69+ DP and CD4 SP cells suggesting that the parallel GC and TCR signs cause the further maturation of DP cells beside the lower rates of apoptosis. 5

6 1 BEVEZETÉS 1.1 T-SEJTEK ÉS JELENTİSÉGÜK A T-limfociták a B-sejtek mellett az adaptív (specifikus) immunrendszer meghatározó sejttípusai. Az immunválasz fontos szabályozói, de részt vesznek a vírussal vagy intracelluláris parazitákkal fertızött sejtek felismerésében és eliminálásában, a tumor sejtek elpusztításában, továbbá alapvetı szerepet játszanak a saját és nem-saját struktúrák megkülönböztetésében és az MHC (maior histocompatibility complex) inkompatibilis szervek kilökıdésében. T-sejt receptornak (TCR) a T-limfociták felszínén megjelenı antigén felismerı molekulákat nevezzük, amelyek két doménes felépítéső polipeptid láncból állnak és a CD3 molekulakomplexszel kiegészülve alkotnak funkcionális egységet. A két fehérjelánc N terminális vége közösen alkotja az antigén felismeréséért felelıs részt. A TCR csak a sejtfelszínen megjelenı MHC molekulákkal bemutatott peptid antigének felismerésére képes. A nekik megfelelı antigén kötése után a T-sejtek klonális aktiváción és osztódáson esnek át, mely során memóriasejtekké és az egyes altípusoknak megfelelı effektor sejtekké differenciálódnak. Két nagy sejtcsoportot tudunk elkülöníteni a T- sejteken belül: az αβ T-sejt receptorral és a γδ TCR-rel rendelkezı sejteket. A T-sejt érés eredményeként lényegesen több αβ TCR-t hordozó sejt jön létre, mint γδ TCR-t kifejezı T-limfocita. Az érett αβ T-sejtek két alcsoportra oszthatók attól függıen, hogy melyik koreceptor molekulát expresszálják kizárólagosan: az MHC II-vel együtt bemutatott antigéneket felismerı, CD4-et hordozó a segítı (helper) míg az MHC I-el bemutatott antigéneket felismerı, CD8-at hordozó a sejtpusztító (citotoxikus) T-limfocita. A γδ TCR pozitív T-limfociták emberben és egérben a lép és a nyirokcsomók T-sejt állományának csak nagyon kis (1-5%) hányadát adják. Nagyobb arányban találhatóak meg a vékonybél, a máj és a reproduktív szervek hámja alatt. Más antigéneket ismernek fel, mint az αβ T-sejtek, és még ma is az egyik legkevésbé ismert sejtcsoportját alkotják az immunrendszernek (1, 2). 6

7 A T-sejtek nevüket a tímuszról (csecsemımirigy) kapták. Ez az a szerv, ahol a csontvelıi eredető elıalakokból naiv, immunokompetens T-sejtekké érnek egy bonyolult, szelekciós lépéseket is tartalmazó érési folyamat során. Ez az érési folyamat biztosítja, hogy a funkcióképtelen TCR-t, vagy a haszontalan, illetve autoantigéneket felismerı sejtek eliminálódjanak. A T-limfocita irányába való elkötelezettség és az αβ illetve γδ irányú differenciálódás szétválása már a T-sejt érés korai stádiumában megtörténik. Ezt követıen a TCR-gének átrendezıdése, az αβ T-sejtek ezt követı szelekciója majd a CD4+ és CD8+ irányba történı differenciálódás zajlik a tímuszban. 1.2 A TMUSZ A tímusz kétlebenyő, a mediastinum anteriusban elhelyezkedı elsıdleges immunszerv. Terszowski és munkatársai az utóbbi idıben funkcióképes nyaki tímuszt is leírtak egerekben, melyet csontvelıi éretlen T-sejt elıalakok kolonizálnak, és képes érett, immunokompetens T-sejtek perifériás keringésbe juttatására (3). A csecsemımirigynek elsıdleges szerepe van a T-sejt repertoár kialakításában, melyben nagyon fontosak a specializált funkciójú stórmaelemek és a tímusz jellegzetes szerkezete. 1. táblázat. A tímuszt alkotó fıbb sejttípusok és azok eredete. A tímuszt alkotó sejtek tranziens, folyamatos kolonizációt folytató haematopoetikus eredető, CD45+ sejtekre és rezidens stróma sejtekre (CD45-) oszthatóak. A CD45- sejtek további két csoportra oszthatóak: tímusz epithel sejtek (TEC, Keratin+) és mesenchimális eredető sejtek (Keratin-), mely utóbbi csoportba különbözı alapstruktúrákat (pl.: tok, erek) felépítı sejtek tartoznak. 7

8 A tímusz stróma eleme közé tartozik a hematopoetikus eredető sejtek kivételével minden tímusz felépítésében résztvevı sejt, tekintet nélkül ezen sejtek pontos eredetére. Ezek a sejtek legegyszerőbben a CD45 pán leukocita marker és a keratin segítségével csoportosíthatóak (1. táblázat, 4). A CD45+ : CD45- sejtek aránya kb. 50:1. A tímusz endotheliuma által expresszált P-selectinhez kötıdnek a limfoid progenitor sejtek a PSGL-1 (P-selectin glicoprotein ligand-1) molekulájukkal, mely jelenség nagyon fontos az elıalakok tímuszba történı vándorlásának folyamatában. A tímusz limfoid progenitorokat befogadó fészkeinek (niche) telítettsége alapvetıen meghatározza a sejtek a P-szelektin expresszióját és ennek következtében a tímuszba vándorlásuk kinetikáját is (5). 1.3 A TIMOCITÁK ÉRÉSE A TMUSZBAN THYMIC EDUCATION A fiatalkori csecsemımirigyben zajló timocita érés négy fı jellemzıje: 1 a belépı differenciálatlan sejtek gyors osztódása a kéreg alatti régióban; 2 a differenciálódás, amely a TCR génátrendezıdéssel és különbözı CD markerek sejtfelszíni megjelenésével jár; 3 a szelekció, melynek során az MHC kizárásnak nem megfelelı, ill. az autoreaktív klónok elpusztulnak; 4 a folyamatokat kísérı sejt-sejt kontaktusok és kemotaktikus faktorok által irányított, a kéregbıl a velıállomány felé tartó mozgás (1. ábra, 6) A T-sejt érés korai szakaszai A csontvelıbıl a tímuszba lépı elıalakok a tok alatti régióban lépnek be, ahol elıször IL-7 függı osztódáson mennek át. Az extenzív profliferáción túl jellemzı rájuk, hogy még pluripotensek, DC, NK, B- és T-sejt irányba is fejlıdhetnek tovább és CD44, CD117 (ckit) expresszióval jellemezhetıek (7). A CD44 a kéreg- és velıállományt behálózó fibroblasztokkal asszociált extracelluláris mátrix hialuronsavkomponensével teremt kapcsolatot. A c-kit az ıssejtek növekedési faktorának (SCF stem cell facor) kinázaktivitással rendelkezı receptora. A TCR génjei germ line elrendezıdésben vannak, és ezek a sejtek sem CD4, sem CD8 molekulát nem expresszálnak, ezért kettısen negatívak. A stróma sejtek által termelt IL-1α és a TNFα hatására az IL-2 receptor alfa láncát (CD25) is kifejezik a felszínükön, és T-sejt-vonal irányába elkötelezıdnek. Úgy 8

9 tőnik, hogy a korai limfoid progenitor sejtek T-sejt irányú elkötelezıdése az elıalakok tímuszba történı belépését követıen történik meg, melyben nagy szerepe van a Notch-1 jelátviteli útnak. A tímusz stróma sejtjein expresszált Notch-1 ligand (Delta-1) folytonos jelenléte és kapcsolódása a timociták felszínén jelenlévı Notch-1-el szükséges a B-sejt irányú elkötelezıdés elnyomásához és a további T irányú differenciálódáshoz (8). 1. ábra. A timociták érésének sematikus folyamata a tímuszban. CEC kortikális epitheliális sejtek, MEC medulláris epitheliális sejtek, DC dendritikus sejtek (Blackburn CC et al. Nat Rev Immunol ) A T-sejt-érés fı irányvonalát jelentı αβ irányban elıször a TCR β-, majd az α láncát kódoló gének átrendezıdése történik meg. A sejtek mintegy 70%-a a sikertelen génátrendezıdések miatt nem jut el a késıi pre-t-sejt szakaszig, ahol az αβ TCR mellett már mindkét sejtfelszíni koreceptor molekula (CD4 illetve CD8) is kifejezıdik: ezek a kettıs pozitív (Double Positive, DP) sejtek. 9

10 A DP timocita jelenti azt az intermedier állapotot, amelyen lezajlanak a TCR/CD3- komplex, a ko-receptorok és az MHC I-et és MHC II-t kifejezı különbözı stróma sejtek között kialakuló szoros kapcsolatokat igénylı szelekciós lépések sorozata A timociták pozitív szelekciója A pozitív szelekció során csak a kéreg epitheliális sejtjein kifejezıdı saját MHC molekulákhoz kapcsolódni tudó timociták jutnak tovább a differenciálódási úton (9): a rövid élettartamú DP sejtek (3 nap a felezési idejük) hosszabb élető sejtekké válnak. Egy adott TCR MHC I-et vagy MHC II-t felismerı képessége dönti el, hogy mi lesz az αβ TCR-t hordozó sejtek további funkciója. A többi, strómasejthez kapcsolódni nem tudó T- sejt elıalak a felismerés hiánya miatt apoptózissal elpusztul. Ez a sorsa azon sejteknek is, amelyekben a sikertelen génátrendezıdés miatt nem jön létre funkcióképes TCR A timociták negatív szelekciója A negatív szelekció azokat a timocitákat távolítja el, amelyek a saját antigénekkel szemben erıs affinitással rendelkeznek. A pozitív szelekció eredményeként aktiválódó és életben maradó timociták között olyanok is vannak, amelyek a saját MHC-molekulákkal együtt bemutatott saját fehérjékbıl származó peptideket erısen kötik. Ezek az MHC-peptid kombinációk a csecsemımirigy velıállományában lévı, medulláris epitheliális sejtek, valamint a csontvelıbıl a tímuszba bevándorló dendritikus sejtek és makrofágok felszínén találhatók. Ezek a sejtek teremtik meg a negatív szelekcióhoz szükséges mikrokörnyezetet úgy, hogy egy speciális transzkripciós faktor (autoimmune regulator AIRE) segítségével minden lényeges saját fehérjét expresszálnak és így az MHC molekulákkal bemutatnak (10). A saját MHC-saját peptid kombinációkat erısen kötı DP sejtek aktiváció indukálta apoptózissal elpusztulnak, míg azok a korlátozott antigén felismerı képességgel rendelkezı timociták, melyek nem jelentenek veszélyt a saját szöveti struktúrákra, vagyis toleránsak: túlélnek (11). A negatív szelekció, mely az ún. centrális tolerancia kialakulásáért felelıs, nem eredményezi az összes autoreaktív T-limfocita klón eliminálását a potenciális készletbıl. Számos adat igazolja, hogy a perifériára kikerülnek olyan TCR-t hordozó érett T- limfociták is, melyek saját MHC molekulák saját peptidekkel alkotott komplexeit ismerik 10

11 fel, de fiziológiás körülmények között ezek jelenléte a periférián is mőködı toleranciát fenntartó mechanizmusok miatt nem vezet önpusztító folyamatok beindulásához. Az újabb irodalmi adatok szerint ezek a saját antigéneket felismerı sejtek regulátoros T- sejtekként (Treg) a saját antigéneket felismerı sejtek gátlásával elızik meg az autoimmun folyamatok kialakulását (12). A negatív szelekciót túlélı timociták vagy csak CD4 vagy csak CD8 ko-receptor molekulát hordozó, egyszeresen pozitív (Single Positive, SP), érett sejtekké alakulnak, és helper (CD4 SP) vagy citotoxikus (CD8 SP) T-limfocitákként funkcionálnak a periférián T-sejtek vándorlása a másodlagos nyirokszervekhez Az érett, naív T-limfociták a velıállományból egy végsı osztódási fázis után a posztkapilláris venulák falán keresztül a keringésbe jutnak és a limfoid rendszer különbözı perifériás szerveihez vándorolnak. Itt ugyancsak a posztkapilláris venulákon keresztül elhagyják a keringést és belépnek a T-sejtes régiókba: a nyirokcsomókban a belsı kéregbe (paracortex), a lépben a periarterialis limfoid hüvelybe (PALS), a Peyer-plakkok, tonsillák és az appendix intranodularis területeire (13). A perifériára kijutott immunokompetens sejtek ha találkoznak azzal az antigénnel, amelyre specifikusak klonális aktiváción és expanzión esnek át, majd további differenciálódás után effektor vagy hosszú élető memóriasejtekké alakulnak (14, 15). 1.4 TIMOCITÁK ÉRÉSÉT BEFOLYÁSOLÓ MOLEKULÁK Számos faktor szabályozza a timociták sok lépésbıl álló, bonyolult érési folyamatát. A sejt-sejt interakciók szabályozásában az MHC antigén TCR kapcsolódáson túl számos adhéziós molekula, és koreceptor is részt vesz (16, 17). A szelekciós folyamatokban a TCR/CD3 komplex a saját MHC-vel reagálva egyszer túlélési, másszor apoptózist indukáló szignált ad a timocitáknak. Még nem teljesen tisztázott az a mechanizmus, amely eldönti, hogy a szignál a túlélést vagy az apoptózist indítja-e el. Ennek befolyásolásában a direkt sejt-sejt interakciókon kívül még szerepet játszik számos szolubilis faktor is, mint például a wnt (18), citokinek (19), és a glukokortikoid hormon (GC) (20). 11

12 Az utóbbi idıben derült fény arra, hogy a tímuszban, a citokineken kívül az epithel sejtek glukokortikoid hormon termelését is végzik (21). Több közlemény utal arra, hogy ennek a hormonnak szerepe lehet a timociták szelekciós folyamatában. Ez a modell a GC-hormon moduláló hatását feltételezi a pozitív szelekcióban (22, 23). 1.5 A T-SEJT RECEPTOR A T-sejt receptor (TCR) egy sejtfelszíni antigén receptor komplex a T-sejteken, melynek segítségével specifikusan képesek felismerni antigéneket. A TCR segítségével a T-sejtek csak az antigén prezentáló sejtek (APC) által feldolgozott, MHC molekulákkal bemutatott peptid antigénekhez képesek csak kapcsolódni. Ezt a korlátozást MHC restrikciónak nevezzük. A prezentált antigén lehet intracelluláris eredető, melyet minden sejt képes bemutatni a saját MHC I molekuláival a CD8 pozitív, citotxikus T-sejteknek. Az extracelluláris antigéneket csak a professzionális antigén prezentáló sejtek képesek bemutatni az MHC II molekuláikkal a CD4 pozitív, helper T-sejteknek. Minden T-sejt csak egyféle antigénre specifikus TCR-t hordoz, melynek variábilis doménje azonban extrémen nagy diverzitású: minden T-sejt klón más epitópra specifikus TCR-t hordoz. Egy egyed T-sejt repertoárja nagyon sokféle antigén felismerésére képes receptorral rendelkezı sejtbıl áll össze. A TCR αβ vagy γδ heterodimer láncokból álló molekula, mely a CD3 molekulával kiegészülve funkcionális TCR komplexet alkot a sejtek felszínén (24) T-sejtek antigén felismerésében résztvevı ko-receptorok A TCR az antigén prezentáló sejtek felületén található MHC molekulák variábilis részében hordozott peptid antigénhez kapcsolódik, mialatt a T-sejt egyéb ko-receptora (CD4 vagy CD8) az MHC molekula konstans részéhez kötıdik (2. ábra). A ko-receptorok (és a TCR is) az immunglobulin szupergéncsaládba tartoznak, amelybe az egymáshoz hasonló, doménes szerkezető molekulákat soroljuk. A domén 110 aminosavból álló építıegység, egy hurok, amelyet diszulfid-híd tart össze. 12

13 2. ábra Az antién prezentáló sejt (APC) és a T-sejt kapcsolódási pontjai ( Components of the immune system alapján). Az αβ TCR-t hordozó T-sejtek két további csoportba oszthatók funkciójukat és a felszínükön található ko-receptort tekintve. A T-helper sejtek (segítı T-sejtek) CD4 pozitívak, míg a T-citotoxikus sejtek CD8 pozitívak. A perifériás T-sejtek körülbelül 2/3-ad része segítı CD4+ T helper sejt, ugyanakkor a monociták, makrofágok, dendritikus sejtek alacsonyabb denzitásban ugyan, de szintén CD4 pozitívak. A CD4 egy 55 kda nagyságú, általában monomer polipeptid, amelynek négy extracelluláris doménje (D1-D4) van. Az N-terminális doménjével az MHC II molekulák proximális α2 és β2 doménjeivel képes kapcsolódni (25). A TCR-MHCII kapcsolódás fizikai támogatásán túl a CD4 molekula intracelluláris részével a p56lck tirozin kinázon keresztül befolyásolja a CD3 komplex jelátvitelét (26). A CD4 molekula szolgál receptorként a Humán Immundeficiencia Vírus (HIV) pg120 envelop fehérjéje számára (27). A CD8 molekulát αα homodimer, vagy αβ heterodimer láncok alkothatják. Funkciója kettıs: adhéziós molekula és ko-receptor. A citotoxikus T-sejt és az intracelluláris antigénjeit az MHC I molekulával bemutató sejt közötti kötés stabilizálásán túl (az MHC I molekula α3-as doménjéhez kötıdik extracelluláris részével) a felismerési folyamat során 13

14 aktivációs jeleket is biztosít az intracelluláris részéhez asszociált p56lck tirozin kinázon keresztül. Az irodalomban egy harmadik, immunomoduláns funkcióját is leírták az αα homodimer formának: rágcsálók intesztinális intraepitheliális T-sejtjeiben egy MHC-hez hasonló molekulához, a TL (tímusz leukémia antigén) molekulához való kötıdését is leírták (28). 3. ábra. A TCR CD3 molekula komplex szerkezete. A CD3 molekulákon a zöld téglalapok az ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) szakaszokat jelzik, melyeknek a TCR ligand kötést követı jelátvitelében van szerepük (van Oers NS. Semin. Immunol alapján) A CD3 komplex szerkezete és funkciója A TCR rövid intracelluláris szakasza miatt nem alkalmas a jelátvitelre, ezért más molekulák továbbítják a T-sejtnek a TCR antigén kötése utáni jelet. Korán felismerték, hogy a CD3 molekula komplex láncai felelısek ezért a folyamatért. Ezt azok a kísérletek is megerısítették, amelyek szerint a CD3 komplex keresztkötése monoklonális antitesttel T- sejt aktivációhoz vezet (29). A több láncból álló CD3 komplex minden T-sejt felszínén megtalálható a TCR-hoz nem kovalens kötéssel asszociálódva. A CD3-at εδ valamint εγ heterodimerek (nem azonosak a TCR γδ láncaival) valamint a ζ-ζ homodimer vagy ξ,η láncból álló heterodimer alkotja. A γ, δ valamint ε láncok egy extracelluláris doménnel és egy relatíve hosszú intracelluláris szakasszal rendelkeznek, melyen egy ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) szekvencia (YxxLx (6-8) YxxL) található (3. ábra). A ζ láncok 3 ITAM szekvenciát hordoznak intracellulárisan, tehát nagyon nagy a szerepük a TCR antigén kötését követı jelátviteli folyamatokban (30). Az ITAM motívumok tirozinjait különbözı kinázok foszforilálják a jelátviteli folyamatok során, 14

15 melyek így más jelátviteli molekulák dokkolási helyéül szolgálnak. Az ITAM szekvenciák nem T-sejt specifikusak, megtalálhatóak a B-sejt receptor, Fc receptorok és citokin receptorok jelátviteli folyamataiban is. Az ITAM szekvenciáknak sokkal szélesebb körő, nem csak az adaptív immunfolyamatokban van lényeges szerepük, mivel irodalmi adatok alapján részt vesznek a veleszületett immunválasz szabályozásán túl a trombociták aktivációjában, a csont reszorpcióban, sıt a tumorok fejlıdésben is (31) A TCR antigén kötését követı jelátviteli folyamatok A MHC molekulákkal bemutatott antigén kötését követıen a TCR által indukált jelátviteli folyamatok során a különbözı molekulák tirozin foszforilációja a felismerést követıen már néhány másodperccel megfigyelhetı. Ez az aktivációs jel olyan biokémiai eseményekhez vezet, amelyek további protein tirozin kinázok (PTK) foszforizációján keresztül teljesen megváltoztatják a T-sejt metabolizmusát. Két órával az aktivációt követıen a T-sejt az IL- 2 citokin nagy affinitású receptorát már expresszálja, 2-6 órán belül több citokin expressziója beindul, melyet 24 órán belül DNS replikáció követ. 48 órán belül mitózissal osztódik az aktiválódott sejt (32, 33). A TCR antigén kötését követı egyik legkoraibb esemény a CD3 komplex ITAM motívumainak Src (Ross Sarcoma onkogén) családba tartozó kinázok általi foszforilációja. A T-sejtekben leginkább tanulmányozott Src kináz a p56-lck és a p59-fyn, melyek a CD4 / CD8 molekulákkal vagy a CD3 komplexszel asszociálódnak. Annak ellenére, hogy ez a két fehérje szerkezetileg nagyon homológ, a p56-lck a T-sejtek aktivációjában játszik szerepet, míg a p59-fyn pedig a T-sejteknek inhibitoros, anergizáló jeleket ad. Ezen Src kinázok aktivációja még nem teljesen ismert, szükséges hozzá az inhibitoros C-terminális tirozin foszfát csoportok eltávolítása, melyet valószínőleg a CD45 tirozin foszfatázok végeznek (34). Az inhibitoros C-terminális tirozin foszfát csoportok eltávolítása az Src kinázok konformációjának megváltozásához és aktiválódásához vezet (35). Az aktiválódott Src kinázok foszforilálják a CD3 komplex ITAM tirozinjait, majd a ζ -lánc duplán foszforilált ITAM-jához, mint dokkolási helyhez a Syk/ZAP-70 molekulacsaládba tartozó PTK-ok kötıdnek a két SH2 (Src-homology 2) doménjükkel. A Syk/ZAP-70 TCR/CD3 komplexhez kapcsolódása és Src általi foszforilációja mindkét kináz család 15

16 kombinált aktivációjához vezet, mely további effektor molekulák (pl. LAT, SLP-76, vav és PLCγ-1) foszforilációjához és aktivációjához vezet (4. ábra, 36). 4. ábra. A TCR molekula komplex ITAM motívumainak protein tirozin kináz aktivációjának modellje (van Oers NS. Semin. Immunol alapján). Az adapter fehérjék olyan molekulák, melyeknek nincs saját enzimatikus aktivitásuk, de a jelátviteli folyamatokban úgy vesznek részt, hogy kötıhelyeik révén elısegítik különbözı jelátviteli molekulák interakcióját. A T-sejtek jelátviteli folyamataiban szerepet játszó legfontosabb adapter fehérjék a LAT (linker for activation of T cells), az SLP-76 (SH2 domain leukocyte protein, 76kDa), a Grb-2 (Growth factor receptor bound protein) és a Gads (Grb2-releated adapter downstream of Shc). A LAT egy transzmembrán glikoprotein, mely a TCR stimulációt követıen intracelluláris részén erısen foszforilálódik, fıleg a ZAP-70 PTK (ζ lánc asszociált protein tirozin kináz, 70kDa) által. A foszforilált LAT dokkolási helyet biztosít a PLCγ-1 és a Grb2, illetve a Gads adapter fehérjéknek. Fontos, hogy a LAT rendelkezik egy palmitoil lánccal, amely lehetıvé teszi a lipid raftokban történı koncentrációját is. Az aktivált PLCγ-1 hidrolizálja a plazmamembrán belsı lemezében található PIP2 (foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát) molekulát IP3 és DAG (diacyl-glycerol) molekulákká (5. ábra, 37). Ezek a másodlagos messengerek felelısek a PKC aktiválásán keresztül az intracelluláris szabad Ca ++ szint növekedéséhez, illetve az IκB molekula foszforilációjához vezet. A kalcium jel a foszfatáz calcineurin aktiválását okozza, amely az IL-2 gén transzkripciójában kulcsszerepet játszó NF-ATc (nuclear factor of activated T cells) 16

17 transzkripciós faktorra hat. A foszforilálódott IκB nem gátolja tovább az NFκB-t mőködésében, így az kifejtheti apoptózist gátló és proliferációt serkentı hatását. 5. ábra. A LAT adapter fehérje szerepe a TCR antigén kötését követı jelátviteli folyamatokban. Dokkolási helyet biztosít a PLCγ-1-nek, illetve annak aktiválásában szerepet játszó Gads, SLP-76, illetve Itk molekuláknak és így segíti elı a TCR komplex jelét követı intracelluláris Ca ++ szint növelést, továbbá Grb2 és SOS kötésen keresztül a Ras és ERK aktivációhoz is hozzájárul (van Oers NS. Semin. Immunol alapján). A TCR antigén kötését követıen a GTP (Guanosine-5'-triphosphate) kötı, aktív p21 Ras gyorsan akkumulálódik a T-sejtek membránjában. A Ras kulcsszerepet játszik a citokin gének expressziójának szabályozásában, különösen az IL-2 promoterének aktiválásában és a T-sejtek proliferációjában (38), A Ras számos úton aktiválódhat T-sejtekben, ezek közül az egyik jól definiált lehetıség a LAT-on kötıdı Grb2 adapter fehérje és annak SOS (Sonof-sevenless) molekulával történı komplex képzésén keresztül történik. Az aktivált Ras a MAPK (ERK) kaszkád aktiválásában is fontos. Az optimális T-sejt aktiváció számos ko-receptor és adhéziós molekula együttmőködését igényli, melyek stabilizálják az APC és a T-sejt közötti kapcsolatot (immunológiai szinapszis), és amelyek fontos ko-stimulációs jeleket is szolgáltatnak (pl. CD28 molekula Jnk/Jun kinázok aktivációja, 6. ábra). Ez a két sejt közötti kapcsolódási pont a T-sejt membrán belsı oldalán számos jelátvivı molekula meghatározott minta szerinti összegyőlését jelenti: SMAC (supramolecular activation cluster). A SMAC kialakulásának folyamatában szerepet játszanak a kortikális citoszkeleton aktin molekulái és a lipid raftok. A lipid raftok olyan gliko-szfingolipidekben és koleszterinben gazdag membrán 17

18 mikrodomének, melyek alacsony koncentrációjú anionos detergensben 4 C-on oldhatatlanok. Acetilált, mirisztilált és glikofoszfatidil-inozitol kapcsolt proteinek lehorgonyzódását teszik lehetıvé, mely proteinek így készen állnak például jelátviteli folyamatokban való részvételre (39). 6. ábra. A T-sejtek antigén hatására beinduló jelátviteli folyamatai (Kuby: Immunology 4. kiadás alapján). 1.6 A GLUKOKORTIKOID HORMON A szteroid hormonok közé tartozó glukokortikoidok számos létfontosságú biológiai folyamatot regulálnak, és a T-sejtek differenciálódásában, aktivációjában, túlélésében és apoptózisában is fontos szerepet játszanak (40). Régóta ismert, hogy egy nagyobb stresszhelyzetben a megnövekedı GC szint hatására a tímusz nagymértékő involúcióval reagál (41), s a hosszan vagy nagy dózisban adott szteroidok immunszupresszív és gyulladásgátló hatását is már hosszú ideje kihasználják a medicinában (42). A szintetikus 18

19 GC-ok erıs gyulladásgátló és immunszupresszív, limfocita apoptózist kiváltó hatásuk miatt világszerte a leggyakrabban rendelt gyógyszerek közé tartoznak. Egy dogma alakult ki, amely kiemeli a GC-ok immunszupresszív szerepét, ugyanakkor figyelmen kívül hagyja azt a tényt, hogy fiziológiás koncentrációtartományban nem csak szupresszáló, de stimuláló szerepe is van az immunfunkciókban. A GC-oknak az immunrendszer befolyásolásán kívül azonban számos más élettani hatásuk is van. Elsısorban a szénhidrát anyagcserét befolyásolják, de hatással vannak a zsír és fehérje metabolizmusra is: emelik a vércukorszintet, csökkentik a fehérjék szintézisét és fokozzák lebontásukat, mobilizálják a zsírt és nagyobb adagban huzamosabb ideig adva a Cushing szindrómának megfelelı módon átrendezik a szervezet zsíreloszlását ( 43 ). Adagolásuk leggyakoribb okai a szekunder osteoporosisnak (44). A tímusz kortiko-epitheliális sejtjei helyben is képesek a glukokortikoid termelésre (45), így a glukokortikoidok parakrin módon is hathatnak a timocitákra, és fontos szerepük van a timociták érésének szabályozásában A glukokortikoid receptor A szteroid receptorok a ligand által indukálható transzkripciós faktorok szupercsaládjába tartoznak. Az alacsony GC hormon szintnél bekövetkezı genomikus hatásokért felelıs receptor (GCR) mellett ide tartozik az ösztrogén receptor, az androgén receptor, a progeszteron receptor, D3 vitamin, a tiroid hormon, a retinolsav receptora és számos árva receptor, mint például a Nurr77 (46). 7. ábra. A szteroid receptorok általános szerkezeti felépítése. A rövidítések magyarázatát lásd a szövegben. Ezek a receptorok azonos szerkezeti egységekbıl épülnek fel: egy nagyon konzervált, centrális elhelyezkedéső, cink-ujj DNS kötı doménbıl (DBD), egy kevésbé konzervált C- terminális ligand kötı doménbıl (LBD), és egy legkevésbé konzervált N-terminális 19

20 doménbıl (NTD, 7. ábra). Az NTD receptor típusonként eltér, de közös egy, a DBD doménhez közel esı része, amely gazdag negatívan töltött aminosavakban. Ezt a régiót AF-1 (activation function 1) vagy tau-1 néven ismerjük, és transzkripciót módosító hatása ligand independens (47); szerepe az alap transzkripciós enzimekkel történı kapcsolat létrehozása. Az AF-1 régióhoz közel esı DBD két cink-ujjakat alkot, melyek háromdimenziós szerkezete lehetıvé teszi a GCR DNS-hez történı kötıdését. Az N- terminális cink ujj választja ki a megfelelı helyet a DNS kötıdéshez, a C-terminális pedig a receptor dimerizációban fontos (48). A DBD mellett egy variábilis hinge régió (H) található, mely tartalmaz egy konstitutív nukleáris lokalizáló szekvenciát (NL1). A H régió lehetıvé teszi a receptor meghajlását, konformáció változását. A GR C-terminális végén található LBD nem csak a hormon kötéséért felelıs, hanem a Hsp90 (hı sokk fehérje, 90 kda) molekula kötését lehetıvé tevı szekvenciát is tartalmaz. Bár a szteroid receptorok többsége a magban tartózkodik, ligandkötés nélkül a GCR a citoszolban található különbözı hısokk proteinekkel (hsp90, hsp70, hsp56) és immunofillinekkel (FKBP52, FKBP51, Cyp40 és PP5) komplexet alkotva. A GCR-Hsp90 kapcsolódás a receptor megfelelı konformációjának a kialakításán túl ligand kötés hiányában megakadályozza a receptor DNS-hez történı kapcsolódását, illetve elfed egy második nukleáris lokalizációs szekvenciát (NL2). GC hormon kötés hatására a GCR disszociálódik a hısokk proteinektıl, dimerizálódik a receptor illetve feltárul az NL2 szignál szekvenciája, melynek hatására a magba transzlokálódik (49). Található egy második aktivációt segítı domén (AF-2) is az LBD-ben. Az AF-2 ligand kötést követıen konformációs változáson esik át és így lehetıvé válik a különbözı ko-aktivátorral vagy korepresszorral történı interakciója. A nukleuszban a receptor homodimerként specifikus DNS szakaszokhoz (glukokortikoid responsive elements, GRE) kötıdik, melyek specifikus, erısen konzervált palindrom DNS szekvenciák (GGRACAnnnTGTTCT, 50). A kötıdés után elısegíti, vagy gátolja a megfelelı gének transzkripcióját: a GCR tehát egy ligand dependens transzkripciós faktor (8. ábra). A GC hormon hatása a klasszikus, genomikus úton a következı képpen zajlik le: A GCR ligand kötést követıen importinok segítségével bekerül a sejtmagba, és immunszupresszív 20

21 gének (pl. IkB, annexin-1, mitogén aktivált protein kináz (MAPK) foszfatáz 1, és IL-10) transzkripcióját serkenti pozitív GRE-khez (pgre) történı kötıdése után (9. ábra A, 51). 8. ábra. A GCR klasszikus, genomikus hatásmódja (Löwenbert et al. Trends in Molecular Medicine alapján). Ezen kívül a GC-GCR komplex gyulladásos proteinek génjének átíródását (pl. IL-1, IL-2) gátolni is tudják a negatív GRE-khez (ngre) történı kötıdést követıen (direkt transzrepresszió, 9. ábra B, 52). Mindezeken túl a GCR közvetítette transzkripció befolyásolás kialakulhat direkt protein-protein interakciók során, amikor GCR proinflammatórikus transzkripciós faktorokkal kerül kapcsolatba, mint például az AP1 (aktivátor protein 1), az NF-kB (nukleáris faktor-kb), az NFAT, vagy a STAT (signal transducers and activator of transcription), és ezek hatását gátolva indirekt transzrepresszióval gátolják az általuk szabályozott gének átíródását (9. ábra C). A hatás órák vagy napok alatt fejlıdik ki, mivel gének transzrepressziójának következtében RNS és fehérje degradáció, illetve az aktiválódás után mrns és proteinek szintézise szükséges hozzá. 21

