Tartalomjegyzék FOCUS MEDICINAE. Bevezetés...2 /Introduction/ Dr. Karabélyos Csaba

Átírás

1 FOCUS MEDICINAE Felelős szerkesztő: Dr. Szolnoky Miklós Főszerkesztő: Dr. Karabélyos Csaba Szerkesztőbizottság: Dr. Bencsik Krisztina Prof. Czirják László Prof. Horváth Örs Péter Dr. Kalmár Ágnes Dr. Mátrai Zoltán Dr. Nemes László Dr. Paál Mária Dr. Pál Katalin Prof. Zeher Margit Szerkesztőbizottság tanácsadó testülete: Prof. Fekete György Prof. Kiss Attila Prof. Kiss István Prof. Komoly Sámuel Prof. Lipták József Prof. Mándi Yvette Prof. Maródi László Prof. Medgyesi György Dr. Mészner Zsófia Dr. M. Tóth Antal Dr. Nagy Kálmán Prof. Pálóczi Katalin Prof. Perner Ferenc Prof. Pénzes István Prof. Péter Ferenc Prof. Romics Imre Prof. Rozgonyi Ferenc Prof. Sas Géza Prof. Schuler Dezső Dr. Siklós Pál Prof. Szegedi Gyula Dr. Szita János Prof. Tekeres Miklós Prof. Tímár László Dr. Trestyánszky Zoltán Prof. Tulassay Tivadar Alapító: Biotest Hungaria Kft. Kiadja és a nyomdai munkáért felelős: Dursusz Bt. Szerkesztőség és levelezési cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A ISSN: Megjelenik: évente négyszer Előfizetési díj: évre 2014,- Ft + 5% áfa Tartalomjegyzék Focus Medicinae Bevezetés...2 /Introduction/ Dr. Karabélyos Csaba In memoriam Prof. Dr. Szegedi Gyula...3 Prof. Zeher Margit Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben. Quo vadis immunhematológia?...4 /Changes in the red serology during the recent 25 years. Quo vadis immunohematology?/ Dr. Nemes Nagy Zsuzsanna, Dr. Nagy Sándor Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása...12 /Blood preparation in the recent 25 years/ Dr. Baróti-Tóth Klára Az aferezis szerepe a gyógyításban...22 /The role of apheresis in the therapy/ Dr. Tremmel Anna Down szűrés a gyakorlatban...27 /Down screening in the practice/ Dr. Török Olga ACPA: citrullinált proteinek és peptidek elleni antitestek és jelentőségük a rheumatoid arthritis laboratóriumi diagnosztikájában...33 /ACPA: antibodies against citrullinated proteins and peptides and their importances in the laboratory diagnostics of rheumatoid arthritis/ Dr. Nagy Gábor 1

2 FOCUS MEDICINAE Interdiszciplinális tudományos folyóírat Focus Medicinae Tisztelt Olvasó! 15 év egy ember esetében nagy idő, 180 hónap alatt már kis híján a csecsemő is nagykorúvá cseperedik. A Biotest Hungaria Kft. a Dursusz Kiadó gondozásában 1999-ben életet adott egy kedves kisgyermeknek, akit elnevezett Focus Medicinae-nek, és amely azóta is töretlen lelkesedéssel szolgálja a tudományt és ontja a szakmai publikációkat különféle immunológiai témakörökben. Eleinte immunglobulinokkal tarkított sötétkék burkolatát keresték az érdeklődők, majd néhány éve cégünk arculatához igazodva négy évszakra színezett fehér külsőt adtunk a lapnak. Idén 2013-at írunk, jövőre a 15. életévünkbe lépünk, és nem csüggedünk, hanem mindmáig lelkesen keressük az új és érdekes szakmai témákat, hogy azok segítségével kommunikációs csatornát hozhassunk létre Nyugat- és Kelet-Magyarország valamint Észak és Dél között. Tapasztalataink alapján Olvasóink szívesen fogadják a kiadványt, és néha több kiadványon keresztüli eszmecserékkel tarkítják a színvonalat. Hirtelen elhatározástól vezérelve eme nevezetes születésnapon úgy gondoltuk, hogy segítséget kérünk a Biotest Hungaria Kft. életében szerepet játszó legfontosabb szakterületek prominens művelőitől, és az ő összefoglaló jellegű publikációival szerettük volna emlékezetessé tenni az elkövetkező 3 kiadványt. Az első jubileumi számban, azaz a jelen folyóiratban a klinikai és a preparatív transzfuziológia összefoglaló közleményei valamint a laboratóriumi diagnosztika két nagyon aktuális témája kaptak helyet. Az első két összefoglalóban szakmai és üzleti életünk egyik legfontosabb partnere, az Országos Vérellátó Szolgálat szakembereinek tollából betekintést nyerhetünk az immunhematológia elmúlt 25 évének módszertani változásaiba valamint az előző negyed század vérkészítmény-előállító eljárásainak fejlődésébe. Szintén egy emberöltőnyi pályafutása van az aferezises terápiának, erről ad egy remek összefoglalást a következő publikáció. Ezt követi napjaink egyik slágertémája, a Down-szűrés diagnosztikájának bemutatása, valamint egy sajnálatos módon egyre többször feltűnő nemkívánatos vendég, az autoantitestek által okozott rheumatoid arthritis történeti, genetikai, diagnosztikai és terápiás áttekintése. Őszintén reméljük, hogy ez, valamint az ezt követő másik két jubileumi szám (Immunterápia, illetve Mikrobiológiai diagnosztika) is el fogja nyerni Kedves Olvasóink tetszését, és ugyanolyan lelkesedéssel fogják forgatni gyermekünk izgalmas lapjait a jövőben is, mint azt eddig tették. Dr. Karabélyos Csaba ÚTMUTATÓ SZERZŐINKNEK: A folyóiratban eredeti áttekintő jellegű közleményeket, valamint folyóiratreferátumokat jelentetünk meg. A kézirattal kapcsolatos formai követelmények (eredeti és áttekintő /review/ jellegű közlemények) a következők: A kézirat sorrendje: magyar nyelv cím, szerzővel, intézettel együtt magyar nyelvű absztrakt magyar kulcsszavak angol nyelvű absztrakt angol kulcsszavak szöveg (csak magyarul) irodalomjegyzék (max. 30) táblázat(ok) ábrá(k), ábrajegyzék Cím: a szerzők a munkahelyük megjelölésével szerepeljenek a közlemény címét követően. Absztrakt: maximálisan 1 oldal terjedelmű legyen, az absztraktok esetén bekezdéseket ne használjunk, folyamatosan történjen a gépelés. Kulcsszavak: 5-10 jellemző kulcsszót emeljünk ki a szöveg elé, mindkét nyelven. Szöveg: (az itt felsorolt követelmények természetesen az absztraktra is vonatkoznak) 1 oldal: sor 1 sor: 70 leütés Betűtípus: Arial, normál 12-es méretű, (a szöveg, amennyiben lehetséges Windows XP vagy újabb változatban készüljön). Maximális oldalszám: 10 (esetenként ettől eltérés lehet a szerkesz tőbizottság döntése alapján), kívánt oldalszám: 6-8 oldal (A/4). Helyesírás: ahol lehet, magyar kifejezéseket és magyaros írásmódot használjunk. Irodalomjegyzék: a hivatkozások száma ne haladja meg a 30-at, a szövegben az adott bekezdés végén levő, dőlt, zárójelbe tett szám jelezze a citált publikációt, az irodalomjegyzék első szerző szerinti ABC-rendben készüljön. Formai kérések: 1. Szerzők megjelölése dőlt betűvel (elől családnév, utána keresztnév első betűje ponttal zárva). 3-nál több szerző esetén az első három szerző után et al.: álljon. 2. A cikk teljes címe 3. A folyóirat hivatalos rövidítése (pl. N. Engl.J.Med.), kötetszáma és oldalszáma, majd legvégül az évszám (pl. 73(1), , 1986) Táblázat(ok): a táblázatok Windows XP vagy újabb verzióval készüljenek, és legyenek címmel ellátva. Ábrá(k): színes ábrákat és fotókat nem áll módunkban leközölni, az esetleges színes ábrák fekete-fehér kópiában jelennek meg. Folyóiratreferátumok: Ezek esetében csak a referáló nevét és a forrást kell feltüntetni, (felül magyarra fordított cím, alatta a forrás pontos adatai, alul a referáló neve). A folyóirat-referátum a két gépelt oldal ter jedelmet ne haladja meg, az előbbiekben valamint az eredeti közleményeknél említett követelmények megtartása mellett. Kérjük a szerzőket, hogy a cikkeket -en adják le szer kesztőségünknek, és amennyiben mód van rá, kinyomtatott formában is juttassák el azt a Biotest Hungaria Kft. irodájába. Cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A biotest@biotest.hu vagy karabelyos.csaba@biotest.hu 2

3 Focus Medicinae In memoriam Nagy veszteség érte a magyar tudományt, belgyógyászatot és klinikai immunológiát, mert október 30-án eltávozott az élők sorából Szegedi Gyula akadémikus úr. Mint tanítványa, és a DE OEC Belgyógyászati Intézet III. sz. Belgyógyászati Klinikájának orvos-szakmai igazgatója szeretném méltatni professzor úr kihívásokban és sikerekben egyaránt gazdag pályafutását. Szegedi professzor úr immunológia iránti érdeklődését tanítómestere, Dr. Petrányi Gyula egyetemi tanár keltette fel, aki hazánkban először kezdett el mélyrehatóan foglalkozni az akkor még kollagén-betegség -nek nevezett betegségcsoporttal ben nyílt arra lehetőség, hogy kezdetben a Tüdőgyógyászati Klinika Általános Belgyógyászati Osztályként, majd önálló III. számú Belklinikaként jöjjön létre egy olyan klinika, ahol az integratív belgyógyászat megtartása mellett már a specializálódás igénye is domináns volt. Klinikánk alapítója és első igazgatója Szegedi Gyula professzor úr volt, aki áldozatos munkáját 26 éven keresztül végezte. Klinikánk története klasszikus példája a fejlesztő, alkotó, mindig újító, megújuló, a lehetőségeket megteremteni tudó szellemiségre. Szegedi professzor úr tevékenységeit mindig a következetesség, a fegyelem, a teljesítmény orientáltság és a sportszerű sikeresség jellemezte. A klinikai immunológia az orvostudomány nagyon fiatal területe volt Szegedi professzor úr pályájának kezdetén. Hatalmas erőt fektetett abba, hogy a kezdetben romos épületben működő belgyógyászati osztályból a kor színvonalánál mindig egy kicsit jobb szintű, modern szemléletű, nagyon sok jól képzett munkatársat kibocsátó klinikát hozzon létre. Hosszú évek kitartó munkájának eredményeként mind regionális, mind országos és nemzetközi kitekintésben a klinikai immunológia fellegvárát alakította ki. Az új profilok dinamikus bevezetésével a klinikán immun-hematológiai, rheumatológiai, intenzív terápiás- és angiológiai, valamint geriátriai tanszékek és részlegek alakultak ki. Professzor úr intenzív kutatásokat végzett a Klinikai Immunológián belül a poliszisztémás autoimmun betegségek területén. E betegségek előfázisában, a nem differenciált collagenosisban leírt megfigyelései nemzetközileg is nagy jelentőségűek. A Magyar Tudományos Akadémia levelező tagjává 1995-ben, majd rendes tagjává 2001-ben választották. Szegedi professzor úr megszervezte az autoimmun betegek speciális gondozását, ami nagyban hozzájárult ahhoz, hogy a magyarországi poliszisztémás autoimmun betegek életkilátásai elérik a legfejlettebb államokban tapasztaltakat. Kutatócsoportja aktív hazai és nemzetközi együttműködést épített ki, eredményes munkánkat széles körben ismerik, és nagyra értékelik. Prof. Dr. Szegedi Gyula akadémikus ( ) Professzor úr széleskörű tevékenységét arra az alaptételre építette, miszerint kutatás nélkül nincs egyetemi színvonalú oktatás és gyógyítás. Iskolateremtő, intézetvezetői tevékenysége alatt 25 munkatársa szerzett kandidátusi vagy Ph.D fokozatot, 12-en lettek az MTA doktorai, 10 tanítványa egyetemi tanár, 5 munkatársa főorvosként dolgozik, további 5 kolléga külföldön folytat sikeres kutatómunkát. Azt vallotta: ahogy egy jó focicsapatban az utánpótlás jó játékosai a hosszútávú sikerek biztosítékai, úgy a klinikai csapatba is már a tehetséges egyetemistákat, tudományos diákkörösöket nyerte meg. Vonzóvá tette számukra a klinikát azzal, hogy viszonylag fiatal életkorban önálló tevékenységet biztosított számukra emelve ezzel szakmai presztízsüket. A fiatalnak mondható klinikán nagyon szerencsés korösszetételű csapat dolgozott, és ma is törekszünk erre. Szegedi professzor úrnak bőven jutott energiája arra, hogy számos rangos szakmai testületben aktívan tevékenykedjen. A teljesség igénye nélkül kiemelném a DOTE oktatási majd klinikai rektor-helyettesi feladatát, a DE OEC Klinikai Kutatások Doktori Iskolájának vezetését, a szakmai kollégiumi és az MTA Klinikai I. Tudományos Bizottság elnöki funkcióját, de a felsorolást még sokáig lehetne folytatni. A klinikai immunológia művelése, oktatása területén végzett iskolateremtő tevékenységéért, nemzetközileg is elismert tudományos, gyógyító és oktató munkásságáért 2002-ben a Magyar Köztársaság érdemrend tiszti keresztjével majd 2006-ban Széchenyi-díjjal tüntették ki. Váratlan és súlyos megbetegedését hatalmas önfegyelemmel és élni akarással viselte. Szellemi aktivitása az utolsó napokig széles körű, hibátlan és eleven volt. Bölcs figyelemmel, megértéssel, megfontoltan, de szókimondóan követte a körülötte zajló klinikai és országos eseményeket. Kedves Professzor Úr! Ígérem, társaimmal ígérjük, megőrizzük a fontos tanításokat, a jó és nagyszerű példákat, a sok-sok útmutatást! Végül Paulo Coelho egy idézetével szeretnék búcsúzni, mely tömörségében és megállapításaiban úgy érzem, hogy tökéletesen jellemzi Professzor úr életútját: Mi ez az erő, amely messzire vezet a megszokott világ kényelmétől, és rávesz, hogy inkább vállaljuk a kihívások seregét, noha tudjuk, hogy e világ dicsősége múlandó? Úgy hiszem, hogy ezt az ösztönző erőt úgy hívják, az élet értelmének keresése. Debrecen, november 29. Prof. Dr. Zeher Margit MTA doktora tanszékvezető egyetemi tanár, orvos-szakmai igazgató DE OEC Klinikai Immunológia Tanszék Belgyógyászati Intézet ESZK Immunológiai és Allergológiai Tagozat Elnöke 3

