(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 079 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 141 A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 141 B (1) Int. Cl.: A61K 39/02 (06.01) A61K 39/00 (06.01) A61K 39/8 (06.01) A61K 39/116 (06.01) A61K 39/12 (06.01) A61K 4/00 (06.01) C12N /82 (06.01) C12P 21/04 (06.01) A61K 39/29 (06.01) C12N /09 (06.01) (87) A zetközi közzétételi adatok: WO 08 PCT/US 03/ () Elsõbbségi adatok: 69 P US (72) Feltalálók: MILLER, Timothy, J., Lincoln, NE 68 (US); FANTON, Matthew, J., Lincoln, NE 6816 (US) (73) Jogosult: Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, Indiana (US) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) Escherichia coliból származó, hõlabilis toxin alkalmazása adjuvánsként madarakban és baromfiban (7) Kivonat A találmány tárgyát képezik adjuváns készítmények és eljárások brojlercsirkék vakcinációjára nyálkahártyapatogének ellen, amelyben E. coliból származó, hõlabilis toxint (LT) és ismert analógjait alkalmazzák adjuvánsként madarakban. A találmány tárgyát képezik továbbá készítmények és eljárások géntechnológiailag módosított növények által termeltetett LT és analógjai, valamint védettséget biztosító immunogének alkalmazására vakcinaként madarakban. HU T2 A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal vizsgálta.

2 A találmány általánosságban az immunológia szakterületére vonatkozik, és a találmány tárgyát képezik adjuváns készítmények és eljárások brojlercsirkék vakcinációjára nyálkahártya-patogének ellen. A találmány tárgyát különösen géntechnológiailag módosított növények alkalmazása képezi, amelyek immunogén peptideket, fehérjéket és adjuvánsokat termelnek. Az orális vakcinációt hosszú ideje kényelmes és traumás módszernek tekintették vakcinák beadása céljából. Fogyasztható vakcinák különösen vonzó megoldásnak számítanak az állategészségügyi ipar számára, mert ideálisan kombinálják az orvosság beadását kialakult etetési szokásokkal állatokban. Orális poliovakcina 19¹as évek óta tartó sikere ellenére nagyon kevés orális vakcina került kereskedelmi forgalomba, különösen olyan vakcinák, amelyekben életképes antigéneket alkalmaznak immunválasz stimulálására. Transzgenikus növények egy eszközt biztosítanak fogyasztható vakcinákban alkalmazható antigének gazdaságos gyártására. Az elsõ munka, amit ezen a területen közöltek, megtalálható az,64,184;,679,880 és,686,079 számú USA-beli szabadalmi leírásokban. Ilyen transzgenikus növények olyan eszközt biztosítanak, ami kombinálja állatok elfogadottan alkalmazott etetési gyakorlatát azokkal a kényelmi szempontokkal, amit antigén orális bevitele jelent nyálkahártyaszövetekhez, vakcináció céljából. Hogy egy fogyasztható vakcina sikeres legyen, az emésztõrendszer komplex környezetét kell navigálni. A nyálkahártyával társult limfoid szövet (MALT), ami gerincesek emésztõ¹, légzõ- és reprodukciós szervrendszereiben található, az egyik legkülönfélébb, de mégis univerzális immunrendszerek közé tartozik a természetben. Bármilyen, a béllel társult limfoid szöveten (GALT) keresztül az emésztõtraktusban immunválaszt stimulálni képes antigén összetett környezettel találkozik, ha bejut az emésztõtraktusba. A szájüregben és más emésztõszervekben tág tartományban változhat a ph, enzimek, detergensek és kommenzális (más szervezetekkel együttélõ) mikroorganizmusok, amelyek hozzájárulnak a táplálék emésztéséhez. Kommenzális mikroorganizmusok száma gyakran több, mint ahány sejtbõl maga az emésztõrendszer felépül [Savage, D., Mucosal Microbiota. Mucosal Immunity, szerk. P. Orga, J. Mestecky, M. Lamm, W. Strober, J. Biennenstock, J. McGhee, Academic Press Inc., 19. oldal (1999)]. Ennek ellenére ezek a kommenzális mikroorganizmusok hasznos funkciót látnak el, és egy állandó tolerancia állapotban vannak a GALT immunrendszere által. Az antigének kompetícióba lépnek a táplálék komponenseivel és más környezeti komponensekkel, amelyek az emésztõrendszerbe kerültek, és különbözõ emésztési állapotban vannak. Az immunrendszernek folyamatosan felügyelnie kell az emésztõ¹, valamint a légzõ- és a reproduktív traktust idegen antigénekre, a saját, beleértve a tápanyag antigénjeivel szemben, amelyek saját tulajdonságokkal rendelkeznek annyiban, hogy immunológiailag toleráltak. Végül, a nyálkával borított bélbolyhos és follikuláris epitélium veleszületett immunológiai gát állandó mozgásban van, 4 0 hogy elhelyezze a tápanyagkomponenseket, és szükséges kiválasztást biztosítson a mukozális felszínre. Az emésztõrendszer komplex környezete ellenére nagyon kis mennyiségû biológiailag aktív (bélben aktív) anyag képes immunválaszt indukálni. A nyálkahártyarendszer leghatásosabb stimulátorai közül kettõ, Escherichia coliból (E. coli) származó hõlabilis toxin, és Vibrio choleraból (V. cholera) származó kolera toxin (CT) már néhány mikrogramm mennyiségben szerológiai választ képes stimulálni, ha orálisan gyomorszondával (töméssel) adjuk be [Isaka, M. és munkatársai, Vaccine 16, (1998); Rappuoli, R. és munkatársai, Immunol. Today, (1999); és Isaka, M. és munkatársai, Vaccine 18, (00)]. Tehát a nyálkahártyafelszínen sikeresen át lehet hatolni, és kis mennyiségû biológiailag aktív fehérjével, például LT¹vel és CT¹vel. Azonban enteropátiás toxigén aktivitásuk miatt, LT és CT natív formáikban ajánlott orális adjuvánsként történõ, biztonságos alkalmazásra emberekben vagy állatokban. Mukozálisan aktív fehérjék, mint például CT és LT fontos jellegzetessége egy életképes antigénnel szemben, hogy CT és LT ligandumai egy gyomorban lévõ receptornak (GM1-gangliozidnak), ami lehetõvé teszi az említett toxinok bejutását kis koncentrációkban (behatolásra való képesség). Ez eltér egy életképes antigéntõl, amely képes behatolni és felhígul, és ki van téve a belek emésztõ környezetének. Általánosan elfogadott, hogy invazív antigént magas dózisokban (milligramm-mennyiségekben), több alkalommal kell beadni, hogy stimulálja az immunrendszert a bélnyálkahártya felszínén keresztül. Azonban valószínûleg magas antigéndózis és többszörös beadás szükséges az emésztõ környezetet telítéséhez. Mivel az antigén nagyobb része lebomlik vagy felszívódik, nagyon kis mennyiségû antigén szûrõdik át és stimulál kívánt immunválaszt. Mivel LT és CT annyira patogén, hogy lényegi biokémiai és genetikai kutatás tárgya volt, hogy patogén tulajdonságaikat csökkentsék vagy megszüntessék úgy, hogy közben megmaradjon adjuváns aktivitásuk. LT és CT analóg tercier fehérjestruktúrával rendelkezik annyiban, hogy mindkettõ egy oligomer B alegységbõl (LT¹B és CT¹A, sorrendben), amely G1 jelû gangliozidreceptorokra specifikus, és egyetlen A alegységbõl (LT¹A és CT¹A, sorrendben) áll, amelynek ADP-riboziltranszferáz-aktivitása van. LT¹vel kapcsolatos kutatásokban számos analógot állítottak elõ, amelyeket immunogén és adjuváns tulajdonságaikra teszteltek emlõsszervezetekben. Az LT¹toxin számos analógját elõállították az A alegységben végrehajtott aminosavszubsztitúciókkal és ¹deléciókkal, az enteropátiás aktivitás gyengítése céljából, anélkül, hogy a toxin adjuváns tulajdonságai csökkentek volna [Ghiara és munkatársai, Infect. Immun. 6, (1997)]. Azonban kevés információ van ilyen toxinok madarakban történõ alkalmazásáról, akár adjuvánsként, akár immunogénként. Hoshi és munkatársai [Vaccine 13, 24 2 (199)], valamint Meinersmann és munkatársai [Avian 2