22 9. ábra. A GCR genomikus hatásának lehetséges mechanizmusai. Különbözı gének átíródását serkenti a pgre-hez kapcsolódó ligand kötött, dimerizálódott GCR (transzaktiváció, A). A ngre-hez kötıdve gátolhatja bizonyos gének átíródását (direkt transzrepresszió, B). Pro-inflammatorikus transzkripciós faktorokkal kölcsönhatásba lépve gátolhatja azok hatását (indirekt transzrepresszió, C) (Löwenbert et al. Trends in Molecular Medicine, alapján) A glukokortikoid különbözı hatásmódjai Noha sokrétő hatása jól ismert a GC hormonoknak, a hatásmechanizmusuk még mai is a kutatások elıterében van. A GCR-rıl nagyon sokáig azt gondolták, hogy csak egy ligand indukálta transzkripciós faktor, és a citoszolban inaktív, a nem-genomikus hatásokban azonban ennek a formának is szerepe van (10. ábra A). A klasszikus, lassú, genomikus hatásmódon túl sok adat áll már rendelkezésre a sokkal gyorsabb, percek alatt kifejlıdı glukokortikoid hormon hatásokról. Mivel ezek a nagyon sokrétő hatások sokkal gyorsabbak annál, minthogy gének aktivációján vagy elnyomásán alapulhatnának. Nem-genomikus hatásoknak hívjuk ıket, hogy megkülönböztessük ıket a klasszikus hatásoktól. Bizonyították, hogy a glukokortikoidok nagyon rövid idı alatt (<30 perc) alatt gátolja a fagocitózist és a szuperoxid-anion termelést rágcsáló peritoneális makrofágjaiban (53). A glukokortikoidok szintén gyorsan hatnak a különbözı jelátviteli utak aktivitására: in vitro GC kezelések hatására gyors biokémiai változásokat találtak, melyek az intracelluláris Ca ++ szintet, másodlagos messengerek szintjét, illetve különbözı jelátviteli fehérjék foszforilációját (pl.: MAPK, annexin-1, phospholypase A2) érintették (54). Preklinikai és klinikai megfigyelések szerint a GC homron kardioprotektív hatását gyors, nem-genomikus mechanizmussal váltja ki, mivel túl gyorsan alakul ki és nem lehet transzkripció gátlóval megakadályozni a kifejlıdését (55). Hasonló, nem-genomikus hatásmódú neuroprotektív hatásról számoltak be nagy dózisú GC kezelés után cerebrális ischaemiás modellben (56). 22

23 A jelenlegi eredmények szerint tehát három különbözı, dózistól függı úton tud a GC hatni. A legrégebb óta és legjobban ismert a kis hormonkoncentrációnál (10 12 mol/l) mőködı genomikus vagy nukleáris hatás 1, mely a GCR-en keresztül zajlik le, és legalább 30 perc kell a kialakulásához. Ismertek még a receptor mediált, nemgenomikus molekuláris interakciók 2, melyek a citoplazmában található egyéb jelátviteli folyamatok és a citoplazmáris vagy membrán asszociált GCR közötti interakciónak köszönhetı. Ez a folyamat sokkal gyorsabban lezajlik, mivel nincs szükség hozzá génátíródásra, fehérjeszintézisre, mint az elızı formánál. Ezek a hatások 10 9 mol/l-nél nagyobb koncentrációjú GC szintnél figyelhetıek meg, és perceken belül bekövetkeznek. Ennél is nagyobb koncentrációnál (10 4 mol/l felett) másodperceken belül bekövetkeznek a nem receptor mediálta, fizikokémiai hatások 3 (57) Membrán GCR szerepe Növekvı mennyiségő adat győlik fel az intracelluláris szteroid receptorok plazmamembrán asszociált formájáról: olyan membrán kötött aldoszteron receptort mutattak ki simaizom sejtek és limfociták felszínén, amely Ca ++ jelet, IP3 és PLC aktivitás tudott kiváltani (58). Hasonló membrán GCR-t mutattak ki egér limfóma sejteken (59), patkány májsejteken és mononukleáris sejteken (10. ábra B, 60). 10. ábra. Nem-genomikus GC hatások. A gyors GC hatások (transzmembrán folyamatok változása, foszforilációs események és kálcium szint változás) kialakulhatnak specifikus citoplazmáris GCR (cgcr, A), illetve membrán asszociált GCR (mgcr, B) közvetítésével, illetve nem specifikus módon, a sejtmembránban oldódó GC-k direkt hatásaként (C) (Löwenbert et al. Trends in Molecular Medicine, alapján). 23

24 Magas GC koncentrációnál nem receptor közvetített hatások is megfigyelhetıek. Ezek mechanizmusára a legegyszerőbb magyarázat, hogy a glukokortikoidok beleolvadnak a membránokba és módosítják azok fluiditását, s így megváltoztatják a rajtuk keresztül folyó iontranszportot és biokémiai mechanizmusokat (10. ábra C). 1.7 TIMOCITÁK APOPTÓZISA A tímuszban a T-sejt fejlıdés során a nem funkcionális T-sejt receptorral rendelkezı, illetve a potenciálisan autoreaktív timociták nem kerülhetnek ki a perifériára, ezért még a csecsemımirigyben eliminálódnak. A periférián az érett, naiv T-sejtek a megfelelı antigén felismerése után klonális aktiváción és expanzión mennek keresztül. Amint a felismert antigént sikerül kiüríteni a szervezetbıl, a felesleges limfociták az ún. aktiváció indukálta sejthalál (AICD) folyamat során távolítódnak el. Tehát mind a T-sejt fejlıdésben, mind a T-sejt mediálta immunfolyamatokban nagyon fontos szerepe van a programozott sejthalálnak, vagy más néven apoptózisnak (61). Az apoptózis egy olyan szigorúan szabályozott folyamat, amely proteolítikus folyamatok sorozatából áll, a sejtek jellegzetes morfológiai elváltozásai kísérik, és végsı soron a sejt halálához vezet. A limfocitákban a programozott sejthalál több útvonalon keresztül vezethet a sejtek halálához (11. ábra). Az ún. intrinsic útvonalnál a sejtet érı stressz vagy a timociták negatív szelekciója során a TCR nagy affinitású ligand kötése a kiváltó ok. A folyamatban a Bcl-2 család pro- és anti-apoptotikus fehérjéi vesznek részt, melyek végsı soron a mitokondriumok külsı membránjának tönkremenetelét és Cytochrom C kiáramlást okoznak. A stimuláló jeleket a pro-apoptotikus BH3-only fehérjék, mint pl. a Bim, Bid, Bad, Puma és Noxa közvetítik a multidoménes családba tartozó Bax és Bak fehérjéken keresztül a mitokondriumhoz. A fenti folyamatot gátolja az anti-apoptotikus Bcl-2 és Bcl-xL fehérje azáltal, hogy a megfelelı pro-apoptotikus párjához kötıdik és neutralizálja. A mitokondrium külsı membránjában a Bax és Bak fehérjék pórusokat alkotnak, melyen keresztül Cytochrom C kiáramlást váltanak ki, amely apoptotikus testek kialakulásához vezet. Ez egy multimer komplex, amely Caspase-9-et és Apaf 1-et is tartalmaz. Az apoptotikus testek Caspase-3 aktiváción keresztül vezetnek a sejt halálához (62). 24

25 11. ábra. A limfociták apoptózisának fıbb útvonalai. Az intrinsic útvonalon a BH3-only molekulák (Bad, Bim, stb.) aktivációján keresztül a multidoménes Bax és Bak aktivációhoz vezetnek. Ez a mitokondriumokból történı Cytochrom C kiürüléshez, az apoptotikus testek kialakulásához és Caspase-3 aktivációhoz vezet. A folyamat gátolható az anti-apoptotikus Bcl-2 és Bcl-xL fehérjékkel. Az extrinsic útvonalon a halálreceptorok oligomerizációja és Caspase-8 aktiváció szintén Caspase-3 aktivációjához vezet. Alternatív utat jelent a lizoszómákból történı Cathepsin kiürülés, mely szintén Caspase-3 aktivációt és sejthalált okoz (Herold MJ et al. Cell. Mol. Life. Sci alapján). Az apoptózis extrinsic útvonalát halál receptorok (mint pl. a Fas) ligációja, oligomerizációja és aktivációja indítja el (63). Ennek következtében Caspase-8 aktiváció figyelhetı meg, amely sejttípustól függıen direkt, vagy a pro-apoptotikus Bid aktivációját és mitokondrium funkciókárosítást magába foglaló erısítés után vezet Caspase-3 aktivációhoz és sejthalálhoz. A fenti két útvonallal lehet magyarázni a különbözı sejttípusokban megfigyelhetı apoptotikus folyamatok zömét, azonban alternatív útvonalak létezését is egyre több információ támasztja alá. Az egyik ilyen alternatív apoptotikus útvonal például a lizoszómák membrán destabilizációján keresztül Cathepsin B és D citoplazmába történı kiáramlását jelenti. Ez nem csak generalizált proteolízist okoz a citoplazmában, de 25

26 mitokondriumok külsı membránját is károsíthatja és Caspase-3 aktivációhoz is vezethet (64). Egy másik ilyen nem konvencionális útvonalat jelenti a mitokondriumokból felszabaduló halál-induláló faktorok (mint pl. AIF, és endonukleáz G), amelyek kaszpáz independens módon tudnak sejthalált okozni (65) T-sejt receptor mediálta apoptózis A TCR komplexen keresztüli aktiváció naiv T-sejteknél a sejt aktivációjához vezet, ugyanakkor ez a stimuláció timocitákban és aktivált érett T-sejteknél apoptózist okoz. Irodalmi adatok alapján a pozitív és a negatív szelekció eltérı jelátviteli útvonalakkal jellemezhetı. A TCR-k pozitív szelekciót eredményezı alacsony affinitású ligand kötése részleges LAT foszforilációt vált ki, amely a PLCγ 1 Gads/Slp76/Itk komplexen át a PLCγ 1 aktivációjához és következményes DAG képzıdéshez, illetve Ca 2+ felszabaduláshoz vezet. Ezzel ellentétben a TCR-k negatív szelekciót kiváltó magasaffinitású ligand kötése hatására a LAT teljes mértékben foszforilálódik, ami azután a Grb2/SOS1 kapcsolódáson át a MAP kináz kaszkádon halad tovább (11). Ras/MEK-1 kettıs mutáns egértörzsekkel végzett kísérletek szerint a MAP kináz kaszkád funkcionálása létfontosságú a timociták túlélésében, de nem szükséges az apoptózisukhoz (66). TCR transzgenikus AND egerekkel végzett in vitro kísérletek szerint a PKC aktivitása szükséges az éretlen timociták apoptózisához. A calcineurin szerepe azonban nem teljesen tisztázott, valószínőleg a TCR aktiváció erısségétıl függ (csak alacsony antigén koncentrációnál volt szerepe, 67, 68). A Nurr77 DNS kötı doménjének szekvencia homológiája alapján a nukleáris szteroid receptorok családjába tartozó fehérje, melynek nem ismert a ligandja ( orphan receptor). A Nurr77 családba tartozik még a Nurr1 (Not-1) és a Nor-1 (MINOR) fehérje, melyek DNS kötı doménjükben nagyon nagy homológiát mutatnak a Nurr77-el. A Nurr77 fehérje nyugvó T-sejtekben alig detektálható, míg TCR stimulust követıen elhúzódó, magas expresszió figyelhetı meg. A Nur77 a többi szteroid receptortól eltérıen monomer formában is képes DNS kötésre az NBRE (NGFI-B responsive element) szekvenciánál (5 - AAAGGTCA-3 ). A Nurr77 NBRE-hez történı kötıdése korrelált T-sejtek apoptózisának mértékével (69). Nurr77 domináns negatív fehérjét expresszáló transzgenikus egérben nem befolyásolt a T-sejt érés. TCR transzgenikus egerekben azonban a Nurr77 domináns 26

27 negatív fehérje expressziója megakadályozta a DP sejtek apoptózisát. A gátlás azonban nem teljes, amely arra utalhat, hogy más úton is kialakulhat az apoptózis a DP sejtekben (70). Ezzel szemben a teljes hosszúságú Nurr77 vagy Nor-1 gén konstitutív expressziója masszív timocita apoptózishoz és csökkent perifériás T-sejt számhoz vezet transzgenikus egerekben (a Nurr1 konstitutív expressziója azonban nem okozott apoptózist). A transzgenikus, masszív apoptózist mutató egerek timocitáiban megnıtt a FasL expressziójának a szintje. A FasL expresszió azonban nem a transzgenikus timociták apoptózisának fı oka, mivel mutáns FasL mellett is kialakul a sejthalál (71). A TCR aktivációt követı azonnali-korai transzkripciós faktor aktivációt a tumor necrosis factor (TNF) receptor családba tartozó számos membránfehérje expressziója követi. Számos, ebbe a családba tartozó fehérjérıl (Fas, TNF receptor I típus, CD30) gondolják, hogy részt vesz a timociták apoptózisában Glukokortikoid hormon indukálta apoptózis A XIX. század vége óta ismert, hogy mellékvesekéreg-elégtelenségben szenvedı vagy adrenalectomián átesett állatok tímusza hypertrophiás, illetve a stressz vagy gyógyszer elıidézte tímusz involúciót meg lehet elızni adrenalectomiával. Késıbb rájöttek, hogy ACTH adással egérnél jelentıs tímusz- és nyirokcsomótömeg csökkenést lehet elérni. Az erıteljes kutatások ellenére a GC hormon apoptózist kiváltó mechanizmusai még ma is jórészt ismeretlenek. A jelenlegi modell szerint a glukokortikoidok apoptózist kiváltó hatásához szükséges a funkcionáló GCR és annak genomikus transzaktiváló hatása, néhány jelenség azonban nem-genomikus GCR hatást is feltételez (12. ábra, 72). A DP timociták nagyon érzékenyek a GC-mediálta apoptózisra és még az a fiziológiás GC koncentráció is elég lehet bennük a programozott sejthalál kiváltására, amely egy erısebb stresszre adott válasz során alakul ki. A nyugvó perifériás T sejtek azonban összehasonlíthatóan rezisztensebbek a GC indukálta sejthalálra. Az eltérı viselkedés okának a Bcl-2 expresszióban való különbözıség tőnik: az egyszeresen pozitív timocitákban és a perifériás T sejtekben megtalálható, míg az elıalakokban alacsonyabb expressziójú. 27

28 12. ábra. A GC indukálta apoptózisban szerepet játszó sejtfolyamatok. Anti-apoptotikus Bcl-2 családba tartozó fehérjék downregulációja, illetve a pro-apoptotikus BH3-only családba tartozó Bim és Puma fehérjék aktivációja; Caspase-ok: Caspase-3, 8 és 9 aktiváció; lizoszómák: Cathepsin B kibocsátás; Proteoszomális degradáció: c-iap1 és XAP fehérje szintő degradációja; H2O2 szint megemelkedik; Ceramidok termelıdnek; Na+/K+ szintek módosulnak; IP3-receptor bevonódik; Kinázok: PKC, Raf fehérjék GCR-rel történı együttmőködése (Herold MJ et al. Cell. Mol. Life. Sci alapján). A glukokoritokoidok és más szteroid hormonok, illetve a tiroid hormon receptorát számos sejttípusban ki tudták mutatni a mitokondriumokban is. Eredményeik szerint a mitokondriumba transzlokálódó GCR-nek szerepe lehet a GC által indukált apoptózis kialakulásában (73). A mitokondriumokat alkotó fehérjék egy része eltérı az egyes sejttípusokban, és ezen a különbségen múlik, hogy a mitokondriumokat érı számos endogén és exogén szignál apoptózist vagy a sejt túlélését fogja jelenteni (74). A GC-k az epitheliális eredető sejteket például az emlı mirigysejtjeit, a májsejteket megvédi az apoptózistól, míg a haematopoetikus sejteknél általában apoptózist okoznak. Különbözı T- sejt vonalakkal végzett kísérletekben Sionov és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy a szteroid rezisztens sejtvonalakban a GCR nem transzlokálódott a mitokondriumokba, míg az érzékenyekben igen, sıt a GCR mitokondriális lokalizációs szekvenciával történı összekapcsolása apoptózishoz vezetett (75) Kölcsönös antagonizmus modell A DP timociták a T-sejt fejlıdés egy fontos ellenırzési pontját jelentik, ahol a funkcióképtelen és az autoreaktív T-sejtek kiszelektálódnak és apoptózissal elpusztulnak. A pozitív és a negatív szelekció modelljeiben a TCR ligand kötésének affinitása által meghatározott jelátviteli folyamatok határozzák meg a timociták sorsát. A kölcsönös 28

29 antagonizmus modell szerint viszont a GC és TCR indukálta apoptotikus útvonalak közötti kölcsönhatások során dıl el a sejt apoptózisa vagy életben maradása (76, 77). A pozitív szelekció során mind a TCR/CD3-komplexen keresztül jövı, mind a GC hatására kialakuló szignál apoptózishoz vezet, ha egyedül jelentkezik (78). A timociták szelekciós lépései során azonban a kölcsönös antagonizmus modell szerint (79) mind a lokálisan termelıdı GC hormonnak, mind az antigén prezentáló sejthez való kötıdés során a TCRon keresztül kapott jel, ha egyszerre éri a DP timocitát, az nem fog apoptózissal elpusztulni, hanem túlél. Ugyanezzel a kölcsönös antagonizmus modellel írható le különbözı citokinek és a glukokortikoid hormon együtthatását leíró megfigyelések is (80). 29

30 2 CÉLKITŐZÉSEK 1. BALB/c és AND TCR transzgenikus egértörzs tímuszában a timocita alcsoportok arányának nyomon követése in vivo glukokortikoid hormon és antigén, illetve anti- CD3 kezelések hatására. Egyszeri glukokortikoid kezelés tímusz sejtes összetételére gyakorolt hatásának idıbeli nyomon követése. 2. Az egyes timocita alcsoportok GCR expressziós szintjének meghatározása BALB/c és AND TCR transzgenikus egértörzsben. A GCR expresszió változásának vizsgálata T-sejt aktiváció, GC hatás, illetve GC antagonista kezelések után. 3. GCR indukálta jelátviteli utak in vivo GC antagonista elıkezeléssel történı gátlásának hatása a tímusz sejtes összetételére. 4. In vivo TCR jelátviteli út és GC kezelés hatására kialakuló korai és késıi apoptotikus sejtek arányának meghatározása, valamint a pro-apoptotikus mitokondrium-funkció változás, caspase-3 aktiváció illetve az anti-apoptotikus Bcl- 2 fehérje expressziójának vizsgálata. 5. Glukokortikoid hormon timociták túlélésére kifejtett hatásásnak in vitro vizsgálata tímusz szövet és timocita sejtkultúrában GCR antagonisták és GC hormon szintézis gátló jelenlétében. 6. TCR aktiváció, és GC kezelés hatására kihatás, illetve GC antagonista kezelések következtében aktiválódó CD69+ sejtek arányának vizsgálata BALB/c és AND TCR transzgenikus egérmodell timocitáinak felhasználásával. 30

31 3 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1 EGÉR MODELLEK Kísérleteinkhez 4 hetes Balb/C (Charles Rives) egereket és 4 hetes B10.Cg-TgN (TcrAND)53Hed (AND) galamb cytochrome C (PCC) specifikus I-E k (MHC-II) restrikcióval rendelkezı Vβ3/Vα11 T-sejt receptor transzgenikus egereket (AND) [Dr. Szondi Zsuzsanna {Debreceni Egyetem} ajándéka] használtunk (81). Mindkét egértörzsnél az egerek átlagos testtömege 8-10g körül volt. Kísérleti állatainkat az elıírásoknak megfelelı körülmények között tartottuk, kereskedelmi forgalomban kapható egér táppal etettük és megfelelı mennyiségő vízzel láttuk el. A kísérletes munkák megfelelnek a Pécsi Tudományegyetem Állatetikai Bizottsága által megállapított szabályoknak. 3.2 VEGYSZEREK ÉS PUFFEREK Kísérleteinkben az állatok oltásához a következı vegyszereket használtuk: DX (Oradexon, Organon Oss Holland, 4mg/ml törzsoldat), RU486 (Sigma) és RU43044 glukokortikoid antagonisták (Szekeres Barthó Júlia {PTE OEKK KK Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet} ajándéka), galamb citokróm C (PCC, Sigma). Az állatok oltásakor a vegyszerek higításához, az eltávolított timociták mosásához phosphate buffered saline-t (PBS) illetve az RU486 és RU43044 hígításához szezámolajat használtunk. Az apoptózis korai detektálását FITC konjugált Annexin V-tel (BD Pharmingen, CA) és propidium jodiddal (PI, Sigma) végeztük. A sejtfelszíni jelöléseket kötı pufferben végeztük (0,1% NaN 3, 0,1% BSA (Sigma) tartalmú PBS). Az intracelluláris jelöléshez a sejtek fixálása 4% paraformaldehid (PFA) tartalmú PBS-ben történt (fixáló oldat). Az intracelluláris jelölés permeabilizáló puffere 0,1% NaN 3, 0,1% BSA és 0,1% saponin tartalmú PBS volt. A korai apoptotikus sejtek detektálásáhız Annexin V-FITC-et (PharmMingen) használtunk, melyet Annexin-kötı pufferben (10mM HEPES/NaOH, ph 7,4, 140 mm NaCl és 2,5 mm CaCl 2 ) oldottunk. A mitokondrium membránpotenciál vizsgálatához a sejteket RPMI médiumban (Sigma) inkubáltunk CMX-Ros festék (Molecular Probes) jelenlétében. 31

32 3.3 MONOKLONÁLIS ANTITESTEK Kísérleteinkben aktiváló hatású hörcsög anti-egér CD3 (NIH clone# 145.2C11) antitesttel in vivo oltottuk egereinket (i.v. 50µg/állat 100µl PBS-ben). A timociták in vitro jelölésére a következı monoklonális antitesteket használtuk: phycoerythrin (PE) konjugált patkány anti-egér CD4 (clone# L3T4, BD Pharmingen, CA), CyChrome (CyC) konjugált patkány anti-egér CD8 (clone# Ly-2, BD Pharmingen, CA), FITC konjugált hörcsög anti-egér CD69 (clone# HI.2F3, Serotec), FITC konjugált egér anti-gcr (clone# 5E4B1, saját laboratórium) (82), FITC konjugált hörcsög anti-egér Bcl-2 (clone# 3F11 BD Pharmingen, CA) FITC konjugált nyúl anti-(humán, egér) aktív Caspase-3 (clone# C BD Pharmingen, CA). 3.4 ÁLLATOK OLTÁSA ÉS TIMOCITA PREPARÁLÁS Kísérleti állatainkat intraperitoneálisan oltottuk magas dózisú (20,0 illetve 10,0 mg/testtömeg kg), közepes dózisú (2,0 mg/kg), és alacsony dózisú (1,0 illetve 0,2 mg/kg) DX-al önmagában vagy az egyéb kezelésekkel kombinációban. A GCR kompetitív antagonistáinak tekintett RU486 vagy RU43044 vegyületeket 1 mg/testtömeg kg szezámolajban hígítva alkalmaztuk intraperitoneális oltásként. Az AND egereket 2 napig oltottuk naponta intraperitoneálisan 10 mg/testtömeg kg PBS-ben higított PCC-vel. A Balb/c egerek intravénásan kaptak 5 vagy 50 µg/állat (magas dózisú) aktiváló hatású anti- CD3 monoklonális antitestet önállóan vagy kombinációban DX-al. A timocita preparálást Compton és Cidlowski módszere szerint végeztük (83) röviden: az egerek gyors dekapitálása után a tímuszokat eltávolítottuk és hideg PBS oldatba helyeztük. A tímusz szövetét üveg-üveg homogenizátorral homogenizáltuk és a szuszpenziót nylon vattán átszőrtük. A sejteket megmostuk PBS-ben és az élı timocita számot Bürker kamrában meghatároztuk Trypán kék festékkizárásos teszt segítségével. 3.5 TIMOCITÁK CMX-ROS FESTÉSE A mitokondriumok funkcionális aktivitásának mérését a Mito Tracker CMX-Ros festék segítségével végeztük (84). A CMX-Ros egy lipofil fluoreszcens festék, amely az aktív mitokondriumokban felhalmozódik azok negatív membránpotenciálja miatt. Az élı sejtek ezért CMX-Ros festékkel intenzíven festıdnek, s mivel az apoptotikus sejtek elveszítik a 32

33 mitokondriális membránpotenciáljukat, nem festıdnek (85). A 10 millió sejtet 30 percen át inkubáltuk 0,1µg/ml CMX-Ros festék tartalmú RPMI médiumban, majd a sejteket mosás után összegyőjtöttük és sejtfelszíni jelölést követıen áramlási citométerrel analizáltuk az eredményeket (86). 3.6 TIMOCITÁK SEJTFELSZNI JELÖLÉSE A sejtfelszíni jelölésekhez 1 millió élı timocitából indultunk ki, melyeket 100µl kötı pufferben 30 percig inkubáltuk jégen 1µg/ml koncentrációjú ani-cd4-pe és anti-cd8- CyChr, anti-cd69-fitc fluoreszcens monoklonális antitestekkel. Az inkubáció után 2- szer mostuk a PBS pufferben, majd 500µl fixáló pufferben vettük fel a sejteket (Current protocols in Immunology chapter 5.4). 3.7 TIMOCITÁK INTRACELLULÁRIS JELÖLÉSE Az intracelluláris jelölésekhez a sejtfelszíni jelölések után fixáló oldatban (4% paraformaledehid (PFA) tartalmú PBS) 20 percig fixáltuk a sejteket. Ezután kétszer megmostuk a timocitákat PBS-ben majd 100µl permeabilizáló pufferben felvettük a sejteket és fénytıl elzárva, jégen 30 percig végeztük az anti-bcl-2-fitc, anit-akitvált Caspase-3-FITC, anti-gcr-fitc fluoreszcens festékekkel konjugált monoklonális antitestekkel a jelöléseket. Az inkubáció végén kétszer mostuk a sejteket permeabilizáló pufferben, majd egyszer kötı pufferben. A jelölés végén 500µl fixáló pufferben vettük fel a sejteket és a mérés kivitelezéséig abban tároltuk azokat (Current Protocols in Immunology chapter 5.6). 3.8 TIMOCITÁK INTRACELLULÁRIS SZABAD KÁLCIUMSZINTJÉNEK MEGHATÁROZÁSA Az intracelluláris szabad kálciumszint meghatározásához a sejteket Fluo-3 AM festékkel töltöttük fel Minta et al. módszere alapján (87). Röviden a következıképpen jártunk el: 10 6 timocitát 100µl 10µM Fluo-3 AM tartalmú szövettenyésztı médiumban inkubáltuk 30 percen át szobahımérsékleten. Ezután a sejtszuszpenziót 10ml RPMI + 10% FCS médiummal hígítottuk és további harminc percig inkubáltuk. Végül a mintákat háromszor mostuk RPMI + 10% FCS médiumban és sejtfelszíni ani-cd4-pe és anti-cd8-cychr jelölés után áramlási citométriás mérést végeztünk. A Fluo-3 AM festék átlagos 33

34 fluoreszcencia intenzitását 526 nm-en (FL1 csatorna) határoztuk meg a különbözı mintákban. 3.9 ANNEXIN V ÉS PI KOMBINÁLT JELÖLÉS Az apoptózis korai jeleinek meghatározásához 10 5 számú élı timocitát 100 µl Annexinkötı pufferben 1mg/ml végkoncentrációjú FITC-el konjugált Annexin V-tel és 0,5 µg PI-al 15 percig inkubáltunk szobahımérsékleten, majd 400 µl Annexin-kötı puffert adtunk a sejtekhez. A sejteket a jelölés után maximum 1 órával áramlási citométer segítségével vizsgáltuk (88) ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁS MÉRÉS ÉS ANALZIS A mintákat FACSCalibur áramlási citométeren (Becton Dickinson, San Jose CA) mértük, az eredményeket a CellQuest program segítségével analizáltuk. A timocitákat a nagyság és granularitás (forvard és side scatter) dot plotokon kijelöltük és a további analíziseket csak ezeken a sejteken végeztük. A kontroll timocitákon felállított kapukat használtuk a kezelt állatok analízisénél is, így kiszőrtük az abnormális morfológiájú és nagyon elırehaladott fázisú apoptotikus sejteket (89). Az egyes timocita alcsoportokat az anti-cd4-pe (FL-2), anti-cd8-cychr (FL-3) fluoreszcencia intenzitásuk alapján különítettük el. Az így kapuzott egyes timocita alcsoportokat önállóan analizáltuk Annexin V, CD69, Bcl-2, aktivált Caspase-3 pozitivitásukra, illetve GCR expresszióra. A felállított fluoreszcens hisztogramokat az egyes alcsoportokra jellemzı átlagos fluoreszcencia intenzitás (MFI) meghatározására, illetve a jelölıdı (pozitív) sejtek arányának meghatározására használtuk STATISZTIKAI ANALZIS Az egyes kezelések hatásainak vizsgálatakor a különbözı csoportok eredményeit Student féle t-próbával hasonlítottuk össze és a p < 0,05 eltéréseket fogadtuk el szignifikánsan különbözınek. 34

35 4 EREDMÉNYEK 4.1 BALB/C ÉS AND EGÉR TMUSZÁNAK SEJTES ÖSSZETÉTELE A tímuszt alkotó limfoid sejtek különbözı fejlıdési stádiumban lévı timociták, melyeket a CD4 és CD8 antigének sejtfelszíni expressziójával négy csoportba tudunk sorolni. A DN sejtek a legéretlenebbek, melyek osztódás után a CD4 és CD8 antigének egyidejő expressziója, illetve a TCR gének átrendezıdésével és a molekula-komplex sejtfelszíni kifejezésével a DP stádiumba jutnak. Pozitív és negatív szelekció során a DP sejtek körülbelül 99%-a apoptózissal elpusztul, a túlélı érett SP sejtek pedig elhagyják a tímuszt. 13. ábra. BALB/c (A) és AND (B) egér tímuszának sejtes összetétele CD4-PE (x-tengely) és CD8- CyChr (y-tengely) fluoreszcens jelölés után áramlási citometriás analízissel. A háromhetes BALB/c egerek tímuszát jellemzıen 1-3% DN, 70-80% DP, 10-15% CD4 SP és 5-8% CD8 SP tiomcita alkotja. (13. ábra A) Az AND TCR transzgenikus egerek tímuszában ettıl merıben eltérı arányban találhatók meg az egyes alcsoportok (13. ábra B). A Balb/c egerekben megfigyelhetı DP populáció dominanciája helyett nagy arányban (60%) találunk érett CD4 SP sejteket, és csak 20-30%-ot tesz ki a DP populáció. Ez a különbség minden kezelés nélkül fennáll, nem kell hozzá a transzgenikus TCR-nek megfelelı antigént, a PCC-t adagolni az egérnek. A kezeletlen AND transzgenikus egér tímusza 8 ± 2,2 % DN, 28,3 ± 6,7% DP, 61 ± 3,2 % CD4 SP és 2,6 ± 2,3 % CD8 SP sejtbıl áll. A sejtes összetétel eltérése a genetikai módosításnak köszönhetı: a timociták több mint 99%-a a Vβ3 antigénnel jellemezhetı transzgenikus TCR-t hordozza, amely az MHCII + PCC antigénre specifikus. 35

36 4.2 GCR EXPRESSZIÓ MEGHATÁROZÁSA TIMOCITA ALCSOPORTOKBAN A kölcsönös antagonizmus modell szerint a GC hatás nagyon fontos szerepet játszik a DP timociták pozitív szelekciója során. Ezért próbáltunk részletesebb információkat szerezni az egyes timocita alcsoportokban detektálható intracelluláris GCR expresszióról. Ehhez az Immunológiai és Biotechnológiai Intézetben kifejlesztett anti-gcr monoklonális antitestet használtunk, mely a receptor regulátoros doménjét ismeri fel, és mind a ligand kötött, mind a szabad receptort képes felismerni GCR expresszió a különbözı timocita alcsoportokban Sejtfelszíni és intracelluláris jelölés segítségével elızetes szeparálás nélkül tudtuk áramlási citométerrel vizsgálni a négy különbözı érettségő timocita alcsoport GCR expresszióját. Ehhez sejtfelszíni anti-cd4-pe és anti-cd8-cychr, valamint intracelluláris anti-gcr- FITC jelölést végeztünk. A sejteket áramlási citométer segítségével analizáltuk: a sejtfelszíni jelölésekkel azonosított egyes timocita alcsoportokban az FL-1 fluoreszcencia intenzitásból határoztuk meg az átlagos GCR expressziót. Eredményeink szerint fiatal (3-4 hetes) BALB/c egerek timocita alcsoportjaiban eltérı mértékben expresszálódik az intracelluláris GCR 14. ábra). Az érett CD4 SP sejtek mérsékelten kevesebb GCR-t expresszálnak, mint a CD8 SP sejtek, melyet alátámasztanak humán perifériás vérmintán elvégzett vizsgálataink eredményei is (nem ábrázolt eredmény). 14. ábra. GCR expresszió 3 hetes BALB/c egér egyes timocita alcsoportjaiban. Az egyes timocita alcsoportokat sejtfelszíni anti-cd4-pe, anti-cd8-cychr jelölést követıen a CD4 és CD8 expresszió alapján különítettük el. Az oszlopok az egyes timocita alcsoportok átlagos FL1 fluoreszcencia intenzitását (MFI, anti-gcr-fitc intracelluláris jelölés) ábrázolják. Az értékek három független kísérlet átlagát jelentik. * p < 0,05. 36

37 A CD4+CD8+ (DP) timociták a többi populációhoz képest szignifikánsan alacsonyabb mértékben expresszálják a GCR-t. Azonos eredményeket kaptunk RT-PCR mérésekkel is a GCR mrns szintő extrakcióját vizsgálva (nem ábrázolt eredmény) Ismételt in vitro DX kezelés indukálta változások az egyes timocita alcsoportok GCR expressziójában A tímusz sejtes összetétele mellett az egyes timocita alcsoportok átlagos GCR expressziója is változott a különbözı dózisú ismételt in vivo DX kezelések hatására BALB/c egérben. A kísérleti állatokat 4 napon keresztül oltottuk 20,0, 2,0, illetve 0,2 mg/kg DX-al, majd a fent említett jelölési kombináció és áramlási citometriás analízis segítségével az egyes timocita alcsoportokban meghatároztuk az átlagos GCR expressziót. 15. ábra. Különbözı dózisú DX kezelés után 24 órával végzett sejtfelszíni és intracelluláris fluoreszcens jelöléssel meghatározott GCR szintek az egyes timocita alcsoportban. Az oszlopok átlagos fluoreszcencia intenzitást mutatnak (MFI). Az értékek három független kísérlet átlag eredményei. * p < 0,05. A DX kezelések során nagymértékben csökkent a tímusz összes sejtszáma és az egyes populációk aránya is. A túlélı CD4 SP, CD8 SP és DN sejtek eredetileg magasabb GCR expressziós szintje csökkent a növekvı dózisú DX kezelések hatására. Egyedül az eredetileg alacsonyabb GCR expressziójú DP populációban nıtt meg a GCR expresszió szintje, vagyis a magasabb GCR szinttel rendelkezı DP sejtek élték túl a GC kezelést (15. ábra). 37