4 Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben. Quo vadis immunhematológia? Dr. Nemes Nagy Zsuzsanna, Dr. Nagy Sándor Országos Vérellátó Szolgálat, Budapest Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben... Összefoglalás: A transzfúziók sikerét vércsoport-szerológiai kompatibilitás vizsgálatok biztosítják. A kompatibilitási vizsgálatok hagyományos módszertana a hemagglutináció, amely a vércsoport antigéneket, antitesteket és azok reakcióit mutatja ki. Az utóbbi évtizedekben a hemagglutinációs módszerekben jelentős változások következtek be (LISS, proteolitikus enzim technika, oszlop agglutináció, szolid fázis módszer, automatizáció). E beszámoló összefoglalja az immunhematológiai módszerek változásait a 20. század utolsó éveitől napjainkig, és bemutatja a jövő figyelemre méltó technikáit (molekuláris genetikai tesztek, microarray-k). Kulcsszavak: antigén-antitest reakció, hemagglutináció, vércsoport-szerológiai kompatibilitás, immunhematológiai módszerek, molekuláris genetikai vércsoport meghatározás Summary: Successful transfusions are based on blood serological compatibility testing. Hemagglutination is the traditional methodology of compatibility procedure which detects blood group antigens, antibodies and their reactions. In the last decades there have been many significant developments of hemagglutination methods (LISS, proteolytic enzym test, column agglutination, solid phase methods, automatisation). This review summerizes the changes of immunohematological methods from the last years of 20 th century until now and shows the considerable future technics such as molecular genetic assays and microarrays. Keywords: antigen-antibody reaction, hemagglutination, blood group serological compatibility, immunohematological methods, molecular blood grouping Rövidítések AHG: anti-humán-globulin ASP: allél-specifikus primer BSA: bovin szérum-albumin DAT: direkt antiglobulin teszt (direkt Coombs-teszt) DNS: dezoxiribonukleinsav EDTA: etilén-diamin tetraecetsav ELISA: enzimhez kötött immunoszorbens módszer HTR: hemolitikus transzfúziós reakció IAT: indirekt antiglobulin teszt (indirekt Coombsteszt) LISS: alacsony ionerősségű sóoldat NAT: nukleinsav amplifikációs teszt NISS: normál (fiziológiás) ionerősségű sóoldat PBS: foszfát puffer oldat PCR: polimeráz láncreakció PEG: polietilén-glikol SNP: egy nukleotidot érintő polimorfizmus ÚHB: magzati-újszülöttkori hemolitikus betegség Bevezetés A vércsoportok vizsgálata a XX. század elején kezdődött, Karl Landsteiner munkásságával, aki egészséges emberek vörösvérsejtjeinek és vérsavójának keresztreakcióit értékelve jutott el a később AB0 vércsoportoknak nevezett tulajdonságok leírásáig. Később már tudatosan megtervezett tudományos módszerekkel, állatok immunizációjából származó immunsavókkal történt a következő néhány vércsoport-tulajdonság keresése, majd ismertetése (MN, P1, Rh, LW). Más vércsoportok felfedezése klinikai esetekhez köthető. A magzati-újszülöttkori hemolitikus betegségekben (ÚHB) megjelenő vércsoport-specifikus antitestekkel (anti-d, anti-k, anti-jk a ), vagy transzfúziókat követő, hemolitikus transzfúziós reakciók (HTR) kapcsán kimutatott antitestekkel (anti-c, anti-e, anti-fy a ) újabb vércsoport-tulajdonságokat, vércsoport antigéneket lehetett meghatározni és azonosítani (9). Érdekes tény, hogy a klinikailag jelentős, legfontosabb vércsoport-rendszerek felfedezése a vércsoport-szerológiai technikák fejlesztése előtt, úgynevezett direkt agglutinációs módszerekkel valósult meg. Ezt az elsőként meghatározott antigének szénhidrát tulajdonsága (AB0, MN), valamint az érintett antitestek immunglobulin osztálya (IgM) tette lehetővé től Coombs és munkatársai által bevezetett indirekt antiglobulin teszt (IAT) alkalmazása a vörösvérsejt-szerológiában forradalmasította a vércsoportokkal összefüggő ismereteket. Ez a módszer főleg az IgG immunglobulin osztályhoz tartozó antitesteket és azok reakcióit mutatja ki. Az IAT számos új vércsoport tulajdonság felfedezéséhez vezetett, és a későbbiekben napjainkig meghatározza az immunhematológiai gyakorlatot. A transzfúziók biztonsága szempontjából legfontosabb vércsoport-rendszerek antigénjeinek és antitestjeinek felfedezése az 1950-es évekig megtörtént. Ez lehetővé tette, hogy a transzfúziók a mindennapi klinikai gyakorlat részévé váljanak. A transzfúziós gyakorlat bővülése újabb és újabb vércsoport antitestek megismerését hozta, melynek kapcsán egyre újabb vércsoport antigének létére derült fény. Az 1990-es évek elejéig az új vércsoport tulajdonságokat főként hemagglutinációs technikákkal határozták meg (a vércsoportok fenotípusának vizsgálata), míg az expresszált vércsoport tulajdonságot meghatározó 4

5 genetikai háttérre, a lehetséges, valószínű allélekre (genotípus) spekulatív úton következtettek. Napjainkban a molekuláris DNS technikákkal a vércsoport tulajdonság genotípusa is meghatározható, melyből az adott allélekhez tartozó fenotípus kikövetkeztethető (a csendes gének, és egyéb eltérések nem mindig teszik lehetővé a genotípus-fenotípus egyértelmű megfeleltetésének lehetőségét). A genetikai vércsoport meghatározás a vércsoportok vizsgálatában egyre nagyobb teret követel magának, mostanra a tudományos közlemények aránya a hagyományos technikákkal szemben a molekuláris technikák irányába tolódott el (38). Fontos azonban tudni, hogy a transzfúziók biztonságát, a vércsoport-rendszerek immunizáló hatásának kimutatását szolgáló rutin laboratóriumi vizsgálatok napjainkban is a hagyományos, egyszerű, megbízható, jól reprodukálható hemagglutinációs módszerekkel történnek, melyeket a hazai és a nemzetközi klinikai transzfúziós gyakorlat arany standardként tart számon (1). Előreláthatóan ez még hosszú évekig szolgálja a biztonságos immunhematológiai gyakorlatot. Hemagglutináción alapuló módszerek Mottó: A vércsoportokról szerzett ismereteink nagy részét egyszerű agglutinációs vizsgálatoknak köszönhetjük. Ismert antitest tartalmú szérumot adunk sós vörösvérsejt szuszpenzióhoz. Amennyiben a sejtek hordozzák a megfelelő antigént, agglutinálódnak; a hiányzó agglutinációból pedig a megfelelő antigén hiányára lehet következtetni. (R.R. Race és R. Sanger 1950) (1). Általános vonatkozások A hagyományos vércsoport szerológiai módszerek antigén-antitest reakciókon alapulnak. A vércsoport tulajdonság meghatározása során ismeretlen antigén tulajdonságú vörösvérsejtek vizsgálata történik ismert specificitású antitestet tartalmazó reagensekkel. A vércsoport specifikus antitestek keresése a vérmintákból meghatározott vércsoportú, több antigén szempontjából ismert, tipizált teszt-vörösvérsejtekkel történik. A vörösvérsejtekhez köthető antigén-antitest reakciók laboratóriumi rendszerekben hemagglutinációt vagy a vörösvérsejtek szenzitizációját okozzák. A hemagglutináció két lépésben zajlik. Először a megfelelő specificitású antitestek a vörösvérsejt felszínén lévő antigénekre kötődnek, immunkomplexek alakulnak ki. Ez a rendkívül gyorsan zajló folyamat a szenzitizálódás. Ezt követően optimális körülmények között a fedett vörösvérsejtek között kapcsolat, kötődés, jön létre, összecsapzódnak, látható agglutinátumot képeznek. Direkt agglutináció esetén a fenti két fázis látható eredményt ad, minden külső segítség nélkül, melyben a Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben... résztvevő antitestek többnyire IgM osztályú, nagyméretű immunglobulin molekulák. Ezek méretük miatt képesek hidat képezni a negatív töltéssel rendelkező, egymást taszító vörösvérsejtek között. Indirekt agglutináció esetén a folyamat a szenzitizálódás fázisban megreked, az antigén-antitest kötődés nem válik láthatóvá. Ilyenkor a vörösvérsejtek felszínét általában kisméretű IgG molekulák fedik. Ezek nem tudják áthidalni a vörösvérsejtek közötti távolságot. A direkt vagy az indirekt agglutináció létrejöttét alapvetően a vörösvérsejtek elektronegatív töltése, a zéta potenciál, az antigének fiziko-kémiai tulajdonságai, valamint az antitestek immunglobulin osztálya határozza meg. Bizonyos feltételek biztosításával a sejtek negatív töltésének csökkentésével, áthidaló segédmolekulák alkalmazásával a szenzitizáció is kimutathatóvá válik. A hemagglutinációt meghatározó tényezők és alkalmazásukban bekövetkezett változások Vérminta Az antigén-antitest reakciók kimutatásának sikere a megfelelő vérmintával kezdődik. A vizsgálatokhoz minőségileg és mennyiségileg megfelelő vérminta szükséges. A vérminta a klasszikus vércsoport vizsgálatokban natív, alvadásban nem gátolt, melyben a véralvadás tökéletesen befejeződött a vizsgálat idejére. Az alvadás közben frissen keletkező fibrin az agglutináció értékelését zavarja. EDTA-val vagy nátrium-citráttal alvadásgátolt vérminták használata az elmúlt negyedszázadban egyre inkább előtérbe került, használatuk napjainkban hazai és nemzetközi vonatkozásban is általános. Ennek alapvető oka az, hogy a vércsoport-szerológiában egyre szélesebb körben elterjedő automatizált módszerekhez ilyen vérminták szükségesek. EDTA alkalmazása esetén számolni kell azzal, hogy a kalcium ionok felhasználásával kelát-képződés indul meg a vérmintában, amely a komplementkötő antitestek kimutathatóságát csökkenti (42). A vizsgálatok sikerességét a vérminta kora is befolyásolja. A vércsoport-szerológiai reakciókhoz friss, 24 órán belüli vérminta a legmegfelelőbb. Hűtőben tárolt vérmintát 72 óráig lehet vizsgálni, de az idő múlásával számolni kell az antitestek kimutathatóságának csökkenésével (29,35). Vércsoport-szerológiai vizsgálatokhoz csak az eljárási rendek szerint megfelelően azonosított vérminta használható (22,35). Reagensek, tesztsejtek, oldatok Specifikus antitesteket tartalmazó reagensek Poliklonális (humán vagy állati szérumok), vagy monoklonális (humán vagy állati sejtvonalakból származó) antitestek használhatók (29,42). 5