3 4 0 Dis. 37, (1993)] leírták, hogy CT orális beadása madárfajokba növelte szisztémás és mukozális humorális válaszok mértékét orálisan beadott tetanusztoxoid vagy inaktivált fertõzõ burzális betegség vírusával szemben. Takeda és munkatársai [Vet. Microbiol. 0, 17 (1996)] kimutatták, hogy CT¹B intranazális és szubkután beadása képes volt Newcastle-betegség vírusa ellen humorális választ fokozni. Vervelde és munkatársai [Vet. Immunol. Immunopath. 62, (1998)] is leírták, hogy CT intraintesztinális, sebészi úton történõ alkalmazása csirkékben növelte az Eimeria-antigén intraintesztinális, sebészi úton történõ bevitelével szemben kialakult, humorális válasz mértékét. Tehát azt a következtetést vonhatjuk le, hogy CT fejtett ki adjuváns hatásokat madarakban orális beadás esetén, bár ha CT¹t sebészi úton juttattak a belekbe, kimutatták kötõdését az intesztinális epitéliumhoz. Emlõsszervezetben vizsgált, LT és CT adjuváns hatásaira vonatkozó, nagy mennyiségû irodalom alapján elõre látható volt, hogy hasonló hatásokat tapasztalhatunk madarakban is. Egészen váratlanul felismertük, hogy brojlercsirkék mutattak hasmenéses tüneteket és más enteropátiás hatásokat, miközben immunológiai választ adtak orálisan beadott, natív LT¹ és CT¹toxinra, amit különbözõ formátumokban állítottak elõ a tisztított toxintól a növény által in situ termelt toxinig. Enteropatogén, hõlabilis toxint expresszáló E. colit még írtak le baromfira, sem LT alkalmazását mukozális immunogénként vagy adjuvánsként. Baromfit fiatal korban lehet immunizálni, részben a B¹sejtek differenciálására szolgáló szerv mûködése következtében (Fabricius tömlõ, bursa Fabricii), amely kikelés elõtt aktív [Dibner, J. J. és munkatársai, Applied Poultry Research 7, (1998)]. Egynapos korukban immunizált madarak belében így kevés a táplálék, mikroorganizmusok és emésztõenzimek mennyisége, ami kompetícióba léphetne életképes antigénnel vagy lebonthatná azt. A leírásban közölt vizsgálatokban bemutatjuk, hogy natív LT és LT¹B szerológiai válaszokat indukál, amit szérum-igg-ben akár már 21 nappal lehet detektálni a toxin beoltása után, ami történhet intranazálisan (IN), szubkután, in ovo vagy orálisan. Hasonló módon, LT¹B és legyengített LT¹A-analóg natív szekvenciáit expresszáló, NT 1 jelû transzgenikus dohánysejtek szerológiai válaszokat indukálnak orálisan és IN¹módon beadva egyaránt, a toxin vagy a növényi anyag okozta bármilyen mellékhatás nélkül. Továbbá váratlanul azt találtuk, hogy orálisan vagy szubkután beadott, natív LT patogén brojlercsirkékre, ha nagyobb dózisokban adjuk be annál, mint ami más közleményekben leírtak szerint egerekben letális és emberekben enteropatogén. A találmány szerinti megoldás röviden összefoglalva egy készítmény, amely adjuváns hatást kifejteni képes mennyiségû fehérjét tartalmaz az alábbiak által alkotott csoportból kiválasztva: E. coliból származó hõlabilis toxin (LT) és E. coliból származó hõlabilis toxinanalógok (LT-analógok), adjuvánsként történõ alkalmazásra, brojlercsirkék vakcinációja esetén. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások brojlercsirkék vakcinációjára, amelyben brojlercsirkéknek beadunk az igényelt készítmények bármelyikébõl adjuváns hatást kifejteni képes mennyiséget, különösen úgy, hogy az ilyen készítmények transzgenikus növényekben lettek elõállítva és/vagy transzgenikus növényi anyagot feldolgozott vagy feldolgozatlan formában adunk be. 1. ábra. NT 1-sejtek transzformálására alkalmazott pslt7 térképe. A T¹DNS bal és jobb határa határozza meg a DNS¹t, amit növényi sejtekbe szándékozunk bevinni, és alábbi transzkripciós kazettákat szegélyez: LT¹A-R72, amelyben a transzkripciót duplán fokozott ( enhanced ) CaMV S-promoter vezérli, és burgonyából származó pin2 3 ¹végi régiója terminálja; LT¹B, amelyben a transzkripciót duplán fokozott ( enhanced ) CaMV S-promoter vezérli, és szójababból származó vspn 3 ¹végi régiója terminálja; és npt2 kanamicinrezisztens növények szelektálására. Azt is megjegyezzük, hogy NT 1-sejtek transzformálására alkalmazott, a példákban leírt pslt1, pslt2 és pslt minden vonatkozásában azonos pslt7-tel, kivéve az LT¹A¹t kódoló régiót. A pslt2-vektor a K63 LT¹Amutánst kódolja, a pslt-vektor a G192 LT¹A-mutánst kódolja, és a pslt7-vektor az R72 LT¹A-mutánst kódolja [Rappuoli és munkatársai, Immunol. Today, (1999)]. A pslt1-vektor a teljes mértékben natív LT¹t kódolja, ami biológiailag ekvivalens az E. coliból származó LT¹vel. Egy immunogén olyan önálló anyag, amely humorális és/vagy celluláris immunválaszt képes kiváltani egészséges állatokban, ezáltal az állat védett lesz az immunogén jövõbeli támadása ellen. Immunogének tipikusan patogének, például vírusok, baktériumok és gombák, amelyek bizonyos alakban patogéneknek tekinthetõk. Immunogének lehetnek patogének antigenikus részletei, például sejtfalkomponensei, vírusok burokfehérjéi és szekretált fehérjék, például toxinok és enzimek, csak hogy néhányat említsünk. Immunogének lehetnek rekombináns sejtek is, például növényi sejtek és ilyen sejtek extraktumai, amelyeket úgy terveztek, hogy immunoprotektív antigéneket expresszáljanak és mutassanak be. A vakcináció és vakcinálás kifejezéseket a leírással összefüggésben úgy definiáljuk, mint egy eszközt patogénnel szembeni védettség biztosítására úgy, hogy egy gazdaszervezetet beoltunk egy patogén ágenst, vagy virulens formáját vagy részét tartalmazó immunogén készítménnyel, hogy ezzel a gazdaszervezet immunrendszerét stimuláljuk, és megelõzzük vagy legyengítsük a gazdaszervezet bekövetkezõ reakcióit, amit a patogén ágens késõbbi jelenléte esetén ad. A beadás vagy bead kifejezéseket a leírásban úgy definiáljuk, mint egy anyag bevitelét egy állat testébe, és történhet orális, nazális, okuláris, rektális, in ovo és parenterális (intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután) úton. A találmány szerinti megoldással összhangban lévõ, elõnyösebb beadási mód orális és/vagy nazális beadás, mindkettõvel elérhetõ a bélnyálkahártya, és in ovo. Az orális beadás a legelõnyösebb. 3

4 4 0 Hatásos és immunológiailag védettséget biztosító mennyiséget a leírásban egy anyag olyan mennyiségeként vagy tömegeként definiálunk, amely elõidézi a kívánt eredményt egy betegség fertõzésével szemben. Hatásos mennyiségek szakember számára nyilvánvalóak a leírásban közölt adatok és információk alapján. A találmány szerinti megoldás céljaira egy adjuváns olyan anyag, amely érvényre juttat, növel vagy fokoz egy immunogénre vagy antigénre adott immunválaszt. Adjuvánsok tipikusan humorális és celluláris immunválaszt egyaránt képesek fokozni, de ha bármelyik válasz fokozódik a másik nélkül, akkor ez is adjuvánst határoz meg. Továbbá, adjuvánsok és alkalmazásaik jól ismertek az immunológusok számára, és tipikusan arra alkalmazzák ezeket, hogy immunválaszt fokozzanak, ha az immunogén dózisa korlátozott, vagy ha az immunogénnek gyenge immunogén tulajdonságai vannak, vagy a beadás módja szuboptimális. Az adjuváns hatást kifejteni képes mennyiség kifejezésen a leírásban egy adjuváns olyan mennyiségét értjük, amely képes immunválaszt fokozni egy adott immunogén vagy antigén ellen. A tömeg, ami ekvivalens egy adjuváns hatást kifejteni képes mennyiséggel, változhat, és sokféle faktortól függ, például, de ezekre korlátozva, az immunogén tulajdonságaitól, a beadott immunogén mennyiségétõl, a gazdaszervezetfajtól, a beadás módjától, és az immunogén beadására szolgáló technológiai elõírástól. Az adjuváns hatást kifejteni képes mennyiséget rutinkísérletekkel könnyen meg lehet határozni, adott konkrét körülményeket feltételezve. Ez szakember köteles tudásának körébe tartozik, és tipikusan rutin dózis-válasz meghatározásokat foglal magában, amelyben a beadott immunogén és adjuváns mennyiségét változtatják. A válaszokat az immunogén ellen képzõdött szérumban lévõ ellenanyagtiterek mérésével mérik, enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárások, radioaktív immonológiai vizsgálati eljárások, hemagglutinációs vizsgálati eljárások és hasonlók alkalmazásával. LT esetén tekintélyes mennyiségû vizsgálatot végeztek emlõsszervezetekben, amelyek szerint testtömegkilogrammonként szubmikrogrammok csak erõs immunválaszt, ha patológiás elváltozásokat is kiváltanak. A legmeglepõbb, hogy ezt brojlercsirkék esetén mutatták ki, mert orálisan beadott natív LT mg/kg¹ig váltott ki semmilyen patológiás tünetet, míg lényegi immunválaszt idézett elõ magas IgG-titerek formájában. Ez ellentétben van azokkal a vizsgálatokkal, amelyekben kimutatták, hogy sebészileg beültetett CT és antigén immunválaszt váltott ki patológiás elváltozások nélkül [Vervelde és munkatársai, mint fent (1998)], miközben CT¹B immunválaszt váltott ki, de patológiás elváltozások nélkül [Takeda és munkatársai, mint fent (1996)]. E. coliból származó hõlabilis toxint (LT) jól jellemezték röntgenkrisztallográfiával, és multimer fehérjébõl áll. A holotoxin dalton molekulatömegû A alegységet (LT¹A) tartalmaz, ami LT¹A1¹re és LT¹A2¹re hasítanak proteázok a vékonybélben. A holotoxin öt, egyenként 11 0 dalton molekulatömegû B alegységet is tartalmaz, amelyek kovalensen kapcsolódnak egy nagyon stabil, fánkszerû pentamer struktúrában. Bármilyen forrásból származó natív LT elõnyös a találmány szerinti megoldásban. E. coliból származó labilis toxinanalógokat (LT-analógokat) úgy definiáljuk, mint bármilyen natív LT¹t, amelyben egy vagy több aminosav szubsztituálva van, és leírták az irodalomban. Számos jól ismert LT¹analóg olyan, amelyekben az alfa-alegységben, a 63, 72. és 192. helyzetben természetes körülmények között található aminosavak szubsztituálva vannak lizinre, argininre és glicinre, sorrendben (K63, R72 és G192) [Rappuoli és munkatársai, Immunol. Today, (1999)]. Biológiailag aktív LT és LT¹analógok GM1- gangliozidhoz képesek kötõdni ELISA-formában, és toxikusak Y1 jelû adrenalis (mellékvese¹) sejtekre in vitro sejttoxicitási tesztekben. A madarak sokféle betegségre érzékenyek, amelyekre a találmány szerinti megoldás védõ hatású vakcinációt biztosít. Az alábbi listában sok gazdaságilag jelentõs madárbetegség közül felsorolunk néhányat, amelyeket okozó ágensek bemutatnak olyan immunogéneket, amelyek kompatibilisek a találmány szerinti megoldással. Ez a lista semmiképpen sem egy kimerítõ lista azokról a madárbetegségekrõl, amelyekre a találmány szerinti megoldás alkalmazható. Newcastlebetegség, madárinfluenza, fertõzõ burzális betegség, coccidiosis, nekrotikus enteritisz, légzsákgyulladás, cellulitisz, csirkeanémia, gége¹, orr- és légcsõgyulladás (laryngorhinotracheitis), fertõzõ bronchitis és Marek-féle betegség. Immunogének elõnyös csoportja, amelyek védelmet biztosítanak madárbetegségek ellen, és a találmány szerinti megoldás ezekre alkalmazható, Newcastle-betegség vírusának antigéndeterminánsai, Newcastle-betegség vírusából származó hemagglutininneuraminidáz fehérje, madárinfluenza vírusának antigéndeterminánsai, madárinfluenza vírusából származó hemagglutinin fehérje. Szakember számos módszert ismer viszonylag tiszta polipeptid- és fehérjemennyiségek, például LT¹A, LT¹B és LT¹analógok elõállítására. A gyakorlatban évtizedek óta alkalmaznak bakteriális és élesztõrendszereket rekombináns polipeptidek és fehérjék elõállítására. A közelmúltban olyan transzgenikus fehérjetermelõ rendszereket fejlesztettek ki, amelyekben a termelés rovarból, gerinces szervezetbõl, emlõsszervezetbõl vagy növénybõl származó sejtekre épül. Egy adjuváns, például LT elõállítása, és adott esetben egy kiválasztott immunogénnel való együtt-expresszálás egy transzgenikus növényben különösen illik a találmány szerinti megoldáshoz, mert a transzgenikus növényi anyagot közvetlenül fel lehet dolgozni, és vakcinaként madaraknak lehet adni vagy intranazálisan be lehet adni. Transzgenikus növényt a leírásban úgy definiáljuk, mint egy olyan növényi sejttenyészetet, növényi sejtvonalat, növényt, vagy transzformált növényi sejtbõl, szövetbõl vagy protoplasztból származó utódot, ahol a transzformált növény genomja exogén, idegen DNS¹t tartalmaz, amit laboratóriumi technikákkal vit- 4