38 4.2.3 Egyszeri nagy dózisú DX kezelés hosszútávú hatása a timocita populációk GCR expressziójára 16. ábra. Egyszeri 20 mg/kg DX kezelés hosszú távú hatása BALB/c timocita alcsoportok GCR expressziójára. 3 független kísérlet átlageredménye. Egyszeri 20 mg/kg dózisú DX kezelés hatására a legalacsonyabb GCR expresszióval jellemezhetı DP populációban 24 óra elteltével 2,2-szer magasabb, míg a többi populációban a kiindulási értékhez képest alacsonyabb receptor expressziót találtunk (CD8 SP: 0,5-szeres, CD4 SP: 0,6-szoros, DN: 0,8-szeres). A negyedik napra minden populációban visszafordult az expresszióváltozás iránya: a DP populációban csökkent (0,6- szeres), a többi populációban viszont nıtt a GCR expresszió (CD8 SP: 1,4-szeres, CD4 SP: 1,4-szeres, DN: 1,1-szeres). A nyolcadik napra a DP populációban a kiindulási értékkel azonos, míg a többi populációban annál alacsonyabb szintő (DN és CD4 SP: 0,8-szoros, CD8 SP: 0,7-szeres) volt a GCR expressziós szintje (16. ábra). Tehát a glukokortikoid hatásra legérzékenyebb DP populációban találtunk egyedül GCR expresszió növekedést, majd ez egy hét múlva visszaállt az eredeti értékre. Az érett SP populációkban a szeteroid hatásra még nyolc nappal a nagy dózisú DX kezelés után is alacsonybb GCR expressziót találtunk, ami feltételezéseink szerint a túlélı és tovább érı (DP) sejtek hormon indukálta GCR downregulációjának a következménye. 38

39 4.2.4 AND transzgenikus egér timocita alcsoportjainak GCR expressziója AND TCR transzgenikus egérmodellen is vizsgáltuk a GCR expressziót a különbözı timocita alcsoportokban intracelluláris jelölést követı áramlási citometriás analízis segítségével. A BALB/c egérmodellen kapott eredményeinkhez hasonlóan a DN sejtekben volt a legmagasabb (160,5 ± 17,7 MFI), míg a DP sejtekben a legalacsonyabb (55.9 ± 2.8 MFI) a GCR expresszió. A BALB/c egerekhez képest azonban a transzgenikus AND egerek érett timociták az éretlen DN sejtekhez képest szignifikánsan kevesebb GCR-t expresszáltak (CD4 SP sejtek: 94,6 ± 15,1 MFI, CD8 SP sejtek: 91,8 ± 17,2 MFI) (17. ábra). 17. ábra. GCR expresszió AND transzgenikus egérmodell egyes timocita alcsoportjaiban. (A) A négy fı timocita alcsoport megoszlása kezeletlen AND egér tímuszában. (B) Az áramlási citometriás hisztogramok az egyes alcsoportokban megfigyelhetı anti-gcr-fitc átlagos fluoreszcencia intenzitást (MFI) mutatják. Az egyes hisztogramokon feltőntettük a három függetlenül elvégzett kísérlet egy reprezentatív eredményét. (C) Az oszlopok három független kísérlet eredményeibıl számolt átlagos GCR expressziót (MFI) ± S.D. mutatják az egyes timocita alcsoportokban (* p < 0,05 a DN populációhoz viszonyítva; # p < 0,05 a CD4 SP és CD8 SP populációkhoz viszonyítva) In vivo DX és PCC antigén, illetve anti-cd3 kezelés hatása AND transzgenikus egér timocitáinak GCR expressziójára Vizsgáltuk a GC kezelés és T-sejt receptor aktiváció hatására bekövetkezı GCR expressziós változásokat is az egyes timocita alcsoportokban. Az AND TCR transzgenikus 39

40 egérmodellen elvégzett kísérletünkben az in vivo 10 mg/kg dózisú DX kezelést anti-cd3, illetve a transzgenikus TCR-nek megfelelı antigénnel, PCC antigén kezeléssel is kombináltuk. A 18. ábra három független kísérlet során kapott eredményeink átlagát mutatja a DP (A) és az érett CD4 SP populációkban (B). 24 órával az in vivo kezelés után a DP populációban a kontroll állatokban talált szinthez (55,9 ± 2,8 MFI) viszonyítva szignifikánsan (p < 0,05) alacsonyabb GCR expressziót találtunk mind a GC, mind a TCR aktiváció, mind a kombinált kezelések hatására [PCC (33,3 ± 4,7 MFI), anti-cd3 (38,3 ± 7,5 MFI), magas dózisú DX (38,1 ± 4,7 MFI), PCC + DX (42,2 ± 6,2 MFI) és anti-cd3 + DX (33,3 ± 0,3 MFI) kombinált kezelések] (18. ábra A). Az érett CD4 SP sejteknél szignifikánsan (p < 0,05) alacsonyabb GCR szinteket találtunk PCC, magas dózisú DX és anti-cd3 + DX kezelések után (55 ± 7,7; 51,1 ± 12,2 és 61,8 ± 11,1 MFI). Nem találtunk szignifikáns változást az intracelluláris GCR szintben anti-cd3 és PCC + DX kombinált kezeléseket követıen (72,4 ± 15,7, 72,1 ± 14,7 MFI) a kontroll állatokban talált szinthez (94,6 ± 15,1 MFI) képest (18. ábra B). 18. ábra. GCR expresszió változások AND transzgenikus egér DP (A) és CD4 SP (B) timocitáiban in vivo PCC, anti-cd3, 10,0 mg/kg dózisú DX és kombinált kezelések után. Az oszlopok a különbözı kezeléseket követıen mért, három független kísérlet eredményeibıl számított átlagos anti-gcr-fitc fluoreszcencia értékeket ± S.D. mutatják. * p < 0,05. Tehát a TCR aktiváció mind önállóan, mind GC kezeléssel kombinálva a 10,0 mg/kg dózisú DX hatásához hasonlóan csökkentette a DP, és a CD4 SP populációban is a GCR expressziót. 40

41 4.3 GLUKOKORTIKOID HORMON HATÁSA A TIMOCITA ALCSOPORTOK TCR INDUKÁLTA AKTIVÁCIÓJÁRA Szabad intracelluláris kálcium szintek a nyugvó (alap) timocita alcsoportokban A kálcium, mint másodlagos messenger, nagyon fontos szerepet tölt be a TCR jelátviteli folyamataiban. Ezért BALB/c egér tímuszának eltávolítását követıen megvizsgáltuk az egyes timocita alcsoportok szabad intracelluláris Ca ++ szintjét nyugvó, majd aktivált sejtekben. A tímuszból készült sejtszuszpenziót in vitro feltöltöttük Fluo-3 kálcium szelektív indikátorral. A mérési eredményinkben a Fluo-3 festék FL1 csatornában mért fluoreszcencia intenzitása egyenesen arányos az intracelluláris Ca ++ szinttel. 19. ábra. A különbözı timocita populációk alap szabad intracelluláris Ca ++ szintje. A függıleges tengely három független kísérletbıl a kálcium szelektív Fluo-3 festék FL1 csatornában mért átlagos fluoreszcencia szintjének átlagát mutatja. Különbséget találtunk az egyes timocita alcsoportok alap szabad intracelluláris Ca ++ szintjében (19. ábra). A legalacsonyabb szabad intracelluláris Ca ++ szintet a DP timocitákban találtunk (17,1 ± 3,51 MFI). Az éretlenebb SP populációkban magasabb volt a nyugalmi állapotban mérhetı szabad citoszolikus Ca ++ szint (CD4 SP: 22,64 ± 6,72 MFI CD8 SP: 28,7 ± 6,18 MFI), akárcsak a legéretlenebb DN populációban (34,1 ± 7,99 MFI). Ezután in vitro anti-cd3 monoklonális antitesttel aktiváltuk a timocitákat, majd ezt követıen 6 percig mértük az egyes timocita alcsoportok intracelluláris Ca ++ szintjének 41

42 változását. Az analízis során az intracelluláris szabad kálcium szint változást az egyes populációk jellemzı alapszintjéhez viszonyítottuk (20. ábra). Eredményeink szerint a különbözı timocita alcsoportok eltérıen reagáltak a direkt TCR stimulusra. Az intracelluláris Ca ++ szint a CD4 SP sejtekben kezdett a leghamarabb növekedni (60 sec.), 150 sec. múlva elérte a csúcspontot (3-szoros növekedés), majd egy platófázis után ( sec.) elkezdett csökkenni, és a kísérletünk végéig nem tért vissza teljesen a kiindulási szintre. A DP populáció sejtjeiben lassabban és kisebb mértékben növekedett a szabad intracelluláris Ca ++ szint, de itt is találtunk egy a CD4 SP populációéval kb. azonos idıszak alatt fennálló 1,5-szeres növekedéssel járó platófázist, amelyet lassú Ca ++ szint csökkenés követett. A CD8 SP populáció sejtjeiben 270 sec.-ig folyamatosan, de alacsony intenzitással nıtt a Ca ++ szint 1,75-szeresre, majd plató nélkül elkezdett csökkenni. A legmagasabb alap Ca ++ szintő DN populációban az in vitro TCR aktivációt követıen nem változott szignifikáns mértékben az intracelluláris szabad kálcium szint, és kísérletünk végéig a bazális tartomány körül maradt. 20. ábra. Az egyes timocita alcsoportok szabad intracelluláris Ca ++ szintjének változása in vitro anti- CD3 stimulálást követıen. A függıleges tengely az alap intracelluláris Ca ++ szinthez (Fluo-3 FL1 MFIhez) viszonyított változást mutatja. Tehát az eltérı nyugalmi szabad intracelluláris Ca ++ szinttel jellemezhetı egyes timocita alcsoportok a TCR direkt stimulálásának következtében eltérı kinetikájú kálcium szint növekedéssel reagálnak. A legnagyobb arányú és leggyorsabb kálcium szint növekedést az érett CD4 SP populáció sejtjeinél találtuk. Eredményeink alapján úgy tőnik, hogy a DP sejtek kevésbé érzékenyek a TCR indukálta aktivációra. 42

43 4.4 GLUKOKORTIKOID HORMON ÉS TCR AKTIVÁCIÓ HATÁSA A TIMOCITA ALCSOPORTOK APOPTÓZISÁRA A tímusz az apoptózis vizsgálatok egyik fı célpontja, mivel régóta ismert, hogy glukokortikoid kezelésre nagymértékő involúcióval reagál. Az apoptózis megindulásánál az egyik legelsı lépés, hogy a sejtmembrán aszimmetriája megváltozik, és az intakt sejtekben csak a sejtmembrán belsı oldalán megtalálható PS molekula a sejtmembrán külsı felén is megjelenik. Az Annexin V egy foszfolipid kötı fehérje, amely szelektíven a foszfatidil szerinhez (PS) kötıdik (21. ábra), lehetıséget adva arra, hogy az apoptózis detektálására használjuk. Az Annexin V pozitivitás egy korai apoptotikus marker. Az apoptotikus folyamat elırehaladása során a sejtek membrán integritása is sérül, áteresztıbbé válik. Az ilyen késıi apoptotikus sejtek detektálásra a PI molekulát használtuk. A PI az intracelluláris nukleinsavakhoz kötıdve vörös színben fluoreszkál, megjelölve a membránjuk integritását elveszített, azaz az apoptózis egy késıbbi fázisban lévı sejteket. 21. ábra. A foszfatidil-szerin (PS) megoszlása normál és apoptotikus sejt membránjában. Az apoptotikus sejtmembrán extracelluláris lemezében is megjelenı PS molekulákhoz szelektíven kötıdik az Annexin V molekula ( nyomán). Kezeletlen BALB/c egér tímuszában a folyamatosan zajló érési és szelekciós folyamatok hatására 4% korai apoptotikus sejtet (Annexin V pozitív) és 3% késıi apoptotikus sejtet (Annexin V és PI pozitív) találtunk (22. ábra A). 43

44 22. ábra. Annexin V-FITC / PI jelöléssel végzett ép, korai és késıi apoptotikus sejtek vizsgálatának egy reprezentatív eredménye. (A) Kezeletlen állat tímuszában is találhatóak Annexin V pozitív (korai apoptotikus) sejtek (2,3%), és késıi apoptotikus (Annexin V és PI kettıs pozitív) sejtek (4,5%). (B) 10 mg/kg DX kezelést követıen 24 órával végzett Annexin V / PI jelölés eredménye: 3,5 % korai és 42,6 % késıi apoptotikus sejt BALB/c egér timocita számának és tímusz sejtes összetételének változása különbözı dózisú ismételt DX kezelés hatására Régóta ismert, hogy a glukokortikoid hormon analóg DX kezelés jelentısen csökkenti a tímusz méretét (90) a T-sejt elıalakok depléciója miatt. A fiziológiás és farmakológiás dózisú glukokortikoid hormon hatás vizsgálatához 3-4 hetes BALB/c egereket 4 napon keresztül 24 óránként 20,0, 2,0, illetve 0,2 mg/kg DX-al kezeltük in vivo. 24 órával az utolsó kezelés után eltávolítottuk az állatok tímuszát és elıször meghatároztuk a teljes timocita számot. Az ismételt DX kezelések koncentráció dependens csökkenést okoztak a teljes timocita számban. A kezeletlen kontrollhoz viszonyítva (120 millió sejt/tímusz) az ismételt 20,0 mg/kg DX kezelés több mint 100-szoros redukciót okozott a timocita számban (1 millió sejt/tímusz, 24. ábra A). 23. ábra. Tímusz sejtes összetételének változása különbözı dózisú (20,0, 2,0, 0,2 mg/ttkg) ismételt DX kezelések után. Az dot-plotok sejtfelszíni anti-cd4-pe és anti-cd8 CyChr jelölést követı áramlási citometriás analízis eredményei. A diagramok három független kísérlet egy jellemzı eredményét mutatják. 44

45 A tímusz sejtes összetétele szintén megváltozott az in vivo DX kezelések hatására. Irodalmi adat, hogy a DP timociták a legérzékenyebbek a glukokortikoid kezelésre (91). A rezisztensebb érett CD4 SP és CD8 SP, illetve éretlen DN populáció mellett egy kisszámú DX rezisztens DP sejtcsoport azonban mindvégig megmaradt a tímuszban, még a magas (20,0 mg/kg) dózisú DX kezelés során is (23. ábra). Az érett SP sejtek között a CD8 pozitívak ellenállóbbak voltak a glukokortikoid kezeléssel szemben, mivel a CD4/CD8 arány csökkent az emelkedı dózisú DX kezeléseknél (24. ábra B). 24. ábra. Tímusz abszolút sejtszám (A) és sejtes összetétel (B) in vivo DX kezelt BALB/c egerekben. Az egereket 4 napon át ismételten kezeltük különbözı koncentrációjú DX-al, majd meghatároztuk a tímuszok sejtszámát és sejtfelszíni anti-cd4-pe / anti-cd8-cychr jelölést végeztünk. Az oszlopok az egyes timocita alcsoportba tartozó sejtek abszolút számát (A) és relatív arányát (B) mutatják In vivo glukokortikoid analóg, anti-cd3, illetve kombinált kezelés hatása BALB/c timociták apoptózisára Vizsgáltuk az apoptotikus markerek megjelenését alacsony dózisú (0,2 mg/kg) DX, anti- CD3 és kombinált anti-cd3 + DX kezelés után is. 24 órával a kezelés után azt találtuk, hogy mindhárom esetben nıtt mind a korai (Annexin V pozitív), mind a késıi apoptotikus (Annexin V és PI pozitív) sejtek aránya BALB/c egerek tímuszában (25. ábra). 45

46 25. ábra. Egyszeri 0,2 mg/kg dózisú DX, anti-cd3 és kombinált in vivo kezelés hatása BALB/c egerek timocitáinak apoptózisára. Az élı sejteknek tekintettük az Annexin V és PI negatívakat (fehér), a korai apoptotikusnak a csak Annexin V pozitívokat (szürke) és késıi apoptotikusnak az Annexin V és PI kettıs pozitívokat (fekete). Az oszlopok három független kísérlet eredményeibıl számolt átlagos megoszlást mutatnak. A csak DX illetve anti-cd3 kezelés hatására megfigyelhetı apoptotikus sejtarányokhoz (28% korai, 22% késıi apoptotikus, illetve 21% korai, 18% késıi apoptotikus) viszonyítva a kombinált kezelés hatására kisebb mértékő apoptózist találtunk (7% korai, 17% késıi apoptotikus sejt). Tehát a kombinált kezelés együtt kivédte a DX, illetve az anti-cd3 antitest apoptózist indukáló hatását. Ez a két jelátviteli út összekapcsolódását jelzi, mely megfelel a kölcsönös antagonizmus modellnek Egyszeri, nagy dózisú DX kezelés hatásának idıfüggése BALB/c egérben Már régóta ismert, hogy a glukokortikoidok által indukált apoptózisra a DP sejtek a legérzékenyebbek (92), a sejtszám csökkenés és tímusz összetétel változásának idıbeli lefolyásáról azonban még kevés az információ. Ezért megvizsgáltuk az egyszeri nagy dózisú (10,0 mg/kg) DX kezelés hatásának idıbeli lefutását. Ehhez BALB/c egér oltása után 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 és 24 órával meghatároztuk a tímociták abszolút számát (2. táblázat) és sejtfelszíni kettıs fluoreszcens jelölést (anti-cd4-pe és anti-cd8-cychr) követıen az egyes timocita alcsoportok arányát (26. ábra). 46

47 26. ábra. Egyszeri 10,0 mg/kg dózisú DX kezelés tímusz sejtes összetételére gyakorolt hatásának idıbeli lefutása. Az oszlopok három független kísérletben meghatározott átlagos timocita populációarányt jelölnek. Egyszeri 10,0 mg/kg dózisú DX kezelés hatására 24 óra alatt a DP timociták aránya jelentısen csökken (83,2%-ról 44,9%-ra), mialatt az érett CD4 SP és CD8 SP populáció relatív dominanciája alakul ki (CD4 SP: 10%-ról 36,1%; CD8 SP: 3,1%-ról 9,8%-ra). Idı Ctrl 0,5h 1h 2h 4h 8h 12h 16h 20h 24h DX 10,0 mg/kg (106 sejt/thymus) 142, ,8 113,4 59,2 37,8 31,6 29,4 26,8 2. táblázat. Egyszeri magas dózisú (10,0 mg/kg) DX kezelés tímusz összes sejtszámára gyakorolt hatásának idıbeli lefutása. Az értékek 10 6 sejtet jelentenek és három független kísérletben meghatározott átlagos abszolút timocita sejtszámot jelölnek. Az abszolút tímusz sejtszámot is meghatároztuk minden idıpontban. 24 órával a nagy dózisú DX kezelést követıen az átlagos sejtszám 26,8 millióra csökkent 142,8 millióról (2. táblázat). Megállapíthatjuk, hogy az egyszeri nagy dózisú DX kezelés sejtszám csökkentı hatása már 2 órával a beadás után megfigyelhetı, és 24 óra elteltével még mindig nem emelkedik a tímusz össz sejtszáma. 47

48 Az egyszeri nagy dózisú DX hatás vizsgálatára ezért egy másik kísérletet is végeztünk, amelyben 15 napig követtük az egyes timocita populációk nagyságának alakulását az in vivo 10 mg/kg DX kezelést követıen (27. ábra). 27. ábra. Egyszeri 10mg/kg DX kezelés hatása az egyes timocita alcsoportok abszolút számára. Az elızı kísérlet eredményeivel egyezıen minden timocita popoulációban nagy mértékő sejtszám csökkenés következett be. A legnagyobb mértékő sejtszám depléciót a 4. napon tapasztaltuk. Ezt követıen kezdıdött a tímusz repopulációja, mely a 15. napra szinte teljesen végbement és a kiindulási állapothoz képest már nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést egyik populációban sem GC indukálta apoptózis mechanizmusának vizsgálata: glukokortikoid receptor antagonista kezelés hatásai A GC-k és glukokortikoid analógok által indukált tímusz involúció a sejtek apoptózisa miatt következik be. Ennek molekuláris mechanizmusa nem tisztázott. A GC-k hatása konvencionálisan a citoszolban található GCR-on keresztül érvényesül. Ezek a receptorok blokkolhatók antagonistákkal. A receptor közvetítette GC hatást kísérleteinkben a nem specifikus RU486 és a GC specifikus RU43044 antagonistákkal blokkoltuk. A konvencionális GC hatás megakadályozására BALB/c egereket 2 napon át 12 óránként oltottunk 1 mg/kg RU43044 glukokortikoid receptor antagonistával önmagában, illetve kombinációban 20 mg/kg DX-al. A kezelések után 24 órával sejtfelszíni fluoreszcens jelöléssel és áramlási citometriás analízissel meghatároztuk a tímuszok sejtszámát és az egyes timocita populációk arányát. Az elızıekben már részletezett hatása volt a DX kezelésnek mind a sejtszámra (Kontroll: 110 millió, DX 20mg: 10 millió timocita), mind a 48

49 sejtes összetételre, melyet nem befolyásolt az egyidejőleg adott glukokortikoid antagonista kezelés (DX 20mg + RU43044: 7 millió timocita). Az RU43044 kezelésnek nem volt hatása sem az abszolút sejtszámra (RU43044: 106 millió timocita), sem az egyes timocita populációk arányára (28. ábra). Önmagában az in vivo RU486 kezelésnek sem volt hatása sem a tímuszok abszolút sejtszámára, sem a sejtes összetételre (nem ábrázolt eredmény). 28. ábra. Az egyes timocita populációk arányának változása RU43044, 20mg/ttkg DX, illetve kombinált kezelés hatására. Az oszlopok a timocita populációk átlagos százalékos arányát mutatják, az értékek három független kísérlet átlag eredményei. Az apoptózist kiváltó hatás idıbeni lefolyásának vizsgálatához 2 napos 12 óránkénti RU486 elıkezelést követıen egyszeri 10,0 mg/kg dózisú DX kezelést után 0-24 órás idıtartamban (0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 óra) megvizsgáltuk BALB/c timociták Annexin V és PI pozitivitásának változását áramlási citometriás módszerrel. 29. ábra. Apoptotikus markerek megjelenésének idıbeli lefolyása BALB/c egér in vivo egyszeri nagy dózisú DX (A), és RU ,0 mg/kg dózisú DX kombinált kezelését (B) követıen. A sejtek Annexin V / PI jelölését követıen áramlási citometriás mérést végeztünk. A csak Annexin V pozitív sejtek (fehér oszlopok)az apoptózis egy korai szakaszában vannak, míg az Annexin V, PI kettıs pozitív sejtek (fekete oszlopok) késıi apoptotikusak (már a membrán integritásuk sem megtartott). A kezelést követıen a tímuszok feldolgozásáig eltelt idıt (0-24h) az x tengely jelzi. Az ábra három függetlenül elvégzett kísérlet egy reprezentatív eredményét mutatja. 49

50 A DX kezelést követı 4. órában a korai apoptotikus jeleket mutató sejtek aránya 4- szeresére nıtt a kontroll állapothoz képest. A 8. órában kismértékő csökkenést figyeltünk meg az Annexin V pozitív sejtek arányában, de a 12 órától ismét fokozatosan egyre nagyobb lett (8-szoros a órában) a korai apoptotikus sejtek aránya (29. ábra A). A késıi apoptotikus jeleket mutató, PI pozitív sejtek aránya a DX injekciót követı 12. órában kezdett el nıni, és 24. órában érte el a maximumát (40%; 29. ábra B). Amennyiben a BALB/c egereket glukokortikoid receptor antagonistával (RU486) elıkezeltük a DX injekciót megelızıen, a kezdeti Annexin V pozitivitás emelkedés a 4. óráig megmaradt, de a késıbbi (8. órát követı) Annexin V és kettıs pozitív, késıi apoptotikus sejtek arányának növekedése elmaradt (29. ábra B). Az RU486 kezelés önmagában nem okozott a kontroll állapothoz képest szignifikáns változást az apoptotikus markerek (Annexin V, PI) megjelenésében (nem ábrázolt eredmény). Tehát a GC hormon hatásra kialakuló apoptózis korai jeleit már 4 órával a kezelés után tudtuk detektálni és a sejthalál késıi jeleként ismert membráni integritás elvesztés is észlelhetı volt 12 óra elteltével. A glukokortikoid receptor antagonistával együtt adott DX hatására a korai apoptotikus jelek ugyanúgy megjelentek a timocitákon, míg a késı apoptotikus jelek elmaradtak, amely arra utal, hogy az apoptózis korai fázisának kiváltásához nem szükséges a receptor ligand kötése, míg késıbbi apoptózis stádiumban már igen AND egér tímuszának sejtes összetétele egyszeri glukokortikoid hormon és/vagy PCC kezelés, illetve direkt TCR stimuláció után Az AND TCR transzgenikus egértörzsben vizsgáltuk, hogyan változik a tímusz abszolút limfoid sejtszáma, illetve összetétele, ha a glukokortikoid hatást befolyásoljuk a TCR-hez kapcsolódó jelátviteli utak aktiválásával. Ehhez AND TCR transzgenikus egereket in vivo 48 és 24 órával a vizsgálat elıtt PCC antigénnel, illetve 24 órával a vizsgálat elıtt anti- CD3 antitesttel és/vagy 10,0 mg/kg DX-al kezeltük. Másnap az állatok tímuszát eltávolítottuk és meghatároztuk az össz timocita számot (3. táblázat), a DP és CD4 SP populációkat alkotó sejtek számát (4. táblázat). A kétszeri in vivo PCC antigén kezelés 81,7 ± 7,6 millióra, az egyszeri stimuláló anti-cd3 antitest kezelés pedig 50,3 ± 8,7 millióra csökkentette a tímusz sejtszámát a kontroll állatokban talált 108,3 ± 18,9 millió sejtszámhoz képest (3. táblázat). A magas dózisú DX 50

51 kezelés önmagában nagyobb sejtszám csökkenéshez vezetett, mint amikor kombinálva adagoltuk PCC antigénnel, illetve anti-cd3 antitesttel együtt. Vagyis a glukokortikoid hatás és a TCR aktiváció együtt kisebb mértékben vezetett a timociták apotózisához, mint a két jel külön-külön. Ez alátámasztja a kölcsönös antagonizmus modellt, mely szerint a glukokortikoid és a TCR aktiváció önmagában apoptózist okoz, míg egy idıben hatva kioltják egymás hatását. Kontroll PCC anti-cd3 DX 10,0 mg/kg PCC + DX 10,0 mg/kg anti-cd3 + DX 10 mg/kg AND tímusz sejtszám ± S.D. (x10 6 ) 108,3 ± 18,9 81,7 ± 7,6 50,3 ± 8,7 41,0 ± 3,6 * 58,3 ± 16,1 * 50,7 ± 4,0 * 3. táblázat. Átlagos teljes tímusz sejtszám (x10 6 ) ± S.D. különbözı in vivo kezelések után (minden csoport eredménye három függetlenül elvégzett kísérlet adatai alapján került kiszámolásra). * p<0,05. A glukokortikoid és TCR aktiváció együttes és külön-külön hatását az össz timocita számon túl vizsgáltuk az AND TCR transzgenikus egér két legjelentısebb timocita csoportján, a DP és CD4 SP populáción is. Az AND TCR transzgenikus egerek DP timocitáinak aránya a kétszeri in vivo PCC kezelés hatására szignifikánsan lecsökkent a kezeletlen állathoz viszonyítva (28,3 ± 6,7%-ról 14 ± 2,2%-ra). A magas és alacsony dózisú DX kezelés még drasztikusabban csökkentette a DP sejtek arányát (0,9 ± 0,3% és 2,7 ± 0,8 %). A kombinációban adott PCC antigén úgy módosította a 10,0 mg/kg dózisú DX hatását, hogy nagyobb arányú DP sejt maradt a tímuszban (4. táblázat). A CD4 SP sejtpopulációt vizsgálva azt találtuk, hogy a PCC antigén kezelés önmagában nem növelte szignifikáns mértékben ennek az értett sejtcsoportnak az AND egérben, míg az alacsony és a magas dózisú DX kezelés kifejtett ilyen hatást. DX kezeléssel kombinálva a PCC adagolás szignifikáns mértékben növelte az érett sejtek arányát, de ez kisebb mértékő, mint a DX kezelés önálló hatása (4. táblázat). Sem a DN, sem a CD8 SP populáció arányában nem találtunk számottevı különbséget a fenti kezelések során (nem ábrázolt eredmény). 51

52 Kontroll PCC DX 10,0 mg/kg DX 1,0 mg/kg PCC + DX 10,0 mg/kg DP% ± S.D. 28,3 ± 6,7 14 ± 2,2 * 0,9 ± 0,3 ** 2,7 ± 0,8 ** 2,2 ± 1,9 ** CD4 SP% ± S.D. 61 ± 3,2 65,7 ± 5,6 78,5 ±13,6 * 87,6 ± 1,9 * 74,2 ± 1,1 * 4. táblázat. DP és CD4 SP sejtarány változásai in vivo PCC antigén, 10,0 ill 1,0 mg/kg DX és kombinált kezelések hatására. Az értékek három erdeménybıl számolt átlagos arányt (timociták százaléka) ± S.D. mutatják. * p < 0,05 ** p < 0, Korai apoptotikus markerek megjelenése transzgenikus AND egér DP és CD4 SP timocitáiban in vivo antigén és glukokortikoid kezelést követıen A GC és TCR aktiváció apoptózist kiváltó hatását vizsgáltuk az AND egérmodellünkön is. In vivo nagy dózisú (10,0 mg/kg) DX kezelés mellett önállóan és kombinációban anti-cd3 és PCC kezelést alkalmaztunk az egereknél a fentebb már említett protokollnak megfelelıen. Eredményeink értékelésénél csak a korai apoptotikus markert (Annexin V pozitivitás) vizsgáltuk az AND transzgenikus egér két legnagyobb timocita csoportjában, a DP és CD4 SP populációban. 30. ábra. Annexin V+ / PI- DP és CD4 SP timociták aránya különbözı kezelések hatására. Az oszlopdiagramok az átlagos Annexin V pozitív sejtek arányát ± S.D. mutatják in vivo PCC, anti-cd3, magas dózisú DX, illetve kombinált kezelések után a DP (A) és a CD4 SP (B) populációban. Az eredmények három független kísérletbıl számított értékek. * p < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva, # p < 0,05 a magas (10,0 mg/kg) dózisú DX kezeléshez viszonyítva. A DP timociták 4.45 ± 0.64%-a volt Annexin V pozitív a kezeletlen AND egerek tímuszában. Kísérleteinkben az Annexin V pozitív DP timociták aránya szignifikánsan megnıtt PCC (29.18 ± 13.37%), a-cd3 (27.63 ± 10.28%) és 10,0 mg/kg DX kezelés után (30.76 ± 2.38%). A kombinációs kezelések a kontrollhoz képest szintén szignifikánsan növelték az Annexin V pozitív DP pozitív sejtszámot, de az önálló kezelésekhez viszonyítva a kombinált DX és PCC (18.86 ± 2.05%) illetve a DX és anti-cd3 antitest 52

53 együttes adagolás (21.59 ± 1.66%) mérsékeltebben volt apoptózist kiváltó hatású (30. ábra A). Az érett CD4 SP sejtek 2.38 ± 0.26%-a volt Annexin V pozitív a kontroll, kezeletlen TCR transzgenikus AND egértörzsben. Szignifikánsan magasabb arányú Annexin V pozitív CD4 SP sejtet találtunk anti-cd3 (4.85 ± 0.43%), DX (7.56 ± 2.25%) és kombinált PCC és DX (7.47 ± 1.42%) kezelés után. Emelkedett a korai apoptotikus CD4 SP sejtek aránya, de a kontrollhoz viszonyítva nem szignifikáns mértékben PCC (5.00 ± 2.77%), illetve anti- CD3 és DX kombinált kezelés után (4.49 ± 2.13%) (30. ábra B). Tehát a TCR transzgenikus AND egértörzsben a TCR és GC hatás együttesen kivédte egymás apoptotikus hatását a DP timocitákban, ami már nem érvényesült az érett, SP sejtekben Mitokondriumok funkcióvesztésének detektálása apoptotikus sejtekben Az apoptotikus folyamatban a sejtmembrán aszimmetriájának megváltozásán és integritásának elvesztésén túl a mitokondriumok is fontos szerepet játszanak. A mitokondriumok funkciójában bekövetkezı változások az apoptózis folyamatában egy olyan pontot jelentenek, ahonnan már irreverzibilissé válik a sejt halálához vezetı folyamat. A mitokondriumok funkcionális aktivitásának vizsgálatára jól alkalmazható a CMX-Ros festék, melyet az intakt mitokondriumok fluoreszkáló molekulává alakítják (93). Az AND TCR transzgenikus egértörzsben az elızı pontban említett kezelések után vizsgáltuk a DP és CD4 SP timociták mitokondriális funkcióját is. A kezelések után CMX-Ros festékkel inkubálva az állatok timocitáit, azt találtuk, hogy a kontroll állatokban ± 5.2 % DP timocita volt CMX-Ros pozitív (intakt mitokondriummal rendelkezı). Ehhez viszonyítva minden kezelés szignifikánsan (p < 0,05) csökkentette az intakt mitokondriális membrán potenciállal rendelkezı sejtek arányát. A legkevesebb funkcionáló mitokondriummal rendelkezı DP sejtet az anti-cd3 (1.11 ± 0.21 %) és a 10,0 mg/kg dózisú DX kezelés (0.55 ± 0.11 %) után találtunk. Ehhez a két kezeléshez viszonyítva szignifikánsan nagyobb arányban maradtak intaktak a DP sejtek mitokondriumai PCC (8.81 ± 2.08 %), illetve a kombinált kezelések hatására (PCC+DX: 5.3 ± 0.2; a-cd3+dx: 5.0 ± 1.1 % DP sejt). (31. ábra A, C). 53

54 31. ábra. Változások a mitokondriális membrán potenciálban CMX-Ros festékkel feltöltött AND egér timocitáiban PCC, anti-cd3, 10,0 mg/kg dózisú DX vagy kombinált kezelések hatására. Az áramlási citometriás hisztogramok a DP (A) és a CD4 SP (B) timociták CMX-Ros fluoreszcencia intenzitását mutatják. Minden diagramon feltőntettük az intakt mitokondriummal bíró timociták arányát. Az oszlopok a magas CMX-Ros fluoreszcencia intenzitású (intakt mitokondriummal rendelkezı) timociták átlagos arányát mutatják a DP (C) és a CD4 SP (D) populációkban. Az eredmények három független kísérletbıl számított értékek. A két populációban különbözı skálájú az y tengely! * p < 0,5 a kontrollhoz viszonyítva, # p < 0,05 a magas dózisú DX kezeléshez viszonyítva. A CD4 SP sejtpopulációban minden kezelés szignifikánsan (p < 0,05) csökkentette az intakt mitokondriális membrán potenciállal rendelkezı sejtek arányát a kezeletlen kontrollhoz (54 ± 3% CD4 SP sejt) viszonyítva. PCC kezelés után 21,2 ± 2,7 %, anti-cd3 kezelés után 13.5 ± 5.6%, 10,0 mg/kg dózisú DX kezelés után pedig 12.1 ± 3.2% volt az intakt mitokondriummal bíró, érett sejtek aránya. A PCC + DX kombinált kezelés szignifikáns mértékben tudta kivédeni a DX kezelés mitokondrium károsító hatását (27.7 ± 7.4%), míg az anti-cd3 adásának nem volt ilyen mértékő a védı hatása a DX kezeléssel kombinálva a CD4 SP sejteknél (15.6 ± 2.3%) (3 1. ábra B, D). Érdekes megfigyelés, hogy míg a PCC jelentısen tudta antagonizálni a magas dózisú DX kezelés mitokondriális membrán potenciál csökkentı hatását a CD4 SP sejtekben, az anti- CD3 + DX kombinált kezelésnek nem volt ilyen protektív hatása, csak a DP sejtekben. 54