6 Az utóbbi negyed században elterjedtek mind a nemzetközi, mind a hazai gyakorlatban az akkreditált laboratóriumi körülmények között, ipari mennyiségben előállítható, magas titerű, jól standardizálható, állandó minőséget biztosító, kereskedelmi forgalomban kapható monoklonális antitestek (13,29,35). A napi rutin gyakorlatból szinte teljesen kiszorították az emberi vérből előállított, változó mennyiségű antitestet tartalmazó poliklonális reagenseket. A monoklonális antitestek / antitest keverékek alkalmazása esetén számolni kell azzal, hogy ezek az antitestek az érintett antigénnek csak meghatározott epitópjával, epitópjaival reagálnak, nem pedig az összessel. A szerológiai vizsgálatok biztonságát szolgálják, hogy a 80-as évektől a legfontosabb reagenseket színkóddal látják el. Az anti-a reagensek kék, az anti-b reagensek sárga színűek. A színt pontosan meghatározott fajta festékek hozzáadásával érik el a reagensek gyártása során (13,35). A színes antitestek alkalmazásakor látható, hogy a reagens bemérése a vizsgálati mintához megtörtént. Az AB0 vércsoport meghatározáshoz a nemzetközi gyakorlat (13,35) anti-a és anti-b monoklonális reagensek, míg a hazai gyakorlat anti-a, anti-b és anti-ab reagensek alkalmazását írja elő a gyenge vércsoport tulajdonságok kimutatása érdekében (26). Az RhD meghatározáshoz két monoklonális anti-d reagens szükséges (25,26,28). Tesztsejtek, tesztsejt-készletek Az AB0 vércsoport meghatározáshoz, antitestszűréshez, antitest-azonosításhoz, pozitív és negatív kontroll vizsgálatokhoz tesztsejt reagensek használatosak. Az állandó minőség biztosításához ajánlott a kereskedelmi forgalomban kapható, szakmai szempontok alapján standardizált tesztsejt-készlet alkalmazása. Ez az elv a nemzetközi gyakorlatban már a 80-as években általános volt (13,35), a hazai gyakorlatban pedig negyedszázad alatt egyre erősödő kívánalommá vált. A kereskedelmi forgalomban kapható AB0-tesztsejt, antitestszűrő, és antitest-azonosító panelsejt sorozatok a hazai napi rutin gyakorlatból teljesen kiszorították a helyi laboratóriumokban előállított változó minőségű tesztsejt készítményeket. AB0 tesztsejt-készlet Az AB0 vércsoport meghatározás részeként az AB0-antitestek kimutatásához legalább A 1 és B tulajdonságú sejtet kell használni (13,29,35). A hazai gyakorlat a négy tagból álló AB0 tesztsejt-készlet alkalmazását írja elő, amely A 1, A 2, B, 0 vércsoportú tesztsejteket tartalmaz (26). Ez az AB0 vércsoport meghatározás fokozott biztonságát szolgálja, melyben a gyenge A tulajdonságú sejt, a 0 tulajdonságú sejttel együtt lehetővé teszi bizonyos irreguláris antitestek kimutatását. A 0 tulajdonságú sejt a vizsgálat negatív kontrolljául is szolgál. Az AB0 tesztsejt-készlet összetételére vonatkozó hazai szabályozás nem változott az elmúlt negyedszázad során. Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben... Antitestszűrő tesztsejt-készlet Az ellenanyagszűréshez olyan 2-3 tagú készletet kell használni, amely 0 vércsoportú, klinikailag jelentős vércsoport-rendszerek egyes antigénjeire tipizált, azokat homozigóta formában tartalmazó, egyedi donoroktól származó tesztsejtekből áll (13,29,35). Antitest-azonosító tesztpanel sor Az ellenanyag-azonosításhoz több, általában 8-16 tagból álló, 0 vércsoportú, klinikailag jelentős vércsoport-rendszerek egyes antigénjeit homozigóta és heterozigóta formában is tartalmazó tesztsejt-készletet kell használni, melynek tagjai egyedi donoroktól származnak (13,29,35). Oldatok, érzékenyítő adalékok, segédantitestek Kereskedelmi forgalomban kapható oldatok használatát kell előtérbe helyezni a helyi laboratóriumokban készítettek helyett. Ez a kívánalom a hazai gyakorlatban mára általánossá vált. Fiziológiás sóoldat Vörösvérsejt szuszpenziók készítésére, sejtmosásra használhatók, úgynevezett normális ionerősségű oldatok (NISS). A reakciókhoz szükséges megfelelő ph-t különböző puffer-rendszerekkel lehet biztosítani (42). Általánosan elterjedt a foszfát pufferek (PBS) alkalmazása. Alacsony ionerősségű oldat (LISS) A fiziológiásnál kevesebb iont tartalmazó közegben az antigén-antitest kötődés gyorsul, a reakcióidő lerövidül. A LISS oldatok hazai használata a 80-as években már elkezdődött, alkalmazásuk jelenleg a napi rutin elengedhetetlen része (56). Makromolekulák A vörösvérsejtek negatív töltésének, a zéta potenciálnak a csökkentésével teszik lehetővé az agglutináció kialakulását. A bovin szérum-albumin (BSA) oldatok az egyes poliklonális reagensek hatásnövelő alkotórészei voltak. Lemez technikák alkalmazásakor használatuk a 80-as években előírásszerűen történt. A poliklonális reagensek háttérbe szorulásával, a vércsoport-szerológiai rutin technikák változásával hazai alkalmazása napjainkra gyakorlatilag megszűnt. A polietilén-glikol (PEG) és polybrene érzékenyítő oldatok rutin használata Magyarországon sosem terjedt el a napi gyakorlatban. Ezeket az oldatokat a nemzetközi laboratóriumokban széleskörűen alkalmazták, használatuk napjainkban már nem általános (13,29,35). Proteolitikus enzimek A proteolitikus enzimek a vörösvérsejtek felszínéről sziálsav maradékot lehasítva, csökkentik a sejtek negatív töltését, ezáltal lehetővé teszik az agglutináció kialakulását. Segítik egyes antigének felszínre kerülését 6

7 (Rh, Jk), így az antitestek könnyebben kötődnek hozzájuk. Más molekulákat eltűntetnek a sejtről (Fy, M, N, S), ezért ezek enzim technikákkal nem vizsgálhatók. A papain, a bromelin, a ficin valamint a tripszin, a kimotripszin és a neuraminidáz alkalmazása a múlt század utolsó két évtizedében széleskörű és általános volt a vércsoport-szerológia minden területén (13,29,35,49). Magyarországon elsősorban a papain és a bromelin terjedt el. Jelenleg az enzim technikák a nemzetközi gyakorlatban antitest azonosítások részeként, főleg referencia laboratóriumokban kerülnek alkalmazásra. Az enzimek használata nálunk is korlátozódott (24), az enzim reagensek helyi laboratóriumi előállítása megszűnt. Az enzimes ellenanyagszűrés azonban a kompatibilitási vizsgálatsorozat kötelező részét képezi (22). Az ellenanyag-azonosításban az enzim technika szintén a napi rutin része. Ehhez kereskedelmi forgalomban kapható, enzimkezelt sejtkészleteket használnak. Anti-humán-globulinok Az anti-humán-globulin (AHG) olyan segédantitest, amely hidat képez az antitestekkel és/vagy komplement-komponensekkel fedett vörösvérsejtek között, ezáltal a vörösvérsejtek szenzitizációja láthatóvá válik (42). Az AHG-t klasszikusan állatokban (kecske, nyúl) termeltették emberi immunglobulinok Fc része ellen. Jelenleg poliklonális (állati szérumok), vagy monoklonális (állati sejtvonalakból származó) antitestet/ antitest keveréket tartalmazó AHG reagensek használhatók. Napjaikban az AHG segédantitestek körében is a monoklonális reagensek dominálnak. Az AHG reagensek lehetnek polispecifikusak vagy monospecifikusak. A polispecifikus reagensek anti-igg-t és anti-c3-t tartalmaznak. A monospecifikus reagensek közül leginkább az anti-igg használata a jellemző. Vannak egyéb immunglobulin osztály illetve alosztály specifikus AHG-k is. A hazai gyakorlatban a rutin AHG technikákhoz a polispecifikus reagensek használata ajánlott. AHG reagensek zöld színűek, a színt pontosan meghatározott fajta festékek hozzáadásával érik el a reagensek gyártása során (13,35). A reagenseket a direkt antiglobulin technikához (DAT, direkt Coombs-teszt), vagy az indirekt antiglobulin technikához (IAT, indirekt Coombs-teszt) használják. A DAT a vörösvérsejtek in vivo fedettségét vizsgálja. Az IAT során a savóból/plazmából antitestek, a vörösvérsejtek felszínéről antigének kimutatása lehetséges. Az AHG-k és a hozzájuk kapcsolódó technikák használata az elmúlt negyedszázadban általánosan elterjedt, napjainkban is ajánlottak mind a hazai, mind a nemzetközi napi rutin gyakorlatban. Az IAT alkalmazása ellenanyagszűréskor és azonosításkor, valamint laboratóriumi keresztpróbák végzésekor általános követelmény (8,13,29,35). Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben... Vércsoport szerológiai módszerek és alkalmazásukban bekövetkezett változások Lemez technika Egyszerű, könnyen kivitelezhető, klasszikusan sós közegű antigén-antitest vizsgálatokra kidolgozott módszer. Direkt agglutinációk kimutatására a legalkalmasabb. A vércsoport-szerológiai vizsgálatok kezdeteitől, de még a 80-as években is széles körben alkalmazott technika volt, bár már abban az időben a csöves metodikák kezdték kiszorítani. Mivel nem automatizálható, és viszonylag nagy minta- és reagens-igényű, ezért az alkalmazási területe egyre szűkül, de még ma is van létjogosultsága (23). Direkt agglutináló, IgM reagensek használatával elsősorban AB0 és RhD vércsoport meghatározásra, és egyéb antigének vizsgálatára, és speciális betegcsoportoknál használható. Az automata rendszerekkel történő antigén vizsgálatok diszkrepanciájának tisztázásakor is hasznos vizsgálati technika lehet. Csöves technika A csöves technikák során az agglutinációs reakciót centrifugálással teszik érzékenyebbé, illetve láthatóvá. A technika többféle hőmérsékleten végezhető, többféle közeggel, és érzékenyítő módszerrel kombinálható. A csöves módszerek alkalmazása hozzáértést és pontosságot igényel (29). Hideg típusú antitestek vizsgálatakor szobahőmérséklet (20-22 o C), de ennél hidegebb inkubációs hőmérséklet is választható. Meleg típusú antitestek esetén a vizsgálatokat 37 o C-on végzik. A sós közegű csöves technikák alkalmazásakor az inkubációs idő perc. A LISS oldat az inkubációs időt percre rövidíti, az antitestek kötődését gyorsítja. Enzimek alkalmazásakor egy- vagy kétfázisú enzimkezelésre nyílik lehetőség. AHG reagenssel csőben DAT és IAT vizsgálatok is elvégezhetők (31,12). A csöves technikákban az érzékenyítő módszerek egymással kombinálhatók. Különösen a kombinált enzim-technikáknál fordul elő, hogy a vizsgálat túlérzékennyé válik, és álpozitív reakciók jelennek meg. Az AHG tesztek alkalmazásakor kritikus pont a sejtek mosása, a kötetlen antitestek eltávolítása. Ehhez automata sejtmosókat használnak. A mosás hatékonyságát a folyamat végén kontrollálni szükséges (29,32). A csöves technikák széles körben elterjedtek a mindennapi vércsoport-szerológiai gyakorlatban. Megfelelő érzékenységet mutatnak vércsoport vizsgálatok, ellenanyag kimutatások területén. A kilencvenes években a nemzetközi és hazai gyakorlat alaptechnikájának számítottak. Napjainkban AB0, RhD vércsoport vizsgálatokban, antigén meghatározásokban, ellenanyag-azonosítási eljárásokban, antitest-titrálások esetén is létjogosultságuk van (56). 7