5 tek be, és eredetileg nincs jelen ugyanehhez a törzshöz tartozó, natív, transzgenikus növényben. A transzgenikus növény és transzformált növény kifejezéseket a szakirodalomban néha szinonim kifejezésként használják egy olyan növény meghatározására, amit tranziensen transzformáltak heterológ DNS-sel olyan virális vektorrendszeren keresztül, amely idéz elõ integrált transzgenikus eseményeket. Ez a technológia szakember számára jól ismert, az,846,79 számú és,00,3 számú USAbeli szabadalmi leírásokból. A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésében elõnyösen alkalmazható növénycsoportok lehetnek növényi sejttenyészetek, burgonya, paradicsom, alfalfa és békalencse (Lemnaceae család). Elõnyösebb növénycsoport lehet növényi sejttenyészetek és paradicsom, a legelõnyösebben növényi sejttenyészetek. Elõnyösen alkalmazható növényi sejttenyészetek közé egyszikû és kétszikû növénybõl származó tenyészetek tartoznak. Különösen elõnyös növényi sejttenyészetek az NT 1 és BY 2 jelû dohánysejttenyészetek, melyeket Toshiyuki és munkatársai írtak le [Int 1 Rev. of Cytology 132, 1 (1992)]. Sok módszer jól ismert szakember számára transzformáló DNS-szegmensek sejtekbe történõ bevitelére, de mindegyik alkalmas DNS bevitelére növényi sejtekbe. Alkalmas módszerek közé tartozhat tulajdonképpen bármilyen módszer, amellyel DNS¹t lehet egy sejtbe bejuttatni, például Agrobacterium-fertõzéssel, DNS közvetlen bejuttatásával, például protoplasztok PEG-közvetített transzformációjával [Omirulleh és munkatársai, Plant Molecular Biology 21, (1993)], kiszárításos inhibícióval közvetített DNS-felvétellel, elektroporációval, szilikon-karbin-rostokkal történõ kevertetéssel, DNS-sel burkolt részecskék felgyorsításával stb. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint, a felgyorsítást alkalmazó módszert részesítjük elõnyben, és idetartozik például a mikrorészecske-bombázás és hasonlók. DNS sejtekbe történõ bevitelére szolgáló technológia szakember számára jól ismert. Négy alapvetõ módszert írtak le idegen DNS bevitelére növényi sejtekbe. Kémiai módszereket [Graham and van der Eb, Virology 4, (1973); Zatloukal, Wagner, Cotten, Philips, Plank, Steinlein, Curiel, Birnstiel, Ann. N. Y. Acad. Sci. 6, (1992)]; fizikai módszereket, idetartozik a mikroinjektálás [Capecchi, Cell 22, (1980)], elektroporáció [Wong és Neumann, Biochim. Biophys. Res. Commun. 7, (1982); Fromm, Taylor, Walbot, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, (198);,384,3 számú USA-beli szabadalmi leírás] és a génágyú [Johnston és Tang, Methods Cell. Biol. 43, 3 36 (1994); Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, (1993)]; virális módszereket [Clapp, Clin. Perinatal., 168 (1993); Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer, J. Exp. Med. 178, (1993); Eglitis és Anderson, Biotechniques 6, (1988)]; és receptorközvetített módszereket [Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, Proc. Natl. Acad. 4 0 Sci. USA 88, (1991); Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, Hu, Hum. Gen. Ther. 3, (1992); Wagner és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, (1992)]. DNS növényi sejtekbe történõ bevitele elektroporáció alkalmazásával szakember számára jól ismert. Növényi sejtfalbontó enzimeket, például pektint lebontó enzimeket alkalmaznak, hogy a fogadó sejtek érzékenyebbek legyenek az elektroporációval végzett transzformációra, mint a kezeletlen sejtek. A transzformáció elektroporációval történõ elvégzéséhez alkalmazhatunk fagyasztható szöveteket, például sejtek szuszpenziós tenyészetét, vagy embriogén kalluszt, vagy éretlen embriókat vagy közvetlenül más szervezett szövetet. Általában szükség van a növényi célanyag sejtfalainak részleges lebontására pektinlebontó enzimekkel vagy mechanikai feltárással, szabályozott módon. Ilyen kezelt növényi anyag kész idegen DNS befogadására elektroporációval. Idegen transzformáló DNS növényi sejtekbe való bevitelére szolgáló másik módszer a mikrorészecskebombázás. Ebben a módszerben idegen DNS-sel burkolnak mikrorészecskéket, és mozgató erõvel viszik be sejtekbe. Ilyen mikrorészecskék tipikusan volfrámból, aranyból, platinából és hasonló fémekbõl készülnek. A mikrorészecskebombázás elõnye, hogy nincs szükség sem protoplasztok izolálására [Cristou és munkatársai, Plant Physiol. 87, (1988)], sem Agrobacterium-fertõzésre való érzékenységre. A módszer szemléltetés célját szolgáló megvalósítási módja szerint, DNS¹t visznek be kukoricasejtekbe Biolistics Particle Delivery System gyorsítással, amelyet DNS-sel burkolt részecskék vagy sejtek mozgatására lehet alkalmazni egy ernyõn keresztül, amelyen egy szûrõ felszíne szuszpenzióban tenyésztett kukoricasejtekkel van burkolva. A szûrõ úgy szórja a sejteket, hogy azok nagy aggregátumok formájában jutnak a fogadósejtekhez. A bombázáshoz a szuszpenzióban lévõ sejtek elõnyösen szûrõkön vagy szilárd tenyésztési tápközegen vannak koncentrálva. Alternatív módszer szerint, éretlen embriókat vagy más célsejteket lehet elrendezni szilárd tenyésztési tápközegen. A bombázandó sejteket alkalmas távolságra helyezik el a makrorészecskefékezõ lemez alatt. A bombázásos transzformációban optimalizálni lehet a bombázás elõtti tenyésztési körülményeket és a bombázási paramétereket, hogy maximális számú, stabil transzformánst kapjunk. A bombázáshoz szükséges fizikai és biológiai paraméterek fontosak ebben a technológiában. Fizikai faktorokon olyanokat értünk, amelyek a DNS/mikrorészecske-kicsapási tevékenységben játszanak szerepet, vagy olyanokat, amelyek bármelyik mikrorészecske repülését és sebességét befolyásolják. Biológiai faktorok közé tartozik minden lépés, ami a sejtek bombázás elõtti és közvetlenül bombázás utáni kezelésében szerepet játszik, célsejtek ozmotikus beállítása a bombázással társult trauma mértékének csökkentése céljából; és a transzformáló DNS természete is, például linearizált DNS¹e vagy intakt cirkuláris ( supercoiled ) plazmidok¹e.

6 Az Agrobacterium-közvetített transzfer széles körben alkalmazott módszer idegen DNS bevitelére növényi sejtekbe, mert a DNS¹t egész növényi szövetekbe lehet bevinni, ami szükségtelenné teszi intakt növény regenerálását egy protoplasztból. Agrobacterium-közvetített növényi integrálóvektorok alkalmazása DNS bevitelére növényi sejtekbe szakember számára jól ismert. Lásd például Fraley és munkatársai [Biotechnology 3, 629 (198)]; Rogers és munkatársai [Meth. in Enzymol. 3, (1987)] által leírtak módszereket. Továbbá a Ti¹DNS integrálása egy viszonylag precíz folyamat, ami néhány újraátrendezõdést eredményez. A transzferálandó DNS-régiót a határolószekvenciák határozzák meg, és a közbeékelõdõ DNS rendszerint a növényi genomba integrálódik, Spielmann és munkatársai [Mol. Gen. Genet., 34 (1986)]; Jorgensen és munkatársai [Mol. Gen Genet. 7, 471 (1987)] által leírtak szerint. Modern Agrobacterium transzformációs vektorok E. coliban, valamint Agrobacteriumban képesek replikációra, ami kényelmes manipulációkat tesz lehetõvé, az irodalomban leírtak szerint [Klee és munkatársai (198)]. Továbbá Agrobacterium-közvetített géntranszferre alkalmazott vektorok területén a közelmúltban bekövetkezett technológiai elõrehaladás javította gének és restrikciós hasítóhelyek átrendezését a vektorokban, olyan vektorok elõállítása céljából, amelyek képesek különbözõ fehérjék vagy polipeptidek expresszálására. A leírt vektorok [Rogers és munkatársai, (1987)] a célnak megfelelõ multilinkerrégiókkal rendelkeznek, amelyeket egy promoter és egy poliadenilálási hely szegélyez az inszertált, polipeptidet kódoló gének expresszálására, és alkalmasak a találmány céljaira. Továbbá, karral rendelkezõ ( armed ) és kar nélküli ( disarmed ) Ti¹géneket egyaránt tartalmazó Agrobacterium alkalmazható a transzformációkra. Növényi protoplasztok transzformációját olyan eljárások alkalmazásával lehet elérni, amelyek kalciumfoszfátos kicsapásra, polietilénglikolos kezelésre, elektroporációra és ilyen kezelések kombinációira alapulnak [lásd például Potrykus és munkatársai, Mol. Gen. Genet. 199, 183 (198); és Marotte és munkatársai, Nature és munkatársai, 3, 44 (1988)]. Az ilyen rendszerek alkalmazása különbözõ növényi fajokban függ az adott faj protoplasztokból való regenerálódási képességétõl példa Anyagok E. coli H7-törzsbõl származó LT¹B¹t kódoló gén növényoptimalizált szekvenciája a szakirodalomból ismert [Mason és munkatársai, Vaccine 16, (1998)]. E. coli H7-törzsbõl származó LT¹A¹t kódoló gén növényoptimalizált szekvenciáját leírták a WO/03/379 számú zetközi közzétételi iratban, amit eredetileg a /113,07 ideiglenes bejelentési számon nyújtottak be. A WO/03/379 számú zetközi közzétételi iratban leírnak három bináris T¹DNS-vektor (pslt2, pslt, pslt7) elõállítását, amit Agrobacterium tumefaciens közvetített módon, Nicotiana tabacum NT 1 növényi sejtek transzformációjára alkalmaztunk a 2. példában leírtak szerint. Az eredményül kapott, transzformált NT 1-sejtvonalak (SLT2, SLT és SLT7) teljesen szervezõdött LT¹t és LT¹analógokat expresszáltak és halmoztak fel, amelyek LT¹B¹t és az LT¹A-alegység módosított formáit tartalmazták. Az 1. ábrán bemutatjuk a pslt7¹et, amely olyan módosított LT¹A-gént tartalmaz, amelyben Ala72 helyettesítve van Arg72-vel. Az SLT2 és SLT expressziós termékek azonosak, kivéve azt, hogy különbözõ változtatásokat tartalmaznak az LT¹A-génben (Ser63-ról Lys63¹ra pslt2- ben; Arg192-rõl Gly192¹re pslt-ben). Ezek a vonalak meghatározott kópiaszámú T¹DNS-régiót tartalmaznak a plazmidokban, stabilan integrálva a nukleáris kromoszomális DNS¹be. A transzgenikus NT1-sejtek LT¹B-alegységeket halmoznak fel, amelyek gangliozidkötõ pentamerekbe szervezõdnek, az összes oldható fehérje 0,4%¹os mennyiségéig, gangliozidfüggõ ELISA-val meghatározva. A transzgenikus NT1-sejtek szintén módosított LT¹A-alegységeket halmoznak fel, amelyek közül néhány LT¹B-pentamerekkel szervezõdik, gangliozidfüggõ ELISA-val, LT¹A-specifikus ellenanyagokkal meghatározva. Elõállítottuk a pqethk¹, pjc217- és pcs96-plazmidokat is. A pqethk egy növényoptimalizált, LTB¹t kódoló szekvencia, Quiagens pqe -vektorba klónozva; pjc217 [Cardenas és munkatársai, Inf. and Immun. 61, (1993)] E. coliból származó LTB-szekvenciát és LTA kódoló régióját tartalmazza puc8¹ba klónozva. A pcs96 E. coliból származó LTB- és LTA-alegységet kódoló géneket egyaránt expresszál. Az egyes plazmidokat E. coli DH vagy JM83 gazdatörzsben növesztettük LB¹tápközegben (Gibco/BRL), 00 g/ml ampicillint alkalmaztunk szelekcióra. Natív LT¹t izoláltunk úgy, hogy 1¹2 liter, pcs96¹ot tartalmazó DH ¹t növesztettünk egy éjszakán át 0 g/ml ampicillint tartalmazó LB¹tápközegben. A sejteket lecentrifugáltuk Meraeus Megafuge ( percig, 00 rpm¹en) alkalmazásával, felszuszpendáltuk 0 ml TE¹pufferben (0 mm Tris, ph=7,2, 1 mm EDTA), percig centrifugáltuk 00 rpm¹en, és felszuszpendáltuk 0 ml TE¹pufferben, és 80 C¹on tároltuk. A felszuszpendált csapadékot Branson 40 ultrahangos feltáróban roncsoltuk szét, lapos cserélhetõ fej alkalmazásával, 8. kimeneti fokozaton, ciklusban, percig jégben. A preparátumokat azután 000 rpm¹en centrifugáltuk percig, 2 7 C¹on, J2 21 Beckman centrifugában, és JA¹ Beckman-rotorban. A felülúszót átvittük új centrifugacsövekbe, és 000 RPM¹en centrifugáltuk 1 óra hosszáig. A 000 RPM¹es centrifugálás után átvittük dialízistasakba ( MWCO), és 2 liter TEN-ben dializáltuk 4 napig (TEN¹t naponta cseréltük). Dialízis után a mintát felvittük TEN-nel ekvilibrált, immobilizált galaktózt tartalmazó affinitásoszlopra körülbelül ml/óra áramlási sebességgel. Az oszlopot néhány oszloptérfogat TEN-pufferrel mostuk, és a kötõdött LT¹t 1 M D(+)- galaktózzal eluáltuk. Az LT¹t tartalmazó frakciókat poli- 6