55 4.4.8 TCR aktiváció és GC hatása DP és CD4 SP timociták Bcl-2 expressziójára Bcl-2 az anti-apoptotikus fehérjecsalád egyik tagja (94). A Bcl-2-t túlexpresszáló sejtek meg tudnak menekülni az apoptózis elıl (95), Annak kiderítésére, hogy az egyes timocita alcsoportok eltérı apoptotikus jellegzetességéért felelıs-e a Bcl-2 fehérje, sejtfelszíni anti- CD4-PE, anti-cd8-cychr, illetve intracelluláris anti-bcl-2-fitc jelölés és áramlási citometriás analízis segítségével megvizsgáltuk a Bcl-2 expresszió mértékét a különbözı timocita populációkban. Az AND transzgenikus egérmodell éretlen DP sejtjeinek csak 0.8%-a volt Bcl-2 pozitív, míg az érett CD4 SP sejtek 2.2%-a expresszálta nagy mennyiségben az apoptózistól védı fehérjét (nem ábrázolt eredmény). 32. ábra. Bcl-2-t expresszáló AND timociták arányának változása PCC, anti-cd3, 10,0 mg/kg dózisú DX és kombinált kezelések után. Az áramlási citometriai hisztogramok a három független kísérlet egy jellemzı eredményét mutatják: DP sejtek (A) és CD4 SP sejtek (B) anti-bcl-2-fitc fluoreszcencia intenzitása. Minden diagramon jelöltük a Bcl-2 pozitív sejtek arányát. Vizsgáltuk az AND TCR transzgenikus egérmodellünk DP és CD4 SP timocitáiban a Bcl-2 expressziót in vivo TCR aktiváció és GC hatást követıen is. A DP populációban minden kezelés után nıtt az élı sejtekben a Bcl-2 pozitív sejtek aránya. 10,0 mg/kg DX (12.34 ± 2.23), PCC + DX kombinált kezelés (29.65 ± 5.45) és a-cd3 DX kombinált kezelés (14.11 ± 4.82) okozott szignifikáns növekedést a Bcl-2-t expresszáló sejtek arányában, míg a PCC (3.18 ± 2.8%) és az anti-cd3 (4.39 ± 0.57%) kezelések nem szignifikáns mértékben növelték a Bcl-2 pozitív DP sejtek arányát. A kombinált PCC + DX kezelés szignifikánsan növelte a Bcl-2 pozitív sejtek arányát mind az önálló PCC, mind a DX kezeléshez 55

56 viszonyítva. A kombinált anti-cd3 + DX kezelés csak az önálló anti-cd3 kezeléshez viszonyítva okozott szignifikáns hatást, a DX kezeléshez viszonyítva nem.(32. ábra A). A CD4 SP timocitáknál is magasabb volt a Bcl-2-t expresszáló sejtek aránya a kezeléseket követıen. Egyedül a PCC kezelésnél nem volt a pozitív sejtek arányának növekedése szignifikáns (8.79 ± 3.49%). Anti-CD3 kezelés után ± 2.73%, DX kezelés után ± 7.56% volt a Bcl-2 pozitív CD4 SP sejtek aránya. A kombinált PCC és DX (24.97 ± 4.15%), illetve az anti-cd3 és DX (50.31 ± 10.20%) kezelések szignifikánsan növelték a Bcl-2 pozitív sejtarányt a kontrollhoz viszonyítva, de a kombinált kezeléseknél tapasztalt változások egyedül a PCC kezeléshez viszonyítva voltak szignifikánsak (32. ábra B). 33. ábra. Bcl-2-t expresszáló AND timociták abszolút sejtszámának változása PCC, anti-cd3, 10,0 mg/kg dózisú DX és kombinált kezelések után. Az oszlopok három független kísérletbıl számolt átlagos Bcl-2 pozitív DP (C) és CD4 SP (D) arányát és S.D. értékeit mutatják. * p < 0,5 a kontrollhoz viszonyítva, # p < 0,05 a 10,0 mg/kg dózisú DX kezeléshez viszonyítva. Kiszámoltuk az Bcl-2 pozitív DP és CD4 SP sejtek abszolút számát is a 3. és 4. táblázat adatainak segítségével. Azt találtuk, hogy a Bcl-2-t expresszáló DP sejtek számát (0,4 ± 0,1 millió a kontroll esetben) a PCC + 10,0 mg/kg dózisú DX, illetve anti-cd3 + nagy dózisú DX kombinált kezelések szignifikánsan növelték (2,1 ± 0,4 és 1,5 ± 0,4 millió DP sejt), míg az önálló anti-cd3 és 10,0 mg/kg dózisú DX kezelés szignifikánsan csökkentette a Bcl-2 pozitív DP sejtek számát (0,1 ± 0,02 és 0,2 ± 0,02 millió). A PCC kezelés önállóan nem befolyásolta szignifikánsan a Bcl-2 pozitív sejtek számát (0,7 ± 0,3), míg az önálló nagy dózisú DX kezelés Bcl-2 pozitív DP sejtszám csökkentı hatása (0,2 ± 0,02 millió) visszafordítható volt az egyidejőleg adott PCC antigénnel vagy anti-cd3 monoklonális antitest adagolással (33. ábra A). 56

57 A CD4 SP sejtek között 3,1 ± 0,6 millió volt Bcl-2 pozitív a kontroll egérben. Úgy találtuk, hogy az összes kezelés szignifikánsan növelte a Bcl-2-t expresszáló CD4 SP sejtek számát, bár különbözı mértékben: PCC kezelés: 4,8 ± 0,4 millió; anti-cd3: 10.2 ± 1,8 millió; DX kezelés: 12,6 ± 1,1 millió; PCC + DX: 8,2 ± 0,7 millió és anti-cd3 + DX kezelés: 22,4 ± 6,2 millió CD4 SP sejt (33. ábra B). Érdekes megfigyelés, hogy a magas dózisú DX kezelés hatására megnövekedı Bcl-2-t expresszáló sejtek számát az egyidejőleg adagolt PCC antigén kezelés csökkentette, míg az anti-cd3 kezelést tovább növelte. Az egyes kezelések után kapott Bcl-2 pozitív sejtek arányának és abszolút sejtszámának összevetésébıl arra következtethetünk, hogy a DP sejtekben DX és anti-cd3 kezelés után magasabb lesz a Bcl-2 pozitív sejtek aránya, de ez abszolút számban szignifikánsan kevesebb sejtet jelent, tehát a Bcl-2-t nagy mennyiségben expresszáló sejtek élnek túl. Ugyanakkor a kombinált kezelés mind arányaiban, mind abszolút számban növelte a Bcl-2-t expresszáló sejtek számát Aktivált Caspase-3 szint a DP populációban Az aktivált Caspase-3 a Caspase-3 hasítása után kialakuló, az apoptózis effektor szakaszában szerepet játszó fehérje. Szintjét egy FITC-el konjugált, csak a hasítás után kialakuló formára specifikus monoklonális antitesttel vizsgáltuk áramlási citometriával az AND TCR transzgenikus egérmodellen, a TCR aktivációt kiváltó (PCC) és a GC hatását modellezı (DX) kezeléseink után. Sejtfelszíni jelölések egyidejő alkalmazásával csak a DP populációban található aktivált Caspase-3 szintet határoztuk meg. Kontroll esetben a DP timociták 1,31 ± 0,55 %-ban találtunk aktivált Caspase-3 fehérjét. PCC kezelés hatására 2,59 ± 0,25, % volt a pozitív sejtek aránya, amely nem volt szignifikáns növekedés. 10,0 mg/kg DX kezelés hatására az aktív Caspase-3 pozitív sejtek aránya szignifikánsan nıt (81,46 ± 4,12%), míg a kombinált PCC és DX kezelés esetében mind a kontroll állapothoz képest ugyan szignifikánsan nıtt, de a DX kezeléshez képest szignifikánsan alacsonyabb arányú aktivált Caspase-3 pozitív DP sejtarányt kaptunk (21,08 ± 0,54%). Tehát a kombinált PCC és DX kezelés megakadályozta a DX kezelés Caspase-3 aktiváló, azaz apoptózist indukáló hatását. (34. ábra). 57

58 34. ábra. Aktivált Caspase-3 pozitív AND TCR transzgenikus DP sejtek aránya kontroll esetben, PCC, 10,0 mg/kg dózisú DX és kombinált kezelés után. Az oszlopok három független kísérletbıl számolt átlagos Caspase-3 pozitív DP sejtek arányát és S.D. értékeit mutatják. * p < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva, # p < 0,05 a 10,0 mg/kg dózisú DX kezeléshez viszonyítva. 4.5 GLUKOKORTIKOID HORMON HATÁSÁNAK IN VITRO VIZSGÁLATA In vivo kísérleteink mellett in vitro tenyésztett timocitákon is vizsgáltuk a glukokortikoidok szerepét a timociták apoptózisában és túlélésében. In vitro kísérleteinkhez 1-2 napos BALB/c egerek intakt mikrokörnyezetét megtartott tímusz lebenyeit (szövet kultúra), illetve homogenizált tímuszból nyert sejteket (sejtkultúra) in vitro inkubáltunk GCR agonista DX-al, receptor antagonistákkal, illetve a lokálils szteroid szintézist gátló Methyraponnal In vitro glukokortikoid hatások tímusz szövetkultúra sejtjeinek túlélésére 1-2 napos BALB/c egerek teltávolított tímuszainak egy-egy lebenyét 24 órán át inkubáltuk in vitro DMEM médiumban (Ctrl), 10-7 mol/l DX-al, RU43044 GCR antagonistával, a kettı kombinációjával vagy szteroid szintézis gátló Methyraponnal, hogy vizsgáljuk a glukokortikoid hormon hatásának szerepét az egyes timocita alcsoportok túlélésében. Eredményeink szerint a DP sejtek esetében mind a DX kezelés, mind a lokális GC szintézis hiánya (Methyrapon) szignifikáns abszolút sejtszám csökkenést okozott a kontroll állapothoz viszonyítva (Ctrl: 27,3 ± 5,2 x 10 5 DP sejt, Methyrapon: 5,1 ± 2,3 x 10 5 DP sejt, DX: 6,0 ± 2,7 x 10 5 DP sejt) Az RU43044 GCR antagonistának önmagában nem volt 58

59 szignifikáns hatása a DP sejtszámra (24,6 ± 6,1 x 10 5 DP sejt), és kombinált kezelésnél nem gátolta a DX hatást sem (5,8 ± 2,4 x 10 5 DP sejt) (35. ábra). * * * 35. ábra. 24 órán át in vitro inkubált tímusz szövet kultúrában a túlélı DP sejtek számának alakulása DX, GC szintézis gátló (Methyrapon) és GCR antagonista (RU43044) kezelések hatására. (* p < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva). A fenti szövetkultúrában az érett, SP sejtek számát vizsgálva azt találtunk, hogy a kontroll állapothoz viszonyítva (Ctrl: 21,5 ± 1,5 x 10 4 CD4 SP sejt; 4,2 ± 0,8 x 10 4 CD8 SP sejt) a szteroid szintézis gátló Methyrapon hatására nem változott szignifikáns mértékben az érett CD4+ sejtek száma (20,1 ± 3,6 x 10 4 CD4 SP sejt), míg az érett CD8+ sejtek száma szignifikáns mértékben megnıtt (7,8 ± 2,4 x 10 4 CD8 SP sejt). A DX kezelés hatására a CD4 SP sejtek száma azonban szignifikáns mértékben lecsökkent, míg a CD8 SP sejtek száma nem változott (4,9 ± 1,7 x 10 4 CD4 SP sejt; 3,8 ± 1,6 x 10 4 CD8 SP sejt). A GCR antagonista kezelésnek önmagában nem volt szignifikáns hatása a kontroll állapothoz képest (19,8 ± 3,9 x 10 4 CD4 SP sejt; 3,4 ± 2,1 x 10 4 CD8 SP sejt), illetve a kombinációban adott RU43044 nem tudta meggátolni a DX hatását (5,4 ± 2,1 x 10 4 CD4 SP sejt; 4,8 ± 1,6 x 10 4 CD8 SP sejt) (36. ábra). Tehát az in vitro tenyésztett tímusz szövet kultúrában, melyben a timociták az eredeti sejtes mikrokörnyezetükben maradtak, a DP sejtek mind a magas dózisú GC hatására, mind a lokális szteroid szintézis gátlásával elért alacsony szteroid koncentrációra érzékenynek mutatkoztak, míg az érett sejtek közül a CD4 pozitívak száma csak a magas GC koncentráció hatására csökkent le szignifikáns mértékben. A GC hatás hiányában a 59

60 szelekción átesı DP sejteket csak a TCR-en keresztül érte aktiváló jel, mely önmagában a sejtek apoptózisát okozhatta a kölcsönös antagonizmus modell szerint. A GC hatás pontos mechanizmusa azonban nem ismert, mivel a GCR antagonista önmagában nem befolyásolta a sejtszámokat és a DX adás hatását sem tudta kivédeni. Ezért felmerül a DX nem receptor mediálta hatásmódja. * * 36. ábra. 24 órán át in vitro inkubált tímusz szövet kultúrában a CD4 SP és CD8 SP sejtek abszolút számának alakulása DX, GC szintézis gátló (Methyrapon) és GCR antagonista (RU43044) kezelések hatására. (* p < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva) In vitro Caspase inhibitor Z-VAD-fmk kezelés hatása a timociták túlélésére Annak bizonyítására, hogy a mikrokörnyezet milyen hatással volt a timociták túlélésére, BALB/c egér timocitáit 20 órán keresztül in vitro sejtkultúrában tenyésztettük 10% FCS tartalmú DMEM médiumban (Ctrl) illetve 10-7 mol/l DX, 60 mmol/l Z-VAD-fmk pancaspase inhibitor, illetve ezek kombinációjának hozzáadásával. Az inkubációs idı letelte után a sejteken Annexin-V-FITC és PI kettıs jelölést végeztünk és vizsgáltuk a kettıs negatív (élı) sejtek arányát az összes analizált sejthez viszonyítva (37. ábra). Eredményeink szerint az in vitro tenyésztett, kezeletlen timociták nagy része 20 óra inkubáció után már apoptotikus, csak 43,2 ± 4,2% volt élı. A médiumhoz adott DX tovább növelte az apoptotikus DP sejtszámot (14,4 ± 8,2% élı sejt). A pan-caspase inhibitor 60

61 Z-VAD-fmk in vitro adásakor növekedett a túlélı DP sejtek aránya (64,0 ± 9,5%), amely DX jelenlétében is megfigyelhetı volt (61,1 ± 8,5% élı DP sejt). * * * 37. ábra. 20 órás in vitro tenyésztett BALB/c timocita sejtkultúrában az élı (Annexin-V, PI kettıs negatív) sejtek aránya különbözı kezelések hatására. (* p < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva). Tehát az Z-VAD-fmk in vitro tenyésztés során kivédte mind a spontán, mind a DX indukálta timocita apoptózist, ezért megállapíthatjuk, hogy ezek a folyamatok Caspase aktiváció dependensek Z-VAD-fmk kivédi a spontán és DX indukálta Caspase-3 aktivációt A pan-caspase inhibitorral végzett kísérleteink során megvizsgáltuk, hogy az in vitro kezelt timocitákban aktiválódik-e a Caspase-3 enzim, mely a többféle apoptotikus útvonal találkozási pontján áll és a kaszkád egyik utolsó lépése. 3 hetes BALB/c egerek tímuszában a sejtek 5,2 ± 1,6%-ban mutatható ki az aktivált Caspase-3 enzim, a timociták 20 órás in vitro inkubálása után pedig a timociták már 32,2 ± 5,2%-a volt pozitív. Az in vitro inkubálás során alkalmazott DX kezelés nem változtatta meg az aktivált Caspese-3 pozitív sejtek arányát (31,3 ± 5,0%). Az in vitro inkubáció során alkalmazott pan-caspase inhibitor Z-VAD-fmk hatására elmaradt az inkubált kontrollnál tapasztalt Caspase-3 aktiváció (7,8 ± 2,3%), melyet a szimultán DX kezelés sem tudott befolyásolni (7,4 ± 2,9% aktivált caspase3 pozitív sejt, 38. ábra). 61

62 * * 38. ábra. Frissen eltávolított (ctrl), illetve 20 órán át in vitro inkubált (inkubált ctrl) timocitákban DX, Z-VAD-fmk, illetve kombinációjuk hatása az aktiválódott Caspase-3 pozitív timociták arányára. (* p < 0,05 a kontrollhoz viszonyítva). Eredményeink felvetik, hogy az in vitro tenyésztett timociták spontán apoptózisában szerepet játszó Casapase 3 aktiváció nem játszik döntı szerepet a DX indukálta apoptózisban, mivel ezen kezelések mellett nem találtunk nagyobb arányú Caspase-3 aktivációt, noha szignifikánsan több sejt lett apoptotikus. Tehát a GC és TCR aktiváció hatására kialakuló apoptózishoz Caspase independens folyamatok is vezethetnek. 4.6 TIMOCITÁK POZITV SZELEKCIÓJÁNAK MODELLEZÉSE A CD69 korai aktivációs molekula megjelenése a DP és a CD4 SP sejteken a sikeres pozitív szelekció jele (96). Annak bizonyítására, hogy a DX kezelés önmagában és TCR jelátviteli út aktivációjával együtt hogyan hat a DP sejtek túlélésére, megvizsgáltuk a túlélı sejtek CD69 expresszióját BALB/c egér DP timocitáinak CD69 expresszió változása glukokortikoid és glukokortikoid receptor antagonista kezelés hatására Megvizsgáltuk BALB/c egér DP timocitáinak CD69 aktivációs molekula expresszióját különbözı dózisú DX kezelések (0,2, 2,0, 20,0 mg/kg DX) és ezek RU43044 GCR antagonistával kombinált hatását. Eredményeink szerint a kontrollhoz viszonyítva a GCR antagonista önálló kezelés és a 0,2, és 2,0 mg/kg dózisú DX kezelés, illetve ezen dózisú 62

63 DX GCR antagonistával kombinált kezelések nem változtatták meg szignifikáns mértékben a CD69+ DP sejtek arányát. A magas dózisú (20,0 mg/kg) DX kezelés, és az RU43044-el kombinált kezelés szignifikáns mértékben növelte a CD69+ DP sejtek arányát (39. ábra). 39. ábra. BALB/c egér CD69+ DP timocitáinak %-os aránya különbözı dózisú in vivo DX és/vagy RU43044 (RU) kezeléseket követıen. Az oszlopok három független kísérlet eredményének átlagát és S.D. értékeit mutatják. * p < 0,005 a kontrollhoz viszonyítva. Elızıleg ismertetett eredményeink szerint a DX hatására dózis dependens módon csökken a tímusz össz sejtszám, nagy (20,0 mg/kg) dózisnál több mint 100-ad részére, fıleg a DP sejtek apoptózisa miatt. Azonban a nagy dózisú DX kezelés után is megmarad egy kis számú, nagyobb GCR expresszióval jellemezhetı DP csoport, mely sejtfelszíni anti-cd69- FITC antitesttel nagy arányban jelölıdik. A GC rezisztens sejtcsoport több mint 60%-ban volt CD69 pozitív. A kontroll mintában csak a DP sejtek 10-14%-a CD69 pozitív, noha a sejtszám több mint 100-szor nagyobb volt DX, anti-cd3, illetve kombinált kezelés hatása BALB/c timocita alcsoportok CD69 expressziójára A kombinált anti-cd3 és 0,2 mg/kg DX kezelés után megfigyelhetı apoptotikus jeleket nem mutató, érett sejtpopulációk arányának megnövekedése azt jelzi, hogy az anti-cd3, alacsony dózisú DX kombinált kezelés a sejtek érését segíti elı. Ezért megvizsgáltuk az 63

64 anti-cd3 és alacsony dózisú DX kezelés, valamint ezek kombinációjának hatását a timocita alcsoportok CD69 expressziójára. 40. ábra. CD69+ sejtszám változás in vivo anti-cd3, 0,2 mg/kg DX és kombinált kezelések hatására BALB/c egér tímuszában. Az oszlopok a kontroll egérhez viszonyítva (0 szint) mutatják a különbözı kezeléseket (anti-cd3, DX és kombinált) követıen megfigyelhetı abszolút CD69+ sejtszámokat az egyes timocita alcsoportokban. Az eredmények három független kísérlet átlagát mutatják. Egyszeri anti-cd3 és kombinált anti-cd3 + 0,2 mg/kg DX in vivo kezelést követıen emelkedı számú DP és CD4 SP sejten tudtuk megfigyelni a pozitív szelekciót jelzı CD69 antigént, míg az alacsony dózisú DX kezelés önmagában inkább csökkentette a CD69+ timociták számát a kontrollhoz képest mindegyik populációban. Ez a megfigyelés szintén alátámaszthatja a kombinált kezelés pozitív szelekciót elısegítı hatását (40. ábra) AND TCR transzgenikus egér DP és CD4 SP sejtjeinek CD69 pozitivitása DX, PCC antigén és kombinált kezelés után A pozitív szelekciót AND transzgenikus egérmodellen is vizsgáltuk, mely során az alacsony (1,0 mg/kg) és magas dózisú (10,0 mg/kg) DX kezelést PCC antigén injekcióval kombináltuk. A kezeletlen AND egér DP timocitáinak kb. 1%-a expresszálja a CD69 antigént. Minden kezelésünk hatására szignifikánsan nıt a CD69+ DP timociták aránya (PCC: 5,1 ± 2%, magas dózisú DX: 9,8 ± 0,6%, alacsony dózisú DX: 13,1 ± 1,6%, PCC + alacsony dózisú DX: 19,4 ± 9,7%; 41. ábra A). 64

65 41. ábra. AND transzgenikus egér DP és CD4 SP sejtjeinek CD69 pozitivitása alacsony és magas dózisú DX, antigén (PCC) és kombinált kezelés után. Az oszlopok a CD69+ timociták három független kísérletbıl számított átlagos százalékos arányát ± S.D. mutatják. * p < 0,05 ** p < 0,005 *** p < 0,001. PCC, alacsony dózisú DX és kombinált kezelés esetén a CD4 SP populációt vizsgálva szintén szignifikánsan magasabb arányú CD69+ sejtet találtunk (29,9 ± 10,9%, 28,2 ± 3,4%, 49,3 ± 28,2%) a kontroll CD4 SP sejtekhez képest (11,5 ± 4,7%). Ezzel szemben a magas dózisú DX kezelés nem befolyásolta a CD69+ CD4 SP sejtek arányát (9,2 ± 0,3%; 41. ábra B). Tehát az antigén (PCC), az alacsony dózisú DX, de fıleg a kombinált alacsony dózisú DX és PCC kezelés a DP sejtek CD4 SP sejtté kiérését segítette elı. 65

66 5 MEGBESZÉLÉS A timociták pozitív és negatív szelekcióját szabályozó molekuláris mechanizmusok a régóta tartó kutatások ellenére még mindig nem teljesen tisztázottak. Az ismert tímusz citokinek, növekedési faktorok és azok jelátviteli útjainak vizsgálata sem tárt fel minden ellentmondást. A glukokortikoidok timociták érésében játszott egzakt szerepe, amelyet a kölcsönös antagonizmus modellel írnak le, még nem egyértelmő, különösen in vivo kísérleti eredmények érhetık el korlátozott számban. A folyamatok további tisztázásához a sokat tanulmányozott BALB/c egérmodell mellett AND TCR transzgenikus egérmodellt is használtuk. A transzgenikus egérmodell szinte minden T-sejtje azonos specificitású TCR-t hordoz, mely a galamb citokróm c (Pigeon Cytochrome c, PCC) fragmentumára (KAERADLIAYLKQATAK) specifikus (81). Az egérmodell segítségével a nem antigén specifikus (pl. aktiváló hatású anti-cd3 monoklonális antitesttel végzett) indirekt TCR aktiváció mellett a specifikus antigénnel történı, direkt TCR-on keresztüli T-sejt aktiváció hatásait is tanulmányoztuk. A T-sejtek csak a 8-20 aminosav hosszúságú, MHC I vagy II molekulával asszociált, az antigén prezentáló sejtek felszínén bemutatott peptid antigéneket képesek felismerni (97). A transzgenikus AND egérben az antigén adagolás után a PCC antigén fragmentumok a tímusz makrofágjainak és dendritikus sejtjeinek felszínén I-E k molekulával asszociálódva kerülnek bemutatásra. A folyamat az antigén MHC II komplexhez nagy affinitással kapcsolódó Vβ3/Vα11 TCR pozitív timociták negatív szelekciójához, ezzel a tímusz sejtszámának csökkenéséhez vezet. Elıször a már széleskörően tanulmányozott BALB/c egér tímuszának összetételét hasonlítottuk össze a transzgenikus egér tímuszával. Eredményeink szerint a kétféle egér csecsemımirigyének sejtes összetétele nagyon eltér: a vad típusúban az intermedier fejlettségő DP sejtek dominálnak, míg a transzgenikus egérnél a CD4 pozitív érett sejtek vannak jelen legnagyobb arányban és szinte nem is lehet CD8 pozitív sejtet kimutatni. Ennek oka a transzgén mőködése, amely a T-sejt prekurzorokban a germ line TCR-bıl egyetlen típusú átrendezıdött Vβ3/Vα11 TCR kialakulását eredményezi, amely az adott MHCII segítségével a pozitív szelekció során csak CD4+ sejtek túlélését biztosítja a timocitáknak. 66

67 A transzgenikus egérben az életkor elırehaladtával nem következik be a tímusz involúciója, még idıs egerekben is a fiatal korra jellemzı mérető csecsemımirigyet találhatunk. Régóta ismert, hogy a glukokortikoid hormon analóg DX kezelés jelentısen csökkenti a tímusz méretét (90). A glukokortikoidok érett és éretlen timocitáknál is apoptózis váltanak ki (72). Az egyes timocita alcsoportok eltérı glukokortikoid érzékenységének pontos oka azonban nem magyarázott. Az egyes populációk különbözı GCR expressziós szintje lehetne az egyik kézenfekvı magyarázat a különbözı glukokortikoid érzékenységre. A szabad citoplazmáris és ligand kötött receptort egyaránt felismerı monoklonális antitesttel (82) végzett vizsgálataink szerint a GCR szint jelentısen eltérı az egyes timocita alcsoportokban: a DP sejtek tartalmazzák a receptort a legkisebb mennyiségben, melynél több található a CD4 SP, a CD8 SP populációkban, és legtöbb a DN sejtekben. Az AND transzgenikus egérmodellben az alacsonyabb DP GCR expressziót mind a glukokortikoid kezelés, mind TCR aktiváció tovább csökkentette. A TCR aktivációt követı GCR expresszió csökkenés magyarázatához még további kísérletek szükségesek, noha a jelátvitel során bekövetkezı AP-1, NFAT, NFκB és Elk aktiváció már ismert (98), melynek szerepe lehet a GCR downregulációjában. A DP sejtek reagálnak a legintenzívebben a glukokortikoidok indukálta apoptózissal, amely arra utal, hogy a GCR szint önmagában nem meghatározó a glukokortikoidok iránti érzékenység szempontjából. Más jelátviteli mechanizmusok is befolyásolhatják a sejtek glukokortikoid érzékenységét (72). A DP timociták alacsonyabb GCR expressziójának egyik lehetséges magyarázata a DP timociták környezetében található, lokálisan magasabb koncentrációjú, a kortikális epitheliális sejtek által termelt glukokortikoid hormon hatására bekövetkezı homológ downregulációs folyamat lehet. Nagy dózisú glukokortikoid hormon in vivo alkalmazásakor egyedül a DP populációban találtunk GCR expresszió növekedést, majd ez egy hét múlva visszaállt az eredeti értékre. Az érett SP populációkban a szeteroid hatásra még nyolc nappal a nagy dózisú DX kezelés után is alacsonybb GCR expressziót találtunk, ami feltételezéseink szerint a túlélı és tovább érı (DP) sejtek hormon indukálta GCR downregulációjának a következménye. A glukokortikoid-gcr komplex 30 percen belül a 67

68 magba transzlokálódik (49), ahol különbözı gének (GRE) transzkripciós faktoraként hat (50). A GCR génje szintén tartalmaz GRE-t, amely szerepet játszhat a GCR expresszió glukokortikoidok által történı regulációjában. A glukokortikoidok bizonyítottan szerepet játszanak a timociták mellett más sejtvonalak GCR expressziós szintjének meghatározásában is (99). Az irodalomban leírták, hogy a GCR 1A promóterrıl történı, az egyes szövetekben eltérı expressziója, felelıs a T-limfociták glukokortikoid érzékenységéért és GC indukálta apoptózisáért (100). A DP sejtek alacsony GCR expressziója és glukokortikoidok iránti nagyfokú érzékenysége között fennálló éles ellentmondás felveti nem genomikus GCR jelátviteli mechanizmusok jelenlétét is. A nem genomikus jelátviteli folyamatok egyik lehetséges módja, hogy a GCR más jelátviteli folyamatokban résztvevı faktorokkal lép kölcsönhatásba a citoplazmában (57). A Hsp-90 lehet az egyik ilyen faktor, amelyrıl kiderült, hogy Lck, Raf és ERK kötésen keresztül szerepet játszik a TCR jelátvitelében is (101), és szerepet játszik a timociták pozitív szelekciójában (102). Ismert, hogy az inaktív (ligandot nem kötı) GCR szintén a Hsp-90-hez kötve található a citoplazmában (103), így ez a molekula fontos érintkezési pont lehet a TCR és GCR jelátvitel kapcsolatában, molekuláris magyarázatot adva a kölcsönös antagonizmus modellhez. Intézetünkben folytatott kutatások során Jurkat T sejtekben a ZAP-70 molekulát egy másik lehetséges kapcsolódási pontnak találtuk a GCR és TCR jel között (104). Ezen nem genomikus mechanizmusok jelenlétét magyarázhatja az a megfigyelésünk is, hogy a glukokortikoid antagonisták nem tudták meggátolni a DP sejtek DX indukálta deplécióját és nem tudták kiküszöbölni a korai apoptotikus markerek megjelenését 4 órával DX adagolást követıen. A glukokortikoid-gcr komplex számos más transzkripciós faktorral bizonyított interakciója, mint például az NFκB (105), AP-1 (106, 107), CREB (108) és STAT-5 (109), felelıs lehet egyes DX hatásokért. Autoregulációhoz hasonlóan a glukokortikoidok szerepet játszanak a GCR expresszió szabályozásában. Munkánk egyik eredménye a glukokortikoid indukálta GCR expressziós változások és apoptotikus markerek (Annexin V / PI) idıbeli lefolyásának vizsgálata egér timocitákban. Érdekes mintázatot találtunk a GCR szintek változásában: egyszeri nagy dózisú DX adagolást követıen BALB/c egerekben 16 óráig nıtt a receptor expressziója, majd azt követıen folyamatosan csökkent a vizsgált 24 óra idıtartamban. Hasonló 68

69 változásokról számoltak be patkány hepatoma sejtekben (110). A 24 óra után talált GCR expresszió mértéke szintén hasonló az irodalomban jegyzett hasonló vizsgálatok eredményeihez (111, 112). Úgy tőnik, hogy a DP sejtekben nem mőködött a többi sejtre jellemzı GCR homológ downreguláció, amely jelentıs szerepet játszik a glukokortikoid rezisztenciában (98). A GCR expresszió lecsökkenése közös mechanizmus minden timocita alcsoportban, kivéve a DP populációt. A módosult GCR szint csökkenési hajlam magyarázhatja a DP sejtek fokozott glukokortikoid érzékenységét a változatlan GCR szint miatt. Mivel a GCR béta izoforma hiányzik egerekben, ennek inhibitoros hatásával (113) nem kell számolni kísérleti rendszerünkben. A TCR-n elinduló jelátviteli folyamatok egyik útja a Ca ++ szignál. Annak tisztázására, hogy van-e szerepe a különbözı timocita alcsoportok eltérı TCR-n keresztüli aktivációjában az intracelluláris szabad Ca ++ koncentrációnak, meghatároztuk annak szintjét mind a négy populációban. Az eltérı nyugalmi szabad intracelluláris Ca ++ szinttel jellemezhetı egyes timocita alcsoportok a TCR direkt stimulálásának következtében eltérı kinetikájú és amplitúdójú Ca ++ szint növekedéssel reagálnak. A legnagyobb arányú és leggyorsabb Ca ++ szint növekedést az érett CD4 SP populáció sejtjeinél találtuk. Ezt az eredményünket alátámasztja az az irodalmi adat is, hogy a DP sejtek érett CD4 SP illetve CD8 SP elkötelezıdésében szerepet játszik az intracelluláris Ca ++ szint mégpedig oly módon, hogy a magasabb Ca ++ szint a CD4 SP irányú elkötelezıdést segíti elı (114). A GCR és TCR jelet követı tímusz sejtszám és sejtes összetétel meghatározáson túl a kezeléseink hatására kialakuló timocita vesztés hátterében álló apoptotikus folyamatokat is vizsgáltuk, különösen korai apoptotikus jelek (Annexin V pozitivitás) és a mitokondrium szempontjából. A timociták apoptózisa számos faktor által szabályozott bonyolult folyamat (115) melynek tanulmányozása során a fenti két érzékeny, az apoptózis korai szakaszára specifikus detektáló módszeren kívül a Bcl-2 expressziót és Caspase-3 aktivációt vizsgáltuk részletesebben. A GCR expresszió változásának lefutásának mintázatához igazodott az apoptotikus sejtek arányának változása is: egy 4 órával a DX kezelést követı növekedést figyeltünk meg a korai apoptotikus sejtek arányában, amit késıi apoptotikus markereket mutató sejtek 69