8 A microplate, a szolid fázis és az oszlop agglutinációs módszerek előretörésével az alkalmazási területük szűkül. Csöves módszerekre fél- és teljes automata rendszereket is kifejlesztettek (16,55), ezeknek elsősorban hazai alkalmazása történik. Microplate technika Folyékony vagy szolid fázis technikák, amelyekben az antigén-antitest reakció 96 lyukú microplate U vagy V alakú csövecskéiben vagy azok falához kötve játszódik le. A folyékony fázisú eljárásokban a microplate-k beszárított reagenseket tartalmazhatnak. A szolid fázisú technikák esetén a csövecskék aljához vörösvérsejt membrán darabok, vagy antitestek vannak kötve. A szerológiai reakció ezek felületén zajlik (30). A vizsgálatok IAT-tel és enzim-technikával is kombinálhatók. A módszernek kicsi a reagens igénye, és jól automatizálható (47). A folyékony fázis technika AB0, RhD vércsoport vizsgálatra, C, c, E, e, K antigének rutin meghatározására alkalmas, a szolid fázis technikát a fentieken kívül ellenanyag vizsgálatokra is alkalmazzák (55). A technika nagy mennyiségű minta egyidejű vizsgálatát is lehetővé teszi. Teljes és félautomata rendszerekben is alkalmazható, automatizált platformok egyik lehetséges vizsgálati technikája. Napjainkban a mindennapi rutin egyik alapmódszerének számít mind a nemzetközi, mind a hazai vércsoport szerológiai gyakorlatban (55). Oszlop agglutinációs technika Az oszlop agglutinációs módszereknél az antigén-antitest reakció gélt vagy üveggyöngyöket tartalmazó csövecskékben játszódik, melyek kártyához kötve helyezkednek el. A gél lehet neutrális közegű, de tartalmazhat specifikus antitesteket, valamint AHG-t is. A vizsgálatok enzim-technikával is kombinálhatók. Az antigén-antitest reakció a gél fölötti reakció kamrában játszódik. Az esetleges inkubációt követő centrifugálás után az agglutinált sejtek a gél felszínen vagy a gél mátrixban csapdába esnek, míg az agglutinálatlan sejtek a gél alján gyűlnek össze (21). A módszer kevés mintát igényel, kivitelezése és értékelése rendkívül egyszerű. Az eredmények a géloszlopban hosszú ideig stabilak maradnak, ezért az eredmények validálása később is megtörténhet. A technika érzékeny, AB0 és RhD vércsoport meghatározásra, egyéb antigén vizsgálatokra, ellenanyag-szűrésre (7) és azonosításra (18,57) és laboratóriumi keresztpróbák (33) elvégzésére is alkalmas. Kevert sejtpopulációk kimutatására optimális (29). Teljes és félautomata rendszerekben is alkalmazható, automatizált platformok egyik lehetséges vizsgálati technikája. Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben... A mikrogél technika elvét a 80-as évek végén dolgozták ki (8,21). Napjainkban a mindennapi rutin vércsoport-szerológia meghatározó módszerének számít mind a nemzetközi, mind a hazai gyakorlatban. Az antitestszűrést és azonosítást, a DAT-ot (12), az IAT alapú laboratóriumi keresztpróbát döntően ezzel a módszerrel végzik (8). A hagyományos technikák összehasonlítása Számos közlemény jelent meg (7,12,15,34,55,56), amely a különböző csöves, microplate, szolid fázis, oszlop agglutinációs technikák érzékenységével, specificitásával, összehasonlításával foglalkozik az antitestek kimutatása tekintetében. Egyetlen olyan módszer sincs, amely önmagában az összes klinikailag jelentős antitestet kimutatná (29). A technikák érzékenysége LISS-, enzim-, IAT- módszerekkel fokozható (19). Az érzékenyítő ágensek használatakor a nem specifikus reakciók értékelése gondot jelenthet. A csöves IAT technikát megfelelő érzékenységűnek ítélik a vércsoport antitestek kimutatásához, azonosításához (55). A szolid fázis és mikrogél technikák érzékenysége meghaladja a csöves technikákét az antitest kimutatások területén, de több, nem jelentős antitestet is kimutatnak. Automatizálás Elsősorban a folyékony és szolid fázisú microplate technikák valamint az oszlop agglutinációs módszerek automatizálhatók jól (39,47). Ezeket kombinálva nagy teljesítményű platformok hozhatók létre, amelyekben az AB0, RhD vércsoport meghatározást és antitestszűrést megfelelő érzékenységű módszerekkel végzik (38). A teljesen automatizált rendszereknél a mintaazonosítástól, a bemérésen, a munkafolyamatokon keresztül, a leolvasást, az eredmények értékelését is automata végzi. Az automatákkal meghatározott eredményeket felelős személy általi validálást követően a laboratóriumi informatika rendszerbe küldik, ahol az eredmények a megfelelő mintához, illetve a mintaadó személyhez rendelődnek (35,46). Nagyszámú mintát vizsgáló laboratóriumokban az automaták használata az alapvető vércsoport-szerológiai vizsgálatok tekintetében szakmai elvárás, a vizsgálatok biztonságát szolgálja (13,29,35,46). A vércsoport-szerológiai automaták használata nemzetközi és hazai viszonylatban is bekerült a napi rutinba. Nem agglutináción alapuló módszerek ELISA (enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat) A 80-as évek óta használják szabad vagy kötött vércsoport antitestek mennyiségi meghatározására a vércsoport-szerológiában. A reagens anti-igg molekula, melyhez enzimet kapcsolnak. Ezt adják fixált IgG molekulákhoz, vagy vörösvérsejtekhez kötött IgG-hez. 8

9 Az enzim szubsztrátjának hozzáadását követően fotometriás módszerrel értékelik a reakciót (29,42). Hazai alkalmazásban nem terjedt el. Áramlási citometria A 90-es évek óta alkalmazott érzékeny módszer, amely vércsoport antitestek mennyiségi meghatározására, vörösvérsejt, fehérvérsejt, thrombocyta antigének vizsgálatára, epitópok számának meghatározására is alkalmas (8,29). A vizsgálatokhoz fluoreszcens festékkel jelölt antitesteket használnak. Magyarországon hozzáférhető, de vércsoport-szerológiai rutinban elvétve alkalmazott módszer. Molekuláris genetikai módszerek A vércsoport polimorfizmusok meghatározására időnként szükség van a tulajdonságok génszintű vizsgálatára is. A genotípusból a fenotípus az esetek jelentős részében kikövetkeztethető (20). Számos vércsoport antigén egyetlen nukleotidot érintő változás, azaz SNP (single nucleotide polimorphism) következménye. Ezek vizsgálatakor az érintett SNP jelenlétét vagy hiányát mutatják ki (FY) (10,11,20). Vannak komplex vércsoport-rendszerek, ahol egy SNP vizsgálata nem elegendő, legalább polimorfizmust kell vizsgálni (AB0, RH) (11,38,43). A vércsoport polimorfizmusokat nukleinsav amplifikációs tesztekkel (NAT) vizsgálják, amelyek többnyire polimeráz láncreakción (PCR) alapulnak. A gyakorlatban a PCR amplifikációt egy adott génszakasz jelenlétének vagy hiányának igazolására végzik. A PCR kombinálható restrikciós enzim technikával, alkalmazható allél specifikus primerrel (ASP), megtörténhet a termék direkt szekvenálása, végezhető kvantitatív meghatározás is (real-time PCR) (53,58). A polimorfizmus genotípusának meghatározása hasznos lehet ÚHB veszélye esetén az apai RHD gén dózisának meghatározására, magzati DNS vizsgálatára anyai perifériás vérből, gyenge antigén tulajdonságok genetikai kimutatására (FY, RHD) (14,39), donor sejtek tipizálására ritka antigén tulajdonságokra, ha reagens nem áll rendelkezésre, politranszfundált beteg saját geno típusának meghatározására, DAT pozitivitás esetén, a beteg genotípusának vizsgálatára (10,11,38,43). A genotípus meghatározása és ezek alapján a lehetséges fenotípusok kikövetkeztetése nem tartozik a napi rutin vércsoport vizsgálatok közé, de referencia laboratóriumokban, valamint véradók vércsoport tulajdonságainak meghatározásában egyre szélesebb körben használják (54). Microarray A microarray olyan biochip módszer, melyben kisméretű üveg vagy szilikon hordozóhoz térben rendezett molekulasorozatokat kötnek. Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben... Ezekkel sok, tulajdonság szimultán vizsgálata lehetséges. A vizsgálatokhoz rendkívül kevés minta szükséges (nanoliter, pikoliter). A DNS alapú microarray-ben sok gén (40,45), a protein microarray-ben sok fehérje tulajdonság egyidejű meghatározására (48) van lehetőség. Kombinált microarray-ket is kifejlesztettek (40). Számos microarray már hozzáférhető a kereskedelmi forgalomban. Hazai alkalmazására az immunhematológiában még nem került sor. Összefoglalás Az immunhematológiai vizsgálatok a transzfúziók biztonságát szolgálják. Az AB0 és RhD vércsoport meghatározások, az antitest kimutatások, a laboratóriumi keresztpróbák elvégzése területén a laboratóriumi vizsgálatokra és transzfúziókra vonatkozó eljárásrendekre kell hagyatkozni (22,25,26,27). A vércsoport-szerológiában a napi rutin vizsgálatok alapelve napjainkban a hemagglutináció, amely az antigén-antitest reakciók alapján a vörösvérsejt antigének fenotípusának meghatározására alkalmas. Hemagglutináció elvén alapuló módszerekkel végezzük a kompatibilitási vizsgálatsor minden elemét. Az AB0 és RhD vércsoportok meghatározásakor a lehető legbiztonságosabb technikákat kell alkalmazni, kompromisszumok ebben a tekintetben nem vállalhatók. A vizsgálatokhoz eljárásrendekben meghatározott reagenseket kell használni. Az ellenanyagszűrésnél a hazai gyakorlatban enzimes és IAT módszerek előírtak (22). Az enzim technika alkalmazása lehetővé teszi a korai antitestek, és a csak enzimben reagáló, többnyire Rh rendszerhez tartozóantitestek kimutatását is. Az ellenanyag-azonosításnál esetenként több, különböző technika alkalmazása is szükségessé válik. Nagyszámú minta esetén a biztonságot fokozza a vizsgálatok automatizációja (13,29,35,46). A jövő lehetőségei Az immunhematológiai vizsgálatok területén mind a hagyományos, mind a molekuláris technikák területén vannak kiszámítható tendenciák (38). Számítani lehet az automatizált platformok kiterjesztésére AB0/RhD tulajdonságok, kiterjesztett fenotipizálás és az ellenanyag vizsgálatok területén a donoroknál és a betegeknél egyaránt. Újabb, hatékonyabb monoklonális antitestek (humán, murin) kerülhetnek bevezetésre. A vércsoport-szerológiában antigén meghatározásokra rekombináns immunglobulinszerű fragmentumok alkalmazása is lehetségessé válik (44). Az ellenanyag-azonosítások során továbbra is szükség lesz több, nagy érzékenységű módszer egyidejű alkalmazására. 9

10 Az antitestek kimutatásának biztonságát szolgálja a jövőben a genetikailag tesztelt panelsejtek alkalmazása, bizonyítottan homozigóta sejtekkel (RHD, FY). Számítani lehet a molekuláris genetikai technikák, és a microarray-k erőteljes fejlődésére. Ezek széleskörű elterjedésének gyakorlati hasznossági, valamint gazdaságossági megfontolások gátat szabnak. Összefoglalva elmondható, hogy a mindennapok vércsoport-szerológiai vizsgálataiban az alapreakció továbbra is a hemagglutináció marad, melyben új módszerek, reagensek is helyet kapnak (1,17,38). Irodalomjegyzék 1. Anstee D.J.: Goodbye to agglutination and all that? Transfusion, 45, , AuBuchon J.P., de Wildt-Eggen J., Dumont L.J.: Reducing the variation in performance of antibody titration. Vox Sang., 95, 57-65, Bognárné S. É., Csernus Z.: Azonosított irreguláris ellenanyagok számának változása az alkalmazott módszerek korszerűsödésével. Transzfúzió, 2, 44-47, Cartron J.P.: Blood groups: genetics and physiology. ISBT Science Series, 5, 27-45, Chaffin J.: Pretransfusion Testing. Basic Immunohemat., Part 2, 1-18, Chapman J.F., Elliott C., Knowles M. et al.: Guidelines for compatibility procedures in blood transfusion laboratories. Transf. Med., 14, 59-73, Cid J., Noguès-Montero R., Hurtado M. et al.: Comparison of three microtube column agglutination systems for antibody screening: DG Gel, DiaMed-ID and Ortho Bio Vue. Transf. Med., 16, , Daniels G., Bromilow I.: Essential Guide to Blood Groups, 1-100, Daniels G., Reid ME.: Blood groups: the past 50 years. Transfusion, 50, , Daniels G.: Blood grouping by molecular genetics. ISBT Science Series, 6, , Daniels G.: Molecular blood grouping. Vox Sang., 87, S63-S66, Dittmar K., Procter J.L., Cipolone K. et al.: Comparison of DATs using traditional tube agglutination to gel column and affinity column procedures. Transfusion, 41, , Downes K.A., Shulman I.A.: Pretransfusion Testing. Technical Manual 16th edition, 15, , Engelfriet C.P., Reesink H.W.: Testing for weak D. Vox Sang., 90, , Finck R., Lui-Deguzman C., Teng S.M. et al.: Comparison of a gel microcolumn assay with the conventional tube test for red blood cell alloantibody titration. Transfusion, 53, , Friss Á.: Vizsgálatok Sedisoft sejtmosó és agglutináció-értékelő automatával. Transzfúzió, 4, , Garratty G.: Where are we, and where are we going with DNA-based approches in immunohematology? Is serology finished? Transfusion, 47, 1S-2S, 2007 Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben Greco Victoria A., Byrne K.M., Procter J.L. et al.: Detection of antibodies in acid eluates with the gel microcolumn assay. Transfusion, 42, , Grey D., Connolly M., Erber W.N.: Comparison of low ionic diluents for use with the Diamed antiglobulin gel test. Transf. Med.,12, 63-69, Hashmi G.: Red blood cell antigen phenotype by DNA analysis. Transfusion, 47, S60-S63, Hitzler W., Schömig-Breckner H., Mathias D.: Gel Centrifugation Test a New Micro Method for Blood Group Typing and Antibody Screening. Das Ärztliche Laboratorium, 35, 89-92, Hoffer I. (sorozatszerk): Transzfúziós Szabályzat. OVSz Módszertani levele 2. kiadás, 4, , Hoffer I.: A vércsoport-szerológia elmúlt 10 éve. Focus Med., 11, 23-26, Hoffer I.: Laboratóriumi enzimes keresztpróba SZER- 04-V01. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-4, Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.. Variáns D tulajdonság kezelése SZER-08-V03. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-5, Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.: A donorok Rh(D) antigén vizsgálati rendje SZER-20-V01. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-10, Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.: Betegek laboratóriumi AB0 és RhD vércsoport meghatározása SZER- 23-V01. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-4, Jakab J., Bohaty I., Csernus Z. et al.: Rh (CcEe) fenotípus, Kell antigén és egyéb cél-antigének vizsgálat SZER- 19-V02. OVSz Minőségügyi Eljárás, 1-3, Klein H.G., Anstee D.J.: Mollison s Blood Transfusion in Clinical Medicine, 11 th edition, 8, , Lai M., Mavilia G., d Onofrio G. et al.: Detection of weak D with a fully automated solid-phase red cell adherence system. Transfusion, 45, , Lajos J., Friss Á., Hoffer I.: Anti-humán-globulin (Coombs) teszt csöves metodika. Transzfúzió, 2, 60-63, Lajos J.: A sejtmosó automaták használhatósága a vércsoport-szerológiai laboratóriumokban. Transzfúzió, 3, 90-92, Lange J., Selleng K., Heddle N.M. et al.: Coombs crossmatch after negative antibody screening a retrospective observational study comparing the tube test and the microcolumn technology. Vox Sang., 98, e269-e275, Lynen R., Krone O., Legler T.J. et al.: A newly developed gel centrifugation test for quantification of RBC-bound IgG antibodies and their subclasses IgG1 and IgG3: comparison with flow cytometry. Transfusion, 42, , Milkins C., Berryman J., Cantwell C. et al.: Guidelines for pre-transfusion compatibility procedures in blood transfusion laboratories. 1-60, Németh K., Fekete Gy.: Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövő. Focus Med.,11, 2-7, Noizat-Pirenne F., Verdier M,. Lejealle A. et al.: Weak D phenotypes and transfusion safety:where do we stand in daily practice? Transfusion, 47, ,