7 akrilamid-gélelektroforézissel igazoltuk, egyesítettük és 80 C¹on tároltuk. 2. példa LT¹t expresszáló, transzgenikus Nicotiana tabacum elõállítása Három-négy nappal a transzformáció elõtt, 1 hetes NT 1-tenyészetet szubkultúrába vittünk friss tápközegben úgy, hogy ml NT 1-tápközeghez 2 ml NT 1-tenyészetet adtunk. A szubkultúrát sötétben tartottuk ±1 C¹on, rázógépen, 0 rpm¹en. Reagens NT 1 tápközeg Per liter MS-sók 4,3 g MES-törzsoldat ( X) 0,ml B1 inozitol törzsoldat (0 X),ml Miller-féle I törzsoldat 3,ml 2,4¹D (1 mg/ml) 2,21 ml Szacharóz,g ph=,7±0,03 B1 inozitol törzsoldat (0 ) (1 liter) Tiamin-HCl (B1-vitamin) 0,1 g MES ( ) (1 liter) MES (2¹N-morfolino-etánszulfonsav) g Mioinozitol g Miller-féle I (1 liter) KH 2 PO 4 g A kérdéses expressziós vektort tartalmazó Agrobacterium tumefacienst glicerin-törzsoldatból 0 mg/l spektinomicint tartalmazó LB¹táptalajt tartalmazó tálcákra szélesztettük. A bakteriális tenyészetet sötétben inkubáltuk C¹on, óra hosszáig. Kiválasztottunk egy jól kialakult kolóniát, és átvittük 3 ml, 0 mg/l spektinomicint tartalmazó YM¹tápközegbe. A folyékony tenyészetet sötétben inkubáltuk C¹on, inkubátorrázógépen, 0 rpm¹en, amíg az OD 0 0, 0,6 lett. Ez körülbelül 24 órát vett igénybe. Reagens Bactotyptone Élesztõkivonat NaCl Difco Bacto Agar Élesztõkivonat Mannit Reagens LB-tápközeg YM-tápközeg Per liter g g g g Per liter 0 mg g 4 0 NaCl MgSO 4 7 H 2 O KH 2 PO 4 Reagens Per liter 0 mg 0 mg 00 mg (Alternatív módon, YM¹et por formájában lehet beszerezni a Gibco BRL cégtõl; katalógusszáma # Folyékony tenyésztési tápközeg elõállítása céljából 11,1 g¹ot adagolunk 1 liter vízhez.) A transzformáció napján ml¹enként 1 l, mm acetosziringont adtunk az NT 1-tenyészethez. Az acetosziringon-törzsoldatot etanolban készítettük el a transzformáció napján. Az NT 1-sejteket kismértékben roncsoltuk a transzformációs hatékonyság fokozása céljából. A roncsoláshoz a szuszpenziós tenyészetet többször (-szor) fel¹le vettük egy ml¹es, széles nyílású, steril pipettán keresztül. Egyenként négy milliliter szuszpenziót vittünk át, mm¹es Petri-csészékbe. Egy tálcát félretettünk, amit transzformált kontrollként alkalmaztunk. Körülbelül 0 0 l Agrobacterium-szuszpenziót adagoltunk a maradék 9 csészéhez. A csészéket parafilmmel fedtük, azután sötétben inkubáltuk rázógépen, 0 rpm¹en, 1 C¹on, 3 napig. A sejteket átvittük egy steril, 0 ml¹es, kúpos centrifugacsõbe, és feltöltöttük 4 ml végtérfogatra NTC-tápközeggel (autoklávozás után hozzáadott, 00 mg/l karbenicillint tartalmazó NT 1-tápközeg). Összekevertük azokat, majd 00 rpm¹en, percig centrifugáltuk lengõfejes rotorral felszerelt centrifugában. A felülúszót eltávolítottuk, és a maradék üledéket felszuszpendáltuk 4 ml NTC-ben. A mosást megismételtük. A szuszpenziót lecentrifugáltuk, és a felülúszót kidobtuk, és az üledéket újra felszuszpendáltuk ml NTC-ben. ml¹es aliquotokat szélesztettünk az egyes Petri-csészékre (0 mm), amelyek NTCB-táptalajt (NTC-tápközeg 8 g/l agar-agarral szilárdítva; mg/l bialaphossal kiegészítve, amit autoklávozás után adtunk hozzá) tartalmaztak. A tálcákat parafilmmel fedtük, és sötétben, ±1 C¹on tartottuk. A tenyésztõhelyiségbe való átvitel elõtt a tálcákat nyitva hagytuk lamináris áramlást biztosító fülke alatt, hogy a feleslegben maradt folyadék elpárologjon. 6 8 hét múlva feltételezett transzformánsok jelentek meg. Ezeket kiválogattuk, és átvittük friss NTCB¹be (NTC-tápközeg 8 g/l agar-agarral szilárdítva; mg/l bialaphossal kiegészítve, amit autoklávozás után adtunk hozzá). A tálcákat parafilmmel fedtük, és sötétben, 1 C¹on tartottuk. Feltételezett transzformánsok kis kalluszklaszterek formájában jelentek meg az elpusztult, transzformálódott sejtek hátterében. Ezeket a kalluszokat átvittük NTCB-táptalajra, és hagytuk néhány növekedni. Az egyes feltételezett transzformánsok egy részletét kivettük ELISA-analízishez. Legalább két futtatás ELISA után kiválasztottuk a legtöbb antigént tartalmazó vonalakat. A legjobb vonalakra kapott kalluszanyag mennyiségét azután felszaporítottuk tálcás tenyészetekben, és adott esetben folyékony tenyészetekben. 7