70 arányának megnövekedése követett órával a kezelés után. Nagyon hasonló apoptózis kinetikát találtak C57BL/6 egerekben is (116). A GCR expresszió és az apoptotikus sejtek arányának változása együtt járt a tímusz DP sejtjeinek depléciójával. A tímuszt alkotó limfoid sejtek abszolút száma az exogén szteroid adás hatására koncentráció dependens módon drámai mértékben csökkent. Ez volt a helyzet az anti-cd3 vagy TCR stimuláló PCC kezelés hatására is. Hasonlóan a BALB/c egérmodellben talált eredményeinkhez, az AND transzgenikus egér timuszában is a DP sejtek a legérzékenyebbek magas dózisú DX adagolásra, bár az alacsony dózisú DX és az antigén kezelés is növelte az Annexin V pozitív DP sejtek arányát. Ezért a timociták kezeléseink hatására bekövetkezı abszolút sejtszámának csökkenését apoptotikus folyamatok következményének tartjuk. A CD4 SP sejteknél, alacsony dózisú DX, illetve kombinált antigén és glukokortikoid kezelések után talált Annexin V arány növekedést a glukokortikoid hormon aktivált T-sejteknél leírt proapoptotikus hatásának tartjuk (117). A DP sejtekben a GCR vagy a TCR aktiváció önmagában és együttesen is fokozott foszfatidil-szerin externalizálódáshoz és csökkent mitokondrium membránpotenciálhoz vezet. Bár relatíve kevesebb korai apoptotikus DP sejtet találtunk, amikor a két aktivációt együtt váltottuk ki, az egyszeres kezelésekhez viszonyítva, hasonlóan a munkánkat megelızı in vitro eredményekhez (78). Ezen eredmények világosan mutatják, hogy a szimultán GCR és TCR stimuláció során tapasztalható magasabb arányú DP timocita túlélés a korai apoptotikus folyamatok gátlásának köszönhetı, ami a két jelátviteli út összekapcsolódását jelzi és a kölcsönös antagonizmus modellt támasztja alá. Mivel az AND TCR transzgenikus egerek tímuszában a DP és CD4 SP sejtek alkotják az összes sejt több mint 90%-át, kísérleteink során fıleg erre a két sejtcsoportra koncentráltunk. Mind a GCR, mind a TCR stimulus az éretlen DP sejtek számában okozott nagy csökkenést, míg a CD4 SP érett populáció csökkenése kevésbé volt szembetőnı. Mind a BALB/c, mind az AND TCR transzgenikus egereknél szignifikánsan több DP timocita menekült meg az apoptózistól, ha GCR stimulációt együtt alkalmaztuk a TCR stimulációval, ami nem volt megfigyelhetı a CD4 SP populációban. 70

71 Az antigén in vivo jelenléte szignifikáns DP sejtarány csökkenést okozott, míg a glukokortikoid és a kombinált kezelés szinte teljesen eltőntette a DP populációt. Ezek a változások a CD4 SP alcsoport arányának egyidejő növekedésével jártak, amely arra utal, hogy a DP sejtek egy része a kezelések hatására valószínőleg differenciálódott és átjutott ebbe az érettebb stádiumba. A Bcl-2 egy anti-apoptotikus tagja a Bcl-2 protein családnak, amelybe mind pro-, mind anti-apoptotikus hatású molekulák tartoznak. Más közleményekhez hasonlóan (118) mi is eltérı Bcl-2 expressziót mutattunk ki az egyes timocita alcsoportokban. Egy T-sejt hibridómákkal végzett in vitro kísérlet bizonyította, hogy a Bcl-2 és a Bcl-xL molekulák szelektíven antagonizálják a glukokortikoidok által indukált apoptózist (119). Kísérleteinkben bizonyítottuk, hogy a TCR stimulus GCR agonistával együtt alkalmazva megnöveli a Bcl-2 pozitív DP sejtek arányát, jelezve azok szelekciós elınyét. Más közlemények leírták azt is, hogy a pozitív szelekció az anti-apoptotikus Bcl-2 expressziójának növekedésével jár (120, 121), amely összefüggésben van a DP timociták túlélésével (122). A Bcl-2 egyik túlélést elısegítı mechanizmusa az lehet, hogy elısegíti a mitokondrium membrán integritásának fenntartását azáltal, hogy interakcióba lép a külsı membrán fehérjéivel (123). Ezt húzzák alá saját megfigyeléseink is, melyek szerint a kombinált kezelések protektív hatással vannak a mitokondriumok membránpotenciáljára. Az aktivált Caspase-3 az apoptózis effektor szakaszában szerepet játszó fehérje. Eredményeink szerint a DX indukálta DP timocita apoptózisban aktiválódott a Caspase-3 enzim, míg az anti-cd3 antitesttel kiváltott TCR aktiváció hatására kialakuló apoptózisban nem. Amennyiben a két jel együtt érte a sejtet, akkor csak részleges aktivációt figyeltünk meg. Irodalmi adatok alapján a Caspase-3 aktiváció mértéke timocitákban arányos az apoptózis mértékével, a DNS töredezettségével és a FAS és Bax expresszió szintjével (124). A DX adagolást 4 órával követı GCR expresszió változásának és a foszfatidil-szerin molekulák külsı membránba történı transzlokációjának egyidejőségébıl arra következtettünk, hogy a GCR szerepet játszik az apoptózis korai lépéseinek szabályozásában. Mivel ezeket a korai (4 órán belüli) hatásokat nem befolyásolta a glukokortikoid antagonista kezelés, felmerül a glukokortikoidok nem genomikus hatásmechanizmusának lehetısége. Az egyszeri nagy dózisú DX kezelés után órával 71

72 detektálható apoptózist gátolta a glukokortikoid antagonista elıkezelés, amely jelenségrıl már más kutatócsoport is közölt adatokat (125). Az RU486 glukokortikoid receptor antagonistáról bizonyították, hogy meggátolja a GCR nukleáris transzlokációját patkány timocitákban (126) és hogy stabilizálja a GCR-Hsp-90 asszociációját egér limfomában (127). Az irodalomban azonban található adat arról is, hogy a GCR RU486 kezelést követıen is transzlokálódik a sejtmagba (99, 128), valamint részleges agonista hatásáról is beszámoltak (129, 130). Az ellentmondó eredmények arra utalnak, hogy az RU486 antagonista hatását a kísérleti körülmények, a vizsgált sejt-szövet nagymértékben befolyásolja. Az in vivo kísérleteinkkel párhuzamosan in vitro is vizsgáltuk a glukokortikoidok hiányát a timociták apoptózisában és túlélésében. A tímusz szövet kultúrában, ahol megtartott volt az eredeti mikrokörnyezet, a lokális szteroid szintézist teljesen le tudtuk gátolni és szteroid mentes médium használatával minimálisra tudtuk csökkenteni a glukokortikoid hatást. A DP sejtek mind a glukokortikoidok megvonására, mind a magasabb glukokortikoid szintre érzékenynek mutatkoztak. A GC hatás hiányában a szelekción átesı DP sejteket csak a TCR-en keresztül érte aktiváló jel, mely önmagában a sejtek apoptózisát okozhatta a kölcsönös antagonizmus modell szerint. A GC hatás pontos mechanizmusa azonban nem ismert, mivel a GCR antagonista kezelésünk önmagában nem befolyásolta a sejtszámokat és a DX adás hatását sem tudta kivédeni. Ezért felmerül a DX GCR independens hatásmódja. Az 1-2 napos BALB/c egér tímusz szövetkultúránkban és sejtkultúránkban is nagy arányú spontán apoptózist találtunk, mely valószínőleg Caspase dependens folyamat, mivel Caspase inhibitorral csökkent a mértéke. Az érési és szelekciós folyamatok további in vitro kísérletezéséhez azonban a reaggregált tímusz kultúra használatára lesz szükség (131). A sikeres pozitív szelekciót követıen a DP és SP sejtek felszínükön a CD69 antigént expresszálják (132). Ezt a jelenséget felhasználtunk a TCR + GCR aktiváció indukálta pozitív szelekció detektálására a DP és CD4 SP sejtpopulációkban. Mindkét egértörzsben az antigén/cd3 indukálta TCR aktiváció, illetve a DX kezelések önállóan is növelte a CD69 pozitív DP sejtek arányát, de a kombinált PCC és DX kezelés volt a leghatásosabb. Ugyanakkor a CD4 SP sejtek között csak az antigén, az alacsony dózisú DX és a kombinált 72

73 kezelések hatására nıtt meg a pozitívan szelektálódott sejtek aránya, míg a jelenség nem volt megfigyelhetı magas dózisú DX kezelés után. Valószínő, hogy a magas dózisú DX hatása csak átmeneti CD69 pozitív sejtarány növekedés, amelyet a sejtek apoptózisa követ. Ez a jelenséget támasztja alá az egyes sejtvonalaknál megfigyelhetı CD69 és CD25 pozitivitás megjelenése spontán vagy szteroid indukálta apoptózis során (133). Ezzel szemben az alacsony dózisú DX és/vagy antigén kezelés hatására végbemenı pozitív szelekció következménye a CD69 pozitív, túlélı CD4 SP sejtek nagyobb aránya. Mindkét egértörzsben talált eredményeink azt a megfigyelést támasztják alá, hogy a glukokortikoidok alacsony dózisban elısegítik a pozitív szelekciót (134) és a sejtek túlélését (135). Eredményeinkbıl továbbá arra következtetünk, hogy az antigén és alacsony dózisú glukokortikoidok együtt képesek pozitív szelekció serkentésére a DP timocitákban, mivel az alacsony dózisú glukokortikoid, illetve a kombinált antigén és glukokortikoid kezelés okozta a legnagyobb növekedést az érett/éretlen sejtarány növekedésben, valamint szignifikáns növekedést a CD69 expresszióban. 42. ábra. A GC hatás és a TCR jel együttes hatásának modellje. Eredményeink szerint a kölcsönös antagonizmus modellben szereplı GCR és TCR aktiváció hatására kialakuló apoptózis (136) korai lépései (membrán foszfolipid 73

74 aszimmetria eltőnése, mitokondriumok mőködésének gátlása) mindenképpen lezajlanak a két jel szimultán jelenlétekor is. A programozott sejthalál effektor szakasza azonban legátlódik, ha a két jel együttesen van jelen, valószínőleg a Ras aktiválásán keresztül. Összefoglalóan elmondhatjuk, hogy eredményeink szerint a DP érési stádiumban lévı timocitákon az amúgy apoptózist kiváltó stimulusok együttesen az éretlen sejtek túléléséhez vezetnek, ellentétben az érett sejtekkel. Feltételezzük, hogy ennek a mechanizmusnak az egyik kulcs eleme a Bcl-2 molekula, amelyet a TCR és GCR szimultán jelének hatására a pozitív szelekción átesett timociták nagyobb arányban expresszálnak. Eredményeink további bizonyítékokat szolgáltatnak annak megismeréséhez, hogy a glukokortikoid hormonok miként befolyásolják a timociták szelekciós lépéseit mind antigén jelenlétében, mind annak hiányában. Ez a hatás a pozitívan szelektált sejtek (Vβ3/Vα11 TCR / CD4 SP) szignifikánsan magasabb arányát (valószínőleg PCC antigént kötı I-E k -t alacsony affinitással felismerı sejtek) okozza, nagyarányú negatívan szelektált sejt (a magas affinitással TCR-t hordozó sejtek) jelenlétében. Ezen döntési folyamat során nagy szerepe van a TCR és GCR jelátviteli utak közötti kölcsönhatásoknak, melynek alaposabb megismerésével, illetve a GCR egyéb jelátviteli utakkal való interakciójának pontos feltárásával valószínőleg magyarázni tudnánk a glukokortikoidok sokrétő hatásait a T-sejt érés bonyolult folyamatára. 74

75 6 KÖSZÖNETNYILVÁNTÁS Szondi Zsuzsának (Debreceni Egyetem, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet) az AND TCR transzgenikus egértörzsért. Prof. Dr. Szekeres-Barthó Júliának a GCR antagonistákért. Pápa Lászlónénak a technikai segítségért. 75

76 RÖVIDTÉSEK JEGYZÉKE AF-1 activation function 1 AICD activation induced cell death (aktiváció indukálta sejthalál) AP1 activator proteine 1 AND T-sejt receptor transzgenikus egérmodell CD cluster of differentiation CD4 SP CD4 pozitív, érett, naiv T helper sejt CD4 SP CD8 pozitív, érett, naiv T citotoxikus sejt cgcr citoplazmáris glukokortikoid receptor DBD DNA bindig domain (DNS kötı domén) DN double negative (kettısen negatív) DP double positive (kettısen pozitív) DX dexamethasone ERK extracellular signal-regulated kinase Gads Grb2-releated adapter downstream of Shc GC glukokortikoid hormon GCR glukokortikoid receptor Grb-2 Growth factor receptor bound protein GRE glukokortikoid responsive element GTP - Guanosine-5'-triphosphate HIV Humán Immundeficiencia Vírus ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif LAT linker for activation of T cells LBD ligand bindig domain MAPK mitogen-activated protein kinase MFI mean fluorescence intensity (átlagos fluoreszcencia intenzitás) mgcr membrán asszociált glukokortikoid receptor MHC major histocompatibility complex NBRE NGFI-B responsive element NF-ATc nuclear factor of activated T cells NF-kB nukleáris faktor-kb ngre negatív glukokortikoid responsive element 76

77 NTD N-terminal domain PCC pigeon cytochrome C (galamb citokróm C) PE phycoerythrin PBS phosphate buffered saline PI propidium iodide pgre pozitív glukokortokoid responsive element PLCγ-1 phospholipase C gamma 1 PS phosphatidyl serine PTK protein thyrosine kinase RE responsive element SLP-76 SH2 domain leukocyte protein, 76kDa SMAC supramolecular activation cluster SOS Son of Sevenless SP single positive, egyszeresen pozitív timociták Src Ross sarcoma onkogén STAT signal transducers and activator of transcription Tc citotoxikus (CD8+) T-sejt TCR T-sejt receptor Th helper (CD4+) T-sejt TL tímusz leukémia antigén TNF tumor necrosis factor ZAP-70 ζ lánc asszociált protein tirozin kináz (70kDa) 77

78 7 PUBLIKÁCIÓS LISTA 7.1 A TÉZIS ALAPJÁT KÉPEZİ PUBLIKÁCIÓK 1. Pálinkás L, Talabér G, Boldizsár F, Bartis D, Németh P, Berki T. Developmental shift in TcR-mediated rescue of thymocytes from glucocorticoid-induced apoptosis. Immunobiology. 2008; 213(1):39-50 IF: (2007-ben) 2. Boldizsár F, Pálinkás L, Czömpöly T, Bartis D, Németh P, Berki T. Low glucocorticoid receptor (GR), high Dig2 and low Bcl-2 expression in double positive thymocytes of BALB/c mice indicates their endogenous glucocorticoid hormone exposure. Immunbiology. 2006; 211(10): IF: 1, Boldizsár F, Pálinkás L, Bartis D, Németh P, Berki T. Antigen and glucocorticoid hormone (GC) induce positive selection of DP thymocytes in a TcR transgenic mouse model. Immunol Lett. 2003; 90(2-3): IF: 1, Berki T, Pálinkás L, Boldizsár F, Németh P. Glucocorticoid (GC) sensitivity and GC receptor expression differ in timocite subpopulations. International Immunology. 2002; 14(5): IF: 3, EGYÉB PUBLIKÁCIÓK 5. Molnár T, Jakab L, Palinkas L, Molnár TF, Bogár L, Illés Z. Increased levels of baseline biomarkers reflecting platelet and endothelial activation predict early cognitive dysfunction after lung surgery. Eur J Anaesthesiol. 2009; publikálás alatt 6. Kumánovics G, Minier T, Radics J, Pálinkás L, Berki T, Czirják L. Comprehensive investigation of novel serum markers of pulmonary fibrosis associated with systemic sclerosis and dermato/polymyositis. Clin Exp Rheumatol. 2008; 26(3): IF: (2007-ben) 7. Aradi D, Kónyi A, Pálinkás L, Berki T, Pintér T, Tahin T, Horváth I, Papp L, Komócsi A. Thienopyridine therapy influences late outcome after coronary stent implantation. Angiology. 2008; 59(2): IF: (2007-ben) 8. Bartis D, Boldizsár F, Kvell K, Szabó M, Pálinkás L, Németh P, Monostori E, Berki T. Intermolecular relations between the glucocorticoid receptor, ZAP-70 kinase, and Hsp-90. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 354(1): IF: Hajto T, Berki T, Palinkas L, Boldizsar F, Nemeth P. Investigation of the effect of mistletoe (Viscum album L.) extract Iscador on the proliferation and apoptosis of murine thymocytes. Arzneimittelforschung. 2006; 56(6A): IF: 0, Pár G, Berki T, Pálinkás L, Balogh P, Szereday L, Halász M, Szekeres-Barthó J, Miseta A, Hegedus G, Mózsik G, Hunyady B, Pár A. [Immunology of HCV infection: 78

79 the causes of impaired cellular immune response and the effect of antiviral treatment] Orv Hetil. 2006; 147(13): IF: Hajtó T, Berki T, Pálinkás L, Boldizsár F, Németh P. Effects of mistletoe extract on murine thymocytes in vivo and on glucocorticoid-induced cell count reduction. Forsch Komplement Med 2006; 13(1):22-7. IF: 1, Bartis D, Boldizsár F, Szabó M, Pálinkás L, Németh P, Berki T. Dexamethasone induces rapid tyrosine-phosphorilation of ZAP-70 in Jurkat cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. No. 2006; 98(2-3): IF: 2, Czömpöly T, Olasz K, Simon D, Nyárády Z, Pálinkás L, Czirják L, Berki T, Németh P. A possible new bridge between innate and adaptive immunity: Are the antimitochondrial citrate synthase autoantibodies components of the natural antibody network? Mol. Immunol. 2006; 43(11): IF: Pál J, Pálinkás L, Nyárády Z, Czömpöly T, Marczinovits I, Lustyik G, Saleh Ali Y, Berencsi G, Chen R, Varró R, Pár A, Németh P. Sandwich type ELISA and a fluorescent cytometric microbead assay for quantitative determination of hepatitis B virus X antigen level in human sera. J. Immunol. Methods. 2005; 306(1-2): IF: 2, Bánvölgyi A, Pálinkás L, Berki T, Clark N, Grant AD, Helyes Z, Pozsgai G, Szolcsányi J, Brain SD, Pintér E. Evidence for a novel protective role of the vanilloid TRPV1 receptor in a vutaneous contact allergic dermatitis model. J. Neuroimmunol. 2006; 169(1-2): IF: 2, Hajtó T, Hostanska K, Berki T, Pálinkás L, Boldizsár F, Németh P. Oncopharmacological perspectives of a plant lectin (viscum albumin agglutinin-i): Overview of recent results from in vitro experiments and in vivo animal models, and their possible relevance for clinical applications. Evid. Based Complement Alternat. Med. 2005; 2(1): IF: Engelmann P, Pálinkás L, Cooper EL, Németh P. Monoclonal antibodies identify four distinct annelid leukocyte markers. Developmental and Comperative Immunology 2005; 29: IF: 3, Engelmann P, Molnár L, Pálinkás L, Cooper EL, Németh P. Earthworm leukocyte populations specifically harbor lysosomal enzymes that may respond to bacterial challenge. Cell. Tissue Res. 2004; 316: IF: 2, Hajtó T, Berki T, Pálinkás L, Boldizsár F, Nagy G, Németh P. Galactoside-specific misletoe lectin modulate the dexamethasone-induced apoptosis and glucocorticoid receptor leveli n Balb/c thymocytes. In Vivo. 2003; 17(2): IF: 0,753 Összesített impakt faktor: 37,429 79

80 REFERENCIÁK 1. Spits H. Human T cell receptor gamma delta + T cells. Semin Immunol. 1991; 3(2): Chien Y, Bonneville M. Gamma delta T cell receptors Cell. Mol. Life Sci. 2006; 63: Terszowski, G, Muller SM, Bleul CC, Blum C, Schirmbeck R. et al. Evidence for a funcional second thymus in mice. Science 2006; 312: Rodewald HR. Thymus organogenesis Annual Review of Immunology. 2008; 26: Rossi FM, Corbel SY, Merzaban JS, Carlow DA, Gossens K, Duenas J, So L, Yi L, Ziltener HJ. Recruitment of adult thymic progenitors is regulated by P-selectin and its ligand PSGL-1. Nat Immunol. 2005; 6(6): Anderson G, Jenkinson EJ. Lymphostromal interactions in thymic development and function. Nat Rev Immunol. 2001; 1(1): Wu L. T lineage progenitors: the earliest steps en route to T lymphocytes. Curr Opin Immunol. 2006; 18(2): Laky K, Fowlkes BJ. Notch signaling in CD4 and CD8 T cell development. Curr Opin Immunol. 2008; 20(2): J.Nikolic-Zugid et. al. Role of self peptides in positively selecting the T-cell repertoirs. Nature 1990; 344: Pitkänen J, Peterson P. Autoimmune regulator: from loss of function to autoimmunity. Genes Immun. 2003; 4(1): Starr TK, Jameson SC, Hogquist KA. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 2003; 21: Maggi E, Cosmi L, Liotta F, Romagnani P, Romagnani S, Annunziato F. Thymic regulatory T cells. Autoimmun Rev. 2005; 4(8): Ladi E, Yin X, Chtanova T, Robey EA. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 2006; 7(4): Weninger W, Manjunath N, von Andrian UH. Migration and differentiation of CD8+ T cells. Immunol Rev. 2002; 186: McKinstry KK, Strutt TM, Swain SL. The effector to memory transition of CD4 T cells. Immunol Res. 2008; 40(2): Santori FR, Vukmanovic S. Delineation of signals required for thymocyte positive selection. J Immunol. 2004; 173(9):

81 17. Buhlmann JE, Elkin SK, Sharpe AH. A role for the B7-1/B7-2:CD28/CTLA-4 pathway during negative selection. J Immunol. 2003; 170(11): Pongracz J, Hare K, Harman B, Anderson G, Jenkinson EJ. Thymic epithelial cells provide WNT signals to developing thymocytes. Eur J Immunol. 2003; 33(7): Savino W, Mendes-Da-Cruz DA, Smaniotto S, Silva-Monteiro E, Villa-Verde DM. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. J Leukoc Biol. 2004; 75(6): Cohen JJ. Glucocorticoid-induced apoptosis in the thymus. Semin Immunol. 1992; 4(6): Vacchio MS, Papadopoulos V, Ashwell JD. Steroid production in the thymus: implications for thymocyte selection. J Exp Med. 1994; 179(6): Ashwell JD, King LB, Vacchio MS. Cross-talk between the T cell antigen receptor and the glucocorticoid receptor regulates thymocyte development. Stem Cells. 1996; 14(5): Jondal M, Pazirandeh A, Okret S. Different roles for glucocorticoids in thymocyte homeostasis? Trends Immunol. 2004; 25(11): Rojo JM, Bello R, Portolés P. T-cell receptor. Adv Exp Med Biol. 2008, 640: Wang JH, Meijers R, Xiong Y, Liu JH, Sakihama T, Zhang R, Joachimiak A, Reinherz EL. Crystal structure of the human CD4 N-terminal two-domain fragment complexed to a class II MHC molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(19): Kim PW, Sun ZY, Blacklow SC, Wagner G, Eck MJ. A zinc clasp structure tethers Lck to T cell coreceptors CD4 and CD8. Science. 2003; 301: Weiss RA, Clapham PR, McClure MO, McKeating JA, McKnight A, Dalgleish AG, Sattentau QJ, Weber JN. Human immunodeficiency viruses: neutralization and receptors. J Acquir Immune Defic Syndr. 1988; 1(6): Cole DK, Gao GF. CD8: adhesion molecule, co-receptor and immuno-modulator. Cell Mol Immunol. 2004; 1(2): Weber WE, Buurman WA, Vandermeeren MM, Raus JC. Activation through CD3 molecule leads to clonal expansion of all human peripheral blood T lymphocytes: functional analysis of clonally expanded cells. J Immunol. 1985; 135(4): Kuhns MS, Davis MM, Garcia KC. Deconstructing the form and function of the TCR/CD3 complex. Immunity. 2006; 24(2): Fodor S, Jakus Z, Mócsai A. ITAM-based signaling beyond the adaptive immune response. Immunol Lett. 2006; 104(1-2):

82 32. Cantrell D T cell antigen receptor signal transduction pathways. Annu Rev Immunol. 1996; 14: Andre E. Nel T-cell activation through the antigen receptor. Part1: Signaling components, signaling pathways, and signal integration at the T-cell antigen receptor synapse. J. Allergy. Clin. Immunol. 2002; 109(5): Janeway CA. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Ann. Rev. Immunol. 1992; 10: Weil R, Veillette A. Intramolecular and extramolecular mechanisms repress the catalytic function of P56lck in resting T-lymphocytes. J. Biol. Chem. 1994; 269: Rudd CE.Adaptors and molecular scaffolds in immune cell signaling. Cell 1999; 96: Ward SG. June CH, Olive D. PI 3-kinase: a pivotal pathway in T-cell activation? Immunol. Today 1996; 17: Genot E, Cleverely S, Henning S, Cantrell D. Multiple p21ras effector pathways regulate nuclear factor of activated T cells. EMBO J. 1996; 15: Janes PW, Ley SC, Magee AI. Aggregation of lipid rafts accompanies signaling via the T cell antigen receptor. J. Cell. Biol. 1999; 147: Reichardt, H.M., Immunomodulatory activities of glucocorticoids: insights from transgenesis and gene targeting. Curr. Pharm. Des. 2004; 10: Wyllie A.H. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 1980; 284: Fauci AS, Dale DC, Balow JE. Glucocorticosteroid therapy: mechanisms of action and clinical considerations. Ann Intern Med. 1976; 84(3): Subramanian S, Trence DL. Immunosuppressive agents: effects on glucose and lipid metabolism. Endocrinol Metab Clin North Am. 2007; 36(4): Mazziotti G, Giustina A, Canalis E, Bilezikian JP. Glucocorticoid-induced osteoporosis: clinical and therapeutic aspects. Arq Bras Endocrinol Metabol. 2007; 51(8): Pazirandeh, A., Xue, Y., Rafter, I., Sjo vall, J., Jondal, M., Okret, S. Paracrine glucocorticoid activity produced by mouse thymus epithelial cells. FASEB J. 1999; 13: Evans, R.M. The steroid and thyroid receptor superfamily. Science 1988; 240:

83 47. Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Lebo, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Primary structure and expression of a functional human glucocorticoid receptor cdna. Nature 1985; 318: Freedman LP, Luisi GV. Ont he mechanism of DNA binding by nuclear hormone receptors: a structural and functional perspective. J. Cell. Bioechem. 1993; 51: Berki T, Grama L, Németh P. Detection of steroid induced glucocorticoid receptor (GR) translocation and expression with a FITC labeled monoclonal antibody. Cytometry 2000; 10(Suppl.): Berg J.M. DNA binding specificity of steroid receptors. Cell 1989; 57: Abraham SM, et al. Antiinflammatory effects of dexamethasone are partly dependent on induction of dual specificity phosphatase. J. Exp. Med. 2006; 203: Dostert A, Heinzel T. Negative glucocorticoid receptor response elements and their role in glucocorticoid action. Curr. Pharm. Des. 2006; 10: Long F et al. Rapid nongenomic inhibitory effects of glucocorticoids on phagocytosis and superoxide anion production by macrophages. Steroids. 2005; 70: Solito E, Mulla A, Morris JF, Christian HC, Flower RJ, Buckingham JC. Dexamethasone induces rapid serine-phosphorylation and membrane translocation of annexin 1 in a human folliculostellate cell line via a novel nongenomic mechanism involving the glucocorticoid receptor, protein kinase C, phosphatidylinositol 3-kinase, and mitogen-activated protein kinase. Endocrinology 2003; 144: Hafezi-Moghadam A, Simoncini T, Yang Z, Limbourg FP, Plumier JC, Rebsamen MC, Hsieh CM, Chui DS, Thomas KL, Prorock AJ, Laubach VE, Moskowitz MA, French BA, Ley K, Liao JK. Acute cardiovascular protective effects of corticosteroids are mediated by non-transcriptional activation of endothelial nitric oxide synthase. Nat Med. 2002; 8: Buttgereit F, Straub RH, Wehling M, Burmester GR. Glucocorticoids in the treatment of rheumatic diseases: an update on the mechanisms of action. Arthritis Rheum. 2004; 50(11): Buttgereit, F., Scheffold, A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells. Steroids 2002; 67: Falkenstein E, Christ M, Feuring M, Wehling M. Specific nongenomic actions of aldosterone. Kidney Int. 2000; 57(4): Gametchu B, Chen F, Sackey F, Powell C, Watson CS. Plasma membrane-resident glucocorticoid receptors in rodent lymphoma and human leukemia models. Steroids. 1999; 64(1-2):

84 60. Grote H, Ioannou I, Voigt J, Sekeris CE. Localization of the glucocorticoid receptor in rat liver cells: evidence for plasma membrane bound receptor. Int J Biochem. 1993; 25(11): Opferman JT. Apoptosis in the development of the immune system. Cell Death Differ. 2008; 15(2): Green DR, Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 2004; 305(5684): Barnhart BC, Alappat EC, Peter ME. The CD95 type I/type II model. Semin Immunol. 2003; 15(3): Boya P, Kroemer G. Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene. 2008; 27(50): Kroemer G, Martin SJ. Caspase-independent cell death. Nat Med. 2005; 11(7): Alberola-Ila J, Hogquist KA, Swan KA, Bevan MJ, Perlmutter RM. Positive and negative selection invoke distinct signaling pathways. J. Exp. Med. 1996; 184: Kane LP, Hedrick SM. A role for calcium influx in setting the treshold for CD4+CD8+ thymocyte negative selection. J. Immunol. 1996; 156: Vasquez NJ, Kane LP, Hedrick SM. Intracellular signals that mediate thymic negative selection. Immunity 1994; 1: Voronicz JD, Lina A, Calnan BJ, Szychowski S, Cheng L, Winoto A. Regulation of the Nurr77 orphan steroid receptor in activation-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 1993; 15: ZhouT, Cheng J, Yang P, Wand Z, Liu C, SuX, Bluuethmann H, Mountz JD. Inhibition of Nurr77/Nurr1 leads to inefficient clonal deleetion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 1996; 183: Astar Winoto Genes involved id T-cell receptor mediatedapoptosisof thymocytes and T-cell hybridomas. Immunology 1997; 9: Ashwell JD, Lu FW, Vacchio MS. Glucocorticoids in T cell development and function. Annu Rev Immunol. 2000; 18: Psarra AM, Sekeris CE. Steroid and thyroid hormone receptors in mitochondria. IUBMB Life. 2008; 60(4): Johnson DT, Harris RA, French S, Blair PV, You J, Bemis KG, Wang M, Balaban RS. Tissue heterogeneity of the mammalian mitochondrial proteome. Am J Physiol Cell Physiol. 2007; 292(2):C

85 75. Sionov RV, Kfir S, Zafrir E, Cohen O, Zilberman Y, Yefenof E. Glucocorticoidinduced apoptosis revisited: a novel role for glucocorticoid receptor translocation to the mitochondria. Cell Cycle. 2006; 5(10): King LB, Vacchio MS, Ashwell JD. To be or not to be: mutually antagonistic death signals regulate thymocyte apoptosis. Int Arch Allergy Immunol. 1994; 105(4): Herold MJ McPherson KG Reichardt HM. Glucocorticoids in T cell apoptosis and function. Cell. Mol. Life Sci. 2006; 63: Zacharchuk CM, Mercep M, Chakraborti PK, Simons SS Jr, Ashwell JD. Programmed T lymphocyte death. Cell activation- and steroid-induced pathways are mutually antagonistic. J Immunol. 1990; 145(12): Vacchio MS, Lee JY, Ashwell JD. Thymus-derived glucocorticoids set the thresholds for thymocyte selection by inhibiting TCR-mediated thymocyte activation. J Immunol. 1999; 163(3): Periyasamy S, Sánchez ER. Antagonism of glucocorticoid receptor transactivity and cell growth inhibition by transforming growth factor-beta through AP-1-mediated transcriptional repression. Int J Biochem Cell Biol. 2002; 34(12): Kaye J, Hsu ML, Sauron ME, Jameson SC, Gascoigne NR, Hedrick SM. Selective development of CD4+ T cells in transgenic mice expressing a class II MHC-restricted antigen receptor. Nature. 1989; 341(6244): Berki T, Kumánovics G, Kumánovics A, Falus A, Ujhelyi E, Németh P. Production and flow cytometric application of a monoclonal anti-glucocorticoid receptor antibody. J. Immunological Methods 1998; 214, Compton, M. M. and Cidlowski, J. A. Rapid in vivo effects of glucocorticoids on the integrity of rat lymphocyte genomic deoxyribonucleic acid. Endocrinology 1986; 118: Pendergrass W, Wolf N, Poot M. Efficacy of MitoTracker Green and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry 2004; 61: Ly JD, Grubb DR, Lawen A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis 2003; 8: Macho A, Decaudin D, Castedo M, Hirsch T, Susin SA, Zamzami N, Kroemer G. Chloromethyl-X-Rosamine is an aldehyde-fixable potential-sensitive fluorochrome for the detection of early apoptosis. Cytometry. 1996; 25(4): Minta A, Kao JP, Tsien RY. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 1989; 264(14):

86 88. Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H, Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods. 1995; 184(1): Curnow SJ, Barad M, Brun-Roubereau N, Schmitt-Verhulst AM. Flow-cytometric analysis of apoptotic and nonapoptotic T-cell receptor-transgenic thymocytes following in vitro presentation of antigen. Cytometry 1994; 16(1): Barone KS, O'Brien PC, Stevenson JR. Characterization and mechanisms of thymic atrophy in protein-malnourished mice: role of corticosterone. Cell. Immunol. 1993; 148(1): Wiegers, G.J., Knoflach, M., Bock, G., Niederegger, H., Dietrich, H., Falus, A., Boyd, R., Wick, G. CD4(+)CD8(+)TCR(low) thymocytes express low levels of glucocorticoid receptors while being sensitive to glucocorticoid-induced apoptosis. Eur. J. Immunol. 2001; 31, Wiegers, G.J., Knoflach, M., Bock, G., Niederegger, H., Dietrich, H., Falus, A., Boyd, R., Wick, G. CD4(+)CD8(+)TCR(low) thymocytes express low levels of glucocorticoid receptors while being sensitive to glucocorticoid- induced apoptosis. Eur. J. Immunol. 2001; 31: Poot M, Zang YZ, Kramer JA, Wells KS, Jones LJ, Hanzel D, Lugade AG, Singer VL, Haugland RP: Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem 1996; 44: Chao, D.T., Korsmeyer, S.J., BCL-2 family: regulators of cell death. Annu. Rev. Immunol. 1998; 16: Veis, D.J., Sorenson, C.M., Shutter, J.R., Korsmeyer, S.J., Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair. Cell 1993; 75: I. Yamashita, T. Nagata, T. Tada, T. Nakayama. CD69 cell surface expression identifies developing thymocytes which audition for T cell antigen receptor-mediated positive selection. Int. Immunol. 1993; 5: Klein J, Sato A. The HLA system. Second of two parts. N Engl J Med. 2000, 14;343(11): Lin, J., Weiss, A. T cell receptor signaling. J. Cell Sci. 2001, 114: Schaaf MJ, Cidlowski JA. Molecular mechanisms of glucocorticoid action and resistance. J Steroid Biochem Mol Biol. 2002; 83(1-5): Purton JF, Monk JA, Liddicoat DR, Kyparissoudis K, Sakkal S, Richardson SJ, Godfrey DI, Cole TJ. Expression of the glucocorticoid receptor from the 1A promoter correlates with T lymphocyte sensitivity to glucocorticoid-induced cell death. J Immunol. 2004; 173(6):