11 38. Olsson M.L.: New developments in immunohaematology. Vox Sang., 87, S66-S71, Petri I.: Molekuláris biológiai vizsgálatok a vércsoportszerológiában, hazai lehetőségek. Hematológia-Transzfuziológia, 42, 42-47, Petrik J.: Microarray technology: the future of blood testing? Vox Sang., 80, 1-11, Poole J.: Problem-solving in antibody identification. Vox Sang., 87, S67-S69, Raman L., Armstrong B., Smart E.: Principles of laboratory techniques. ISBT Science Series, 3, 33-60, Reid M.E.: Overview of molecular methods in immunohematology. Transfusion, 47, S10-S16, Ridgewell K., Dixey J., Scott M.L.: Production of soluble recombinant proteins with Kell, Duffy and Lutheran blood group antigen activity, and their use in screening human sera for Kell, Duffy and Lutheran antibodies. Transf. Med., 17, , Robb J.S., Roy D.J., Ghazal P. et al.. Development of non-agglutination microarrey blood grouping. Transf. Med., 16, , Roxby D.: Current concepts in pre-transfusion serological compatibility testing. ISBT Science Series, 6, , Sandler S.G., Langeberg A., Avery N. et al.: A fully automated blood typing system for hospital transfusion services. Transfusion, 40, , Spisák S., Molnár B., Galamb O. ET AL.: Fehérjechipek elméleti alapjai és alkalmazási lehetőségük az orvosi diagnosztikában és kutatásban. Orv. Hetil., 32, , 2007 Vércsoport-szerológiai módszerek változása az elmúlt 25 évben Szabó J. (sorozatszerk.): Ellenanyagszűrés és a laboratóriumi keresztpróba (Laboratóriumi kompatibilitás). OVSz módszertani ajánlása, 5-24, Tormey C.A., Hendrickson J.E.: Antibodies of undetermined significance: nuisance or near miss? Transfusion, 53, , Urbaniak S.J.: Alloimmunity to RhD in humans. Transf. Clin. Biol., 13, 19-22, Vagner M.: Az Rh vércsoportrendszer genetikája és komplexitása. Hematológia-Transzfuziológia, 38, , van der Schoot C.E.: Molecular diagnostics in immunohaematology. Vox Sang., 87, S189-S192, Veldhuisen B., van der Schoot C.E., de Haas M.: Blood group genotyping: from patient to high-throughput donor screening. Vox Sang., 97, , Voak D.: The status of new methods for the detection of red cell agglutination. Transfusion, 39, , Weisbach V., Kohnhäuser T., Zimmermann R. et al.: Comparison of the performance of microtube column systems and solid-phase and the tube lowionic-strength solution additive indirect antiglobulin test in the detection of red cell alloantibodies. Transf. Med., 16, , Weisbach V., Ziener A., Zimmermann R. et al.: Comparison of the performance of four microtube column agglutination systems in the detection of red cell alloantibodies. Transfusion, 39, , Westhoff C.M.: Molecular testing for transfusion medicine. Curr. Opin. Hemat., 13, ,

12 Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása Dr. Baróti-Tóth Klára Országos Vérellátó Szolgálat, Budapest Összefoglalás: A szerző célja, hogy bemutassa a preparatív transzfuziológiában, az elmúlt 25 évben bekövetkezett fejlődést (a vérvételtől a vérkomponens szeparáláson keresztül, azok tárolásával bezárólag) és azok hatását a hatékony betegellátásra. Kulcsszavak: preparatív transzfuziológia, vérkomponens, betegellátás Fogalmak bc = Buffy coat (Határréteg, fehérvérsejtben és thrombocytában gazdag) GMP = Helyes Gyógyszergyártási Gyakorlat (Good Manufacturing Practice) GVH = Graft versus Host IT = Informatical Technology S/D = Solvens/Detergens módszer Bevezetés A XX. század a medicina valamennyi területén óriási fejlődést tudhat be magának, hiszen mindkét világháború és a hidegháborús történelmi időszak számos tudomány alapkutatási eredményeit építette be, sőt fejlesztette tovább az alkalmazott kutatásaiban. A felsoroltakat mind bevezették a rutin gyakorlatba a hatékonyabb és biztonságosabb betegellátás érdekében (tároló oldatok, műanyag és teflon vérvételi, és egyéb zsákok, ionizáló sugárzás, gépesítés, stb.). Ezek a fejlesztések jelentős iramban jelentek meg az ún. interdiszciplináris területeken, mint immunológia, immunhematológia és preparatív transzfuziológia (utóbbi a donorkivizsgálással kezdődik a vérvételen át a vérkészítmények előállításával, és azok tárolásával bezárólag értendő). Jelen írás azt a célt tűzte ki, hogy áttekintést adjon az elmúlt évtizedek technológiai változásairól, új eszközök és technikák bevezetéséről, amelyek hozzájárultak a Summary: The aim ofthe author is to show the development of the prepa rative transfusiology (from blood collection through the blood components separation until the end of the storage of them) and their effect onto the patient therapies in the last 25 years. Keywords: preparative transfusiology, blood component, patient therapy biztonságosabb, kevesebb kockázatot jelentő, standard minőségű komponens terápia megvalósításához a vérkészítmények előállítása során (1. ábra). A komponens terápia iránti elvárás már a II. Világháború idején megfogalmazódott a klinikusok részéről, hiszen a keringési túlterhelés jelentette az egyik kockázatát a transzfúzióknak, azonban a technikai háttér nem volt minden esetben elérhető ahhoz, hogy előállítsák és tárolni tudják hosszan a vörösvérsejt és plazma készítményeket. Azonban meghatározó tapasztalatokat gyűjtöttek és már akkor létrejöttek azok az iskolák, amelyek később a bölcsői lettek a vérkészítmény előállítás és konzerválási technikák kidolgozásának, mind Európában (Högman, Svédország), mind az USA-ban (Greenwalt). Természetesen igen korán felismerték az üzleti és szakmai lehetőségeket az egyes cégek, akiknek valamilyen korábbi érdekeltsége révén piaci szerepet kaptak a gyógyszergyártás (infúzió-, reagens-gyártás), vegyipar (műanyaggyártás, textilipar) területeken, és többnyire családi vállalkozásokból (Baxter, Biotest, Fresenius, MacoPharma) nőtték ki magukat és lettek a legnagyobb beszállítók. A komponensterápia másik célja és egyben mozgatórugója a vérrel átvihető fertőzések számának lecsökkentése lett, amit szintén tapasztalati úton bizonyítottak még a hatvanas és hetvenes években (Hepatitis B, Syphilis), azaz a fagyasztott-olvasztott vörösvérsejt készítmények transzfúzióival. Már akkor megállapították, hogy a vérkészítményekben lévő fehérvérsejtekkel magyarázhatóak a szövődmények jelentős száma, tehát elindultak azok a kutatások, technológiai változtatások, amely azt célozták meg, hogy a lehető legnagyobb mértékben eltávolítsák ezeket a sejteket (2a,2b. ábra), illetve olyan módszert alkalmazzanak, amelyek megakadályozzák a proliferációjukat. Az 1980-as évek 1. ábra: Mérföldkövek a vérkészítmény-előállítás és -konzerválás történetében Már a 70-es években kifejlesztették azokat a műanyag vérvételi zsákokat, összetett zsákrendszereket, amelyek tartalmazták a steril alvadásgátló oldatot (CPD, CPDA-1), azonban a humán teljesvér szeparálási eljárás az ún. thrombocyta dús módszerrel történt. Ennek következtében a vörösvérsejteket plazmában reszuszpendálták, ami a tárolhatóságot korlátozta, aminek az 12

13 2. ábra: Vérkészítmény előállítás gyakorlata/ Fehérvérsejt eltávolítás lehetőségei 2/a. ábra: Buffy coat-os technika (LD = leukocyte depletion = fehérvérsejtmentesítés szűrővel, a zsák konfigurálásakor a vörösvérsejt szűréséhez használt szűrő beépíthető gyárilag a rendszerbe, ez opcionális, de elvégezhető egy laboratóriumi szűrő-zsák szetben is a thrombocytához hasonlóan) 2/b. ábra: Inline szűrővel ellátott zsákrendszerből előállítható vérkészítmények oka a készítmény jelentős fehérvérsejt és thrombocyta tartalma miatt a mikroaggregátum-képződés, valamint a fehérvérsejtekből felszabaduló enzimek voltak. Európában jelentős iramban megindultak a buffy coat eltávolítására tett próbálkozások, aminek hazai vonatkozású eredményei is megjelentek (29,33,35,40,65). A módszer széleskörű elterjedéséhez azonban néhány feltételnek teljesülnie kellett, azaz olyan steril, összetett zsákrendszerek (2-, 3-, vagy 4- részes Top-Top) bevezetése, ami már nemcsak az alvadásgátló, hanem a reszuszpendáló (CPD, SAG-M, ADSOL) oldatot is tartalmazza (28,34). Ekkorra datálható az a nemzetközi konszenzus, amely kimondta, hogy vörösvérsejt tartalmú készítményeket csak PVC alapú DEHP-tal (diethyl-hexyl-ftalát) lágyított zsákban szabad tárolni. A thrombocyta készítmények ph-ja azonban túlságosan lecsökkent az ilyen zsákokban, mivel a széndioxid nem tud kidiffundálni a környezetbe, szénsavvá alakul és a ph alacsonyabb lesz, mint 6,4 ez pedig a sejtek funkcióvesztését okozza. A thrombocyták tárolhatóságát csak lágyítót nem tartalmazó zsákban (pl. poliolefin), vagy trimellitáttal Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása (TOTM) kezelt zsákban lehet biztosítani (32,55,63,59). Ebben az időben fejlesztették ki azokat a thrombocyta rázó készülékeket is, amelyek közül az ún. síkágyas (flat bad típusú) mozgatással működő eszközzel lehetett leghatékonyabban megőrizni a sejtek funkcióit (+20) (+24) C-on (74). A plazma készítményeket elsődlegesen transzfúziós céllal alkalmazták, másrészről vérbanki körülmények között előállított kryoprecipitátum alapanyagául szolgált, bár a fokozott vírusátviteli kockázat miatt előtérbe került az ipari frakcionálás, vírusinaktiválás, azaz a labilis faktorkészítmények (FVIII) nagyüzemi szintű előállítása (62). A fejlesztések középpontjába került a teljes vér komponensekre történő szétválasztásának tökéletesítésére való törekvés, hiszen az alapanyagnak mennyiségileg és minőségileg is javulni kellett. Még mindig a 80-as években járunk, amikor a vérellátóban is megjelenik az igény a Helyes Gyógyszergyártási Gyakorlat (GMP) alapelveinek lefektetésére és szemléletváltásra (72). Megfogalmazódott, hogy nem szabad pusztán laboratóriumi körülmények között, intuíciókon, előírások és ellenőrzések nélkül vérkészítményeket előállítani, hiszen igen nagy kihívást jelent a terápiás hatásosság elérése miatt a minőség szűkebb határokon belülre szorítása, ami üzemesítés-, gyógyszerészi szemléletet kíván/kívánt a biológiai eredetű termékek esetében is. Megszülettek azok a publikációk, amelyek elsődlegesen alkalmazott kutatásokra épültek és bemutatták a vérkészítmények előállítására vonatkozó standardizálási feladatokat. Vizsgálták a jobb kinyerés, a sejtek túlélési esélyeit, ezek ellenőrzésére módosításokkal ugyan, de bevezettek olyan laboratóriumi diagnosztikai módszereket, amivel igazolták az elgondolásukat (3,42,45,46,76,80). A teljes vér szétválasztásának hatékonyságát egy határon túl azonban nem lehetett manuális technikákkal javítani. Bizonyítást nyert, hogy kihat a mennyiségre, minőségre a vérvétel és a szétválasztás között eltelt időtartam hossza, a teljes vér hőmérséklete, a centrifugálás paraméterei, de óriási hatással bír az asszisztencia szeme és manualitása (30,52,58). A standardizálás jelentős mérföldköve az ún. Amsterdami technika, ami ugyan kézi módszer, de behatárolta a kritikus előállítási lépéseket és korlátozta a szabad, kézi technológiát (11,12,57). A módszer megfelelt annak a célnak, hogy megfelelő minőségű plazma-előállítás történjen, akár ipari céllal és egyúttal a lehető legjobb minőségű egyedi thrombocyta koncentrátum és vörösvérsejt készítmény álljon a betegek rendelkezésére. Megjelentek az első félautomata vérkomponens szeparáló készülékek, amelyek kiváltották a kézi technológia első szeparálási lépését, azaz a 3 alap vérkomponens (plazma, vörösvérsejt, buffy coat) egymástól történő elválasztását (14,19,47,67,78). Magyarországon ebben az időben még mindig az általános vérvételi- és tároló-edényzet az üvegpalack volt, csak a központi intézetben használtak egyrészes PVC vérvételi zsákot, amit az intézet gyógyszertárában CPD oldattal töltöttek meg és sterilizáltak. Az aszepszist a komponensekre történő szétválasztáskor lamináris 13