8 Az eredményül kapott, SLT2, SLT és SLT7 jelû, transzformált NT 1-sejtvonalak E. coli eredetû, hõlabilis enterotoxin B¹alegységét (LT¹B) és az LT¹A-alegység módosított formáját expresszálták és akkumulálták. Az SLT2¹, SLT- és SLT7-bõl származó expressziós termékeket azonosítottuk, kivéve, ha az LT¹A-gén különbözõ változatait tartalmazták. Egy másik NT 1-vonal, SLT1 a natív LT¹A- és LT¹Bgéneket expresszálta, és minden vonatkozásában ekvivalens volt az E. coliból származó LT¹vel. Ezek a vonalak meghatározott kópiaszámú T¹DNS-plazmidrégiót tartalmaztak stabilan integrálva a sejtmagban lévõ (nukleáris) kromoszomális DNS¹be. Valamennyi transzgenikus NT 1-sejt LT¹B-alegységet akkumulált, ami gangliozidkötõ pentamerekké szervezõdött, az oldható összfehérje akár 0,4%-áig is, gangliozid- ELISAval meghatározva. Valamennyi transzgenikus NT 1- sejt natív (SLT1) vagy módosított LT¹A (SLT2, SLT és SLT7) alegységeket is expresszált, amik LT¹B-pentamerekkel szervezõdtek, gangliozidfüggõ ELISA-val, LT¹A-specifikus ellenanyagokkal meghatározva példa Oltóanyag elõállítása Pufferek és reagensek: ampicillint a Sigma cégtõl szereztük be (Lot No. 14H0041), és 0 mg/ml¹es törzsoldatot készítettünk steril vízben. Tryptont a Fisher Biotech cégtõl szereztünk be (Lot No. 976JE). Élesztõkivonatot a Difco cégtõl szereztünk be (Lot No JD). Nátrium-kloridot (Lot NO. 49H026), D(+)- galaktózt (Lot No. 46HO61), MES (2¹[morfolino]- etánszulfonsav) (Lot No. 29H4281) és nátrium-hidroxid (Lot No. K0229) a Sigma cégtõl szereztünk be. Coomassie Brillant Blue G 0¹et a Bio-Rad cégtõl szereztük be. Metanolt a VWR-tõl (Lot No ) jégecetet az EM Sciences cégtõl (Lot No. K272700) és etil-alkoholt (Lot No. DUO9723BU) az Aldrich Chemical cégtõl szereztünk be. Foszfátpufferelt nátriumklorid-oldatot az alábbiak szerint állítottunk elõ: 0,14 M nátrium-klorid, 1, mm kálium-dihidrogén-foszfát, 2, ml kálium-klorid és 6 mm dinátrium-hidrogén-klorid, ph=7,2 (BRL/Gibco). Transzformált NT 1-sejteket kalluszként állítottuk elõ agartálcákon, melyet 0,8% agart tartalmazó NT 1- táptalajból preparáltunk. A táptalaj összetétele az alábbi volt: 2, mm MES, 1,2 mm dikálium-hidrogén-foszfát (Lot No. 47HO811), 0,1 vegyes% mioinozitol (Lot No. 49H0390), 0,001 vegyes% tiamin-hcl (Lot No. 7H0278), 0,4 vegyes% MS¹sók (Lot No ), 3 vegyes% szacharóz (Lot No. 476H0803) és 0,8 vegyes% agar-agar (L#390906), valamennyit a Sigma cégtõl szereztük be, és 0,22 térfogat% 2,4¹D (Lot No. 7091) a Gibco cégtõl. A szuszpenziós sejtek, valamint az agartálcák is 0 g/ml kanamicint tartalmaztak (L#129H08941, Sigma), ami szükséges a rekombináns DNS-sel transzformált NT 1 szelekciójának értékeléséhez. A kalluszt átvittük úgy, hogy egy steril pipettával szétroncsoltuk a kalluszt, és kis mennyiségû kalluszt (0, cm 3 ) átvittünk friss tálcára. NT 1-sejtek szuszpenziós tenyészetének elõállítása céljából a kalluszt egy pipettával szétroncsoltuk, és néhány darab kalluszt átvittünk agar nélküli NT 1-tápközegbe egy Erlenmeyerlombikba, és forgóinkubátorba helyeztük 28 C¹ra. A sejteket passzálás után 6 12 nappal számos módszerrel elkülönítettük. Teljes, nedves sejtekhez úgy jutottunk, hogy a rázólombikot nyugalomban tartottuk, hogy a sejtek leülepedjenek, azután a tápközeget dekantáltuk. Ultrahanggal feltárt (szonikált) teljes, nedves sejtekhez a fentebb leírtak szerint jutottunk úgy, hogy a nedves sejteket felszuszpendáltuk extrakciós pufferben, amit foszfátpufferelt nátrium-kloridban (ph=7,2) készítettünk el, és 0 nm nátrium-aszkorbátot, 1 mm EDTA¹t, 1 mm PMSF¹et és 0,1% Triton X 0¹at (mindet a Sigma cégtõl szereztük be) tartalmazott. A sejteket Branson 40 ultrahangos feltáróban roncsoltuk, lapos cserélhetõ fej alkalmazásával, 8. kimeneti fokozaton, ciklusban, percig jégben. Szonikált, nedves sejtekbõl származó felülúszót és az üledéket perces, 30 rpm¹en végzett centrifugálással állítottunk elõ, Beckman GPR centrifugában. Teljes, szárított sejteket úgy preparáltunk, hogy a teljes, nedves sejteket Büchner-tölcsér és Spectramesh alkalmazásával szûrtük; az összegyûjtött sejteket Spectramesh-lapokon szétterítettük egy lapos mûanyag tálcára, azután élelmiszer-szárítóba helyeztük egy éjszakára. A táplálékkal beadott kezelésekhez a teljes sejtekben, szárított sejteket vagy szonikált nedves sejtekben elõzõleg meghatároztuk a célantigén mennyiségét, majd azt közvetlenül az etetõedényekbe helyeztük. A célantigén fogyasztása azonban brojlercsirkék esetén sokkal hatékonyabb volt, ha a teljes, nedves sejteket, szárított sejteket vagy szonikált sejteket elõször összekevertük a táplálékkal (6 gramm 1 napos brojlercsirkéknek), és X madarat tartalmazó boxonként egyetlen etetõtálba helyeztük. Intranazális (IN) oltáshoz a nedves sejteket, szárított sejteket vagy szonikált sejteket PBS-ben szuszpendáltuk, amíg konzisztens állapotot el értünk, ami lehetõvé tett l pipettázását a madár orrnyílásába. A sejtek tömeg/térfogat aránya, ami tipikusan szükséges IN¹oltáshoz, 1 rész sejt 2 rész extrakciós pufferben. 4. példa Vakcina beadása és kezelések Brojlercsirkéket a Stover Hatchery (Stover MO) cégtõl szereztünk be. Ezek a csirkék hím vagy vegyes û csirkék voltak, amiket kis tenyész-brojler mûveletekhez keltettek. A csirkék elsõbbségi, expressz postával érkeztek, és azonnal csirkekeltetõ Petersime-ketrecekbe helyeztük azokat (7¹et ketrecenként). Egy kezelésbe bevont csirkék számát teljesen véletlenszerû tervezésre alapoztuk, megismételt méréseket alkalmazva. Feleslegben maradt csirkéket random helyeztük el egyedi ketrecekben, és olyan csirkék helyettesítésére használtuk ezeket, amelyek elpusztultak a szállítási vagy az elhelyezési stressz miatt. Víz korlátlanul (ad libitum) rendelkezésre állt közvetlenül attól kezdve, hogy a madarak a ketrecekbe kerültek. A madarak koplaltatása céljából, a táplálékot egy éjszakán át megvontuk, 8

9 és a következõ reggel adtuk be az oltást, vagy a táplálék egy éjszakán át korlátlanul (ad libitum) rendelkezésre állt, és azután reggel óra hosszáig megvontuk, és délután végeztük az oltást. A táplálékkal beadott oltások esetén a növénybõl származó antigénbõl egy vizes zagyos készítettünk minimális mennyiségû vízzel, és azután a táplálékhoz kevertük csomós pasztát elõállítva. A táplálékot etetõtálba helyeztük, és az etetõtálat a ketrecbe helyeztük, hogy minden madár hozzáférjen. Töméssel végzett kezeléshez egy fecskendõre rögzített, 2, cm¹es tömõtût alkalmaztunk közvetlenül a nyelõcsõbe vagy begybe történõ oltáshoz. Az intranazális beadáshoz l¹t oltottunk közvetlenül az orrlyukakba. A csirkék általában 18 és órásak voltak oltáskor, tehát valamennyi klinikai kísérlet a csirkék 1 napos életkorában kezdõdött, a kísérlet 0. napján.. példa Kvantitatív ELISA Nunc Maxisorp 96 mérõhelyet tartalmazó ELISAtálcákat g/mérõhely kevert GM1-ganglioziddal burkoltunk 0,01 M borátpufferben, 0 l/mérõhely alkalmazásával; a tálcákat szobahõmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át. A tálcákat 3¹szor mostuk PBS- Tween -nel (1 ¹es 0,0% Tween ¹at tartalmaz, Sigma Lot No. 1K0248). Az egyes mérõhelyeket azután egy óra hosszáig inkubáltuk 37 C¹on 0 l blokkolópufferrel, ami vegyes% zsírmentes tejport tartalmazott PBS 0,0% Tween-ban. A mérõhelyeket 1 mostuk 0 l/mérõhely PBS-Tween-szal. A referenciaantigént és a mintaantigéneket összekevertük a blokkolópufferrel, mielõtt a tálcára adagoltuk. LT referenciaantigént és LT¹B referenciaantigént 0 ng/ml¹re hígítottuk az elsõ mérõhelyen, míg a mintákból elõzetesen hígításokat készítettünk néhány különbözõ kiindulási hígításban. A mintákat úgy adtuk a tálcára, hogy 0 l mintát mértünk az A sorba, és 0 l blokkolópuffert a többi sorba. Mérõhelyenként 0 l összekeverésével és átvitelével felezõ hígítási sort készítettünk. A tálcákat azután 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 C¹on, 3 mostuk PBS-Tweenben, és hozzáadtunk mérõhelyenként 0 l, blokkolópufferben hígított antiszérumokat, és 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 C¹on. A tálcákat 3 mostuk PBS-Tweenben, és azután hozzáadtunk 0 l ellenanyag-konjugátumot, és 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 C¹on. A tálcákat 3 mostuk PBS-Tweenben, és azután hozzáadtunk 0 l TMBszubsztrátot az egyes mérõhelyekre, és a szubsztrát hozzáadása után perccel hozzáadtunk TMB-stopoldatot. Az optikai denzitást 40 nm hullámhosszon mértük Tecan Sunrise tálcaleolvasóban. Az adatokat átvittük és ábrázoltuk Tecan Magellan szoftver alkalmazásával. Lineáris regressziót és kvantitatív kiértékelést végeztünk Microsoft Excel SR 1 verziójú szoftverrel. 6. példa Szérum ELISA Vért vettünk 0 7 napos madaraktól a fej eltávolításával (dekaptációval) vénaszúrással a szárnyba vagy a 4 0 jugularis (nyaki) vénába. A madarakat cervikális diszlokációval pusztítottuk el vagy szén-dioxid-atmoszférában tartottuk azokat 1 percig a dekapitáció elõtt. A vért az állatházból átvittük a laboratóriumba, és 2 7 C¹ra helyeztük 4 percig, hogy vérrögök képzõdjenek és tömörödjenek. A vérmintákat áthelyezzük 37 C¹os vízfürdõbe percig, azután lecentrifugáltuk percig, 00 rpm¹en, Beckman GPR centrifugában, 2 7 C¹on. A szérumot aszeptikusan eltávolítottuk az egyes csövekbõl, 0, 1, ml aliquotot helyeztünk fagyasztócsövekbe ( cryotube, Nunc), és 18 C¹on tároltuk azokat felhasználásig. Szérum ELISA-hoz, a gangliozidadszorpciós lépésben 1, g/ml¹t alkalmaztunk egy éjszakás inkubálással, 2 7 C¹on. A tálcákat 3 mostuk PBS-Tweennel, és 0 l/mérõhely, 3% zsírmentes tejport tartalmazó PBS-Tweenben blokkoltuk. A szérummintában lévõ ellenanyagtiter meghatározása céljából a gangliozid adszorbeálása után, 0 l LT¹B¹t vagy LT¹t 2, g/ml koncentrációban, blokkolópufferben adtunk a mérõhelyekre, és 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 C¹on. A tálcákat 3 mostuk PBS-Tweennel, és azután 0 l, blokkolópufferben hígított szérummintát adtunk az A sorhoz, és 0 l blokkolópuffert adtunk a többi sorhoz. A szérum kiindulási hígítása 1: volt, hacsak másképpen specifikáljuk. A szérummintákból felezõ hígítási sort készítettünk, a tálcákat 1 óra hosszáig, 37 C¹on inkubáltuk, és azután 3 mostuk PBS-Tweennel. Kecskében, csirke ellen termeltetett, az optimális kötéshez elõzetesen titrált ellenanyagot, és kromogént adtunk hozzá, és 1 óra hosszáig, 37 C¹on inkubáltuk. A tálcákat mostuk, és hozzáadtunk 0 l ABTS¹t, és addig inkubáltuk, amíg a pozitív kontroll kezdeti hígításának abszorbanciája /492 nm kettõs hullámhosszon 0,7 1,0 lett, Tecan Sunrise tálcaleolvasóban. Az adatokat átvittük és ábrázoltuk Tecan Magellan szoftver alkalmazásával. Lineáris regressziót és kvantitatív kiértékelést végeztünk Microsoft Excel SR 1 verziójú szoftverrel. Az egyes kezelt csoportokra meghatároztuk a szérum titerének geometriai középértékét Microsoft Excel SR 1 verziójú szoftverrel. A ¹nél kisebb ELISA háttértitereknek 1 értéket adtunk ezekben a számításokban. Azokat a kezeléseket tekintettük hatékonynak, amelyekben szignifikáns különbség volt a kezelt csoport és vakcinát kapott, és a fertõzött, kontrollcsoport között. 7. példa Y1 jelû adrenalis sejtekkel végzett vizsgálati eljárás Egerekbõl származó, Y1 jelû adrenalis (mellékvese¹) sejteket az ATCC-tõl szereztünk be (CCL 79, L#130). A sejteket tartalmazó edényt felolvasztottuk 37 C¹on, és cm 2 ¹es T¹edénybe (Corning) helyeztük, amelyben ml tenyésztési tápközeg % donor lószérumot (Quad¹ L# 2212), 2,% magzati marhaszérumot (JRH L# 7N2326), 1% glutamax-1¹et (Gibco L# 80323) tartalmazott F 12K-tápközegben (Gibco L# 89716). A sejteket 37 C¹on inkubáltuk % szén-dioxidban. A sejteket ebben a tenyésztési 9