87 101. Schnaider, T., Somogyi, J., Csermely, P., Szamel, M. The Hsp90-specific inhibitor geldanamycin selectively disrupts kinase-mediated signaling events of T-lymphocyte activation. Cell Stress Chaperones 2000, 5: Alberolanti-Ila, J., Hernandez-Hoyos, G. The Ras/MAPK cascade and the control of positive selection. Immunol. Rev. 2003, 191, Smith, D.F., Toft, D.O. Steroid receptors and their associated proteins. Mol. Endocrinol. 1993, 7: Bartis, D., Boldizsár, F., Kvell, K., Szabó, M., Pálinkás, L., Németh, P., Monostori, É., Berki, T. Intermolecular relations between the glucocorticoid receptor, ZAP-70 kinase, and Hsp-90. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 354: Ray, A., Prefontaine, K.E. Physical association and functional antagonism between the p65 subunit of transcription factor NF-kappa B and the glucocorticoid receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91: Periyasami, S., Sanchez, E.R. Antagonism of glucocorticoid receptor transactivity and cell growth inhibition by transforming growth factor-beta through AP-1 mediated transcriptional repression. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002, 34: Yang-Yen, H.F., Chambard, J.C., Sun, Y.L., Smeal, T., Schmidt, T.J., Drouin, J., Karin, M. Transcriptional interference between c-jun and the glucocorticoid receptor: mutual inhibition of DNA binding due to direct proteinprotein interaction. Cell 1990, 62: Zhang, Z., Jones, S., Hagood, J.S., Fuentes, N.L., Fuller, G.M. Stat3 acts as a coactivator of glucocorticoid receptor signaling. J. Biol. Chem. 1997, 272: Stocklin, E., Wissler, M., Gouilleux, F., Groner, B. Functional interactions between Stat5 and the glucocorticoid receptor. Nature 1996, 383, Okret, S., Poellinger, L., Dong, Y., Gustafsson, J.A. Down-regulation of glucocorticoid receptor mrna by glucocorticoid hormones and recognition by the receptor of a specific binding sequence within a receptor cdna clone. Proc. Natl. Acad. Sci. 1986, 83: Rosewicz S, McDonald AR, Maddux BA, Goldfine ID, Miesfeld RL, Logsdon CD. Mechanism of glucocorticoid receptor down-regulation by glucocorticoids. J Biol Chem. 1988; 263(6): Hoeck, W., Rusconi, S., Groner, B. Down-regulation and phosphorylation of glucocorticoid receptor in cultured cells. J. Biol. Chem. 1989, 264: Oakley, R.H., Jewell, C.M., Yudt, M.R., Bofetiado, D.M., Cidlowski, J.A. The dominant negative activity of the human glucocorticoid receptor beta isoform. Specificity and mechanisms of action. J. Biol. Chem. 1999, 274:

88 114. Adachi S, Iwata M. Duration of calcineurin and Erk signals regulates CD4/CD8 lineage commitment of thymocytes. Cell Immunol. 2002, 215(1): Hengartner, M.O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000, 407: Tosa, N., Murakami, M., Jia, W.Y., Yokoyama, M., Masunaga, T., Iwabuchi, C., Inobe, M., Iwabuchi, K., Miyazaki, T., Onoe, K., Iwata, M., Uede, T. Critical function of T cell death-associated gene 8 in glucocorticoidinduced thymocyte apoptosis. Int. Immunol. 2003, 15: Cancedda C, Filaci G, Puppo F, Ghio M, Contini P, Indiveri F. Immune homeostasis requires several biologic factors including glucocorticoid hormones. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002, 966: Ma, A., Pena, J.C., Chang, B., Margosian, E., Davidson, L., Alt, F.W., Thompson, C.B. Bclx regulates the survival of double-positive thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92: Memon, S.A.,Moreno, M.B., Petrak, D., Zacharchuk, C.M. Bcl-2 blocks glucocorticoid- but not Fas- or activation-induced apoptosis in T cell hybridoma. J. Immunol. 1995, 155: Linette, G.P., Grusby, M.J., Hedrick, S.M., Hansen, T.H., Glimcher, L.H., Korsmeyer, S.J. Bcl-2 is upregulated at the CD4+ CD8+ stage during positive selection and promotes thymocyte differentiation at several control points. Immunity 1994, 1: Williams, O., Mok, C.L., Norton, T., Harker, N., Kioussis, D., Brady, H.J. Elevated Bcl-2 is not a causal event in the positive selection of T cells. Eur. J. Immunol. 2001, 31: Chao, D.T., Korsmeyer, S.J. Bcl-2 family: regulators of cell death. Annu. Rev. Immunol. 1998, 16: Gross, A., McDonnell, J.M., Korsmeyer, S.J. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 1999, 13: Aquino Esperanza JA, Aguirre MV, Aispuru GR, Lettieri CN, Juaristi JA, Alvarez MA, Brandan NC. In vivo 5-fluorouracil-induced apoptosis on murine thymocytes: involvement of FAS, Bax and Caspase3. Cell Biol Toxicol. 2008, 24(5): Erlacher, M., Knoflach, M., Stec, I.E., Bock, G., Wick, G., Wiegers, G.J. TCR signaling inhibits glucocorticoidinduced apoptosis in murine thymocytes depending on the stage of development. Eur. J. Immunol. 2005, 35(11): Lefebvre, P., Danze, P.M., Sablonniere, B., Richard, C., Formstecher, P., Dautrevaux, M. Association of the glucocorticoid receptor binding subunit with the 90K nonsteroid- 88

89 binding component is stabilized by both steroidal and nonsteroidal antiglucocorticoids in intact cells. Biochemistry 1988, 27: Distelhorst, C.W., Howard, K.J., Evidence from pulsechase labeling studies that the antiglucocorticoid hormone RU486 stabilizes the nonactivated form of the glucocorticoid receptor in mouse lymphoma cells. J. Steroid Biochem. 1990, 36: Pariante, C.M., Pearce, B.D., Pisell, T.L., Su, C., Miller, A.H. The steroid receptor antagonists RU40555 and RU486 activate glucocorticoid receptor translocation and are not excreted by the steroid hormones transporter in L929 cells. J. Endocrinol. 2001, 169: Kraml, J., Kolinska, J., Sinkora, J., Zakostelecka, M., Kadlecova, L., Hirsova, D., Noskova, L. Glucocorticoid agonistic and antagonistic effects of mifepristone and onapristone on thymocyte subset composition and CD26/ dipeptidyl peptidase IV activity in infant male rats. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2003, 87: Nordeen, S.K., Boba, B.J., Moyer, M.L. Latent agonist activity of the steroid antagonist, RU486, is unmasked in cells treated with activators of protein kinase A. Mol. Endocrinol. 1993, 7: White A, Jenkinson E, Anderson G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. 2008; I. Yamashita, T. Nagata, T. Tada, T. Nakayama. CD69 cell surface expression identifies developing thymocytes which audition for T cell antigen receptor-mediated positive selection. Int. Immunol. 1993, 5: Kishimoto H, Surh CD, Sprent J. A role for Fas in negative selection of thymocytes in vivo. J. Exp. Med. 1998, 187(9): Vacchio, M.S., Lee, J.Y., Ashwell, J.D. Thymus-derived glucocorticoids set the thresholds for thymocyte selection by inhibiting TCR-mediated thymocyte activation. J. Immunol. 1999, 163: Erlacher M, Knoflach M, Stec IE, Böck G, Wick G, Wiegers GJ. TCR signaling inhibits glucocorticoid-induced apoptosis in murine thymocytes depending on the stage of development. Eur J Immunol. 2005, 35(11): Stephens, G.L., Ashwell, J.D., Ignatowicz, L. Mutually antagonistic signals regulate selection of the T cell repertoire. Int. Immunol. 2003, 15:

90 MELLÉKLETEK A tézis alapját képező eredeti közlemények. 90

91 ARTICLE IN PRESS Immunobiology 213 (2008) Developmental shift in TcR-mediated rescue of thymocytes from glucocorticoid-induced apoptosis La szlo Pálinka s, Gergely Talabér, Ferenc Boldizsa r, Domokos Bartis, Pe ter Ne meth, Timea Berki Department of Immunology and Biotechnology, University of Pécs, Szigeti út 12, H-7643 Pécs, Hungary Received 22 September 2006; received in revised form 24 May 2007; accepted 22 June 2007 Abstract Glucocorticoid hormone (GC) production by thymic epithelial cells influences TcR signalling in DP thymocytes and modifies their survival. In the present work, we focused on exploring details of GC effects on DP thymocyte apoptosis with or without parallel TcR activation in AND transgenic mice, carrying TcR specific for pigeon cytochrome C, in vivo. Here we show that the glucocorticoid receptor (GR) protein level was the lowest in DP thymocytes, and it was slightly down-regulated by GC analogue, anti-cd3, PCC and combined treatments as well. Exogenous GC analogue treatment or TcR stimulation alone lead to marked DP cell depletion, coupled with a significant increase of early apoptotic cell ratio (AnnexinV staining), marked abrogation of the mitochondrial function in DP cells (CMXRos staining), and significant decrease in the Bcl-2 high DP thymocyte numbers, respectively. On the other hand, the simultaneous exposure to these two proapototic signals effectively reversed all the above-described changes. The parallel analysis of CD4 SP cell numbers, AnnexinV, CMXRos, Bcl-2 and GR stainings revealed, that the GR and TcR signals were not antagonistic on the mature thymocytes. These data provide experimental evidence in TcR transgenic mice, in vivo, that when TcR activation and GR signals are present simultaneously, they rescue double positive thymocytes from programmed cell death. The two separate signalling pathways merge in DP thymocytes at such important apoptosis regulating points as the Bcl-2 and GR, showing that their balanced interplay is essential in DP cell survival. r 2007 Elsevier GmbH. All rights reserved. Keywords: Glucocorticoid hormone (GC); Glucocorticoid receptor (GR); Double positive (DP) thymocytes; Apoptosis; Mutual antagonism; Bcl-2 Introduction The production of immunocompetent (self MHC restricted, tolerant) T lymphocytes is a key element for the balanced function of the immune system (Klein and Horˇejsˇí, 1997). The special microenvironment of the Corresponding author. Tel.: ; fax: address: fboldizsar@hotmail.com (F. Boldizsár). thymus has a central role in this process (Ladi et al., 2006). The complex meshwork of thymic stromal cells is composed of thymic epithelial cells, macrophages, dendritic cells and fibroblasts, providing a vast surface for direct cell cell interactions and producing soluble factors regulating thymocyte development, intrathymic migration and selection processes (Anderson and Jenkinson, 2001). Key molecular players in cell cell interactions are adhesion molecules, chemokine recep /$ - see front matter r 2007 Elsevier GmbH. All rights reserved. doi: /j.imbio

92 40 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) tors (Savino et al., 2004), Wnt (Pongracz et al., 2003) and MHC (Klein and Kyewski, 2000) molecules. Thymocyte maturation proceeds through well-defined stages in the thymus, characterised by the sequential expression of T-cell specific surface molecules, including T-cell receptor (TcR), CD3, CD4 and CD8 (Res and Spits, 1999). Bone marrow progenitors are committed to the T-cell direction as a result of Notch-1 receptor signalling (Radtke et al., 2004), and become double negative (DN) thymocytes with no cell surface TcR, CD3, CD4 and CD8, respectively. After successful rearrangement in the a and b TcR gene loci, the developing cells reach the double positive (DP): CD4+, CD8+, TCR+, CD3+ stage, and are selected on the basis of the signal transducing capability and antigen specificity of their TcR (Sebzda et al., 1999). DP thymocytes expressing a TcR with subthreshold avidity die by neglect (Starr et al., 2003). Thymocytes that express a TcR with high avidity for self peptides presented on self MHC molecules are eliminated by activation induced apoptosis (negative selection) (Starr et al., 2003). Cells recognising self MHC bound peptides with medium to low avidity survive (positive selection) (Starr et al., 2003). As a result of these selection processes, a self MHC-restricted and self-tolerant naive T cell repertoire is formed, to be distributed in the peripheral lymphoid organ compartments (Starr et al., 2003). Several soluble factors are produced locally by the thymic stromal cells, including glucocorticoid hormone (GC) (Lechner et al., 2000). Lymphoid cells, especially the DP thymocytes, are highly sensitive to GC induced apoptosis (Cohen, 1992; Blomgren and Andersson, 1970), but the molecular mechanism(s) in the background are still to be elucidated. Paradoxically, low-tomoderate concentrations of GCs antagonise TcRmediated apoptosis via the glucocorticoid receptor (GR) ( mutual antagonism theory ) (Vacchio et al., 1999). On the other hand, the role of the GR in thymic diffentiation processes was questioned by works on GRknockout and GR dimerisation mutant mice where there was no abnormality in T cell development and selection (Godfrey et al., 2000). Apoptosis is a central element in eliminating the nonfunctional or potentially self-reactive T-cell clones during thymic maturation. Programmed cell death is a universal chain of events, leading to the cleavage of genomic DNA and the fragmentation of the cells (Hengartner, 2000). Early steps of apoptosis include the loss of membrane phosphatidylserine asymmetry (Vermes et al., 1995) and the activation of upstream caspases (caspase-8 and -10) (Ho and Hawkins, 2005). The central or mitochondrial phase integrates various apoptotic stimuli, and initiates the effector caspases (caspase-9, -3, -6, and -7), mainly through the release of cytochrome C to the cytoplasm (Hengartner, 2000). Although GC induced apoptosis in thymocytes has been known for a long time, we still do not have an integrated picture of the underlying molecular events. However, several details have been elucidated in the last decade (Frankfurt and Rosen, 2004). Most of the works agree that for apoptosis induction the liganded GR has to translocate to the nucleus, where it acts as a transcription factor, binding to GRE sequences in GC responsive genes. However, recent work by Sionov et al. (2006) showed that mitochondrial translocation, rather than nuclear translocation, of the GR plays a key role in determining GC sensitivity of cells. GC exposure leads to Ca 2+ -mobilisation, Src and Cdk2 activation, together with phosphatidylinositol-specific phospholipase C phosphorylation, and activation of acidic sphingomyelinase (Smase) with subsequent ceramide generation (Marchetti et al., 2003; Granes et al., 2004). The mitochondrial pro-apoptotic members of the Bcl-2 protein family Bax, tbid, Bim, and Bak are involved in the downstream effector mechanisms (Almawi et al., 2004). The mitochondrial membrane potential decreases, and cytochrome C and Smac/Diablo are released to the cytoplasm leading to the activation of caspase-9 and -3 and endonucleases (Zhang et al., 2000). The Bcl-2 protein, a member of the anti-apoptotic BH1-4 subfamily, was demonstrated to play a critical role in thymocyte survival, especially at the stage of death by neglect (Zhang et al., 2000). Bcl-2 overexpressing T-cell hybridoma is resistant to GC induced apoptosis (Memon et al., 1995). Our previous in vivo observations have provided in vivo evidence in both normal, Balb/c and AND TcR transgenic mice that the four major thymocyte subpopulations (DN, DP, CD4 SP and CD8 SP cells) have different GC sensitivities (Berki et al., 2002; Boldizsar et al., 2003). We demonstrated that the DP cells are the most sensitive to GCs, although they have the lowest GR expression, suggesting the possible participation of non-genomic GC actions in thymocyte development (Berki et al., 2002). We also found that TcR stimulationinduced apoptosis could successfully be inhibited with synthethic GC analogue treatments, in both Balb/c (Berki et al., 2002) and AND TcR transgenic mice (Boldizsar et al., 2003), resulting in a higher ratio of positively selected CD4+ SP cells, providing further in vivo evidence for the role of GCs in the positive selection processes (Boldizsar et al., 2003). In our present work, we further investigate the role of GCs in the apoptosis of thymocytes during the selection processes in the transgenic PCC specific TcR bearing AND mouse model. We characterised the apoptotic processes of thymocytes upon simultaneous or separate activation through TcR and GR by analysing phosphatidylserine translocation to the outer cell membrane layer and mitochondrial membrane potential changes as two early parameters of apoptosis and correlated these

93 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) features with the expression of Bcl-2 and GR in the DP and CD4 SP subsets, respectively. Materials and methods Mice We used 3 4-week-old (10 g body weight) B10.Cg- TgN (TcR AND) 53Hed (AND) pigeon cytochrome C specific I-E k (MHC-II) restricted Vb3, Va11 TcR transgenic mice (a generous gift from Zsuzsanna Szondi from the University of Debrecen, Hungary). Mice were kept under conventional conditions and were provided with pelleted rodent chow and acidified water ad libitum. The animal experiments were carried out in accordance with the regulations set out by the University s Committee on Animal Experimentations (#BA 02/2000-2/2006). Treatment of animals and thymocyte preparation The first group of AND mice were injected i.p. with 40 mg Pigeon Cytochrome C (PCC, Sigma) dissolved in 100 ml PBS once per day for 2 days. Another group of mice received monoclonal anti-cd3 antibody (50 mg/ animal) once 24 h before sacrifice. The third group of mice was treated 10 mg/kg body weight Dexamethasone (DX) i.p. dissolved in 100 ml PBS 4 h before sacrifice. The fourth group of mice was injected with PCC for 2 days and DX 4 h before sacrifice. The fifth group of mice received anti-cd3 24 h before and DX 4 h before the sacrifice. Control mice received only PBS. Isolated thymi were homogenised in PBS with a glass/glass homogeniser. The suspension was filtered through nylon mesh, thymocytes were washed once in PBS and then the cell number of samples was set to 10 6 except for AnnexinV staining, where cells were used. Chemicals and buffers DX (Oradexon, Organon) (4 mg/ml stock solution) was purchased from N.V. Organon Oss Holland. Phosphate buffered saline (PBS) was used for washing and keeping cells until use. Cell surface labelling with monoclonal antibodies was carried out in binding buffer (PBS containing 0.1% NaN 3 and 0.1% BSA), cell fixation in 4% paraformaldehyde (PFA) solution and permeabilisation buffer (PBS containing 0.1% NaN 3, 0.1% BSA and 0.1% saponin) was used for intracellular labelling. Annexin V labelling was performed in Annexin binding buffer (10 mm HEPES/NaOH, ph 7.4, 140 mm NaCl and 2.5 mm CaCl 2 ). Propidium iodide (PI) was purchased from Sigma. CMX-ROS was obtained from Molecular Probes. Monoclonal antibodies We used the following monoclonal antibodies for cell surface labelling: phycoerythrin (PE) conjugated rat anti-mouse CD4 (clone# L3T4, BD Pharmingen, CA), CyChrome (CyC) conjugated rat anti-mouse CD8 (clone# Ly-2, BD Pharmingen, CA) and FITC conjugated anti-mouse CD4 (clone# YTS 191.1). Intracellular GR labelling was performed with FITC conjugated mouse anti-gr antibody (clone # 5E4-B1) developed in our laboratory (Berki et al., 1998). For apoptosis analysis, we used FITC conjugated AnnexinV (BD Pharmingen, CA) and anti-bcl-2 antibody (BD Pharmingen, CA). For in vivo CD3 stimulation mice were injected i.v. with 50 mg hamster anti-mouse CD3 antibody (clone #145.2C11) per recipient. Thymocyte fluorescent cell surface labelling For the simultaneous detection of cell surface CD4 and CD8 double labelling technique was used. Briefly, thymocyte samples (10 6 ) were incubated with monoclonal antibody cocktails for 30 min in 100 ml binding buffer on ice, then washed twice in PBS, and finally resuspended in 500 ml 0.1% buffered PFA in PBS. For the detection of early apoptotic thymocytes Annexin V FITC staining was performed. Briefly, samples were incubated with Annexin V FITC for 20 min in 100 ml Annexin binding buffer at room temperature, then diluted with 400 ml Annexin binding buffer, immediately followed by flow cytometric measurement. Intracellular cell labelling We used triple labelling technique for the simultaneous detection of cell surface CD4, CD8, and intracellular GR or Bcl-2 protein. Briefly, after cell surface CD4, CD8 labelling thymocyte samples (10 6 ) were fixed in 4% PFA buffer for 20 min at room temperature then cells were further washed and intracellularly labelled in the permeabilisation buffer. Thymocytes were incubated with FITC-conjugated anti-gr and FITC-conjugated anti-bcl-2 monoclonal antibodies for 30 min at room temperature. Afterwards cells were washed twice in permeabilisation buffer then once in PBS and finally resuspended in 500 ml 0.1% PFA in PBS. CMXRos CMXRos is a lipophilic cationic fluorescent dye that is sequestered in active mitochondria because of their negative mitochondrial membrane potential (Pendergrass et al., 2004), therefore living cells show high CMXRos fluorescence at (CMXRos high ). Since apoptotic cells lose their mitochondrial membrane potential (Ly et al.,

94 42 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) ), CMXRos staining of mitochondria decreases (CMXRos low ). The lower CMXRos high cell ratio indicates the loss of mitochondrial membrane potential, i.e. the presence of mitochondrial type of apoptosis (Pendergrass et al., 2004). 10 ml CMX-ROS stock solution (1 mg/ml in DMSO) was added to 10 6 cells in 1 ml of RPMI medium then cells were incubated for min in 37 1C and after cell surface labelling (a-cd4-fitc, a-cd8-cyc) analysed with flow cytometry. Flow cytometric acquisition and analysis Samples were measured and analysed in a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA), using the CellQuest software. The thymocytes were gated according to their size and granularity on forward and side scatter dot plots. The gate set on untreated control living thymocytes was used for the analysis of all samples, thus excluding cells with abnormal morphology that are mostly apoptotic (Curnow et al., 1994). Thymocyte subpopulations resolved according to their CD4-PE/CD8-CyChr fluorescence parameters were separately analysed for AnnexinV-FITC, anti-gr-fitc and anti-bcl-2-fitc fluorescence in FL1 channel. We used fluorescent histogram plots for both comparing the MFIs of different samples and for calculating the ratio of positively stained cells. Statistical analysis The effect of various treatments between groups was tested for statistical significance using Student s t-test. Po0.05 denoted statistical significance. Results GR expression in AND DP and CD4 SP thymocytes and its regulation by in vivo DX, anti-cd3, PCC and combined treatments In our previous works we have shown that the GR expression differs in the four main thymocyte subpopulations of Balb/c mice (Berki et al., 2002; Boldizsa r et al., 2006). In the present work, we wished to determine the GR expression levels of the 4 thymocyte subpopulations (DN, DP, CD4 SP, CD8 SP) in young (3 4-week old) AND mice (Fig. 1) by intracellular flow cytometric labelling with anti-gr-fitc antibody. Thymocyte subpopulations were distinguished based on their cell surface CD4 (FL2 channel) and CD8 (FL3 channel) expression (Fig. 1A). The mean fluorescence intensity (MFI) was in the DN cells (Fig. 1A, upper left histogram; Fig. 1B), in DP cells (Fig. 1A, upper right histogram; Fig. 1B), in the CD4 SP cells (Fig. 1A, lower left histogram; Fig. 1B) and in the CD8 SP cells (Fig. 1A, lower right histogram; Fig. 1B). The GR MFI values of CD4- or CD8 SP cells were significantly higher (Po0.05) than in the DP cells, and significantly lower (Po0.05) than in the DN cells (Fig. 1B). In recent works we have also shown that GCs participate in the autoregulation of the GR expression in Balb/c thymocytes (Boldizsa r et al., 2006). As TcR signalling was demonstrated to interact with the GR signalling (Iwata et al., 1991), we examined the GR expression changes in the DP and CD4+ SP thymocyte populations of AND TcR transgenic mice after exposure to the cognate antigen (PCC), anti-cd3, DX and combined treatments (Fig. 2). In the DP cells we found a significant decrease of GR expression (Po0.05) after the administration of PCC (MFI: ), anti-cd3 (MFI: ), DX (MFI: ), PCC+DX (MFI: ) and anti-cd3+dx combination (MFI: ) compared to the control animal (MFI: ) (Fig. 2A and C). In CD4 SP cells we detected significantly (Po0.05) lower GR levels in PCC, DX and anti-cd3+dx treated animals (MFI: , and , respectively) compared to the control mice (MFI: ) (Fig. 2B and D). There was no significant change in the GR level of CD4 SP cells after anti-cd3 and PCC+DX treatments (MFI: and , respectively) compared to the control (MFI: ) (Fig. 2B and D). Cell number changes in thymus after DX, anti-cd3, PCC and combined treatments As has been established previously, DX treatment or TcR engagement either with antigen or anti-cd3 antibody results in thymic cell depletion both in Balb/c (Berki et al., 2002) and AND TcR transgenic mice (Boldizsar et al., 2003). In the present experiments we found that total thymus cell numbers significantly decreased (Po0.05) after anti-cd3 ( million), DX ( million) and combined PCC+DX ( million) or anti-cd3+dx ( million) treatments, and markedly but not significantly after PCC ( million) treatment alone, compared to control ( million), respectively (Table 1). Previously we, as well as others, have shown that the DP population is the most sensitive thymocyte subgroup for DX induced cell depletion (Berki et al., 2002; Boldizsa r et al., 2006). We have also reported that the DX-induced DP cell elimination can be antagonised by simultaneous TcR engagement in vivo either with anti- CD3 treatment in Balb/c mice (Berki et al., 2002) or with antigen treatment in TcR transgenic mice (Boldizsar et al., 2003). In the current work we also found that in

95 anti-cd8-cyc (FL3-H) ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) CD8 SP DP CD4 DN SP anti-cd4-pe (FL2-H) Cell count DN CD4 SP MFI: MFI: DP CD8 SP MFI: anti-gr-fitc fluorescence intensity (FL1-H) MFI: GR mean fluorescence (FL1) * # * * DN DP CD4 SP CD8 SP Fig. 1. GR expression of the four major thymocyte subpopulations. (A) Typical distribution of the four major thymocyte subpopulations are shown on the two-dimensional fluorescent dot-plot. Flow cytometric histograms show the typical GR expression, as fluorescence intensities in the four thymocyte populations. (B) Bars represent the average GR expression (MFI)7SD in the different thymic cell populations calculated from the data of three transgenic mice (* Po0.05 compared to DN; # Po0.05 compared to CD4 SP and CD8 SP). TcR transgenic mice all treatment modalities led to a significant (Po0.05) DP cell number decrease, except for the PCC treatment alone (Fig. 3A). DP cell number was million in control animals, million in PCC treated mice, million in anti- CD3 treated mice, million in DX treated mice, million in PCC+DX treated mice and million in anti-cd3+dx treated mice (Fig. 3A). However, the simultaneous PCC or anti-cd3 treatment with DX led to significantly (Po0.05) increased survival of DP thymocytes compared to DX treatment alone ( million or million DP cells versus million DP cells, respectively) (Fig. 3A). In AND TcR transgenic mice there is an inherent bias towards the CD4 SP direction in thymic T-cell development (Kaye et al., 1989), resulting in high CD4 SP ratio compared to Balb/c mice. We found that the number of CD4 SP cells decreased significantly (Po0.05) after each treatment modality (control: million, PCC: million, anti-cd3: million, DX: million, PCC+DX: million and anti-cd3+dx: million CD4 SP cells, respectively) (Fig. 3B). Annexin V staining of DP and CD4 SP thymocytes Annexin V is a phospholipid binding protein that selectively binds phosphatidyl-serine molecules (PS) (Vermes et al., 1995). Under physiological conditions PS can only be found in the inner membrane layer of intact cells. As one of the first step on the road leading to apoptosis, this membrane-asymmetry changes, and PS appears in the outer membrane phospholipid layer, too (Vermes et al., 1995). We found that from % in control AND TcR transgenic mice (Fig. 4A and C) the ratio of Annexin V high DP thymocytes increased significantly (Po0.05) to %, % or % after PCC, anti-cd3 or DX treatments, respectively (Fig. 4A and C). Although the combined treatments also caused a significant increase (Po0.05) in the Annexin V high DP cell ratio compared to the control ( %), co-treatment with PCC ( %) or anti-cd3 ( %) significantly (Po0.05) inhibited the proapoptotic effect of DX treatment alone ( %) (Fig. 4A and C). In contrast in CD4 SP population we could not detect significant changes in the ratio of Annexin V high cells

96 44 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) Fig. 2. GR expression changes in DP (A) and CD4 SP (B) cells after PCC, anti-cd3, DX or combined treatments characterised by flow cytometry. Fluorescent histogram plots with mean fluorescent intensity values show the anti-gr-fitc fluorescence from a representative experiment. Bars represent the mean GR fluorescence intensities7sd of DP (C) and CD4 SP (D) cells calculated from the data of three animals in each test group (* Po0.05). Table 1. Average of total thymocyte number ( 10 6 )7SD after different treatments Ctrl PCC a-cd3 DX PCC+DX a-cd3+dx Cell number (million) * 41* 58.3* 50.7* SD Each test group consisted of three animals of a representative experiment. *Po0.05. after PCC (572.8%) or anti-cd3 and DX combined treatments ( %) compared to control ( %) (Fig. 4B and D). However, we found significantly (Po0.05) higher ratio of early apoptotic cells after anti- CD3 ( %), DX ( %) and combined PCC and DX ( %) treatments (Fig. 4B and D). Changes in the mitochondrial function of DP and CD4 SP cells Mitochondria play a pivotal role in the integration of various apoptotic signals and also in the central effector phase of apoptosis (Wang, 2001). As CMXRos is a useful means for monitoring the mitochondrial status (Pendergrass et al., 2004), we stained thymocytes with this mitochondrial membrane potential sensitive dye to study the effects of the various treatments in the different thymocyte populations. The CMXRos high DP cell ratio significantly decreased (Po0.05) after PCC ( %), anti-cd3 ( %), DX ( %), PCC+DX ( %) and anti-cd3+dx (571.1%) treatments compared to control ( %) (Fig. 5A and C). However, after combined PCC+DX or anti- CD3+DX treatments significantly (Po0.05) higher percentage of DP cells survived with intact mitochondrial function than in the DX or anti-cd3 treated animals ( % and 571.1% versus % and %, respectively) (Fig. 5C). In the CD4 SP cell population PCC, anti-cd3, DX, PCC+DX and anti-cd3+dx treatments caused significant (Po0.05) mitochondrial membrane potential

97 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) DP cell number (x10 6 ) * Ctrl PCC a-cd3 DX PCC+DX a-cd3+dx * * # * # CD4 SP cell number (x10 6 ) * * * * * Ctrl PCC a-cd3 DX PCC+DX a-cd3+dx Fig. 3. Changes in the number of DP (A) and CD4 SP (B) cells after PCC, anti-cd3, DX or combined treatments. Bars represent the average numbers ( 10 6 )7SD calculated from the data of three animals of each test group. Note the different scales for the two different thymocyte subsets. The number of thymocyte subsets was calculated based on total cellularity and percentage of the given cell population (* Po0.05 compared to control; # Po0.05 compared to DX treated sample). Fig. 4. The ratio of early apoptotic (Annexin V high ) DP and CD4 SP thymocytes after different treatments. Typical flow cytometric histogram plots show AnnexinV-FITC fluorescence intensities of the DP (A) and CD4 SP populations (B) after different treatment modalities. AnnexinV high cell percentage is labelled in each histogram plot. Bars show the average Annexin V high cell ratio7sd of DP (C) and CD4 SP populations (D) based on the data of three animals in each test group. Note the different scales for the two different thymocyte subsets (* Po0.05 compared to control; # Po0.05 compared to DX treated sample).

98 46 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) Fig. 5. Changes in mitochondrial membrane potential of DP and CD4 SP cells after PCC, anti-cd3, DX or combined treatments assessed by flow cytometry after CMX-Ros loading of thymocytes. Flow cytometric histogram plots show CMX-Ros fluorescence of the DP (A) and the CD4 SP cells (B). Percentage of CMX-Ros high cells is labelled in each histogram. Bars represent the percentage of CMX-Ros high (with intact mitochondria) DP (C) and CD4 SP (D) cells7sd calculated from the data of three animals after different treatments. Note the different scales for the two different thymocyte subsets (* Po0.05 compared to control; # Po0.05 compared to DX treated sample). decrease compared to the untreated control ( %, %, %, %, % versus 5473% CMXRos high CD4 SP cells) (Fig. 5B and D). Interestingly, while PCC could effectively antagonise the DX induced mitochondrial membrane potential decrease ( % CMXRos high CD4 SP cells in PCC+DX treated mice versus % CMXRos high CD4 SP cells in DX treated mice; Po0.05), anti-cd3 treatment did not have such protective effect ( % CMXRos high CD4 SP cells in anti-cd3+dx treated mice versus % CMXRos high CD4 SP cells in DX treated mice) (Fig. 5D). Anti-apoptotic Bcl-2 expression Bcl-2 protein is an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins, key regulators of apoptosis (Chao and Korsmeyer, 1998). Since the Bcl-2 expression was shown to be critical in resistance to DX induced thymocyte apoptosis (Veis et al., 1993), we analysed the changes in Bcl-2 high DP and CD4 SP thymocyte numbers after the different treatments. In the analysis of Bcl-2 fluorescent histogram plots (Fig. 6A and B), the ratio of those cells were calculated that had higher fluorescence intensity than the control and thus considered Bcl-2 high (Fig. 6A and B). We calculated the absolute number of Bcl-2 high cells from the ratio of Bcl- 2 high cells (Fig. 6A and B) and the absolute cell numbers in each treatment groups (Table 1). In control AND mice million DP cells were Bcl-2 high. PCC+DX and anti-cd3+dx combined treatments caused significant (Po0.05) rise in the number of Bcl-2 high DP thymocytes ( and million DP cells, respectively) (Fig. 6A and C), while anti-cd3 and DX treatments significantly (Po0.05) decreased the numbers of Bcl-2 high DP thymocytes ( and million DP cells, respectively) (Fig. 6A and C). PCC treatment alone did not change significantly the Bcl-2 high DP cell number compared to the control ( vs million). The DX treatment caused Bcl-2 high DP thymocyte number decrease could be reversed by parallel PCC or anti-cd3 treatments ( versus and million DP cells) (Fig. 6C).