14 fülkében biztosították és a Medicor által gyártott egyszer használatos szerelékekkel csatlakozatták az üres transzferzsákot a 400 ml teljes vért tartalmazó zsákhoz. Ha a klinikum igényelte a thrombocyta készítményt, akkor a készítménynek 4 egység bc-ból történt az előállítása, és azt közvetlenül a kiadás után kellett transzfundálni. Az alkalmazott technológia hátránya az volt, hogy mielőtt ismertek lettek volna a szűrővizsgálati eredmények, megtörtént a poolozás, ha egy tag reaktív lett, akkor a készítményt meg kellett semmisíteni. A 90-es évek elején történt meg az országos szintű 4 részes top-top vérvételi zsákrendszer bevezetése (11,12,56,57,58). A preparatív transzfuziológia újabb és újabb elvárásoknak kellett, hogy megfeleljen, mivel ebben az időben már ismert volt a HIV és CMV vírus vérrel való átvitelének lehetősége is. Megfogalmazódtak a vérkészítményekkel szemben támasztott minőségi elvárások a transzplantációra váró, illetve azon átesett betegeknél, ahogyan a neonatológiai betegek speciális igényei is. Diepenhorst és munkacsoportja (21) valamint Kikugawa és Minoshima (38) munkásságának eredményeként 1978-ban vezették be az egyszer használatos fehérvérsejt-mentesítési eljárást (gyapot oszlopszűrő) a vérbanki technikák közé. Prins és mts-i 1978-ban (54) buffy-coat-mentesített vörösvérsejt koncentrátumok Cellselect-A TM -val végzett szűrések hatékonyságát mutatta be szűrésből 60,6%-ban 99,9%-kal csökkent a vörösvérsejt koncentrátumnak a leukocyta tartalma. A felhasználói igények növekedésével és a vegyipar fejlődésének eredményeként 1985 óta a kereskedelmi forgalomban elérhető szűrők mind méretükben, mind fehérvérsejt-eltávolítási hatékonyságuk alapján jelentős változáson mentek át (1. táblázat). Magyarországon már az 1960-as években kipróbálták a gyapot töltetű oszlopszűrőket Langfelder Mária és mtsai (40), valamint Prof. Gál György. Aferezises technikát már ebben az időben, hazánkban is alkalmazták pl. Réti Marienn cyta- és terápiás plazmaferezisre (aferezis technika változásaira a szerző nem fókuszál jelen írásban). A számítógépes adatnyilvántartást szintén bevezették az USA-ban, Európában és hazánkban is. Az 1990-es évek A fehérvérsejt-mentesítési technika csak az 1990-es évektől terjedt el hazánkban a vérbanki gyakorlatban, a Nemzedék első második harmadik negyedik Eltávolítandó célsejt mikroaggregát mikroaggregát leukocyta leukocyta 1. táblázat: Fehérvérsejt mentesítő szűrők Szűrő anyaga screen filter (pórusátmérő: m) screen filter (kb.40 m ) vagy/és mélységi szűrő finom rostok (rostátmérő: m) nem szőtt ultrafinom rostok (rostátmérő: 1-2 m) Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása szakmai támogatást a laboratóriumi szűrők kapták, bár az ún. ágy melletti szűrőket a negatív irodalmi adatok (5,15,24,36,64,69,75,81) ellenére (hirtelen vérnyomásesés, vörös szem effektus) sem lehetett könnyen kiszorítani a kórházi beszerzésekből több mint 15 éven át. Miután a négyrészes zsákrendszerrel egy új technológia került bevezetésre az így előállított vörösvérsejt koncentrátumok fehérvérsejt tartalma 0,4-0,8 x ra csökkent. Pietersz és munkacsoportja (51) > 99%-os fehérvérsejt csökkenést állapított meg a Cellselect-A TM szűrő alkalmazásakor. Vakkila és Myllylä kimutatták, hogy a buffy-coat mentesített SAGM-ben reszuszpendált vörösvérsejt Cellselect gravity TM -mel történt szűrésekor 99,9%-os fehérvérsejt eltávolítást eredményezett (77). A végtermékben maradt sejtek granulocytákból és T-sejtekből álltak. A poliészter flat-bed szűrők napjainkban is alkalmazott eszközei a fehérvérsejt-mentesítéseknek. A szűrők általában tartalmaznak a tárolás során kialakuló mikroaggregátumok kiszűrésére, szőtt vagy nem szőtt szálakból álló előszűrő réteget és egy nem szőtt szövedéket az ún. fő szűrőréteget, amely a leukociták eltávolítására szolgál. A fő szűrő szálakat szintetikus rostokból, mint poliészter, polietilén, polipropilén, polimetil-metakrilát, polisztirén, polifluoroklóretilén (59), készítették. A rostok nedvesíthetőségét kémiai és ionizációs eljárásokkal érik el. A leukocyták eltávolítását a sejtek felülethez történő kötődéssel, valamint kiszűréssel végzik. Jelenleg igen sokféle flat-bed szűrőt forgalmaznak a gyártók (pl. Sepacell RZ200, Pall BPF4 stb.). Ezek a szűrők a rostok anyagában, az előszűrők rétegeinek számában, a fő szűrő rétegeinek számában, a rostok átmérőjének, a keresztező szálak távolságában, a szűrő vastagságában és felületük nagyságában térnek el egymástól. Sok tanulmány jelent meg, a szűrés hatásmechanizmusáról és hatékonyságáról (39,53,70,71). A szűrők hatékonyságát vizsgáló mérések eredményei sok szempont miatt nehezen összehasonlíthatóak, mivel a legkülönbözőbb szűrőkkel (általában órás vörösvérsejt készítményt), eltérő hőmérsékleten (+4 vagy +22 C) fehérvérsejt-mentesített terméket állítottak elő. A sejtszennyezettséget nem egységes módszerrel történt fehérvérsejt-számolással végezték. Wenz és Burns (80) poliészter szűrővel szerzett tapasztalatai (maradék fehérvérsejt: monocyták 19-25%, T-sejtek 21-27%, B-sejtek 6-27%) nem különböztek Vakkila és Myllylä (77) cellulóz acetát szűrővel kapott tapasztalataitól. Al és mtsai (3) összehasonlították a Cellselect gravity oszlopszűrőt egy poliészter flat bed szűrővel és megállapították, hogy az előbbi alkalmazásakor főleg lymphocyták, az utóbbi szűrő estén granulocyták jutottak a filtrátumba, ha buffy-coat mentesített vörösvérsejtet szűrtek. Ezek az adatok azt sugallták, hogy eltérő mechanizmusokkal működnek a különböző alapanyagú szűrők. Az irodalmi adatok alapján a szűrést lehetőleg a vérvétel után órán belül célszerű végrehajtani, ennek következtében csökken a vírusátvitel (25,61), szignifikánsan alacsonyabb a szűrt készítményekben 14

15 az IL-6, IL-8, hisztamin koncentráció (17,22,23) valamint csökken az aktív sejtek sérülése (6,73) a tárolás során, azonban nem mentesek teljesen a fehérvérsejtektől és fragmentektől (60) ezek a készítmények. A 90-es évek közepén egy újabb bumm történt Nagy Britanniában, a prion okozta vcj megbetegedés diagnosztizálása, aminek a rutinszerű szűrőtesztjének a bevezetése gyakorlatilag napjainkig nem megoldott, viszont kevés számban, azonban dokumentált a vérrel való átvitel valószínűsítése (31,41). Mint az egyetlen megoldás az átvitel csökkentésére a fehérvérsejt-mentesítő szűrők alkalmazása. Ennek és más egyéb kedvező transzfuziológiai hatás (thrombocyta refrakterállapot, alloimmunizáció, vírus, bakteriális átvitel, immunmoduláció kialakulásának csökkentése, azaz a szövődmények visszaszorítása) érdekében az EU tagországok közel 100%-a csak szűrt vérkészítménnyel transzfundál, aminek költséghatékony eredményességét mára már néhány ország kimutatta (16,49,50,68) az ápolási napok, a szövődmények kezelésére fordított költségek csökkenésének elemzésével. Hazánkban azonban csak a korábban említett betegcsoportok számára készülnek szűrt készítmények. Az 1990-es években a vérellátós tevékenység elmozdult a gyógyszergyártás felé, a folyamatok standar dizálása, validálása megkezdődött, csak kvalifikált eszközökkel kezdtek dolgozni, a minőségügyi rendszer kiépítése minimum elvárás lett. Még igazából hiányzott a vérellátási GMP ebben az időben. A történéseket a gyógyszeripar, és a transzfuziológiai kérdésekkel foglalkozó nemzetközi szakmai szervezetek (pl. Európa Tanács, WHO) generálták, hiszen a plazma gyógyszeralapanyag lett. Ezeknek a változásoknak köszönhetően megkezdődtek az egységesítések, azaz a véradók vérvétel előtti kivizsgálásával (donorkérdőív, hemoglobinmérés, előzetes vércsoport meghatározás, stb.), egységes vérvételi mennyiség gyűjtésével, amit vérvételi rázómérleg alkalmazásával biztosítottak megszületett az az alapelv, ami a vérkomponensek szétválasztásával folytatódhatott. Van der Meer és mtsai (79) standardizálták a hőmérsékleti viszonyokat a vérvételtől a teljes vér elválasztásáig, kidolgozták a bután-1,4-diol hűtőközeg alkalmazását, amivel optimálisan megőrizhetőek a plazma labilis alvadásfaktorai és az előállításra kerülő thrombocyta készítmények funkciói is. A teljes vér tárolása (+20) (+24) C-on szükséges, amelyet egy speciálisan erre a célra kifejlesztett rendszerrel (1. kép) (Compocool, Fresenius Kabi, Németország) lehet megvalósítani a komponensek szétválasztását megelőzően, maximum a vérvételt követő 24 órán belül. A vérkomponensek előállításánál fokozódott az igény az automatizálásra, bár többnyire még mindig a 4 részes összetett, top-top zsákrendszert alkalmazták, ami annyit jelentett, hogy a diafragmás nyílások és a zsáktagokat összekötő csőszakaszok csatlakozásai a zsák felső részén helyezkedtek el. Az automata vérkomponens lenyomók a manuális lenyomás elvét ültették át a gépi rendszerbe. A szétválasztása az egyes határrétegeknek a sűrűségeltéréseken alapult, előtérbe 1. kép: Compocool rendszer Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása került a centrifugálási paraméterek módosítása, mivel a készülékek a túl tömény, magas hematokritú buffy coat-okat nem tudták megfelelően átnyomni a transzferzsákba. Ennek következtében módosította az Európa Tanács (26) a plazmakészítmény sejtszennyezettségét thrombocyta/ml-re thrombocyta/ml-ről, másrészt előírták, hogy a készítmény maghőmérsékletének 60 percen belül el kell érnie a (-30) C-ot (1,2,48). Ezt a gyors sebességű fagyasztást csak erre a célra gyártott készülékekkel lehet a mai napig elérni, ennek teljesülését dokumentáltan kell bizonyítani a hatósági ellenőrzések és a vevői auditok során. Alkalmaztak olyan készülékeket, amelyekben a hűtőközeg (szilikon olaj) keringett a zsebekben elhelyezett plazmazsákok körül, másokban a hideg levegővel történő kontaktérintkezéssel fagy le a plazma és egy mechanikai préselés révén érik el a megfelelő készítmény vastagságot a fagyasztási folyamat előtt. Az alapkészítmények között az egyedi buffy coat-ból egyedi thrombocyta koncentrátumot állítottak elő (14,56), amit csak a transzfúziós igény kézhezvételekor pool-oztak össze, általában 10 donortól, egy zsákba. A módszer előnyének számított, hogy minimalizálni lehetett azokat a selejteket, amelyek abból származtak, hogy a szűrővizsgálatuk valamelyike (HBsAg, anti-hiv, anti-hcv, TP) reaktívnak bizonyult. A fehérvérsejt szennyezettséget 10 7 /egység alá lehetett szorítani, azonban előfordult, hogy 10 8 /egységet is elérte, ami fokozott transzfúziós kockázatot jelentett, bár az átlagos thrombocytaszám nagyobb, mint 0,5 x /egység. 15