10 tápközegben tartottuk minden passzáláskor, és LT és CT citotoxicitási vizsgálati eljárásokhoz. A vizsgálathoz a sejteket 96 mérõhelyet tartalmazó, sejttenyésztõ tálcákba (Nunc) passzáltuk, és hagytuk, hogy 80%¹os konfluenciát érjenek el. LT¹ vagy CT¹toxint 1 g/ml¹re hígítottunk F 12K növesztési tápközegekben. A toxint tovább hígítottuk felezõ hígítási sorban, 96 mérõhelyet tartalmazó, mikrotitertálcában úgy, hogy 0 l elõzõleg hígított mintát adtunk a tálca A sorába. Azután felezõ hígítási sort készítettünk úgy, hogy az A sorból 0 l mintát átvittünk a következõ mérõhelyre, amely 0 l növesztési tápközeget tartalmazott. Minden hígított mintát 1 4, Y1 jelû adrenalis sejteket tartalmazó mérõhelyhez adtunk, attól függõen, mennyi minta vagy sejt állt rendelkezésre. A CT¹ vagy LT¹toxin végponttitere az g/ml érték, ami 0%¹os citotoxicitáshoz (sejtpusztuláshoz) szükséges [Guidry, J. J. és munkatársai, Inf. and Immun. 6, (1993)]. 8. példa Brojlermadarak fertõzése natív LT¹vel Brojlercsirkéket tartottunk vagy 21 napos korukig, ¹6 madarat ketrecenként. Egy pilot vizsgálatban 16 napos csirkéket elosztottunk 3 csoportra ( madár oltás nélkül, madarat 0 g/madár mennyiséggel, madarat 0 g/madár mennyiséggel kezeltünk), és szubkután beoltottunk E. coliból származó natív LT¹vel. Az LT¹toxinról elõzõleg meghatároztuk, hogy aktív formában van¹e, egéreredetû Y1 jelû adrenalis sejteken történõ titrálással, a fentebb leírtak szerint. A madarakon óránként figyeltük a klinikai jeleket, 8 óra hosszáig az oltás után. Az oltás utáni 1., 2., 4., 8., 24. és 26. órában a madarakat elpusztítottuk, és makroszkopikus (szabad szemmel végzett vizsgálat) nekropsziát végeztünk. Feljegyeztük a kritikus szervek, ideértve a belek, máj, vese, lép és mellékvese tömegét és elváltozásait, valamint a testtömeget. A második vizsgálathoz 84, 21 napos madarat elosztottunk 6 csoportba, ahol egy csoportban 16 madár volt, és szubkután oltottuk 0,, 0, 0, 0 vagy 0 g natív LT¹holotoxonnal madaranként. Oltás után, 24 és 48 órával az egyes csoportokból madárnak vizsgáltuk a testtömegét, szabad szemmel látható patológiát, a széklet konzisztenciáját és az általános egészségi állapotot. Valamennyi madárnak táplálék és víz korlátozás nélkül (ad libitum) rendelkezésre állt a vizsgálat alatt. 9. példa Szerológiai válasz orálisan beadott CT¹B¹re brojlercsirkékben Kolera-toxin B alegységet (CT¹B) adagoltunk a táplálékhoz, vagy közvetlenül oltottuk csirkékbe különbözõ formák alkalmazásával. Ehhez a vizsgálathoz három oltást végeztünk 1, 14 és 28 napos korukban; vért vettünk az ellenanyag-analízishez az 1, 14, 28 és napos korban. Az adatok számos olyan megfigyelést tükröztek, amit elõzõleg már leírtak emlõsökre, azonban írtak le csirkékre. Mérhetõ szerológiai 4 0 választ könnyen detektáltunk 28 napos korban vagy két héttel a második vakcináció után 14 napos korban. Tehát csak két dózis volt szükséges detektálható válasz indukálásához. Azonban egy harmadik dózis beadása 28 napos korban fokozta a választ. Az intranazális (IN) és a táplálékkal beadott (OF) oltások egyaránt szerológiai válaszokat indukáltak; a legmagasabb titer (7) g CT¹B-oltással alakult ki, amit l vizes oldatként adtunk a csõr egyes orrlyukaiba. CT¹B orális beadása szintén jó választ biztosított, akár g dózis baromfitöméssel (titer 1790), vagy g közvetlenül a táplálékra (fedõrétegként) sprayzve (titer 36). Ahogyan emlõsszervezeteken megfigyelték, az IN¹út CT¹B alkalmazásával jó szerológiai választ ad [Verweiji és munkatársai, Vaccine 16, (1998); és Isaka és munkatársai, Vaccine 16, (1998)]. Azonban a szükséges dózis térfogata kicsi, hogy bejuthasson az orrlyukakon keresztül. Ebben az esetben tisztított CT¹B-toxint lehet elõállítani 2 mg/ml¹es törzsoldatként, ami lehetõvé tesz alkalmas g dózist, l-ben történõ bevitelét. A spray-vel történõ beadáskor g¹ot alkalmazunk 6 gramm táplálékban, vagy körülbelül 0,3 ppm¹et, ami jó titert biztosít. A CT¹B hígítását a táplálékon és az eredményül kapott válasz mértékét tekintve, az orálisan beadott dózisok jó GALT-stimulálást biztosítottak, akár közvetlenül a nyelõcsõbe adva, vagy ad libitum 6 gramm oltóanyagot fogyasztva. Összehasonlításképpen: 2 g CT¹Bdózis IN¹beadva vagy g orálisan táplálékkal beadva csirkékben nagyon hasonló ahhoz a dózishoz, ami mukozális választ stimulál egerekben. CT¹B¹re ebben a vizsgálatban kimutatott hatásos dózis összehasonlítható azzal az antigénmennyiséggel is, amit állatokban szokásosan alkalmaznak intramuszkuláris (IM) vagy szubkután (SC) módszerekben. Továbbá figyeltük meg CT¹B által kifejtett mellékhatásokat ezekben a madarakban; a tömeggyarapodás és a táplálék fogyása normális volt, ami alátámasztja növényi eredetû, transzgenikus antigének orális vakcinaként való biztonságos alkalmazását.. példa Szerológiai válasz dohányból származó LT¹re csirkékben CT-B¹re meghatározott, hatásos dózis alkalmazásával egy második vizsgálatot végeztünk annak értékelésére, hogy vajon natív, E. coliból származó hõlabilis toxin (LT) vagy LT¹B, valamint módosított, hõlabilis toxint kódoló gén hasonló válasz képes¹e elõidézni. Ebben a vizsgálatban g toxint adtunk be három dózisban, hasonló idõbeosztásban, mint a fentebb leírt CT¹B-vizsgálatban, ahol az LT¹B mennyiségét kvantitatív ELISA-val határoztuk meg. Az 1. táblázatban bemutatjuk az eredményeket, amiket dohányból származó LT (SLT) és natív toxin beadásával kaptunk táplálékhoz adagolt módszerrel vagy orális vakcinációval. Valamennyi kezelt csoport adott választ, kivéve az SLTfelülúszó. Az SLT teljes minták (titer 844) és az SLT szonikált (titer 7) adták a legerõsebb választ ebben a vizsgálatban.

11 1. táblázat Növényi eredetû LT bakteriális eredetû LT¹, LT¹B- és CT¹B-hez viszonyítva : titer geometriai középértéke Kezelt csoport 0. nap 14. nap 28. nap 34. nap PBS a < a < < NT szonikált < a < a < < NT szárított kevert < < < < CT¹B spray-zett < < LT¹B spray-zett < < 171 LT spray-zett < < 32/3 133/226 SLT teljes kevert < < SLT szonikált kevert < < 1 77 SLT üledék kevert < < 272 SLT felülúszó kevert 80 < < < SLT szárított kevert < < 96 SLT szonikált kevert O/N < < Az SLT egész kifejezésen egész, nedves sejteket értünk, melyeket úgy izoláltunk, hogy egyszerûen hagytuk leülepedni a sejteket az NT 1-termelõ edényben, a tápközeget dekantáltuk és a megmaradt egész sejteket a maradék tápközeggel összekevertük, és a táplálékhoz adtuk. Az SLT szonikált kifejezésen olyan egész sejteket értünk, amiket elõször ultrahanggal kezeltünk a sejtfal szétroncsolása céljából, és azután összekevertük a táplálékkal. Mindkét dohányból származó SLT-minta jobb szerológiai választ indukált, mint a natív LT vagy CT¹B, ha közvetlenül a táplálékhoz adtuk. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a dohánysejtekbõl származó LT (SLT) és a natív LT egyaránt jó mukozális antigén csirkékben. A 2. táblázatban továbbá bemutatjuk, hogy dohányból származó SLT rendelkezik káros mellékhatásokkal, a testtömeg-növekedés mérése alapján, amelyek adatokat biztosítanak annak alátámasztására, hogy csirkéknek biztonságosan lehet vakcinát beadni orálisan, növényi eredetû vagy natív LT¹t alkalmazva. Továbbá g natív LT¹toxin 1, 14 és 28 napos korban történõ beadása után tapasztaltunk látható enteropatogén hatásokat (hasmenés, nyugtalanság, kiszáradás) kezelt madarakban, semmilyen életkorban. Az LT tömege testtömeg-kg-onként 0,6 mg/lt/kg-testtömegnek becsülhetõ, ami jóval az egerekre megfigyelt letális dózis felett van [Gill, M. D., Microbiol. Reviews 46, (1982)], és alátámasztja azt a feltételezést, hogy natív LT¹t biztonságosan lehet alkalmazni csirkékben. 2. táblázat Átlagos össztesttömeg madaranként, kezelésenként Kezelés Átlagos tömeg 0. nap (kg) Átlagos tömeg 14. nap (kg) Átlagos tömeg 28. nap (kg) Átlagos tömeg 34. nap (kg) PBS-kontroll 0,038 0,29 1,06 1,34 NT szonikált-kevert 0,0 0, 1,06 1,39 NT szárított-kevert 0,039 0,32 1,04 1,36 CT-B-spray-zett 0,0 0, 1,04 1,36 LT-B-spray-zett 0,038 0,29 0,98 1,3 LT-spray-zett 0,0 0, 1,02 1,32 SLT teljes-kevert 0,0 0,29 0,94 1,28 SLT szonikált-kevert 0,0 0, 1,00 1,3 SLT üledék-kevert 0,038 0, 1,04 1,38 SLT felülúszó-kevert 0,0 0,33 0,92 1,32 SLT szárított-kevert 0,0 0,32 1,08 1,42 SLT szonikált-kevert és szárított egy éjszakán át 0,038 0,33 1,12 1,41 11