99 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) Fig. 6. Changes in the number of Bcl-2 high cells after PCC, anti-cd3, DX or combined treatments measured by flow cytometry. Flow cytometric histogram plots show the typical Bcl-2 fluorescence intensities of DP (A) and CD4 SP cells (B). The Bcl-2 high cell percentage is labelled in each histogram plot. Bars show the average number ( 10 6 ) of Bcl-2 high DP (C) and CD4 SP (D) cells7sd calculated from three different mice in each test group. Note the different scales for the two different thymocyte subsets. The number of thymocyte subsets was calculated based on total cellularity and percentage of Bcl-2 high cells (* Po0.05 compared to control; # Po0.05 compared to DX treated sample). Among CD4 SP cells million were Bcl-2 high in control mice. We found that all treatment modalities led to the significant (Po0.05) increase of Bcl-2 high CD4 SP numbers, although at different scales. Bcl-2 high CD4 SP numbers were million after PCC, million after anti-cd3, million after DX, million after PCC+DX and million after anti-cd3+dx treatments, respectively (Fig. 6B and D). Interestingly the DX induced increase in Bcl- 2 high CD4 SP numbers ( million) was significantly decreased by parallel PCC treatment ( million), while it was further elevated by parallel anti-cd3 treatment ( million), respectively (Fig. 6D). Discussion The role of GCs and their receptor (GR) in thymocyte development has remained controversial to date (Stephens et al., 2003). Although the apoptosis inducing effect of GCs is established (Cohen, 1992), their role in positive selection of DP thymocytes is still controversial (Vacchio et al., 1999). We have described previously, that among the four major cell populations in Balb/c mice thymi, the DP cells are the most sensitive to GC induced apoptosis, despite their low GR expression (Berki et al., 2002; Boldizsa r et al., 2006). When the exogenous GC treatment is coupled with TcR stimulation, either with anti-cd3 antibody or with the cognate antigen (PCC), it leads to the increased positive selection of DP thymocytes in Balb/c (Berki et al., 2002) orin AND TcR transgenic mice (Boldizsar et al., 2003), respectively. In our present work we investigated the connection of GC hormone and its receptor in relation to apoptosis signalling, especially the early events of programmed cell death during thymic maturation and selection processes in AND TcR transgenic mice.

100 48 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) In this work thymic cellularity decreased significantly both upon TcR stimulation either with anti-cd3 antibody or the cognate antigen or exogenous GR agonist treatments. The DX induced cell depletion could be reversed when TcR stimulation was also present. Since in AND TcR transgenic mice DP and CD4 SP cells together represent more than 90% of total thymocyte pool, we investigated the changes in the number of these two major subpopulations. The GR agonist or the TcR engagement caused a major drop in DP cell numbers, while this cell depleting effect was less efficient on the CD4 SP mature cell population. Significantly more DP, but not CD4 SP cells survived when the GC and TcR stimulating agent was present simultaneously. On one hand these results confirm our previous work in Balb/c mice (Berki et al., 2002; Boldizsa r et al., 2006), they also provide further in vivo evidence for the mutual antagonism theory (Vacchio et al., 1999; Zacharchuk et al., 1990). In addition to determining the cell number and composition changes upon the activation of the GR and the TcR, we also followed the outer membrane lipid layer phosphatidylserine content and mitochondrial activity changes, both sensitive early signs of apoptosis (Hengartner, 2000). In DP cells the GR signalling and the TcR signalling either alone or in combination lead to increased phosphatidylserine externalisation, together with a decreased mitochondrial activity. However, we found relatively less early apoptotic DP cells from mice where the two signals were present simultaneously, compared to the single treated animals, similar to previous in vitro findings (Zacharchuk et al., 1990). These results clearly show, that in the case of simultaneous GR and TcR stimulation the increased survival of the DP thymocytes is due to the inhibition of early apoptotic events. Apoptosis of thymocytes is regulated by several factors including GR and Bcl-2 expression studied in this work. In AND TcR transgenic mice we found that GR expression of DP cells was significantly lower than that of DN or mature CD4 or CD8 SP cells, similar to age matched Balb/c mice (Berki et al., 2002; Boldizsa r et al., 2006). A possible explanation of the low GR expression in DP cells could be the homologous downregulation process of the GR upon endogenous GC exposure in the local GC rich microenvironment of the thymus (Boldizsa r et al., 2006). In AND mice we found that activation of either the GR or the TcR leads to further GR down-regulation. GCs have been shown to participate in the regulation of GR expression in thymocytes (Boldizsa r et al., 2006) and various other cell types (Schaaf and Cidlowski, 2002). However the exact mechanism of how TcR activation induced GR down-regulation in thymocytes occurs needs to be further elucidated, while causing AP-1, NFAT, NFkB and Elk activation (Lin and Weiss, 2001). There is a clear discrepancy between the sensitivity of DP cells for GC, and their low level of expression of GR, indicating the possible involvement of non-genomic GC signalling mechanisms (Buttgereit and Scheffold, 2002). One possibility for how non-genomic GR action may take place is through cytoplasmic interactions of the GR with other signalling proteins (Buttgereit and Scheffold, 2002), pointing to Hsp-90, which was found to play a role in TcR signalling, by binding Lck, Raf and ERK (Schnaider et al., 2000), also involved positive selection of thymocytes (Alberolanti-Ila and Hernandez- Hoyos, 2003). Since the inactive GR is also an Hsp-90 client protein (Smith and Toft, 1993), this offers a tempting explanation of the link between GR and TcR signalling, providing a molecular basis for the mutual antagonism theory. Recently ZAP-70 was also found to serve as linker between TcR and GR signalling in Jurkat cells (Bartis et al., 2006, 2007). Bcl-2 is an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins comprising of both pro- and anti-apoptotic molecules. We and others have shown differential Bcl-2 expression by thymocyte subsets previously (Boldizsa ret al., 2006; Ma et al., 1995). In vitro study using T-cell hybridoma described that Bcl-2 and Bcl-xL selectively antagonised the GC induced apoptosis (Memon et al., 1995). In this study we show that the TcR stimulus when applied together with the GR agonist increase the number of Bcl-2 high DP cells significantly, implying their selection advantage. It was also shown earlier that positive selection is coupled with anti-apoptotic Bcl-2 up-regulation (Linette et al., 1994; Williams et al., 2001), which could contribute to DP cell survival (Chao and Korsmeyer, 1998). One possible mechanism for Bcl-2 to enhance cell survival is that it helps preserve the mitochondrial membrane integrity by interacting with outer membrane elements (Gross et al., 1999). This activity is also in line with our present data on the protective effect of the combined treatments on the mitochondrial function. Taken together here we provide data showing that at the DP stage of differentiation otherwise apoptotic stimuli together lead to survival of cells, in strong contrast to mature CD4 SP cells. We propose that one of the key elements in the anti-apoptotic outcome might be the Bcl-2 molecule, that is up-regulated in positively selected cells as a consequence of the simultaneous presence of TcR and GR signals, respectively. Acknowledgements To Zsuzsanna Szondi (University of Debrecen, Hungary) for AND mice. To Pe ter Balogh for critical reading of the manuscript and useful advice. To Ms. Ma ria Pápa and Ms. Judit Melczer for technical assistance.

101 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) References Alberolanti-Ila, J., Hernandez-Hoyos, G., The Ras/ MAPK cascade and the control of positive selection. Immunol. Rev. 191, Almawi, W.Y., Melemedjian, O.K., Jaoude, M.M., On the link between Bcl-2 family proteins and glucocorticoidinduced apoptosis. J. Leukoc. Biol. 76, Anderson, G., Jenkinson, E.J., Lymphostromal interactions in thymic development and function. Nat. Rev. Immunol. 1, Bartis, D., Boldizsa r, F., Szabo, M., Pálinka s, L., Ne meth, P., Berki, T., Dexamethasone induces rapid tyrosinephosphorylation of ZAP-70 in Jurkat cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 98, Bartis, D., Boldizsar, F., Kvell, K., Szabo, M., Palinkas, L., Nemeth, P., Monostori, E., Berki, T., Intermolecular relations between the glucocorticoid receptor, ZAP-70 kinase, and Hsp-90. Biochem. Biophys. Res. Commun. 354, Berki, T., Kumanovics, G., Kumanovics, A., Falus, A., Ujhelyi, E., Nemeth, P., Production and flow cytometric application of a monoclonal anti-glucocorticoid receptor antibody. J. Immunol. Methods 214, Berki, T., Pálinkás, L., Boldizsa r, F., Ne meth, P., Glucocorticoid (GC) sensitivity and GC receptor expression differ in thymocyte subpopulations. Int. Immun. 14, Blomgren, H., Andersson, E., Characteristics of the immunocompetent cells in the mouse thymus: cell population changes during cortisone-induced atrophy and subsequent regeneration. Cell. Immunol. 1, Boldizsar, F., Palinkas, L., Bartis, D., Nemeth, P., Berki, T., Antigen and glucocorticoid hormone (GC) induce positive selection of DP thymocytes in a TcR transgenic mouse model. Immunol. Lett. 90, Boldizsa r, F., Pálinka s, L., Czo mpo ly, T., Bartis, D., Ne meth, P., Berki, T., Low glucocorticoid receptor (GR), high Dig2 and low Bcl-2 expression in double positive thymocytes of Balb/c mice indicates their endogenous glucocorticoid hormone exposure. Immunobiology 211, Buttgereit, F., Scheffold, A., Rapid glucocorticoid effects on immune cells. Steroids 67, Chao, D.T., Korsmeyer, S.J., BCL-2 family: regulators of cell death. Annu. Rev. Immunol. 16, Cohen, J.J., Glucocorticoid-induced apoptosis in the thymus. Semin. Immunol. 4, Curnow, S.J., Barad, M., Brun-Roubereau, N., Schmitt- Verhulst, A.M., Flow-cytometric analysis of apoptotic and nonapoptotic T-cell receptor-transgenic thymocytes following in vitro presentation of antigen. Cytometry 16, Frankfurt, O., Rosen, S.T., Mechanisms of glucocorticoid-induced apoptosis in hematologic malignancies: updates. Curr. Opin. Oncol. 16, Godfrey, D.I., Purton, J.F., Boyd, R.L., Cole, T.J., Stress-free T-cell development: glucocorticoids are not obligatory. Immunol. Today 21, Granes, F., Roig, M.B., Brady, H.J., Gil-Gomez, G., Cdk2 activation acts upstream of the mitochondrion during glucocorticoid induced thymocyte apoptosis. Eur. J. Immunol. 34, Gross, A., McDonnell, J.M., Korsmeyer, S.J., BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev 13, Hengartner, M.O., The biochemisty of apoptosis. Nature 407, Ho, P.K., Hawkins, C.J., Mammalian initiator apoptotic caspases. FEBS J. 272, Iwata, M., Hanaoka, S., Sato, K., Rescue of thymocytes and T cell hybridomas from glucocorticoid-induced apoptosis by stimulation via the T cell receptor/cd3 complex: a possible in vitro model for positive selection of the T cell repertoire. Eur. J. Immunol. 21, Kaye, J., Hsu, M.L., Sauron, M.E., Jameson, S.C., Gascoigne, N.R., Hedrick, S.M., Selective development of CD4+ T cells in transgenic mice expressing a class II MHC-restricted antigen receptor. Nature 341, Klein, J., Horˇejsˇí, V., Immunology. Blackwell Science. Klein, L., Kyewski, B., Self-antigen presentation by thymic stromal cells: a subtle division of labor. Curr. Opin. Immunol. 12, Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E.A., Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat. Immunol. 7, Lechner, O., Wiegers, G.J., Oliveiranti-Dos-Santos, A.J., Dietrich, H., Recheis, H., Waterman, M., Boyd, R., Wick, G., Glucocorticoid production in the murine thymus. Eur. J. Immunol. 30, Lin, J., Weiss, A., T cell receptor signaling. J. Cell Sci. 114, Linette, G.P., Grusby, M.J., Hedrick, S.M., Hansen, T.H., Glimcher, L.H., Korsmeyer, S.J., Bcl-2 is upregulated at the CD4+ CD8+ stage during positive selection and promotes thymocyte differentiation at several control points. Immunity 1, Ly, J.D., Grubb, D.R., Lawen, A., The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis 8, Ma, A., Pena, J.C., Chang, B., Margosian, E., Davidson, L., Alt, F.W., Thompson, C.B., Bclx regulates the survival of double-positive thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, Marchetti, M.C., Di Marco, B., Cifone, G., Migliorati, G., Riccardi, C., Dexamethasone-induced apoptosis of thymocytes: role of glucocorticoid receptor-associated Src kinase and caspase-8 activation. Blood 101, Memon, S.A., Moreno, M.B., Petrak, D., Zacharchuk, C.M., Bcl-2 blocks glucocorticoid- but not Fas- or activation-induced apoptosis in T cell hybridoma. J. Immunol. 155, Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M., Efficacy of MitoTracker Green and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry A 61, Pongracz, J., Hare, K., Harman, B., Anderson, G., Jenkinson, E.J., Thymic epithelial cells provide WNT signals to developing thymocytes. Eur. J. Immunol. 33, Radtke, F., Wilson, A., Mancini, S.J., MacDonald, H.R., Notch regulation of lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, Res, P., Spits, H., Developmental stages in the human thymus. Semin. Immunol. 11,

102 50 ARTICLE IN PRESS L. Pálinkás et al. / Immunobiology 213 (2008) Savino, W., Mendes-Danti-Cruz, D.A., Smaniotto, S., Silvanti-Monteiro, E., Villanti-Verde, D.M., Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. J. Leukoc. Biol. 75, Schaaf, M.J., Cidlowski, J.A., Molecular mechanisms of glucocorticoid action and resistance. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 83, Schnaider, T., Somogyi, J., Csermely, P., Szamel, M., The Hsp90-specific inhibitor geldanamycin selectively disrupts kinase-mediated signaling events of T-lymphocyte activation. Cell Stress Chaperones 5, Sebzda, E., Mariathasan, S., Ohteki, T., Jones, R., Bachmann, M.F., Ohashi, P.S., Selection of the T cell repertoire. Annu. Rev. Immunol. 17, Sionov, R.V., Cohen, O., Kfir, S., Zilberman, Y., Yefenof, E., Role of mitochondrial glucocorticoid receptor in glucocorticoid-induced apoptosis. J. Exp. Med. 203, Smith, D.F., Toft, D.O., Steroid receptors and their associated proteins. Mol. Endocrinol. 7, Starr, T.K., Jameson, S.C., Hogquist, K.A., Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, Stephens, G.L., Ashwell, J.D., Ignatowicz, L., Mutually antagonistic signals regulate selection of the T cell repertoire. Int. Immunol. 15, Vacchio, M.S., Lee, J.Y., Ashwell, J.D., Thymus-derived glucocorticoids set the thresholds for thymocyte selection by inhibiting TCR-mediated thymocyte activation. J. Immunol. 163, Veis, D.J., Sorenson, C.M., Shutter, J.R., Korsmeyer, S.J., Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair. Cell 75, Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C., A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cell using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods 184, Wang, X., The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, Williams, O., Mok, C.L., Norton, T., Harker, N., Kioussis, D., Brady, H.J., Elevated Bcl-2 is not a causal event in the positive selection of T cells. Eur. J. Immunol. 31, Zacharchuk, C.M., Mercep, M., Chakraborti, P.K., Simons Jr., S.S., Ashwell, J.D., Programmed T lymphocyte death. Cell activation- and steroid-induced pathways are mutually antagonistic. J. Immunol. 145, Zhang, J., Mikecz, K., Finnegan, A., Glant, T.T., Spontaneous thymocyte apoptosis is regulated by a mitochondrion mediated signaling pathway. J. Immunol. 165,

103 ARTICLE IN PRESS Immunobiology 211 (2006) Low glucocorticoid receptor (GR), high Dig2 and low Bcl-2 expression in double positive thymocytes of BALB/c mice indicates their endogenous glucocorticoid hormone exposure Ferenc Boldizsa r,lászlo Pálinka s, Tama s Czo mpo ly, Domokos Bartis, Pe ter Ne meth, Timea Berki Department of Immunology and Biotechnology, Faculty of Medicine, University of Pecs, Szigeti ut 12., H-7643 Pecs, Hungary Received 10 January 2006; received in revised form 15 June 2006; accepted 16 June 2006 Abstract Several studies have shown that of the four major thymocyte subsets, the CD4/CD8 double positive (DP) thymocytes are the most sensitive to in vivo glucocorticoid hormone (GC)-induced apoptosis. Our aim was to analyse fine molecular differences among thymocyte subgroups that could underlie this phenomenon. Therefore, we characterised the glucocorticoid hormone receptor (GR) expression of thymocyte subgroups both at the mrna and protein levels by real-time PCR and flow cytometry, and correlated these features to their apoptotic sensitivity. We also investigated the time-dependent effects of the GC agonist dexamethasone (DX) with or without GC antagonist (RU486) treatments on GR mrna/protein expression. We also analysed the expression of two apoptosis-related gene products: dexamethasone-induced gene 2 (Dig2) mrna and Bcl-2 protein. We found that DN thymocytes had the highest GR expression, followed by CD8 single positive (SP), CD4 SP and DP thymocytes in 4-week-old BALB/c mice, both at the mrna and protein levels, respectively. In DP cells, the Dig2 expression was significanty higher, while the Bcl-2 expression was significantly lower than in DN, CD4 SP and CD8 SP thymocytes. Single high dose DX treatment caused time-dependent depletion of DP thymocytes due to their higher apoptosis rate, which could not be abolished with RU486 pretreatment. After a single high dose DX treatment, there was a transient, significant increase of the GR mrna and protein level of unsorted thymocytes after 8 and 16 h, followed by a significant decrease at 24 h, respectively. The time-dependent GR expression changes after DX administration could not be inhibited by the GC antagonist RU486. Twenty-four hours after exposure to high dose DX the DN, CD4 SP and CD8 SP cells showed a significant decrease of GR mrna and protein expression, whereas the DP thymocytes, showed no significant alteration of GR mrna or protein expression. The kinetical analysis of GR expression and apoptotic marker changes upon single high dose GC analogue administration revealed a two-phase process in thymocytes: early events, within 4 8 h, include GR upregulation and early apoptosis induction, while the late events appear most prominently at h, when the GR is already downregulated and apoptotic cell ratio reaches its peak, with marked DP cell depletion. The low GR, high Dig2 and low Bcl-2 expression, coupled with the absence of homologous downregulation of GR after exogenous GC analogue treatment, could contribute to the high GC sensitivity of DP thymocytes. The downregulated GR and Bcl-2 together with the upregulated Dig2 level in DP cells indicates the significance of intrathymic GC effects at this differentiation stage. Since GR expression changes and apoptotic events could not be Corresponding author. Tel.: ; fax: address: fboldizsar@hotmail.com (F. Boldizsár) /$ - see front matter r 2006 Elsevier GmbH. All rights reserved. doi: /j.imbio

104 786 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) completely inhibited by GC antagonist, we propose the involvement of non-genomic GR mechanisms in these processes. r 2006 Elsevier GmbH. All rights reserved. Keywords: Double positive thymocytes; Glucocorticoid receptor; Glucocorticoid hormone autoregulation; Dig2; Bcl-2; Dexamethasone Introduction Glucocorticoid hormones (GCs) are regulators of differentiation, activation, survival and apoptosis of T lymphocytes (Reichardt, 2004). GCs exert their action either through genomic, or through other, non-genomic mechanisms described recently (Buttgereit and Scheffold, 2002). The glucocorticoid receptor (GR) is a member of the steroid receptor superfamily (Evans, 1988), consisting of 3 domains: a hormone-binding domain, a highly conserved DNA-binding domain and the least conserved N-terminal domain (Hollenberg et al., 1985). The inactive form of GR is associated with Hsp-90 in the cytoplasm (Smith and Toft, 1993). Upon hormone binding, GR dissociates from Hsp-90 and translocates to the nucleus, where it forms dimers and functions as a transcription factor, binding to specific conserved palindromic DNA sequences (GGTACAnnnTGTTCT), called glucocorticoid response elements (GRE) (Berg, 1989). GREs were found in the promoter region of a broad array of genes from different species, for example the rat phenyletanolamine N-methyltransferase gene (Tai et al., 2002) and beta2- adrenergic receptor gene (Cornett et al., 1998), the murine tyrosine hydroxylase gene (Hagerty et al., 2001), the human sgk1 gene (Itani et al., 2002), parathyroid hormone (He et al., 2002) and PHEX gene (Hines et al., 2002), explaining the complex effects of GCs. Wang and colleagues (2003) performed oligonucleotide microarray analysis of 10,000 genes from dexamethasone (DX) treated S49.A2, WEHI 7.2 cells and murine thymocytes, and identified dexamethasone-induced gene 2 (Dig2, GeneBank accession No.: AY260552), as a candidate anti-apoptotic gene. The overexpression of Dig2 in WEHI 7.2 mouse thymoma cell line resulted in GC resistance (Wang et al., 2003), suggesting that it possesses anti-apoptotic activity. The mouse GR gene spans approximately 110 kilobases and its transcripts consist of 9 exons (Stra hle et al., 1992). The N-terminal segment is encoded by exon 2, the DNA-binding zinc-fingers are encoded by exons 3 and 4, while the C-terminal hormone-binding site is encoded by the remaining 5 exons, respectively (Stra hle et al., 1992). In humans there are two isoforms of the GR: alpha (777 AA residues) and beta (742 AA residues) differing at their carboxyl termini (Hollenberg et al., 1985); in mice, however, the beta isoform could not be identified (Otto et al., 1997). The expression of GR is autoregulated by GCs in a cell- or tissue-dependent manner. Its repression was described in NIH 3T3 mouse fibroblasts (Hoeck et al., 1989), in human IM-9 lymphocytes and rat pancreatic acinar AR42J cells (Rosewicz et al., 1988), and in rat hepatoma cells (Okret et al., 1986), while upregulation was found in a human leukaemic T-cell line CEM-C7 (Eisen et al., 1988; Antakly et al., 1989; Ashraf et al., 1991). It was observed that homologous downregulation is an important factor in GC resistance (Schaaf and Cidlowski, 2003). Even though GREs were described in the promoter region of the GR gene, the mechanism of homologous downregulation has not been completely explored yet (Okret et al., 1986). Thymus cortical epithelial cells are capable of local GC production (Pazirandeh et al., 1999), thus exerting paracrine action on thymocytes and possibly participating in the regulation of positive selection processes (Vacchio et al., 1994). Our previous results showed that CD4, CD8 double positive (DP) thymocytes are the most sensitive thymic subset in 4-week-old BALB/c mice to DX-induced apoptosis in vivo (Berki et al., 2002). On the other hand, others claimed that GCs are dispensable in thymocyte maturation (Godfrey et al., 2000), based on studies performed on GR -/- mice (Cole et al., 1995), where unaltered thymocyte differentiation was found (Purton et al., 2000). Nevertheless, the exact role of GC and its receptor in thymocyte development still remains controversial up to date (Jondal et al., 2004), complicated by other regulators of apoptosis, e.g. proteins of the Bcl-2 family (Reed, 1998), which, besides GCs, could also contribute to the different apoptotic sensitivity of thymocyte subpopulations. To elucidate the background of different GC sensitivities of thymocytes, in the present study, we analysed the GR expression in thymocyte subpopulations at different maturation stages (DN, DP and CD4 or CD8 SP cells) at the mrna and protein levels. In addition, we investigated the time-dependent effect of GC agonist (DX) and antagonist (RU486) treatment on GR expression using real-time PCR and flow cytometry and correlated them to the thymus composition and apoptotic marker changes. We also characterised two apoptosis-related gene products Dig2 and Bcl-2 levels in thymocyte subpopulations, respectively. Our data indicate that the effect of GCs in thymocytes is determined by a balance between the GR expression and Dig2 and Bcl-2 transcription in a differentiation-stage-dependent manner.

105 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) Materials and methods Materials DX (5 mg/ml stock solution) (Oradexon, OR) was purchased from NV Organon Holland. RU486 (Mifepristone, Sigma) (10 mg/ml stock solution in ethanol) was used as GC inhibitor. The following monoclonal antibodies were used for cell surface labelling: phycoerythrin-conjugated rat anti-mouse CD4 (Clone L3T4, Pharmingen) and CyChromeconjugated rat anti-mouse CD8 (Clone Ly 2, Pharmingen). Cytoplasmic GR labelling was performed with monoclonal anti-gr-fitc antibody (Clone 5.E4) (Berki et al., 1998). The Bcl-2 protein was detected with monoclonal anti-bcl-2-fitc antibody (Clone 3F11) from BD Pharmingen. Annexin V (BD, Pharmingen, CA) labelling was performed in Annexin-binding buffer (10 mm HEPES/NaOH, ph 7.4, 140 mm NaCl and 2.5 mm CaCl 2 ). Propidium iodide (PI) was purchased from Sigma. Thymi were homogenised in PBS (phosphate buffered saline). The cells were washed and labelled in PBS containing 0.1% BSA and 0.1% NaN 3 staining buffer. For intracellular labelling, the cells were fixed in 4% paraformaldehyde, and permeabilised in PBS containing 0.1% saponin, 0.1% BSA and 0.1% NaN 3. Total RNA isolation was performed with TriReagent (Sigma). DNA was digested with Deoxyribonuclease I (Sigma). For reverse transcription M-MLV RT, RNase H (-) point mutant enzyme (Promega), oligothymidylic acid (Sigma) and RNaseOut recombinant Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen) were used. Real-time PCR was done with Light-Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I kit (Roche). All other fine chemicals were purchased from Sigma. Fluorescence labelling, flow cytometric acquisition and analysis We used triple labelling technique for the simultaneous detection of cell surface CD4, CD8 and intracellular GR or Bcl-2 molecules on unsorted thymocytes. Briefly, thymocytes ( ) in 100 ml staining buffer (PBS, 0.1% NaN 3, 0.1% BSA) were labelled for the expression of CD4 and CD8 molecules for 30 min on ice. After two washing steps in PBS, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS for 20 min, washed twice in PBS and stained in permeabilising saponin buffer (0.1% saponin, 0.1% NaN 3 and 0.1% BSA) for intracellular GR and Bcl-2 molecules (Berki et al., 1998). After 30 min incubation on ice, the cells were washed twice in saponin buffer, once in binding buffer and stored in 500 ml 0.1% PFA/PBS buffer until flow cytometric analysis. The samples were analysed in a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose CA) using the CellQuest software. Thymocytes were gated on FSC/ SSC plots according to their size and granularity. The gate determined by the untreated thymocyte sample was used for every further measurement. To determine the expression of GR and Bcl-2 cells in DN, DP, CD4 SP or CD8 SP populations, two-parameter dot-plots showing cell surface CD4/CD8 staining (FL2/FL3 channels) were first created from the previous gate. Thymocytes were gated according to their CD4 and/or CD8 fluorescence, and these populations were separately analysed for anti-gr FITC or anti-bcl-2-fitc log fluorescence (FL1 channel). The fluorescence intensity of GR or Bcl-2 staining was compared in different thymocyte subpopulations by overlaying the FL1 histograms. Treatment of mice and thymocyte preparation One group of 3- to 4-week-old (10 g body weight) BALB/c mice (Charles River) were injected i.p. with high (10 mg/kg) dose DX dissolved in 100 ml PBS. Another group of animals received RU486 in 100 ml sesame oil i.p./animal for 2 days before the high dose DX administration. The third group of mice was injected with only 1 mg/kg body wt RU486 in 100 ml sesame oil i.p./animal. Control mice received only PBS. Mice from each group were killed by rapid decapitation after 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 or 24 h, their thymi were isolated and homogenised in PBS with a glass/glass homogeniser. The suspension was filtered through nylon mesh, the thymocytes were washed once in PBS and then the cell concentration of samples was set to 10 7 /ml. Apoptosis detection For apoptosis detection, double staining with Annexin V-FITC (PharMingen) and PI was performed according to the method of Vermes et al. (1995). Briefly, thymocytes were resuspended in 100 ml binding buffer (10 mm HEPES/NaOH, ph 7.4, 140 mm NaCl and 2.5 mm CaCl2). Then 5 ml Annexin V FITC (1 mg/ml final volume) and 0.5 mg PI were added to the cells, and the mixture was incubated at room temperature in the dark for 15 min. Binding buffer (400 ml) was added before flow cytometric analysis. Two-parameter dot-plots showing Annexin V/PI staining (FL1/ FL3 channels) were created to determine the ratio of apoptotic cells in the thymus glands. Annexin V/PI double positive cells are late apoptotic, while Annexin V single positive cells are early apoptotic cells (Vermes et al., 1995).

106 788 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) Cell sorting 10 7 thymocytes were labelled with anti-cd4-pe and anti-cd8-cyc mabs for 30 min, in labelling buffer at room temperature, followed by washing and flow cytometric analysis performed on a BectonDickinson FACS-Vantage SE instrument with Cell Quest Pro sofware. Sorting of thymocyte subpopulations was carried out according to their fluorescence in FL2 (PE 578 nm) and FL3 (CyChrome 670 nm) channels. RNA isolation and reverse transcription Total RNA was isolated from 10 7 unsorted or sorted thymocytes with Tri Reagent according to the manufacturer s instructions. The final RNA precipitate was dissolved in DEPC water and the RNA content and purity was checked by UV spectrophotometry at 260 and 280 nm. To eliminate DNA contamination of RNA, the samples were digested with DNase before reverse transcription. Reverse transcription was performed from 1 mg RNA/sample in the presence of 0.5 mg oligo(dt) 16, M-MLV RT 1 reaction buffer, 1 mm of each dntp, 40 units of RNase Inhibitor and 1 unit of M-MLV reverse transcriptase according to the manufacturer s instructions, parallel with negative controls without the reverse transcriptase enzyme. Real-time PCR Real-time PCR reactions were performed on the cdna samples with rat-mouse b-actin (forward: ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC AC-3 0 ; reverse: 5 0 -TCT GCG CAA GTT AGG TTT TGT C-3 0 ; product size 825 bp; Tm: 57 1C), mouse GR (forward: 5 0 -TGG TGT GCT CCG ATG A-3 0 ; reverse: 5 0 -AGG GTA GGG GTA AGC-3 0 ; product size: 328 bp; Tm: 60 1C) and mouse Dig2 (forward: 5 0 -GACGTGTGTGTG- GAGCAAGGC-3 0 ; reverse: 5 0 -CCGGTACTTAGCGT- CAG-3 0 ; product size: 197; Tm: 60 1C) primers on a Roche Light Cycler using LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit. Reaction mix (20 ml/capillary tube) contained 4 mm MgCl 2, 0.5 mm primers, 1 ml cdna and 2 ml LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I in PCR grade sterile water. SYBR green fluorescence was detected during the 35 cycles long reactions at 87 1C in case of actin primers and at 82 1Cin case of GR primers. The specificity of the reactions was verified by melting curve analysis (melting peak of ratmouse actin at 89 1C; mouse GR at 84 1C) and agarose gel electrophoresis. Relative quantification was done using both primers in each sample. First reaction efficiencies were calculated, based on a dilution series of the strongest cdna sample, then from the crossing point differences, the relative cdna levels were obtained. At the end, the relative GR mrna values were corrected with relative actin mrna values of the same sample. Statistical analysis The effect of various treatments between groups was tested for statistical significance using Student s t-test. Po0:05 denoted statistical significance. Results Different GR mrna expression of thymocyte subpopulations Thymocyte subpopulations were sorted after anti- CD4-PE and anti-cd8-cyc labelling based on their FL2 FL3 fluorescence signals (Fig. 1A). The original thymocyte sample contained 3% DN, 76% DP, 15% CD4 SP and 6% CD8 SP cells (Fig. 1A). The cell sorting yielded 96%, 98%, 95% and 93% purity of DN (Fig. 1D), DP (Fig. 1C), CD4 SP (Fig. 1B) and CD8 SP (Fig. 1E) cells, respectively. Real-time PCR analysis of cdna from these sorted thymocytes revealed that there are significant differences in the GR mrna expression among thymocyte subpopulations (Fig. 1F). DP cells had the lowest GR mrna expression (0:7 0:25 relative mrna level), CD4 SP cells expressed 1.9 times (1:31 0:66 relative mrna level), CD8 SP cells expressed 2.7 times ð1:90 2:04Þ and DN thymocytes expressed 4 times higher (2:85 2:53 relative mrna level) GR mrna levels than DP thymocytes, respectively ðpo0:05þ (Fig. 1F). GR and Bcl-2 protein expression of thymocyte subpopulations Parallel to GR mrna, GR protein level in thymocyte subpopulations was also determined after surface labelling of cells with anti-cd4-pe and anti-cd8-cyc antibodies, followed by intracellular labelling with anti-gr-fitc (Berki et al., 1998). Thymocyte subpopulations were gated based on their fluorescence signals in FL2 and FL3 channels and GR levels were analysed from each thymocyte gate (Berki et al., 1998). Flow cytometric detection of the GR also showed that DP thymocytes had significantly lower GR protein levels compared to DN, CD4 SP and CD8 SP cells ðpo0:05þ (Fig. 2A). We found no significant difference in GR protein levels of DN, CD4 SP or CD8 SP populations (Fig. 2A). Interestingly, in CD4 SP thymocytes, there was a considerable discrepancy between GR protein and mrna levels. Bcl-2 is an anti-apoptotic protein inhibiting the function of caspases (Cory, 1995). Since DP cells show

107 GR prot. (FL1 mean) ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) (A) * 0 DN DP CD4 SP CD8 SP 20 (B) Bcl-2 (FL1mean) * 0 DN DP CD4 SP CD8 SP Fig. 2. GR and Bcl-2 expression in thymocyte subpopulations. (A) Cytoplasmic GR protein levels of thymocyte populations in untreated mice measured by triple colour flow cytometry. Bars represent GR mean fluorescence intensities SD measured in FL1 channel from 3 separate experiments ð Po0:05Þ. (B) Bcl-2 expression of thymocyte subgroups in untreated mice measured by flow cytometry. Bars represent mean FL1 fluorescence intensities SD from 3 separate experiments. Bcl-2 level of DP cells was significantly lower than that of other thymocyte subgroups (Student t-test, Po0:01). Fig. 1. GR mrna expression in thymocyte subpopulations. (A) (E) Thymocytes were sorted after cell surface anti-cd4- PE and anti-cd8-cyc labelling according to their FL2/FL3 fluorescence. (A) The two dimensional fluorescence dot plot shows the tipical distribution of 3 4-week-old BALB/c thymocytes. (B) CD4 SP thymocytes after cell sorting. (C) DP thymocytes after cell sorting. (D) DN thymocytes after cell sorting. (E) CD8 SP thymocytes after cell sorting. Numbers on dot plots B E indicate the purity of cell populations after cell sorting. (F) GR mrna expression relative to b-actin of the different thymocyte subpopulations analysed by real-time PCR. Bars represent the mean SD of relative GR mrna levels in DN, DP, CD4 SP and CD8 SP thymocytes from 3 separate experiments. ð Po0:05Þ. a considerably higher sensitivity to DX-induced apoptosis than DN, CD4 SP and CD8 SP cells, we compared the Bcl-2 level of thymocyte subpopulations by intracellular flow cytometry in the four major thymocyte subsets (Fig. 2B). We found that DP thymocytes expressed significantly lower levels of Bcl-2 (FL1 mean fluorescence: 4:1 0:14), compared to DN, CD4 SP and CD8 SP thymocytes (FL1 mean fluorescence: 12:3 1:2, 12:1 1:56 and 14:5 1:7, respectively) (Fig. 2B), in similar distribution to that of the GR. Time-dependent changes in thymocyte numbers, subsets and apoptotic markers after a single high dose DX administration with or without RU486 pretreatment Since it has been previously established by our group (Berki et al., 2002) and also others (Wiegers et al., 2001), that DP cells are the most sensitive to GC-induced depletion, we assessed the time-dependent thymocyte subpopulation changes after a single high dose DX and/ or RU486 injection, using cell surface anti-cd4-pe and anti-cd8-cyc labelling of cells by flow cytometry. Flow cytometric statistics showed that in untreated control thymi, distribution of the four major subsets were 3.6% DN, 83.2% DP, 10% CD4 SP and 3.1%

108 790 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) CD8 SP, respectively (Fig. 3). After a single high dose DX treatment, DP cells reached gradually a marked depletion at 24 h (44.9%), with a relative dominance of the mature CD4 SP (36.1%) and CD8 SP (9.8%) cells (Fig. 3A). RU486 pretreatment could not revert the DX-induced thymus composition changes, at 24 h the DP cell ratio dropped to 35.4%, while the CD4 SP and CD8 SP cell ratio increased to 44 and 15.2%, respectively (Fig. 3B). RU486 treatment alone caused no significant changes in apoptotic markers (data not shown). We also analysed the total cell count from each group of mice (Table 1). Twenty-four hours after a single high dose treatment, the thymus cell number decreased to 26.8 million from million in control mice. There was a major drop in total cell numbers 8 h after the DX treatment (59.2 million), before this time point cell numbers were 142.8, 144, 148, and million, respectively. The cell-depleting effect of the DX could not be inhibited with RU486 pretreatment (19.5 million cells 24 h after treatment vs million in control mice), although it was a bit prolonged: the major decrease in cell numbers appeared 12 h after the DX treatment (105.4, 109.3, 108.4, 129, and million before 12 h vs. 38.4, 35.9, 25 and 19.5 million cells after 12 h, respectively). RU486 treatment alone caused no significant changes in thymic cell numbers (data not shown). GC- and GC-analogue-induced DP cell depletion is mediated by apoptosis, so next we analysed the timedependent changes in apoptosis with combined Annexin V/PI staining by flow cytometry. Annexin V single positive cells indicate the early apoptotic cells, while Annexin V/PI double positive cells represent the late apoptotic cells, respectively (Vermes et al., 1995). After a single high dose DX injection, thymocytes showed an initial 4-fold increase in Annexin V staining at 4 h, with a slight decrease at 8 h followed by a more marked 8-fold increase at h (Fig. 4A). The late apoptotic cell ratio increase significantly 12 h after the DX treatment, and reached a maximum at 24 h when more than 40% of cells were already late apoptotic (Fig. 4A). When mice were pretreated with GC antagonist prior to the DX administration, the initial increase (at 4 h) in the percentage of Annexin V single positive cells was present, but the later (after 8 h) changes in Annexin V and Annexin V/PI positive cell percentage were abolished (Fig. 4B). RU486 treatment alone caused no significant changes in apoptotic markers (data not shown). Time-dependent changes of thymocyte GR mrna and protein level after a single high dose DX administration with or without RU486 pretreatment As GCs themselves have been established to participate in the regulation of GR expression (Rosewicz et al., 100% 75% 50% 25% 0% 100% 75% 50% 25% 0% (A) (B) CD8 CD4 DX RU+DX 1988), we next characterised the time-course of GR mrna levels 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 and 24 h after exposure to DX with or without RU486 treatment from DP DN Time (h) Time (h) Fig. 3. Time-dependent changes in thymocyte composition after single high dose DX administration with (B) or without RU486 pretreatment (A). Thymocyte composition was analysed by flow cytometry after cell surface labelling with anti- CD4-PE and anti-cd8-cyc antibodies. Time elapsed after different treatments is indicated on the x-axis. White, black, light grey and dark grey segments of the bars represent DN, DP, CD4 SP and CD8 SP cell ratio, respectively. Diagrams show the data of a representative measurement from 3 separate experiments.