16 Az optimális kinyerés, az új terápiás lehetőségek előtérbe helyezték a thrombocyta készítmények adását, egyre nagyobb igény merült fel a cytaferezissel előállított készítményekre is, bár ekkor még nem minden esetben teljesítették a szűrt minőségű készítmény paramétereit, azonban óriási előnnyel bírt, hogy csak egy donortól származik a terápiás értékű készítmény. Elsődlegesen csontvelőtranszplantáltakat és onkohematológiai betegeket látták el ezzel a készítménnyel. Az aferezis készülék újabb generációi már lehetőséget adtak őssejt- és fehérvérsejt (neutrofil granulocyta) készítménygyűjtésre is, sőt a terápiás igények növekedésével kifejlesztették az ún. multikomponens aferezis készülékeket (44,82). Ez utóbbi legalább kétféle eltérő típusú vérkészítmény előállítására alkalmas. Ez időben jelent meg az első generációja a sterilen hegesztő (SCD/TSCD, Terumo, Japan) készüléknek, amely lecsökkentette a lamináris fülkében történő készítmény előállítás számát, hiszen az egyes csőszakaszokat képes volt úgy összeilleszteni, hogy azok belső része vizsgálatokkal igazoltan sterilen maradtak (2. kép). A készülék mind folyadékkal, mind levegővel telt csőszakaszokat képes volt egymásba illeszteni, kellő erősségű varratot kialakítani a most már egy csőszakaszon. Ezzel az eszközzel lehetővé vált, hogy az egyetlen nyitott rész a zsákrendszerrel csak a vérvételi csőszakasz, tehát a kontamináció leginkább innen származhat. A vérvételi zsákrendszereket előállító gyárak megoldották, hogy a rendszerbe beillesztettek 2. kép: Vérvételnél és a vérkészítmény előállítás, tárolásnál alkalmazott készülékek a vakuumos vérvételre alkalmas harangot, másrészt tűvédők fejlesztésével lecsökkentették a munkahelyi balesetek számát (3. kép). 3. kép: Vérvételi zsákrendszerek 3/a. Mintavételi kis zsákkal együtt, jelenleg alkalmazott zsákrendszer Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása 3/b. Az első, Magyarországon bevezetésre került zsákrendszer A vérkészítmény előállítási lépések során egy-egy csőszakaszt le kell zárni, ehhez csőhegesztőket fejlesztettek ki, még pedig olyan hegesztési varratok kialakítására, amely tépőszakaszt is készít, amivel a dolgozók vérrel való kontaminációját lehetett visszaszorítani. Ebben az évtizedben már rutinszerűen alkalmazták azokat a vérbesugarazó készülékeket, amelyek zárt sugárforrással (pl. Cs137) rendelkeztek és alkalmasak arra, hogy Gy (min. max.) sugárdózissal elérjék, hogy a vérkészítményekben maradó lymphocyták proliferációját felfüggesszék. Az eljárás képes meggátolni a transzfúzióhoz köthető GVHD kialakulását (8,9,26,27,43). A módszer hatásosságát már kb. két évtizeddel korábban leírták, azonban csak ebben az időszakban született konszenzus, hogy a vörösvérsejt tartalmú készítményeket a fokozott K + ion koncentráció extracellularis térben történő megnövekedése miatt, a vérvételt követő 14 napon belül szabad az eljárással kezelni, és maximum utána 14 napig lehet transzfundálni, míg a neonatológiai felhasználásnál ez az időtartam 48 óra. Ehhez hasonló korlátozás nem vonatkozik sem a plazmakészítményekre, sem pedig a thrombocyta koncentrátumokra. A kilencvenes évek végére a világ elfogadta, hogy standardizált módon kell dolgozni, hogy a vérből előállított vérkészítmények speciális gyógyszerek, amelyek előállítása szigorúan ellenőrzött és tervezett módon kell, hogy megtörténjenek. Az előállítás valamennyi részletét, ami a minőségre és mennyiségre kihat regisztrálni kell és visszakereshetővé kell tenni, aminek a legegyszerűbbnek tűnő módja a megfelelő informatikai háttér. A készülékeket, amelyek a vérkomponensek szeparálását végzik, számítógépes programokkal is lehet üzemeltetni az adatgyűjtés érdekében (4. kép). Hatékonyabb buffy coat kinyerés céljából felülvizsgálták a teljes vér szétválasztásának lehetőségét, és kialakították az ún. top-bottom vérvételi zsákrendszert, aminek 3 tagja van. A nevét onnan kapta a rendszer, hogy a vérvételi zsák alján lévő csövön keresztül tudja a vérkomponens szeparáló automata átnyomni a vörösvérsejteket a reszuszpendáló oldatot tartalmazó zsákba, míg a buffy coat az eredeti zsákban marad és a plazma az üres zsáktagba kerül (3. kép). A szeparáló automata regisztrálja a kezelőt, a készítmények tömegét és a vérvételt jelentő sorszámot, természetesen a lenyomás időpontjával és időtartamával együtt, és képes a csőszakaszokat lehegeszteni. 16

17 4. kép: Automata vérkomponens szeparáló készülékek A 2000-es évek Az előbb bemutatottakból érezhető, hogy a véradó és a beteg biztonságára kell a teljes folyamat során törekedni, miközben időben és gazdaságilag a lehető leghatékonyabban történjenek a lépéssorozatok. A vérvételi zsákrendszerek konfigurációjában lényeges változások nem következtek be, inkább további biztonsági elemek jelentek meg pl. a tűvédő kivitelében. Bizonyítást nyert, hogy a thrombocyta koncentrátumok a legérzékenyebbek a bakteriális kontaminációra, amit elősegít a plazmás közeg és a (+20) (+24) C-os tárolási hőmérséklet. Ez a kockázat lecsökkenthető, ha a vérvétel során az első ml teljes vért a zsákrendszerbe illesztett mintavételi zsákocskába gyűjtik (3. kép). Az univerzális fehérvérsejt-mentesítési (szűrési) törekvés egy-egy országban átrendezte a vérkészítmény előállítási gyakorlatot. Megjelentek azok a zsák konfigurációk, amelyekbe beillesztették a szűrőt (in line), és ily módon mielőtt a komponensekre történő szeparálás megtörtént volna, előtte a teljes vért átengedték a szűrőn. Ilyenkor csak szűrt minőségű plazma és vörösvérsejt koncentrátum készült. Ha szükség van a teljes vérből előállítható thrombocytára is, akkor a szűrőt úgy építették be a zsákrendszerbe, hogy a teljes vérből képesek legyenek az alapkészítményeket előállítani és csak a vörösvérsejt legyen 1 x nál kevesebb fehérvérsejttel szennyezett. Mindkét eljárásnál fontos, hogy a vérvételt követően maximum 48 órán belül elvégezzék a szűrést. Az eljárások előnye, hogy az aszepszis megtartott, ahogy a lejárati idő sem módosul (3. ábra). A thrombocyta koncentrátumok esetében gazdálkodási szempontok miatt néhány éven át előtérbe került a 7 napos tárolás, amelyre a tároló zsák okán lehetőséget adtak néhány országban, ha a transzfúzió előtti bakteriológiai vizsgálat negatív eredményt ad. Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása Mindezt a gyakorlatot támogatta, hogy kifejlesztettek olyan kristályos oldatokat (pl. Composol, PAS, stb.), amelyekben a vörösvérsejtek reszuszpendáló oldatához hasonlóan a sejtek megőrzik a funkciójukat, ha 20-30%- ban tartalmaznak plazmát is. A tárolási vizsgálatok kedvező eredményekről számoltak be, aminek hatásaként az időközben megjelent ún. véres direktívában (4,7,37) eltörölték a maximált ph = 7,4 értéket. A hazai vérkészítmény előállítás valamennyi technikát, eszközt alkalmazza, és ami a minőséget erősíti más országokhoz képest, hogy egységes alapelveket, módszereket, egységes informatikai rendszerrel támogatja. Jelenleg 4 egységes buffy coat-os módszerrel történik a thrombocyta előállítás, nem plazmás közegben. A neonatológiai betegek számára valamennyi készítmény típust ki tudjuk szerelni 4 részre. Speciális igényre az ún. mosott vörösvérsejt koncentrátumot teljesen zárt rendszerben állítjuk elő, majd reszuszpendáló oldatban vesszük fel, ennek eredménye a 48 órás felhasználhatóság (10,13). Az elmúlt évtizedek egyre inkább arra fókuszáltak, hogy a vérkészítmények a lehető legbiztonságosabbak legyenek a betegek számára, azaz a fehérvérsejt csökkentésen (3. ábra) kívül a készítményben lévő, ismeretlen mikrobiológiai szennyeződés kockázat lehetőségét is minimalizálni kell. A 90-es évek óta a plazmafaktorok előállításánál kezdték meg alkalmazni a vírusinaktiválási eljárásokat (solvens-detergens = SD), amelyre ma már számos országban a rutin vérellátós gyakorlatban is alkalmaznak vírus redukciós módszereket (18,20,66). Napjainkban már számos vérellátóban használnak patogén redukciós módszert a thrombocyta és plazma készítmények esetében. Mindkét készítmény típusnál valamilyen kémiai anyaggal hozzák össze a terméket (thrombocyta és plazma esetében psoralen (S59), vörösvérsejteknél (S303) riboflavin (vitaminb2), majd eltérő hullámhosszúságú UV fénnyel sugarazzák be. Ennek eredményeként a patogén DNS-ében, vagy RNS-ében visszafordíthatatlan (irreverzíbilis) kötések alakulnak ki, így a nukleinsavak replikációja véglegesen gátolt lesz (4. ábra). A segédanyagot speciális szűrővel eltávolítják, amivel a készítmény biztonságát növelik. A módszer alkalmas HIV, HCV, HBV, CMV és HTLV vírusok, valamint mind Gram-negatív, mind Gram-pozitív baktériumok esetében, ahogyan képes megelőzni a HLA alloimmunizációt is. Bár ez már számos intézetben része 3. ábra: Vérkészítmények fehérvérsejt szennyezettsége és klinikai kockázatuk 17