12 11. példa SLT¹re adott szerológiai válasz kialakulása és a szerológiai válasz idõtartama Az elõzõ két vizsgálatban kimutattuk, hogy a natív, E. coliból származó vagy dohányból származó, hõlabilis toxin erõs szerológiai választ indukál brojlercsirkékben. Egy kísérletben azt a legkorábbi életkort vizsgáltuk, amelyben már mérhetõ a válasz brojlercsirkékben, és a válasz idõtartamát. Ebben a kísérletben a dózist és a madarak életkorát változtattuk SLT¹re adott válasz vizsgálatára. A 3. táblázatban bemutatjuk a kezelt csoportokat, a madarak életkorát a dózis beadásakor és az alkalmazott antigén mennyiségét az egyes dózisonként ebben a vizsgálatban. A második dózis alacsonyabb volt az antigén alacsony hozama miatt, ami alacsonyabb antigéndózist jelent, ha szétosztjuk a csoportok között. Az IN¹dózis körülbelül 0 ng volt; az alacsony dózis amiatt volt, mert az SLT-antigént a dohánysejttömeg meghígítja, és az SLT-sejtek felszuszpendálását elegendõen homogénné kell tenni, hogy lehetõvé tegye az egynapos madarak orrlyukába juttatást. NT 1-sejtek szuszpenziója olyan mértékben van felhígítva, hogy egy pipettával nagy kis mennyiségû oltás bevihetõ legyen az elsõ dózisban. Mindezek ellenére, ha egy második, ismétlõ oltást táplálékban adunk be, ezek a madarak választ adnak, ami arra utal, hogy kis dózis is elég, hogy a madarakban kezdeti immunválasz alakuljon ki IN beadott LT¹antigénnel szemben. 3. táblázat Kezelés 1 dózis ( g) 2 dózis ( g) 3 dózis ( g) 1. IN/orálisan NT kontrollsejtek (0., 14., 28. nap) Táplálékban NT kontrollsejtek (0., 14., 28. nap) Táplálékban SLT2-sejtek (0., 14., 28. nap) Táplálékban SLT2-sejtek (0., 14. nap) 3 N/A. Táplálékban SLT2-sejtek (0., 7. nap) 3 N/A 6. Táplálékban SLT2-sejtek (0., 7., 14. nap) Táplálékban SLT2-sejtek (0., 14., 28. nap) 8. Táplálékban SLT2-sejtek (0., 14. nap) N/A 9. Táplálékban SLT2-sejtek (0., 7. nap) N/A. Táplálékban SLT2-sejtek (0., 7., 14. nap) 11. IN/orálisan SLT2-sejtek (0., 14., 28. nap) 0,(ng) 12. IN/orálisan SLT2-sejtek (0., 7., 14. nap) 0,(ng) A 3A. táblázatban bemutatjuk a szerológiai válaszokat. A legkorábbi életkor, amelyben szerológiai választ lehetett detektálni, 21 napos kor volt, függetlenül attól, hogy a dózist a 0, 7 vagy 14 napos korban adtuk be. A 3., 7. és 11. csoportban egy harmadik dózist is adtunk 28 napos korban, de ez volt szükséges kimutatható titerhez. A 21 napos korban detektált válasz 42 napos életkorig tartott, ami összhangban volt azzal az életkorral, amikor a brojlercsirkéket értékesítik ( 6 naposak). A legjobb szerológiai választ akkor figyeltük meg, amikor csak két dózist adtunk a madárnak, és mindkét esetben az elsõ oltás 1 napos korban történt, és a második oltás 7 napos korban történt. Mivel a csirkéket tipikusan in ovo oltják a kikelés elõtti harmadik napon vagy egynapos korban a keltetõben, kezdeti immunválasz kialakításának lehetõsége a madarak egynapos korában adaptálható a csirketenyésztés gyakorlatába. 3A. táblázat Szerológiai válasz kialakulása és a válasz idõtartama Kezelés 0. nap 7. nap 14. nap 18. nap 21. nap 28. nap. nap 42. nap < < < < < < < 2. < < < < < < < 3. < < < < < < < < < < < 17 < <. < < < < < < < 6. < < < < 13 < < 7. < < < <

13 3A. táblázat (folytatás) Kezelés 0. nap 7. nap 14. nap 18. nap 21. nap 28. nap. nap 42. nap 8. < < < < < < < < < < < < < < < < példa Brojlermadarak kezelése E. coliból származó natív LT¹vel A 4. és. táblázatban bemutatjuk két vizsgálat eredményeit, amelyekben napos és 21 napos brojlermadarakat kezeltünk szubkután natív LT¹vel. Szubkután oltást alkalmaztunk, mivel leírták, hogy ez legalább olyan hatásos, ha hatásosabb eljárás, mint egerek letális fertõzése [Isaka és munkatársai, (1998)]. 16 madár és három kezelt csoport alkalmazásával lehetett látni számottevõ különbséget a kezeletlen és kezelt madarak között. Bár néhány madár esetén enyhe hasmenést és enyhe vérzést tapasztaltunk, a hisztológiai metszeteken tapasztaltunk különbséget a kezelt madarak és a kezeletlen kontrollok között. Hasmenésre érzékeny állatok egyik jellemzõje a vízvisszatartás mértéke a belekben, teljes testtömegre vonatkoztatva. Azonban ebben a vizsgálatban a belek testtömegre vonatkoztatott átlagos tömege ténylegesen alacsonyabb volt a kontrollokban, mint a 0 g-mal kezelt csoportban. Ezekre az eredményekre alapozva kijelenthetjük, hogy voltak intenzív patológiai válaszok madarakban, ha LT¹t ilyen módszerrel beadtunk. Egy második vizsgálatban, ugyanebbõl a fészekaljból származó, 84 db, huszonegy napos brojlermadarat pilotkísérletként kezeltünk tágabb tartományban natív LT¹vel. Mivel láttunk különbségeket a minták között hisztokémiai szinten, vagy szabad szemmel látható patológiában, és a madarak össztömegében a pilotvizsgálatban, csak szabad szemmel látható patológiai és általános egészségi állapotra vonatkozó megfigyeléseket végeztünk a második vizsgálatban. Az. táblázatban bemutatott adatok azt mutatják, hogy a kezelt csoporttól függetlenül, volt patológia vagy az általános egészségi állapotot átfogóan érintõ változás a madarakban, függetlenül az LT¹koncentrációjától vagy a megfigyelés idõpontjától. Bár néhány vérzõ sérülést láttunk néhány kezelt mintában, ezeket megfigyeltük a kontrollokban is, és így tehát úgy tekintjük, hogy ez a kezeléssel társult. A vizsgált átlagos tömeg madaranként ebben a pilotkísérletben 162 g volt, míg a madarak átlagos tömege a fertõzési vizsgálatban 636 g volt. Ezért az LT¹tömeg a madarak testtömegére vonatkoztatva mindkét vizsgálatban 0,2 mg/kg és 1,2 mg/kg között volt. A közölt tömeg/testtömeg arány az irodalomban leírtak szerint letális egerekre 1 mg/kg testtömegig CT¹re (IN beadva) és 0, mg/kg¹ig LT¹re (IV beadva) [Glenn és munkatársai, J. Immunol. 161, (1998); és Gill (1983)]. Emberekben akár 0,1 mg/kg is elegendõ, ami súlyos, több literes folyadékveszteséget okoz. Az itt tesztelt arány, ami elfogadott és érzékeny módszer LT¹fertõzésre, okozott semmilyen hasmenéses indikációt kontrollhoz viszonyítva. 4. táblázat Natív LT szubkután oltásának vizsgálata napos madarakban Kezelés Szabad szemmel látható patológia Szerv tömege Madár tömege bél máj vese lép mellékvese bél máj vese lép mellékvese G1 1. madár N N N N nd 18, 8,1 1,0 0,2 nd 166,8 2. madár N N N N nd 19,4 9,9 1, 0,36 nd 174,4 3. madár N N N N nd 19,1 11,7 1,9 0,16 nd 178,3 4. madár N N N N N 22,4 9,12 1,4 0,21 nd 4,4. madár N N N N N 16,2,6 1,4 0,16 nd 6,8 G2 6. madár N N N N nd 19, 12,9 1,3 0,2 nd 178,4 7. madár N N s. h. N nd 17,8 12,3 1,3 0,17 nd 191,1 13

14 HU T2 4. táblázat (folytatás) Kezelés Szabad szemmel látható patológia Szerv tömege Madár tömege bél máj vese lép mellékvese bél máj vese lép mellékvese 8. madár N s. h. N N N,6 9,2 1,92 0,18 nd 167,6 9. madár D s. h. N N N 11,4 8,1 1,1 0, nd 166,6. madár D 1 N N N N 14,82,8 2,3 0,09 nd 170,6 G3 11. madár N N N N nd 21,4 14,9 0,99 0,17 nd 186,9 12. madár N N N N nd 18,0 8,0 1,2 0,2 nd 167,2 13. madár N 1 s. h. nd N N 19,09 12,4 2, 0,13 nd 196,1 14. madár N 1 N N N N 13, 7,2 1,8 0,27 nd 142,7. madár D N N N N 13,1 7,4 1,9 0,11 nd 144,1 16. madár D N N N N 7,6 6,7 1,4 0,14 nd 1,3 G1-csoport, 1 oltott kontroll; nd=nincs meghatározva; D¹vízmentes; s. h.=kismértékû vérzés; G2-csoport 20 g/madár; G3¹csoport 30 g/madár; 1 Némi hasmenést jegyeztünk fel a pusztulás után.. táblázat Brojlermadarak kezelése natív LT alkalmazásával szubkután úton Kezelés 1 Madár tömege (átlagos tömeg, gramm) Bél Máj Vese Lép G1 0 g kontroll h 1 69 N N N N G1 0 g kontroll 24 h N N N N G1 0 g kontroll 48 h m. h. 1 madár s. he. 2 madár N N G2 g kezelés h N N N N G2 g kezelés 24 h s. h. 1 madár N N N G2 g kezelés 48 h 3 76 N N N N G3 0 g kezelés h N N N N G3 0 g kezelés 24 h N N N N G3 0 g kezelés 48 h N N N N G4 0 g kezelés h 1 7 m. h. 2 madár s. he. 2 madár N N G4 0 g kezelés 24 h N N N N G4 0 g kezelés 48 h 66 m. h. 1 madár N m. h. 1 madár G 0 g kezelés h N N N N G 0 g kezelés 24 h N N N N G 0 g kezelés 48 h N N N N G6 0 g kezelés hr 1 6 N s. h. N N G6 0 g kezelés 24 hr 1 34 N N N N G6 0 g trt 48 hr 3 N N N N 1 4 madár idõpontonként, kezelt csoportonként. 2 6 madár idõpontonként, kezelt csoportonként.. 3 madár idõpontonként, kezelt csoportonként m. h.=enyhén vérzéses; s. he.=kis hematóma; s. h.=kismértékben vérzéses. 14