109 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) Table 1. Time-dependent changes in total thymocyte numbers Time Ctrl 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h DX RU+DX Time elapsed after different treatments is indicated in the first row in hours (time). The second and third rows show thymocyte numbers (million cells) after DX or RU+DX treatments, respectively. Table shows the data of a representative measurement from 3 separate experiments. Percent of gated cells Percent of gated cells DX Annexin+ Annexin/PI+ unsorted thymocytes. After a single high dose DX injection, GR mrna expression increased considerably at first, reaching a 4.5-fold peak at 4 8 h, followed by a gradual decrease until 24 h, when it dropped to only 50% of the control (Fig. 5A). Pretreatment with the GC antagonist RU486 could not inhibit the initial effect of DX (Fig. 5B), though there was a faster decline in GR mrna levels after 4 h. The RU486 treatment alone did not cause any significant alteration in GR mrna levels (Fig. 5C). (A) Time (h) RU+DX (B) Time (h) Fig. 4. Time-dependent changes in apoptosis markers after single high dose DX administration with (B) or without RU486 pretreatment (A). Annexin V/PI stainig of cells was followed by flow cytometric detection. Annexin V single positive cells are early apoptotic (white bars), Annexin V/PI double positive cells are late apoptotic (black bars). Time elapsed after different treatments is indicated on the x-axis. Diagrams show the data of a representative measurement from 3 separate experiments. The GR protein levels were also determined by flow cytometry after intracellular GR staining at each time point. There was also a transient increase in the protein levels after DX treatment (3.5-fold, compared to control) ðpo0:05þ, reaching the peak at 16 h, followed by a decrease until 24 h (Fig. 5D). RU486 pretreatment slightly inhibited the DX-induced cytoplasmic GR protein level changes (Fig. 5E), and had no effect alone (Fig. 5F). The alterations of protein level followed the mrna expression changes with an approximately 8 h delay (Fig. 5). Effect of DX treatment on the GR mrna and protein expression of thymocyte subpopulations To delineate more specifically the likely candidate subpopulation for DX-mediated GR expression changes, next we analysed how the GR expression of different thymocyte subpopulations were affected by DX treatment. Twenty-four hours after a high dose DX treatment, we measured the GR mrna levels of sorted thymocytes by real-time PCR. GR mrna levels variously decreased by 81% in DN (Fig. 6A), 74% in CD4 SP (Fig. 6A) and 93% in CD8 SP (Fig. 6A) thymocytes, respectively. DP thymocytes showed unaltered GR mrna expression after a single high dose DX treatment (Fig. 6A). Parallel to determining the GR mrna expression changes induced by DX, we also analysed the GR protein expression alterations. We found that GR protein levels decreased after a single high dose DX injection in DN, CD4 SP and CD8 SP thymocytes by 56%, 64% and 66%, respectively (Fig. 6B). In contrast, the GR protein level in DP cells remained unaltered after a single high dose DX treatment (Fig. 6B), similarly to its mrna expression (Fig. 6A). Dig2 expression of thymocyte subpopulations Dig2 is a recently identified gene product induced by DX treatment in vitro (Wang et al., 2003). First we assessed whether Dig2 is also induced by DX treatment in vivo. Two hours after a single high dose DX administration, we found a 5-fold increase of Dig2 mrna expression (relative Dig2 mrna level: 2.05) compared to the untreated control (relative Dig2

110 792 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) GR mrna DX 6 RU486+DX 6 RU486 (A) (B) (C) (D) (E) (F) GR prot Time (h) Fig. 5. Time course of GR mrna and protein expression in thymocytes after a single high dose DX injection, either with (B, E) or without (A, D) previous RU486 pretreatment, or RU486 administration alone (C, F). Data points on diagrams A, B and C represent the relative GR mrna level of thymocytes, while data points on diagrams D, E and F represent the ratio of FL1 mean fluorescence intensities compared to the untreated control measured by flow cytometry, respectively. Diagrams show the data of a representative measurement from 3 separate experiments. mrna level: 0.34) (Fig. 7A). This increased expression could not be inhibited by RU486 pretreatment (relative Dig2 mrna level: 2.22) (Fig. 7A). RU486 treatment alone also increased Dig2 mrna levels (relative Dig2 mrna level: 0.8) in thymocytes (Fig. 7A). Next, we analysed the Dig2 expression by various thymocyte subgroups from untreated mice. DP cells had significantly higher Dig2 mrna level (relative Dig2 mrna level: 0.3) than that in DN (relative Dig2 mrna level: 0.12) or CD4 SP (relative Dig2 mrna level: 0.05) and CD8 SP cells (relative Dig2 mrna level: 0.15), respectively (Fig. 7B). Discussion The ability of GCs to induce apoptosis of both mature and immature T lymphocytes is well established (Ashwell et al., 2000). In a previous work, we reported different GC sensitivities of thymocyte subpopulations (Berki et al., 2002), which was in line with previous findings (Cohen, 1992) as well. However, the reason for different GC sensitivity of distinct thymocyte subsets is still unclear. Here, we analysed four possible underlying factors: GR level, GR expression regulation by GCs, Dig2 expression and Bcl-2 expression, together with functional data on apoptosis. Differential GR expression by target cells could be an obvious explanation for their different GC sensitivity (Pazirandeh et al., 2002). In the present study, we establish that the GR mrna and protein expression showed considerable differences between thymocyte subpopulations: the DP cells had the lowest GR expression, followed by CD4 SP, CD8 SP and DN cells, at both the mrna expression and the protein level. DP cells react most intensely to GC-induced apoptosis, despite their relatively low GR expression, suggesting that the GR level alone is unlikely to be the determining factor of GC sensitivity. Other signalling mechanisms could contribute to the GC sensitivity of cells (Ashwell et al., 2000), as well. Another possible explanation might be that apoptosis of DP thymocytes is mediated by non-genomic GC effects (Buttgereit and Scheffold, 2002), including the interaction of the cytoplasmic GR with other signalling molecules. This mechanism is also supported by our present results, that RU486 could not inhibit the GC-induced DP cell depletion and also could not revert the initial apoptotic events 4 h after the DX administration. In an autoregulatory fashion, GCs participate in GR expression regulation (Rosewicz et al., 1988). A major goal of our present study was, to follow the time course of GC-induced in vivo GR expression changes in mouse thymocytes, together with the apoptotic markers Annexin V/PI and the changes in thymocyte subsets, respectively. We found an interesting bi-phasic pattern of expression change in GR mrna and protein levels after a single high dose DX administration, with an initial increase until 4 8 (mrna) and 16 (protein) h, followed by a gradual decrease until 24 h. Similar biphasic GR expression changes were described in rat hepatoma cells by Okret and colleagues (1986). The repression of GR expression 24 h after DX treatment was also in line with previous findings (Okret et al., 1986; Rosewicz et al., 1988; Hoeck et al., 1989). Similarly to the GR expression pattern change, the rise

111 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) (A) 3 (A) GR mrna 4 2 ctrl DX Dig2 mrna DN DP CD4 SP CD8 SP 0 ctrl DX DX+ RU486 RU (B) 0.4 (B) 60 ctrl DX 0.3 GR prot. (FL1 mean) DN DP CD4 SP CD8 SP Fig. 6. GR mrna (A) and protein level (B) changes in different thymocyte subpopulations 24 h after a single high dose DX treatment. (A) Bars represent the relative GR mrna levels of sorted DN, DP, CD4 SP and CD8 SP thymocytes analysed by real-time PCR, respectively, from control (black) or high dose DX treated (white) mice. (B) GR protein level changes of thymocyte subpopulations measured by flow cytometry. Bars show the mean FL1 fluorescence of control, untreated (black) and high dose DX treated (white) thymocyte subpopulations. Diagrams show the data of a representative measurement from 3 separate experiments. in early apoptotic cell ratio showed two peaks: an early increase at 4 h and a later, more marked increase at h, followed by the increase in the late apoptotic cell ratio as well. Very similar in vivo apoptosis kinetics were found in C57BL/6 mice by Tosa and colleagues (2003). The GR expression changes and the apoptotic marker changes were coupled with the gradual depletion of DP cells. Based on the parallel GR expression changes and phosphatidyl-serin translocation to the outer lipid layer of the plasma membrane 4 h after GC analogue treatment, we propose that the GR could participate in the regulation of the early steps of apoptosis. Since these early (within 4 h) events were not antagonised by the GC antagonist pretreatment, the possibility of non-genomic GC action arises. Here, we found that apoptosis induced h after a single high dose GC analogue exposure was inhibited by GC antagonist pretreatment, that is in line with previous findings by others (Erlacher et al., 2005). Dig2 mrna DN DP CD4 CD8 Fig. 7. Dig2 mrna expression of thymocytes assessed by real time PCR. (A) Bars represent the relative Dig2 mrna levels in control, DX, DX+RU486 and RU486 treated mice. (B) Bars show the relative Dig2 mrna expression of thymocyte subpopulations in untreated mice. Diagrams show the data of a representative measurement from 3 separate experiments. The GC GR complex translocates to the nucleus within 30 min (Berki et al., 2000), where it acts as a transcription factor of different genes containing GREs (Berg, 1989). The GR gene itself also contains GRE (Okret et al., 1986), possibly contributing to the selfregulatory role of GCs on GR. The initial increase of GR mrna (8 h) and protein (16 h) expression could be caused by direct binding of the GR GC complex to the GR gene itself, thus inducing transcription. RU486 was shown to inhibit the translocation of GR to the nucleus in rat thymocytes (Lefebvre et al., 1988) and also to stabilise the the association of GR to Hsp-90 in mouse lymphoma cells (Distelhorst and Howard, 1990). On the other hand, the translocation of GR to the nucleus was described upon RU486 treatment (Pariante et al., 2001; Schaaf and Cidlowski, 2003), and the partial GR agonistic effect of RU486 was also shown (Kraml et al., 2003; Nordeen et al., 1993), suggesting that the GR antagonist effect of RU486 is dependent on the experimental system and cell/tissue type, respectively. According to our data, RU486 could not block the early (within 8 h) transcriptional autoregulatory activity of the GR in mouse thymocytes, in vivo, but the exact

112 794 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) mechanism of this needs further elucidation. The GC GR complex may interact with a number of other transcription factors, including NF-kB (Ray and Prefontaine, 1994), AP-1 (Periyasami and Sanchez, 2002; Yang-Yen et al., 1990), CREB (Imai et al., 1993), STAT-3 (Zhang et al., 1997) and STAT-5 (Stocklin et al., 1996), which could account for the effects of DX manifested later (24 h). Twenty-four hours after a single high dose DX injection, DN, CD4 SP and CD8 SP cells showed a considerable decrease in GR mrna expression, while DP cells did not change their GR mrna expression, which was also reflected in the immunologically detectable amount of the receptor. It seems that in DP cells the homologous downregulation which plays a pivotal role in glucocorticoid resistance (Schaaf and Cidlowski, 2002) is impaired. GR downregulation seems to be a common mechanism in all thymocytes except DP cells. This lessened sensitivity to downregulate GR in DP cells could contribute to their higher sensitivity to GCs. Unaltered GR level could lead to increased hormone efficiency through persistant GC action. In addition, NF-kB transrepression could also lead to GC resistance (Almawi and Melemdjian, 2002). Since the GR beta isoform is missing in mice, the inhibitory role of GR beta (Oakley et al., 1999) can be excluded in our experimental system. A recent study identified Dig2 as a valuable reporter for GC exposure of thymocytes in vitro (Wang et al., 2003). We found that its expression could be increased by in vivo GC analogue treatment in BALB/c thymocytes, confirming the in vitro results of Wang and colleagues (2003). However, we could not inhibit GC action with RU486 pretreatment, although a succesful in vitro inhibition on S49.A2 mouse thymoma cells was reported (Wang et al., 2003). Currently, the inefficiency of RU486 in in vivo systems cannot be excluded. According to Wang and colleagues (2003), overexpression of Dig2 in vitro had a protective effect against DXinduced apoptosis in WEHI 7.2 cells. Interestingly, we found a relatively high Dig2 expression in BALB/c DP thymocytes, despite their high DX sensitivity. Amongst the various participants of the cellular responses leading to apoptosis, Bcl-2 protein family members are important regulators of apoptosis (Reed, 1998). Here we describe that not only GR, but the antiapoptotic protein Bcl-2 is also expressed differentially in mouse thymocyte subsets. Not surprisingly, DP thymocytes, with the highest sensitivity for apoptosis, express the lowest levels of Bcl-2, which might contribute to their higher DX sensitivity. Similar expression pattern was described by Ma and colleagues (1995). In addition to regulating their own receptor and Dig2, GCs also participate in the regulation of the expression of Bcl-2 family members (Almawi et al., 2004). The proapoptotic protein Bad is upregulated in thymocytes after 5 h DX treatment (Mok et al., 1999), while the antiapoptotic Bcl-2 and Bcl-xL is repressed by DX in leukaemic cells (Broome et al., 2002) and human osteosarcoma cells (Rogatsky et al., 1999). Based on these results, we propose that the DXinduced effects on thymocytes in vivo appear in two waves: an early group of events (at 4 8 h) include GR upregulation and the appearance of a smaller proportion of early apoptotic cells coupled with the Dig2 gene induction, while the second group of events is induced later (at h) when the GR is already downregulated and the number of early and late apoptotic cells increase dramatically, respectively. The low GR, the high Dig2 and low Bcl-2 expression, and the inefficient homologous downregulation upon GC analogue exposure in DP cells imply that DP cells are under endogenous GC influence, originating from GC-rich compartments of the thymus, within the cortical reticular epithelial domain (Vacchio et al., 1994). Therefore, prior to their exposure to DX, these cells had already downregulated their GR and Bcl-2 proteins, and increased their Dig2 expression, still within the thymic microenvironment, thereby exogenous GC administration could not induce further expression changes in these molecules at this differentiation stage. This humoral balancing mechanism unique for the DP cells might further shape the available T-cell repertoire during their thymic differentiation. It remains to be seen whether this steroiddriven mechanism can interact with the other signalling events operating at this crucial stage of T-cell development. Acknowledgements To Pe ter Balogh for critically reading the manuscript and useful advice. To Ms. Ma ria Pa pa and Ms. Judit Melczer for technical assistance. To Attila Miseta and Pe ter Csutora (Department of Laboratory Medicine, University of Pe cs) for helping us in using the Roche Light Cycler and Krisztia n Kvell (Department of Immunology and Biotechnology, University of Pe cs) for useful advice. This work was supported by Hungarian National Health Foundation ETT32/KO/03. References Almawi, W.Y., Melemdjian, O.K., Negative regulation of nuclear factor-kb activation and function by glucocorticoids. J. Mol. Endocrinol. 28, Almawi, W.Y., Melemedjian, O.K., Jaoude, M.M., On the link between Bcl-2 family proteins and glucocorticoidinduced apoptosis. J. Leukocyte Biol. 76, Antakly, T., Thompson, E.B., O Donnell, D., Demonstration of the intracellular localization and up-regulation

113 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) of glucocorticoid receptor by in situ hybridization and immunocytochemistry. Cancer Res. 49 (8 Suppl), 2230s 2234s. Ashraf, J., Kunapuli, S., Chilton, D., Thompson, E.B., Cortivazol mediated induction of glucocorticoid receptor messenger ribonucleic acid in wild-type and dexamethasone-resistant human leukemic (CEM) cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 38, Ashwell, J.D., Lu, F.W., Vacchio, M.S., Glucocorticoids in T cell development and function. Annu. Rev. Immunol. 18, Berg, J.M., DNA binding specificity of steroid receptors. Cell 57, Berki, T., Kumanovics, G., Kumanovics, A., Falus, A., Ujhelyi, E., Nemeth, P., Production and flow cytometric application of a monoclonal anti-glucocorticoid receptor antibody. J. Immunol. Methods 214, Berki, T., Grama, L., Ne meth, P., Detection of steroid induced glucocorticoid receptor (GR) translocation and expression with a FITC labeled monoclonal antibody. Cytometry 10 (Suppl.), 99. Berki, T., Pálinkás, L., Boldizsa r, F., Ne meth, P., Glucocorticoid (GC) sensitivity and GC receptor expression differ in thymocyte subpopulations. Int. Immunol. 14, Broome, H.E., Yu, A.L., Diccianni, M., Camitta, B.M., Monia, B.P., Dean, N.M., Inhibition of Bcl-xL expression sensitizes T-cell acute lymphoblastic leukemia cells to chemotherapeutic drugs. Leukemia Res. 26, Buttgereit, F., Scheffold, A., Rapid glucocorticoid effects on immune cells. Steroids 67, Cohen, J.J., Glucocorticoid-induced apoptosis in the thymus. Semin. Immunol. 4, Cole, T.J., Blendy, J.A., Monaghan, A.P., Krieglstein, K., Schmid, W., Aguzzi, A., Fantuzzi, G., Hummler, E., Unsicker, K., Schutz, G., Targeted disruption of the glucocorticoid receptor gene blocks adrenergic chromaffin cell development and severely retards lung maturation. Genes Dev. 9, Cornett, L.E., Hiller, F.C., Jacobi, S.E., Cao, W., McCraw, D.W., Identification of a glucocorticoid response element int he rat beta2-adrenergic receptor gene. Mol. Pharmacol. 54, Cory, S., Regulation of lymphocyte survival by the bcl-2 gene family. Annu. Rev. Immunol. 13, Distelhorst, C.W., Howard, K.J., Evidence from pulsechase labeling studies that the antiglucocorticoid hormone RU486 stabilizes the nonactivated form of the glucocorticoid receptor in mouse lymphoma cells. J. Steroid Biochem. 36, Eisen, L.P., Elsasser, M.S., Harmon, J.M., Positive regulation of the glucocorticoid receptor in human T-cells sensitive to the cytolytic effects of glucocorticoids. J. Biol. Chem. 263, Erlacher, M., Knoflach, M., Stec, I.E., Bock, G., Wick, G., Wiegers, G.J., TCR signaling inhibits glucocorticoidinduced apoptosis in murine thymocytes depending on the stage of development. Eur. J. Immunol. 35 (11), Evans, R.M., The steroid and thyroid receptor superfamily. Science 240, Godfrey, D.I., Purton, J.F., Boyd, R.L., Cole, T.J., Stress-free T-cell development: glucocorticoids are not obligatory. Immunol. Today 21, Hagerty, T., Fernandez, E., Lynch, K., Wang, S.S., Morgan, W.W., Strong, R.T., Interaction of a glucocorticoidresponsive element with regulatory sequences in the promoter region of the mouse tyrosine hydroxilase gene. J. Neurochem. 78, He, B., Tong, T.K., Hiou-Tim, F.F., Al-Akad, B., Kronenberg, H.M., Karapli, A.C., The murine gene encoding parathyroid hormone: genomic organisation, nucleotide sequence and transcriptional regulation. J. Mol. Endocrinol. 29, Hines, E.R., Collins, J.F., Jones, M.D., Serey, S.H., Ghishan, F.K., Glucocorticoid regulation of the murine PHEX gene. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 283, Hoeck, W., Rusconi, S., Groner, B., Down-regulation and phosphorylation of glucocorticoid receptor in cultured cells. J. Biol. Chem. 264, Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Lebo, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Primary structure and expression of a functional human glucocorticoid receptor cdna. Nature 318, Imai, E., Miner, J.N., Mitchell, J.A., Yamamoto, K.R., Granner, D.K., Glucocorticoid receptorcamp response element-binding protein interaction and the response of the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene to glucocorticoids. J. Biol. Chem. 268, Itani, O.A., Liu, K.Z., Cornish, K.L., Campbell, J.R., Thomas, C.P., Glucocorticoids stimulate human sgk1 gene expression by activation of a GRE in its 5 0 flanking region. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283, Jondal, M., Pazirandeh, A., Okret, S., Different roles for glucocorticoids in thymocyte homeostasis? Trends Immunol. 25, Kraml, J., Kolinska, J., Sinkora, J., Zakostelecka, M., Kadlecova, L., Hirsova, D., Noskova, L., Glucocorticoid agonistic and antagonistic effects of mifepristone and onapristone on thymocyte subset composition and CD26/ dipeptidyl peptidase IV activity in infant male rats. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 87, Lefebvre, P., Danze, P.M., Sablonniere, B., Richard, C., Formstecher, P., Dautrevaux, M., Association of the glucocorticoid receptor binding subunit with the 90 K nonsteroid-binding component is stabilized by both steroidal and nonsteroidal antiglucocorticoids in intact cells. Biochemistry 27, Ma, A., Pena, J.C., Chang, B., Margosian, E., Davidson, L., Alt, F.W., Thompson, C.B., Bclx regulates the survival of double-positive thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, Mok, C.L., Gil-Gomez, G., Williams, O., Coles, M., Taga, S., Tolaini, M., Norton, T., Kioussis, D., Brady, H.J., Bad can act as a key regulator of T cell apoptosis and T cell development. J. Exp. Med. 189,

114 796 ARTICLE IN PRESS F. Boldizsár et al. / Immunobiology 211 (2006) Nordeen, S.K., Boba, B.J., Moyer, M.L., Latent agonist activity of the steroid antagonist, RU486, is unmasked in cells treated with activators of protein kinase A. Mol. Endocrinol. 7, Oakley, R.H., Jewell, C.M., Yudt, M.R., Bofetiado, D.M., Cidlowski, J.A., The dominant negative activity of the human glucocorticoid receptor beta isoform. Specificity and mechanisms of action. J. Biol. Chem. 274, Okret, S., Poellinger, L., Dong, Y., Gustafsson, J.A., Down-regulation of glucocorticoid receptor mrna by glucocorticoid hormones and recognition by the receptor of a specific binding sequence within a receptor cdna clone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, Otto, C., Reichardt, H.M., Schutz, G., Absence of glucocorticoid receptor-beta in mice. J. Biol. Chem. 272, Pariante, C.M., Pearce, B.D., Pisell, T.L., Su, C., Miller, A.H., The steroid receptor antagonists RU40555 and RU486 activate glucocorticoid receptor translocation and are not excreted by the steroid hormones transporter in L929 cells. J. Endocrinol. 169, Pazirandeh, A., Xue, Y., Rafter, I., Sjo vall, J., Jondal, M., Okret, S., Paracrine glucocorticoid activity produced by mouse thymus epithelial cells. FASEB J. 13, Pazirandeh, A., Xue, Y., Prestegaard, T., Jondal, M., Okret, S., Effects of altered glucocorticoid sensitivity in the T cell lineage on thymocyte and T cell homeostasis. FASEB J. 16, Periyasami, S., Sanchez, E.R., Antagonism of glucocorticoid receptor transactivity and cell growth inhibition by transforming growth factor-beta through AP-1 mediated transcriptional repression. Int. J. Biochem. Cell Biol. 34, Purton, J.F., Boyd, R.L., Cole, T.J., Godfrey, D.I., Intrathymic T cell development and selection proceeds normally in the absence of glucocorticoid receptor signaling. Immunity 13, Ray, A., Prefontaine, K.E., Physical association and functional antagonism between the p65 subunit of transcription factor NF-kappa B and the glucocorticoid receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, Reed, J.C., Bcl-2 family proteins. Oncogene 17, Reichardt, H.M., Immunomodulatory activities of glucocorticoids: insights from transgenesis and gene targeting. Curr. Pharm. Des. 10, Rogatsky, I., Hittelman, A.B., Pearce, D., Garabedian, M.J., Distinct glucocorticoid receptor transcriptional regulatory surfaces mediate the cytotoxic and cytostatic effects of glucocorticoids. Mol. Cell. Biol. 19, Rosewicz, S., McDonald, A.R., Maddux, B.A., Goldfine, I.D., Miesfield, R.L., Logdson, C.D., Mechanism of glucocorticoid down-regulation by glucocorticoids. J. Biol. Chem. 263, Schaaf, M.J., Cidlowski, J.A., Molecular mechanisms of glucocorticoid action and resistance. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 83, Schaaf, J.M., Cidlowski, J.A., Molecular determinants of glucocorticoid receptor mobility in living cells: the importance of ligand affinity. Mol. Cell. Biol. 23, Smith, D.F., Toft, D.O., Steroid receptors and their associated proteins. Mol. Endocrinol. 7, Stocklin, E., Wissler, M., Gouilleux, F., Groner, B., Functional interactions between Stat5 and the glucocorticoid receptor. Nature 383, Stra hle, U., Schmidt, A., Kelsey, G., Stewart, A.F., Cole, T.J., Schmid, W., Schu tz, G., At least three promoters direct expression of the mouse glucocorticoid receptor gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, Tai, T.C., Claycomb, R., Her, S., Bloom, A.K., Wong, D.L., Glucocorticoid responsiveness of the rat phenyletanolamine N-methyltransferase gene. Mol. Pharmacol. 61, Tosa, N., Murakami, M., Jia, W.Y., Yokoyama, M., Masunaga, T., Iwabuchi, C., Inobe, M., Iwabuchi, K., Miyazaki, T., Onoe, K., Iwata, M., Uede, T., Critical function of T cell death-associated gene 8 in glucocorticoidinduced thymocyte apoptosis. Int. Immunol. 15, Vacchio, M.S., Papadopoulos, V., Ashwell, J.D., Steroid production in the thymus: implication for thymocyte selection. J. Exp. Med. 179, Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C., A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cell using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods 184, Wang, Z., Malone, M.H., Thomenius, M.J., Zhong, F., Xu, F., Distelhorst, C.W., Dexamethasone-induced gene 2 (dig2) is a novel pro-survival stress gene induced rapidly by diverse apoptotic signals. J. Biol. Chem. 278, Wiegers, G.J., Knoflach, M., Bock, G., Niederegger, H., Dietrich, H., Falus, A., Boyd, R., Wick, G., CD4(+)CD8(+)TCR(low) thymocytes express low levels of glucocorticoid receptors while being sensitive to glucocorticoid-induced apoptosis. Eur. J. Immunol. 31, Yang-Yen, H.F., Chambard, J.C., Sun, Y.L., Smeal, T., Schmidt, T.J., Drouin, J., Karin, M., Transcriptional interference between c-jun and the glucocorticoid receptor: mutual inhibition of DNA binding due to direct proteinprotein interaction. Cell 62, Zhang, Z., Jones, S., Hagood, J.S., Fuentes, N.L., Fuller, G.M., Stat3 acts as a co-activator of glucocorticoid receptor signaling. J. Biol. Chem. 272,

115 Immunology Letters 90 (2003) Antigen and glucocorticoid hormone (GC) induce positive selection of DP thymocytes in a TcR transgenic mouse model Ferenc Boldizsár, László Pálinkás, Domokos Bartis, Péter Németh, Tímea Berki Department of Immunology and Biotechnology, Faculty of Medicine, University of Pécs, Pécs, Szigeti út 12, H-7624 Pécs, Hungary Received 7 July 2003; received in revised form 4 August 2003; accepted 5 August 2003 Abstract Thymocyte maturation in the thymus is controlled by stromal and humoral components. Among the humoral regulators locally produced glucocorticoids (GCs) seem to have a key role in the positive selection of thymocytes. Our previous studies have shown that the administration of GCs or the stimulation through the CD3 complex can induce apoptosis of double positive (DP) cells, but the combined presence of these stimuli induces positive selection. In this work our aim was to investigate the effects of antigen exposure and synthetic GC hormone (dexamethasone, DX) administration on the selection processes of DP cells in TcR transgenic mice. In our model, AND pigeon cytochrome c (PCC)-specific I-E k (MHC-II) restricted V 3, V 11 TcR expressing transgenic mice were treated with PCC, with high or low dose DX, or with PCC and DX together, followed by the analysis of total thymocyte numbers, thymocyte composition, with regard to their CD69, V 3 and Annexin V expression. The administration of PCC and/or DX for 2 days resulted in a decreased DP cell number and a significantly increased CD4 SP cell ratio. However, in both cases the total thymocyte numbers decreased. CD69 expression increased on both DP and CD4 SP cells after PCC and/or DX treatments. We found that after DX or combined treatment, the percentage of Annexin V positive cells increased. The ratio of V 3 TcR bearing DP thymocytes showed no change after DX or PCC administrations alone, but it decreased significantly after combined treatment. MHC-II bound PCC peptides in the presence of GCs enhanced the maturation of V 3+ DP cells into CD4 SP stage, therefore, the V 3 cells remained mostly in the DP immature stage. These data indicate that both antigen and low dose GC alone are capable of inducing positive selection of DP cells, but together they gave a stronger effect in promoting positive selection. From these we conclude that GCs influence the maturation and selection processes of thymocytes Elsevier B.V. All rights reserved. Keywords: Glucocorticoids; TcR transgenic mice; Positive selection 1. Introduction T-cell development in the thymus proceeds through well defined stages [1]. The T-cell receptor (TcR) gene rearrangement processes are initiated in immature cells with double negative (DN: CD4, CD8, TcR, CD3 ) phenotype coupled with their intense proliferation. After successful TcR gene rearrangement, the developing cells reach the double positive (DP: CD4+, CD8+, TcR+, CD3+) stage of maturation, and are selected on the basis of the signal transducing function and antigen specificity of their TcR. DP thymocytes expressing non-functional TcR are deleted by neglect, thymocytes bearing high affinity TcR for antigens presented in the thymus are prone to die during negative selection, while the cells with functional, but Corresponding author. Tel.: ; fax: address: fboldizsar@hotmail.com (F. Boldizsár). low affinity TcR survive (positive selection) [2,3]. These cells have been found to display CD69, a reliable cell surface marker associated with positive selection [4,5]. Finally, self-mhc-restricted, non-autoreactive CD4 or CD8 single positive (SP) cells are permitted to leave the thymus and home to peripheral lymphoid organs. Thymocyte maturation, selection, proliferation and migration processes are regulated by micro-environmental factors, provided by the complex meshwork of thymic epithelial cells, dendritic cells and macrophages [6,7]. High density of MHC-I- and MHC-II-presented antigen fragments on the surface of thymic stromal cells are crucial for both positive and negative selection processes, in addition to a range of adhesion molecules. Transgenic mice expressing TcR for a specific antigen are useful models in the investigation of T-cell activation/apoptosis pathways initiated by TcR signaling [8] and also for studying thymic selection processes [9,10] /$ see front matter 2003 Elsevier B.V. All rights reserved. doi: /j.imlet