18 Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása a fejlődésről, amely az elmúlt 25 évben bekövetkezett a nemzetközi és hazai vérkészítmény előállítás terén, a biztonságos betegellátás egyik pillérében (5. ábra). Kronológiai sorrendben bemutatta a fehérvérsejt csökkentési technológiákat, amelyek a legnagyobb hatékonysággal képesek megelőzni a transzfúzióhoz kapcsolódó szövődmények kialakulásának valószínűségét, azonban soha nem szabad megfeledkezni arról, hogy ezeknek a lépéseknek ára van, együtt járnak hatóanyag-veszteséggel. Ennek egyik tipikus jövőképe a vérbanki patogén redukciós eljárások. Irodalomjegyzék 4. ábra: Patogén redukciós eljárás sematikus folyamata a rutin eljárásoknak, biztosan nem tudunk még mindent a módszer működéséről, nagyon sok ország mérlegelte a transzfúzió kockázatát és bevezette az eljárást egyes betegcsoportokba kötelezően (pl. Svájc, Franciaország). Összefoglalás Az elmúlt 26 év a preparatív transzfuziológiában, szűk értelmezésben a vérkészítmény előállításban óriási fejlődésen ment át. Ehhez hozzájárultak azok a társtudományok, amelyek képesek voltak megteremteni az anyagokat és eszközöket, az IT-t, amelyek alkalmazásával egy fokozottabban biztonságos betegellátást tudtunk kialakítani, miközben a véradók és a dolgozók kockázatát is minimalizálni lehetett. A technológiák kialakításával tervezhető, jól definiálható és mérhető módszereket fejlesztettek ki, amelyek alkalmasak a szigorú gyógyszergyártási (GMP) elvárásoknak is megfelelni. Jelen dokumentum áttekintést adott arról 4. ábra: Biztonságos transzfúzió pillérei /83/EC Directive GMP 2. 44/2005. (X. 19.) EüM rendelet az emberi alkal mazásra kerülő gyógyszerek gyártásának személyi és tárgyi feltételeiről. 3. Al E.J.M., Visser S.C.E., Prins H.K.: A flow cytometeric method for determination of white cell subpopulations in filtered red cells. Transfusion, 31, , Alhumaidan H., Sweeney J.: Current status of additive solutions for platelets. J. Clin. Apher., 27(2), 93-98, Alonso-Echanove J., Sippy B.D., Chin A.E. et al.: Nation wide outbreak of red eye syndrome associated with transfusion of leukocyte-reduced red blood cell units. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 11, , Andreu G.: Early leukocyte depletion of cellular blood components reduces red blood cell and pla telet storage lesions. Semin. Hematol., 28, 22-25, Ashford P., Gulliksson H., et al.: Standard Termi nology for Platelet Additive Solutions. Vox Sang., 98, , Baróti K., Rácz Z., Pintér J. et al.: Are Gy sufficient to abrogate the proliferation of lympho cytes in blood components? Blood, 86, 853, Baróti K., Rácz Z., Járosi Jné: Mekkora sugárdózis kell a vérkészítményekben levő lymphocyták proli fe rációjának megszüntetéséhez? 12. Magyar Belorvosi Archivum, 48, 41, Barótiné Tóth K., Pintér J., Hoffer I. et al.: Quality control of washed red blood cells. Transf. Clin. Biol., 8, 222a, Barótiné Tóth K., Rácz Z., Járosi Jné: Vérkészítmény előállítás négyrészes zsákrendszerben buffy coat technikával (gyomorfogó segítségével). Transzfúzió, 26, 24-30, Barótiné Tóth K., Rácz Z., Járosi Jné: Vérkészítmény előállítása négyrészes zsákrendszerben buffy coat technikával (klammer segítségével). 5 napig tárolható thrombocyta koncentrátum előállítása egyedi buffy coatból. Transzfúzió, 26, , Baróti-Tóth K., Kramer J., Pintér J. et al.: IgA content of washed red blood cell concentrates. Vox Sang, 74, 13-14,

19 Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása 14. Baróti-Tóth K., Pintér J., Hoffer I. et al.: Comparison of two different whole blood separation method., Vox Sang., 78S1, Belloni M., Alghisi A., Bettini C. et al.: Hypotensive reactions associated with white cell-reduced aphre sis platelet concentrates in patients not receiving ACE inhibitors (letter). Transfusion, 38, , Blumberg N., Fine L., Gettings K.F. et al.: Decreased sepsis related to indwelling venous access devices coincident with implementation of universal leuko reduction of blood transfusions. Transfusion, 45, , Bowden R.A., Slichter S.J., Sayers M.H. et al.: Use of leucocyte-depleted platelets and cytomegalovirusseronegative red blood cells for prevention of primary cytomegalovirus infection after marrow transplant. Blood, 78, , Butler C., Doree C., Estcourt L.J. et al., Pathogenreduced platelets for the prevention of bleeding. Cochrane Database Syst. Rev., 3, Cid J., Claparols M., Pinacho A. et al.: Comparison of blood component preparation methods from whole blood bags based on buffy coat extraction, Transf. Aph. Sci., 36, , Custer B., Agapova M., Martinez R.H.: The costeffectiveness of pathogen reduction technology as assessed using a multiple risk reduction model. Transfusion,. 50, , Diepenhorst P., Sprokholt R., Prins H.K.: Removal of leukocytes from whole blood and erythrocytes suspensions by filtration through cotton-wool. I. Filtration technique. Vox Sang., 23, , Frewin D.B., Dyer S.M., Haylock D.N. et al.: A comparative study of the effect of three methods of leukocyte removal on plasma histamine levels in stored human blood. Semin. Hematol., 28, 18-21, Frewin D.B., Jonsson J.R., Frewin C.R. et al.: Influence of blood storage time and plasma histamine levels on the pattern of transfusion rections. Vox Sang., 56, , Fried M.R., Eastlund T., Christie B. et al.: Hypotension reactions to white cell-reduced plasma in a patient undergoing angiotensin-converting enzyme inhibitor therapy. Transfusion, 36, , Gilbert G.L., Hayes K., Hudson I.L. et al.: Prevention of transfusion-acquired cytomegalovirus infection in infants by blood filtration to remove leucocytes. Lancet, i, , Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation No. R (95) 15. ed. European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare, Strasbourg. 27. Guidelines on gamma irradiation of blood components for the prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfus. Med., 6(3), , Gulliksson H., Karleman G., Segerlind A. et al.: Preser vation of red blood cells: Content of microaggregates and di-2-ethylhexylphthalate (DEHP) in red blood cells stored in saline-adenin-glucosemannitol (SAGM) medium. Vox Sang., 50, 16, Hegedűs E., Rácz Z.: Higher ATP level and reduced glucose consumption of red cells stored in PVC bags compared to glass bottles. Vox Sang., 53, 23, Hess J.R.: On behalf of the BEST collaborative: The overnight warm hold of whole blood before processing into components. Transfusion, 51. No.1S, Hewitt P.E., Llewelyn C.A., Mackenzie J. et al.: Creutzfeldt Jakob disease and blood transfusion: results of the UK transfusion medicine epide miological review study. Vox Sang., 91, , Holme S., Heaton W.A., Courtright M.: Platelet storage lesion in second generation containers: Correlation with platelet ATP levels. Vox Sang., 53, , Högman C.L.: Leucocyte depletion of blood com ponents. VU University Press., Högman C.L., Eriksson L., Hedlund K., et al.: The bottom and top system. Vox Sang., 55, , Högman C.L. Hedlund K., Akerblom O. et al.: Red blood cell preservation in protein-poor media. I. Leukocyte enzymes as a cause of hemolysis. Transfusion, 18, , Hume H.A., Popovsky M.A., Benson K. et al.: Hypotensive reactions: a previously uncharac terized complication of platelet transfusion? Transfusion, 36, , Kacker S., Ness P.M., Savage W.J.: The cost-effecti veness of platelet additive solution to prevent allergic transfusion reactions. Transfusion, 53, , Kikugawa K, Minoshima K.: Filter columns for preparation of leukocyte-poor blood for trans fusion. Vox Sang., 34, , Koerner K., Sahlmen P., Zimmerman B.: Preparation of leukocyte-poor red cell concentrates: comparison of five different filters. Vox Sang., 60, 61-62, Langfelder M., Jakschitz M., Jánossy A.: Comparison of different methods used in the preparation of leucocyte-free whole blood and erythrocyte concentrates. Vox Sang., 19, 57-63, Llewelyn C.A., Hewitt P.E., Knight R.S.G. et al.: Possible transmission of variant Creutzfeldt Jakob disease by blood transfusion. Lancet, 363, , Masse M., Andreu G., Anque M.: A multicenter study on the efficiency of white cell reduction by filtration of red cells. Transfusion, 31, , Massey E., Paulus U., Doree C. et al.: Granulocyte transfusions for preventing infections in patients with neutropenia or neutrophil dysfunction. Cochrane Database Syst. Rev., 21(1), Mattes G., Moog R., Implementation of preparative haemapheresis in the production of blood derived 19

20 concentrates recommendations on preparative haemapheresis of the German society of transfusion medicine and immunohaematology (DGTI). Transfus. Med. Haemother., 37, , Meryman H.T.: The preparation of red cells depleted of leukocytes-review and evaluation. Transfusion., 26, , Mijovic V., Brozovic B., Hughes A.S.B., et al.: Leuko cyte-depleted blood-a comparison of filtration techniques. Transfusion., 23, 30-32, Mondéjar H., Bonanad S., Soler M. A. et al.: Quality analysis of blood components obtained by automated buffy-coat layer removal with a top and bottom system., Haematologica, 85, , Monograph on Human Plasma for Fractionation 0853, European Pharmacopoeia, 5th ed. Strasbourg, France, Council of Europe, Nathens A.B., Nester T.A., Rubenfeld G.D. et al.: The effects of leukoreduced blood transfusion on infection risk following injury: a randomized controlled trial.shock, 26, , Phelan H.A., Sperry J.L., Friese R.S.: Leukoreduction before red blood cell transfusion has no impact on mortality in trauma patients. J. Surg. Res., 138, 32-36, Pietersz R.N.I., Dekker W.J.A., Reesink H.W.: A new cellulose-acetate filter to remove leukocytes from buffy-coat-poor red cell concentrates. Vox Sang., 56, 37-39, Pietersz R.N.I., de Korte D., Reesink H.W. et al.: Storage of whole blood for up to 24 hours at ambient temperature prior to component preparation. Vox Sang., 56, , Pikul F.J., Farrar R.O., Boris M.B.: Effectiveness of two synthetic fiber filters for removing white cells from AS-1 red cells. Transfusion, 29, , Prins H.K., Henrichs H.P., Conemans J.M.H.: Preparation of leukocytes-poor red cell suspensions from buffy-coat-free red cell concentrates by simplified cotton-wool filtration (abstract). 17th congress of Int Soc Hemath and 15th congress of Int. Soc. Blood Transf., Paris, I, 147, Rácz Z., Baróti K.: Effect of DEHP plasticizer on stored platelets. Vox Sang., 68, , Rácz Z., Baróti K.: Storage of platelet concentrates from overnight-stored blood and overnight-stored buffy coat: in vitro studies.vox Sang., 68, , Rácz Z., Baróti K.: Technical aspects of buffy coat removal from whole blood and those of platelet production from single buffy coat unit. Biomed. Techn., 38, , Rácz Z., Baróti K., Hidvégi T.: Quality of plasma separated from (buffy coat+plasma). An alternative way of blood processing. Acta Haemat. Polon., 25, 47-53, Rácz Z, Barótiné Tóth K.: A műanyagok transzfu zioló giai felhasználása. Transzfúzió, 1, 2-10, Ramos R.R., Curtis B.R., Duffy B.F. et al.: Low retention of white cell fragments by polyester fiber Az elmúlt 25 év vérkészítmény előállítása white cell-reduction platelet filters. Transfusion, 34, 31-34, Rebulla P., Porretti L., Bertolini F. et al.: White cellreduced red cells prepared by filtration: A critical evaluation of current filters and methods for counting residual white cells. Transfusion, 33, , Robinson H.J. Blood separation and plasma fractiona tion. Wiley-Liss, Inc. p , Rock G., Tocchi M., Ganz P.R. et al.: Incorporation of plasticizer into red cell during storage. Transfusion, 24, 493, Sano H., Koga Y., Hamasaki K. et al.: Anaphylaxis associated with white-cell reduction filter (letter). Lancet, 347, 1053, Schrier S.L., Hardy B., Bensch K. et al.: Red blood cell memb rane storage lesion. Transfusion, 19, , Seghatchian J., Putter J.S.: Pathogen inactivation of whole blood and red cell components: An overview of concept, design, developments, criteria of acceptability and storage lesion. Transfus. Apher. Sci., 17, S , Semple E., Bowes-Schmidt A., Yi Q. L., et al.: Trans fusion reactions: a comparative observational study of blood components produced before and after implementation of semiautomated production from whole blood, Transfusion, 52, , Shander A., Hofmann A., Gombotz H. et al.: Estimating the cost of blood: past, present, and future directions Best Pract. Res. Clin. Anaesth., 21, , Shiba M., Tadokoro K., Sawanobori M. et al.: Activation of the contact system by filtration of platelet concentrates with a negatively charged white cell removal filter and measurement of venous blood bradykinin level in patients who received filtered platelets. Transfusion, 37, , Sirchia G., Rebulla P., Parrvicini A.: Leukocyte depletion of red cell units at the bedside by transfusion through a new filters. Transfusion, 27, , Sirchia G., Wenz B., Rebulla P.: Removal of white cells from red cells by transfusion through a new filter. Transfusion, 30, 30-33, Smit-Sibinga C., Th. Das H-J. Heiniger P.C.: Good Manufacturing Practice in Transfusion Medicine: Proceedings of the Eighteenth International Symposium on Blood Transfusion, Groningen, Organized by the Red Cross Blood Bank Groningen- Drenthe, Snyder E.L., Mechanic S., Baril L. et al.: Removal of soluble biologic response modifiers (complement and chemokines) by a bedside white cell-reduction filter. Transfusion, 36, , Snyder E.L., Pope C., Ferri P.M. et al.: The effect of mode of agitation and type of plastic bag on storage characteristics and in vivo kinetics of platelet concentrates. Transfusion, 26, , Sweeney J.D., Dupuis M., Mega A.J.: Hypotensive reactions to red cells filtered at the bedside, but not to 20