15 . példa SLT és LT alkalmazása adjuvánsválaszhoz intranazális/okuláris oltással Ezt a kísérletet olyan LT¹dózis vizsgálatára terveztük, amely adjuvánsként történõ alkalmazásához szükséges más antigén intranazális/okuláris beadásával. Ebben a vizsgálatban a célantigén Newcastle-betegség vírusából származó hemagglutinin-neuraminidáz (HN) fehérje volt, melyet az,3,678 számú USA-beli szabadalmi leírásban közöltek. NT 1-sejteket transzformáltunk lényegében a 2. példában leírtak szerint, transzformációs vektorként pchn18 alkalmazásával, ezzel olyan transzformált NT 1-vonalat állítottunk elõ (CHN18), ami natív HN¹gént expresszált. Immunogéneket az alábbiak szerint, külön-külön preparáltunk a transzformált sejtek szétroncsolásával és SLT¹t, HN¹t expresszáló és nulla-kontroll NT 1-sejtek extraktumainak liofilizálásával. Körülbelül 1 gramm szûrt sejteket 2 ml pufferbe (DPBS és 1 mm EDTA) helyeztünk, és ultrahanggal kezeltük (szonikáltuk) másodpercig jégben. Az ultrahangos kezelést Branson 40 ultrahangos feltáróban végeztük, cserélhetõ mikrotip alkalmazásával, 8. kimeneti fokozaton, ciklusban, másodpercig. Az ultrahanggal kezelt anyagot azután g¹n, percig centrifugáltuk a sejttörmelékek eltávolítása céljából, és a felülúszót dekantáltuk. Az extraktumot üveg szérumtároló edényekbe helyeztük, liofilizáltuk és felhasználásig 2 7 C¹on tartottuk. A liofilizált sejtextraktumokat oltóanyagként használtuk növényi eredetû kezelésekre. E. coliból származó LT¹holotoxint (,92 mg/ml DPBS-ben szuszpendálva) alkalmaztunk pozitív kontrollként. A vakcinaoltásokat a vizsgálat 0. és 14. napján végeztük. CHN18-ból származó extraktumokat adtunk 7 g mennyiségben a 0. napon, és 18 g¹ot a 14. napon. E. coliból származó LT¹t összekevertük a CHN18- extraktummal, amelybõl 8 g¹ot adtunk a 0. napon, és g¹ot a 14. napon, és a növényi eredetû, hõlabilis toxinból (SLT 2) 0, g¹ot adtunk a 0. napon, és 1, g¹ot a 14. napon. LT¹vel vagy SLT-vel kezelt mintákat olyan kezelt csoportokhoz hasonlítottuk, amelyek elterjedtebben alkalmazott víz az olajban adjuvánst kaptak, amit úgy készítettünk el, hogy a liofilizált antigénpreparátumot 2,% végkoncentrációig felszuszpendáltuk olyan Drakeol Oil -ban, ami 0,16% Span 80¹at 4 DPBS-ben és 0,% Tween 80¹at tartalmazott. A mintákat két fecskendõ és egy háromutas csap alkalmazásával kevertük össze, ami lehetõvé tette az antigén szuszpendálását a vízbõl és olajból álló keverékben. Intranazális/okuláris oltás céljából l¹t adtunk az egyes orrlyukakba, és az egyes szemekbe napos életkornál fiatalabb madaraknak, és 0 l¹t orrlyukanként szemenként a napos életkornál idõsebb madaraknak. Vért vettünk a 21.,. és 42. napon. A. napon a madarakat szubkután oltottuk inaktivált natív vírussal fertõzõ dózis szimulálása céljából, 7 nappal a szimulált fertõzés után (42. napon) vért vettünk szerológiai analízis céljából. A 6. táblázatban látható eredmények azt mutatják, hogy mind LT¹re, mind SLT¹re adott szerológiai választ könnyen detektáltuk a vizsgálat 21. napján, vagy 7 nappal a második vakcináció után. Az LT¹re adott szerológiai válasz ELISA-val kimutatva sokkal nagyobb volt, mint növényi eredetû SLT¹re adott válasz, azonban az elsõ immunizáláskor alkalmazott dózis több, mint ¹szer kisebb volt SLT¹re, mint LT¹re. A. és 42. napon az LT¹re és SLT¹re adott szerológiai válasz elég magas volt, ami azt mutatja, hogy intranazálisan és okulárisan kiváltott mukozális válasz akkor is hatékony, ha az elsõ immunizáláskor adott dózis csak 0, g. Ezzel ellentétben, CHN18 jelû transzgenikus NT1-sejtvonalakból származó HN¹fehérjére adott válasz adott detektálható titert a 21. napon, ELISA-val vagy HAI-vel detektálva. Azonban a 42. napon, ami 7 nappal volt a natív NDV-vel végzett, szimulált fertõzés után, az 1. és 2. számú kezelés jelentõs mértékû HAI szerológiai válaszokat mutatott, amit figyeltünk meg a többi kezelésben. A többi kezelésben LT¹ és SLT¹t (7. és 8. számú kezelés) adtunk be az 1. és 2. számú kezelésben alkalmazottakhoz hasonló dózisokban, kivéve azt, hogy olajban és vízben emulgeáltuk. Az eredmények alapján feltételezzük, hogy HN¹re adott memóriaválasz mértéke növelhetõ natív antigénnek való érintkezés után, szimulált fertõzési dózisban. HN¹re adott szerológiai választ tipikusan lehet detektálni az antigénre adott válasz után 7 nappal. Továbbá HN¹antigén önmagában vagy kombinációban más keverékekkel indukált választ bármelyik más kezelésben sem, tehát az 1. és 2. számú kezelésben a HN¹titerek kialakulása HN és LT/SLT-vel való érintkezés következménye volt. 6. táblázat LT- és SLT-fehérjék intranazális/okuláris beadásának adjuváns hatása madarakban Kezelt csoport Kezelés leírása NDV ELISA NUV HI LT ELISA 21. nap. nap 42. nap 21. nap. nap 42. nap 21. nap. nap 42. nap 1. phn+slt2 2. phn+e. coli LT 1 3. phn Corixában (MPL/TDM emulzió)

16 6. táblázat (folytatás) Kezelt csoport Kezelés leírása NDV ELISA NUV HI LT ELISA 21. nap. nap 42. nap 21. nap. nap 42. nap 21. nap. nap 42. nap 4. phn 1. emulzióban phn 2. emulzióban phn 3. emulzióban phn+slt 1. emulzióban phn+e. coli LT 1. emulzióban NT kontroll+slt 1. emulzióban NT kontroll+e. coli LT 1. emulzióban Minõségellenõrzés még vizsgálta NDV ELISA-titer <0: háttér NDV HI¹titer <8: háttér LT ELISA-titer <: háttér A 7. táblázatban bemutatott eredményeket úgy kaptuk, hogy LT¹t szubkután (SQ) oltottunk HN¹el kombinációban. A vakcina preparálása a 6. táblázatban feltüntetett módon történt. Vakcinát ebben a vizsgálatban a combszövetbe adtuk be. Két oltást alkalmaztunk, a 0. napon és a 14. napon. A. napon beadtunk egy szimulált fertõzési dózist inaktivált NDV-vel. A 7. táblázatban bemutatott eredmények alátámasztják, hogy LT SQ¹oltással beadva szintén szerológiai választ eredményez, és azt, hogy megfigyelhetõ HN¹re adott szerológiai válasz fokozódása, ha együtt adjuk be. 7. táblázat Csirkék szubkután oltása LT¹vel és növényi eredetû HN¹nel Kezelt csoport Kezelt csoport leírása NDV HI LT ELISA 21. nap. nap 42. nap 21. nap. nap 42. nap 7. phn ( g)+slt (2, g) 1. emulzióban 8. phn ( g)+e. coli LT ( g) 1. emulzióban 9. NT kontroll+slt (2, g) 1. emulzióban. NT kontroll+e. coli LT ( g) 1. emulzióban LT in ovo oltással is választ stimulált. A 8. táblázatban bemutatottak szerint, E. coliból származó LT¹t légzsákon keresztül és az amnionüregbe oltottunk. Termékeny tojásokat átvilágítottunk a keltetés 18. napján, és csak egészséges embriókat azonosítottunk oltásra. Az injektálás helyét letöröltük alkohollal közvetlenül a tojás légzsákja fölött. Az üreget óvatosan megszúrtuk tojásszúróval, és egy 22 gauge méretû, körülbelül 3,8 cm hosszú tût illesztettünk be a lyukon keresztül. Maximum 0,3 ml oltóanyagot juttattunk az amnionüregbe, közvetlenül a légzsák membránja alá. A tojásokat azután a napig átvittük a keltetõbe. Tizennégy nappal azután, hogy kikeltek a madarak, ismétlõ immunizálási adtunk LT¹vel, és a vért szerológiai válaszra analizáltuk a 21. napon. Szerológiai választ figyeltünk meg egyetlen oltással 7 napon 16

17 belül, kivéve, ha elõzõleg egy elsõ immunizáló ( priming ) dózist kaptak. Az eredmények azt mutatják, hogy in ovo oltott LT hatékony volt elsõ immunizálásra 18 napos embrióban. 8. táblázat In ovo immunizálás Kezelt csoport leírása 21. nap szerológia # kikelt LT ELISA NT kontroll 2. emulzióban 1 NT kontroll+e. coli LT ( g) 3 16 Szakember könnyen felismeri vagy kideríti a találmány leírásban ismertetett és szemléltetett, konkrét elõnyös megvalósítási módjainak ekvivalenseit a leírás, a technika állása és némi rutin kísérletek elvégzése alapján. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Készítmény amely natív, E. coliból származó hõlabilis toxin (LT) adjuvánst tartalmaz brojlercsirke vakcinációjára történõ alkalmazásra, ahol a készítmény orális vagy szubkután úton történõ beadásra van adaptálva. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely továbbá brojlercsirkékben hatásos immunoprotektív antigént is tartalmaz. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén virális, bakteriális vagy gombaeredetû patogének által alkotott csoportból van kiválasztva. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén az alábbi ismert immunoprotektív antigének által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség, madárinfluenza, fertõzõ burzális betegség, coccidiosis, nekrotikus enteritisz, légzsákgyulladás, cellulitisz, csirkeanémia, laryngorhinotracheitis, fertõzõ bronchitis és Marek-féle betegség.. A 4. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség vírus hemagglutinin-neuraminidáz fehérje és madárinfluenzavírus hemagglutinin fehérje. 6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az adjuváns E. coli baktérium által van termeltetve Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az adjuváns transzgenikus növény által van termeltetve. 8. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén transzgenikus növényben van termeltetve. 9. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az adjuváns és az immunoprotektív antigén transzgenikus növényben van termeltetve.. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az adjuváns és az immunoprotektív antigén egyetlen transzgenikus növényben van termeltetve. 11. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása brojlercsirkék madárbetegség elleni vakcinációjára szolgáló gyógyszer gyártására. 12. Eljárás brojlercsirkék madárbetegség elleni védelmére szolgáló vakcina elõállítására, amelyben natív LT hatásos mennyiségét összekeverjük olyan immunoprotektív antigén hatásos mennyiségével, amelyrõl ismert, hogy immunválaszt képes elõidézni egy madárban, ahol a vakcina orális vagy szubkután úton történõ beadásra van adaptálva. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunoprotektív antigén az alábbi ismert immunoprotektív antigének által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség, madárinfluenza, fertõzõ burzális betegség, coccidiosis, nekrotikus enteritisz, légzsákgyulladás, cellulitisz, csirkeanémia, laryngorhinotracheitis, fertõzõ bronchitis és Marek-féle betegség. 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunoprotektív antigén az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség vírus hemagglutinin-neuraminidáz fehérje és madárinfluenza-vírus hemagglutinin fehérje.. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunoprotektív antigén a Newcastle-betegség vírus hemagglutinin-neuraminidáz fehérje. 17

18 HU T2 Int. Cl.: A61K 39/02 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest