Vasoactiv ágensek cardioprotectiv szerepe myocardialis ischaemia során. Dr. Soós Pál. Budapest 2006

Átírás

1 Vasoactiv ágensek cardioprotectiv szerepe myocardialis ischaemia során Dr. Soós Pál Budapest 2006 Témavezető: Dr. Horkay Ferenc, PhD, DsC Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Program: Szív- és érrendszeri betegségek élettana és klinikuma Bírálók: Dr. Mohácsi Attila, PhD Dr. Szokodi István, PhD Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Sándor Péter, PhD, DSc Prof. Dr. Székács Béla, PhD Dr. Szokodi István, PhD

2 Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék 0 Rövidítések jegyzéke 2 1 Összefoglalás 5 2 Summary 6 3 Bevezetés Pitvari nátriuretikus peptid (ANP) A pericardialis folyadéktér Parathormon (PTH) L-arginin 21 4 Célkitűzések 25 5 Módszerek Humán vizsgálatok Experimentális modellek Biokémiai vizsgálatok Kompartmentalizációs matematikai modell Statisztikai módszerek 36 6 Eredmények Pericardialis és szöveti ANP szintek elemzése Az interstitialis és pericardialis folyadéktér dinamikája Parathormon hatás a coronariákon Szisztémás L-arginin hatása a reperfúzióra L-arginin vascularis hatásai agyhalál állapotában 51 7 Megbeszélés 55 8 Következtetések 71 9 Irodalomjegyzék Saját publikációk jegyzéke Köszönetnyilvánítás 92 1

3 Rövidítések jegyzéke ±dp/dt ACH ADO AMP ANP AoP AT-II ATP BD BNP CA CAD camp CBF CNP CO CPB EDRF enos ESPVR ET-1 HR IMP INO inos KATP L-arg MAP NEP kontraktilitás acetilkolin adenozin adenozin monofoszfát pitvari (atrialis) nátriuretikus peptid aortanyomás angiotensin II adenozin trifoszfát agyhalál (brain death) B-típusú (brain) nátriuretikus peptid szívmegállás (cardiac arrest) ischaemiás szívbetegség ciklikus adenozin monofoszfát coronariaáramlás C-típusú nátriuretikus peptid perctérfogat (cardiac output) cardiopulmonalis bypass endothelium-derived relaxing factor endothelialis nitrogén monoxid szintáz end-systolic pressure-volume relationship endothelin-1 szívfrekvencia inozin monofoszfát inozin indukálható nitrogén monoxid szintáz ATP-függő kálium csatorna L-arginin artériás középnyomás neutralis endopeptidáz 2

4 nnos NO NYHA PRSW PTH SAH SNP VHD VP neuralis nitrogén monoxid szintáz nitrogén monoxid New York Heart Association preload recruitable stroke work parathormon S-adenozil-homocisztein nátrium-nitroprussid szívbillentyű betegség vénás plazma A matematikai modellben alkalmazott rövidítések: PS g a kapillárisok permeábilis területén átjutó anyag mennyisége a plazma és az interstitium között (ml*g -1 *min -1 ) PS ecl PS eca PS pc PS transz az endothelsejtek lumen felőli membránjának permeábilis területén átjutó anyag mennyisége a plazma és az endothelsejt cytosol között (ml*g -1 *min -1 ) az endothelsejtek lumennel ellentétes oldali (abluminalis) membránjának permeábilis területén átjutó anyag mennyisége az interstitialis folyadék és az endothelsejt cytosol között (ml*g -1 *min -1 ) a parenchymasejtek membránjának permeábilis területén átjutó anyag mennyisége az interstitialis folyadék és a parenchymasejt cytosolja között (ml*g -1 *min -1 ) a transzszudációs folyadék és az interstitialis folyadék közötti molekulaáramlás nagysága (ml*g -1 *min -1 ) V isf az eloszlás során kitöltött tér az interstitiumban (ml/g, az adott terület-plazma közötti áramlás partíciós koefficiense szorozva az anatómiai térfogattal (V)) V ec az eloszlás során kitöltött tér az endothelsejtekben (ml/g, anatómiai adatok alapján 0.02 ml/g értékben megállapítva) 3

5 V pc az eloszlás során kitöltött tér a parenchymasejtekben (ml/g, kevéssé érzékeny paraméter mg/l között) G p G isf G ec G pc az intravasalis metabolizmus során keletkezett anyagok clearance-e (ml*g -1 *min -1 ) az interstitialis metabolizmus során keletkezett anyagok clearance-e (ml*g -1 *min -1 ) az intracellularis metabolizmus során keletkezett anyagok clearance-e az endothelsejtekben (ml*g -1 *min -1 ) az intracellularis metabolizmus során keletkezett anyagok clearance-e a parenchymasejtekben (ml*g -1 *min -1 ) G transz a transzszudációs térben folyó metabolizmus során keletkezett anyagok clearance-e (ml*g -1 *min -1 ) F p áramlás per szövettömeg (ml/g/sec) C koncentráció (mol/cm 3 ) D tengely irányú diffúzió, illetve diszperziós koefficiens (cm 2 /sec) L kapilláris hossza (cm; szívben cm) t idő (sec) x távolság a kapillárisban (cm) V egy terület térfogata (ml) V megoszlási térfogat egy adott területen (ml) α plazmaáramlás sebessége (cm/sec);=f p *L 4

6 1 Összefoglalás Myocardialis ischaemia során egy összetett védekező rendszer aktiválódik, melynek lokálisan (parakrin) és szisztémásan (endokrin) ható alkotóelemeit tanulmányoztuk humán és experimentális vizsgálataink során. Ezek egyik kitüntetett eleme a pericardialis tér volt, melynek a szívműködés szabályozásában betöltött szerepe az elmúlt évek során körvonalazódott. Leírtuk a pitvari nátriuretikus hormon (ANP) koncentrációviszonyait a szívizomszövetben, a plazmában és a pericardialis folyadékban, továbbá vizsgáltuk az ANP-szintek változásait különböző klinikai állapotokban. Feltételezésünk szerint a pericardialis folyadéktér kinetikai szempontból az interstitialis térhez kötött, és a pericardialis folyadékban mért anyagkoncentrációk talán e nehezen hozzáférhető területről is indirekt felvilágosítást adhatnak. Elemeztük a folyadék-kompartmentek közötti anyagcsere-kapcsolatokat, és egy matematikai modellt készítettünk, mellyel az interstitialis folyadék egyes alkotóelemeinek koncentrációját becsülhetjük meg a pericardialis folyadékban és a vérplazmában mért szintjeik függvényében. Az ismert endokrin tényező, a parathormon coronariadilatatióban játszott szerepét elemezve megállapítottuk, hogy a camp rendszert és az L-típusú Ca csatorna inaktivációt involváló reakcióutak közötti kapcsolatot a K ATP csatornák jelenthetik a peptid cellularis hatásmechanizmusának kifejtése során. A NO prekurzor L-arginin cardioprotectiv hatását igazoltuk szisztémás adás mellett hypothermiás szívmegállást követő reperfúzió során. Emellett kimutattuk jelentőségét az endothelialis funkció javításában mind ischaemia-reperfúziós folyamatokat követő, mind az agyhalál jelenségéhez kapcsolódó endothel diszfunkció kialakulása során. Vizsgálataink eredményei alapján a vasoactiv ágensek szerepe a cardioprotectio mechanizmusában jelentős, részletes ismeretek birtokában, alkalmazásukkal a klinikai terápiás lehetőségek tovább bővíthetők. 5

7 2 Summary The aim of our human and experimental studies was to examine the local (paracrine) and systemic (endocrine) components of the complex protective mechanism that activates during myocardial ischaemia. Recently the role of pericardial fluid in cardiac regulation became certain, that s why we have paid special attention on its function. We characterized the atrial natriuretic peptide (ANP) concentrations of human myocardial tissues, in blood plasma and in pericardial fluid, moreover we analyzed the relationship between ANP levels and some special clinical conditions. Theoretically, pericardial fluid may reflect the composition of interstitial fluid, thus concentrations measured in pericardial fluid samples may indirectly provide information about the interstitial space. To present opportunity even to esteem the composition of interstitial fluid we composed a mathematical model using blood plasma samples and pericardial fluid samples to calculate interstitial concentrations. Moreover we characterized the role of the well known endocrine factor parathyroid hormone in coronary dilation and concluded that in addition to the activation of the intracellular camp system and inactivation of the L-type Ca channels described in connection with parathyroid hormone-induced coronary responses ATP-sensitive potassium channels may play an integrative role in the intracellular mechanisms of action of the peptide. In further studies we demonstrated the cardioprotective effect of the NO precursor L-arginin after reversible deep hypothermic ischaemia and reperfusion even if applied systemically. In addition, beneficial effect on endothelial function was proved during ischemic-reperfusion injury, as well as during endothelial dysfunction following brain death. According to our results, the role of vasoactive agents in the mechanism of cardioprotection is considerable, therefore clinical applications based on these molecules may provide new therapeutic potentialities in the near future. 6

8 3 Bevezetés Élettani körülmények között a koszorúerekben a szívizomszövet metabolikus igényét kielégítő mennyiségű vér áramlik. Ischaemiás szívbetegségekben a myocardium vérellátása elégtelenné válik, melynek oka lehet a csökkent véráramlás (coronaria stenosis vagy occlusio), vagy a megnövekedett perfúziós igény (hypertrophiás myocardium). A myocardialis ischaemia egy lokális hypoxiás állapot, ami alapvetően befolyásolja a mitokondriális energiametabolizációs folyamatokat; csökkenti a kreatin-foszfát és ATP szinteket, fokozza a piruvát-laktát átalakulást, ami végül intracellularis acidózishoz vezet. Ezeknek az intracellularis biokémiai változásoknak az eredménye, hogy csökken a myocardialis kontraktilitás, továbbá elektromos vezetési zavarok jönnek létre, szívritmuszavarok alakulhatnak ki. A kontraktilitás csökkenése a perctérfogat romlását okozza, ami elsősorban a terhelhetőség csökkenését vonja maga után. A szív pumpafunkcióján túl számos olyan anyagot is termel, melyek közvetlenül befolyásolják önnön működését vagy részt vesznek szisztémás szabályozó folyamatokban (pl: vérnyomás illetve a só- és vízháztartás szabályozásában). Ezek közül legismertebbek a nátriuretikus peptidek, az endothelinek, a renin-angiotenzin rendszer egyes komponensei, a nitrogén monoxid (NO), illetve a prostaglandinok. Ezen ágensek hatásai részben a klasszikus endokrin módon érvényesülnek (pl. a nátriuretikus peptidek); de feltételezhető, hogy a szív kontraktilitására, vérellátására, a sejtosztódásra és a növekedés folyamataira a substantiák többsége közvetlenül, autokrin/parakrin módon is kifejti hatását. Másrészről, számos, nem a szívben termelődő vasoactiv ágens is befolyásolhatja a koszorúerek működését. Az endokrin szabályozás ezen formájára példa a mellékpajzsmirigyben termelődő parathormon (PTH) hatása, amely elsődlegesen a csontokból történő Ca ++ mobilizációval, illetve foszfátürítés renalis regulációjával a szervezet Ca ++ és a 7

9 foszfátháztartásának szabályozásáért felelős. Emellett azonban kimutatták, hogy a PTH-nak vasodilatator, ezáltal hypotensiv hatása is van, illetve növeli a szívfrekvenciát és a bal kamra kontrakciós erejét. A PTH simaizom sejteken található receptorához kötődve, adenil-cikláz aktiválásával fejti ki vasodilatator hatását. A koszorúerek keringésének autoregulációs szabályozásában fontos szerepet játszik a nitrogén monoxid. A NO erőteljes vasodilatator hatása mellett gátolja a thrombocyta aggregációt, csökkenti a leukocyta adhéziót és gátolja az erek simaizom-proliferációját. A NO képződés elsődleges helyei a coronariák endotheliuma, a cardiomyocyták és az endocardialis sejtek, ahol L-argininből képződik. Az L-arginin-NO tengely fontos szerepet játszik az ischaemia-reperfúziós folyamatok során; növeli a postischaemiás coronaria-áramlást, csökkenti az adhéziós molekulák expresszióját, emellett antioxidáns hatása is feltételezhető. Ismert, hogy első sorban a cardiomyocyták, az endocardium és a vascularis endothelium sejtjei képesek cardioactiv faktorok szintézisére. Míg az endocardium és az endothelium élettani szerepét intenzív kutatások vizsgálják, ez ideig kevés figyelmet fordítottak az epicardium élettani jelentőségére. Az epicardium külső felszínét mesothelsejtek borítják, melyek fejlődéstanilag azonos eredetűek az endotheliummal, ezért feltételezhető, hogy ezek a sejtek is termelnek cardioactiv faktorokat. Ezek az anyagok az interstitialis folyadék közvetítésével eljuthatnak a pericardialis folyadékba és ott feltehetően a lassú eliminációnak köszönhetően akkumulálódnak. A pericardialis folyadékban így kialakuló magas cardioactiv szubsztancia koncentráció hatást gyakorolhat a szív működésére. Az endocardium és a microvascularis endothelium szívizomra kifejtett hatása, valamint a szívizomsejtek egymás közötti interakciója mellett, az epi- és pericardialis mesothel sejtek által termelt ágensek is jelentősen befolyásolhatják a szívműködést. Mindezek alapján joggal feltételezhető, hogy a szívben több egymással szoros kapcsolatban lévő autokrin/parakrin mechanizmus létezhet. 8

10 Ezen megfontolások alapján vizsgálatainkban a myocardialis ischaemia során cardioprotectiv szerepet játszó vasoactiv ágensek hatását elemeztük, a coronaria keringés lokális szabályozása mellett kiemelt figyelmet fordítva a pericardialis tér regulátor funkciójára. 3.1 Pitvari nátriuretikus peptid (ANP) A nátriuretikus peptid családot három olyan molekula alkotja, melyek hasonló karakterisztikájú aminosav szekvenciával és hurkolt szerkezettel rendelkeznek: az atrialis nátriuretikus peptid (ANP), az agyi (brain) nátriuretikus peptid (BNP) és a C-típusú nátriuretikus peptid (CNP). Az ANP és a BNP első sorban a szívizomszövetben termelődik, a CNP a központi idegrendszer neuronjaiban és a vascularis endotheliumban (1). A BNP élettani hatásai többségükben megegyeznek az ANP hatásaival, azonban plazmakoncentrációja érzékenyebben reagál a szívelégtelenség progressziójára (2) Molekuláris biológia De Bold és munkatársai 1981-ben megfigyelték, hogy pitvari izomszövet kivonatot infúzióban juttatva patkányok keringésébe, az állatok natriuresise és diurézise jelentősen megnőtt (3). Ez a felfedezés vezetett az ANP izolálásához és klónozásához, mely az első tagja volt egy olyan peptid-családnak, ami nátriuretikus, diuretikus és vasorelaxans aktivitással rendelkezik. Az ANP szintézise első sorban a pitvari cardiomyocytákban történik, azonban a kamrákban is kimutatható kis mértékű ANP képződés (4). Az ANP molekula prekurzora a 126 aminosavból álló proanp molekula, ami biológiailag inaktív és a szívizomsejtek granulumaiban tárolódik. Megfelelő szignál hatására membránhoz kötött proteázok a proanp-t tovább hasítják egy N-terminális darabra (ANP [1-98]), és egy C- terminális peptidre (ANP [99-126]) (5). A biológiailag aktív ANP ez utóbbi, 28 aminosavat tartalmazó peptid, mely jellemzője a 17 aminosavat 9

11 tartalmazó gyűrű, amit egy diszulfid-híd zár két cisztein molekula között (1. ábra). A humán plazmában meglehetősen magas a proanp N-terminális szegmentjének koncentrációja (az ANP szintjének több, mint 20-szorosa). Ez feltehetően a keringésből történő lassabb eliminációjának köszönhető, ennek ellenére az N- és a C- terminálisok plazmában mért koncentrációja erősen korrelál (6). Emellett a vesékben is kimutatható az ANP gén expressziója, melynek során egy alternatív képződési útvonalon a proanp molekulából egy 32 aminosavból álló peptid keletkezik, az urodilatin (ANP [95-126]). Ennek feltehetően a vese lokális nátrium- és 1. ábra: A pitvari nátriuretikus peptid vízháztartás szabályozásában van biológiailag aktív formája; ANP [99-126] szerepe (7). A normál plazma ANP koncentrációja 10 és 60 pg/ml között van. Az ANP felezési ideje a plazmában 2-5 perc. Eliminációjában majdnem minden szövet részt vesz; így a tüdők, a vesék, a gastrointestinalis rendszer, illetve a nagyobb izomtömegek. Az ANP lebontása két úton történik; az egyik során egy neutrális endoproteáz (NEP) hasítja, így hozva létre a csökkent aktivitású nyílt láncú formát. A másik esetben ún. clearance receptorok (NPR-C receptor) kötik meg az ANP-t a plazmából, a receptor-ligand komplex átjut a sejtmembránon és a ligandot lizoszómák hidrolizálják (8) Élettani és patofiziológiás jelentőség Az ANP szekréció legfontosabb meghatározója a pitvari falfeszülés. Bár a pitvari nyomás változása is pozitívan korrelál a plazma ANP koncentrációjával, kimutatták, hogy a pitvari transmuralis nyomás, így a falfeszülés, az elsődleges meghatározója a keringő ANP mennyiségének 10

12 (9). A pitvari falfeszülés növekedésével különböző endogén faktorok is felszabadulnak, melyek szintén befolyásolhatják az ANP szekrécióját. Ilyen az endothelin-1 (ET-1) és az angiotensin II (AT-II), melyek fokozzák az ANP szekréciót, illetve a NO, ami csökkenti ezt (10). Az ANP által létrehozott különböző hatások célja akut és krónikus körülmények között a szisztémás vérnyomás és az intravascularis folyadék mennyiségének csökkentése. Az ANP-nek két fő érhatása van; fokozza a plazma redisztribúcióját az extravasalis térbe, és vasodilatatiót okoz, feltehetően a vascularis simaizmok intracellularis Ca ++ koncentrációjának csökkentésével. Az ANP emellett csökkenti a perifériás erek szimpatikus tónusát. Az ANP a vesékben hyperfiltratiót és natriuresist okoz (kapcsolódó kaliuresis nélkül); a gyűjtőcsatornák Na + és vízvisszaszívásának gátlásával. Csökkenti a macula densa renin szekrécióját, csökkenti a keringő AT-II szintjét, és direkt gátló hatása van a zona glomerulosa aldoszteron szekréciójára (8). A centrális vénás nyomás emelkedésével járó állapotokban emelkedik a vér ANP koncentrációja, és ez az intra-atrialis nyomás, illetve pitvari falfeszülés ANP szekrécióban játszott meghatározó szerepét bizonyítja. Az emelkedett plazma ANP koncentráció részben a pitvarok fokozott ANP szintézisének következménye, ugyanakkor kialakulásában a peptid eliminációja is meghatározó, ami clearance receptorokhoz kötődve vagy a neutrális endopeptidáz hidrolízisével történhet. Az ANP felezési ideje a keringésben viszonylag rövid. Hasonlóan az ANP-hez, emelkedett BNP vérkoncentrációkat is mértek szívbetegekben. A BNP eliminációja az ANPhez hasonlóan clearance receptorokon és neutrális endopeptidáz útján történik, felezési ideje a keringésben szintén rövid. Ezek alapján nem meglepő, hogy jelentősen emelkedett ANP és BNP plazma koncentrációk mérhetők jelentős intravasalis volumenterhelés, emelkedett centrális vénás nyomás, tachycardia és csökkent veseműködés mellett. A különböző betegség típusokat, illetve az ezeken belüli egyes stádiumokat vizsgálva komoly különbségeket tapasztalhatunk (1. táblázat). 11

13 Ezek a különbségek az egyes kórképek eltérő patofiziológiai eredetével magyarázhatók. ANP BNP Esszenciális hypertonia Tachycardiák Szívelégtelenség Izolált diastolés diszfunkció Mitralis stenosis Aortastenosis Dilatatív cardiomyopathia Hypertrophiás cardiomyopathia nem obstruktív obstruktív Myocardialis infarctus beteg felvételekor a felépülés során Krónikus veseelégtelenség dialízis kezelést igénylő dialízis kezelést nem igénylő 1. táblázat: Plazma ANP és BNP szintek néhány cardiovascularis betegségben (Sagnella 1998, átdolgozva). A jelek a relatív növekedés közelítő értékeit mutatják a megfelelő kontrollokhoz viszonyítva: kisebb, mint 3-szoros; kb szeres; kb szoros; nagyobb, mint 30-szoros. Mindemellett, emelkedett plazma nátriuretikus peptid koncentrációkat mértek esszenciális hypertoniás betegekben is, ami azért érdekes, mert az esszenciális hypertonia nem jár jelentős vértérfogat emelkedéssel; bár ilyen betegekben normális pumpa funkció mellett- a centrális vénás nyomás és a pulmonalis kapilláris nyomás emelkedését tapasztalták (11). Az emelkedett praeload a hypertrophiás szívizom ANP és BNP termelését fokozza; részben ez okozhatja a plazma ANP szintek szignifikánsan 12

14 emelkedett koncentrációit. A plazma BNP főként a kamrákból származik. Fiziológiás körülmények között az ANP plazma koncentrációja sokkal magasabb, mint a BNP koncentráció; azonban szívelégtelenségben a plazma BNP szintje eléri, sőt meghaladja az ANP szintjét, ami a szívelégtelenségben jelentkező kamrai és pitvari túlterhelést mutatja (2). Ezen túl, a szívelégtelenség különböző stádiumaiban levő betegek plazma ANP és BNP koncentrációit vizsgálva, korreláció mutatható ki a koncentrációk és a kamrai diszfunkció között (12). Az ANP hatására a plazmából folyadék lép ki az extravasalis térbe, ami szívelégtelenség során szerepet játszik a perifériás oedema képződésben. A plazma ANP és BNP szintjei mellett a N-terminális ANP is jól jellemzi a bal kamrai szisztolés funkció csökkenését; hosszú felezési ideje miatt első sorban a hosszú távú ANP-termelésről ad tájékoztatást (13). Myocardialis infarctus után emelkedett ANP és BNP koncentrációk mérhetők a plazmában. A myocardialis infarctus korai fázisában jelentősen emelkedett (kb. 60-szoros) plazma BNP koncentrációkat mértek, míg a plazma ANP koncentrációja csak kisebb (kb. 3-szoros) mértékben emelkedett a kontroll értékekhez képest. Az ANP plazma szintje az infarctus tüneteinek megjelenése utáni 8 órán belül már a legmagasabb értéket mutatta, és ez a folyamatosan csökkent a normál érték eléréséig, amit az első 24 órán belül ért el. A BNP plazma szintjében gyors emelkedés volt tapasztalható, a csúcsot kb. 20 órával a tünetek első megjelenése után érte el. A plazma ANP szintekben továbbá második csúcs is megjelenhet az infarctus subacut fázisában (bifázisos időbeni lefutás), aminek lehetséges magyarázata, hogy a később gyorsan, nagy mennyiségben ürített ANP szintézisében és szekréciójában már a kamrák is részt vesznek (14). A vérplazma mellett a pericardialis folyadékban is kimutatták az ANP-t, és szívműtétre kerülő betegek pericardialis folyadékát vizsgálva jelentős különbség mérhető a plazma, illetve pericardialis folyadék ANP szintjei között (15). 13

15 3.2 A pericardialis folyadéktér A pericardium a szívet körülölelő zsák elsődleges szerepe a szív mellüregben elfoglalt helyének megtartása, izolációja a szomszédos szervektől (pl. gyulladások esetén) és védelme az esetleges mechanikai behatásoktól. Határt szab a szívtérfogat akut növekedésének, pl. papillárisizom ruptura, pulmonalis embolia esetén mintegy ellentartva az emelkedett kamrai végdiasztolés nyomásnak. Emellett limitálja a verőtérfogat nagyságát szívmegnagyobbodás esetén, krónikus szívelégtelenségben. A pericardialis zsákot kitöltő folyadék, mintegy kenőanyag csökkenti a szív és a pericardium közötti súrlódást, és ezt a hatást pericardium által termelt foszfolipid surfactant anyagok tovább fokozzák. A pericardialis folyadék egészen az elmúlt időkig csak csökkent, illetve kórosan megemelkedett állapotával hívta fel magára a klinikus orvos figyelmét. Az elmúlt évek élettani kutatásai azonban rámutattak, hogy a pericardialis folyadék is nagy számban tartalmaz olyan biológiailag aktív molekulákat, melyek szerepét korábban csak a keringésben tartották meghatározónak. Ezek az eredmények arra késztették a fiziológusokat, hogy a pericardialis folyadékot egy önálló folyadéktérként kezeljék és feltárják kapcsolódási pontjait a szervezet élettanilag fontos kompartmentjeihez; így a keringő vérhez, pericardiumot alkotó sejtekhez, szívizomsejtekhez és az interstitialis térhez A pericardialis folyadék összetétele A pericardialis folyadék emberben kb ml serosus folyadék, melyet a pericardium termel; fehérje- és ionösszetétele nagyjából megfelel egy plazma ultrafiltrátumnak. A pericardium termeli, de a myocardialis interstitialis folyadék és a myocardialis nyirokelvezetések alkotói is megtalálhatóak benne (16). A pericardialis folyadék ozmolaritása alacsonyabb a plazmáénál; fehérje tartalma mintegy harmada a plazmában mértnek. Magyar szerzőktől származik az a közel harminc éves gondolat, hogy a pericardialis térben fellelhető ágensek 14

16 egyszersmind a biológiai szabályozás hatótényezői is lehetnek (17). A pericardialis folyadékban mért, a plazmában mértnél magasabb peptid és más makromolekula koncentrációk azonban azt jelzik, hogy az itt megtalálható makromolekulák elsődleges forrása nem lehet a vérplazma (18,15,19,20). Irodalmi adatok alapján, szívműtétre kerülő betegekben a plazmaszintnél nagyságrendekkel nagyobb pericardialis folyadék ET-1 koncentrációk mérhetők (21,15), és hasonló eredmények születtek adenin nukleozidokat (22), illetve ferritint (20) vizsgálva is. Bár ezeknek az anyagoknak sem pontos keletkezési helye, sem a szívműködésben betöltött szerepe nem eléggé ismert, feltételezhetően hatással vannak a szívben lejátszódó biológiai folyamatokra (23). A pericardialis folyadékban jelen levő endothelin-1 szerepet játszhat a koszorúerek véráramlásának szabályozásában (24), illetve aritmiák kialakulásában (25,26), míg az adenin nukleozidok (adenin+inozin) az ischaemiás szívizom vérellátásának kompenzációs szabályozásában vehetnek részt. Ez utóbbi feltételezést támasztja alá, hogy koszorúér betegek pericardialis folyadékában szignifikánsan magasabb adenin nukleozid koncentrációk mérhetők, mint billentyű betegek pericardialis folyadékában (22). Az ANP esetében a helyzet nem ennyire egyértelmű. Kis betegszámú vizsgálatokban humán pericardialis folyadékban a plazma szintnél sokkal alacsonyabb ANP koncentrációkat mértek (27), amit későbbi vizsgálatok azonban nem tudtak megerősíteni (18,15). A pericardialis folyadékban jelen levő ANP a koszorúserek tónusának szabályozásában játszhat szerepet (28) Anyagcsere a pericardialis folyadéktérben A pericardialis folyadék nagy számban tartalmaz olyan biológiailag aktív molekulákat, melyek szerepét korábban csak a keringésben tartottak meghatározónak. Ezek a megfigyelések adtak alapot arra, hogy a pericardialis folyadékot egy önálló folyadéktérként kezeljék és feltárják kapcsolódási pontjait a szervezet élettanilag fontos kompartmentjeihez; 15

17 így a keringő vérhez, pericardiumot alkotó sejtekhez, szívizomsejtekhez és az interstitialis térhez. Az interstitialis tér összetevőinek közvetlen meghatározása jelen ismereteink szerint biztonsággal nem megoldható, ezért a biológiailag hozzáférhető folyadékterek vizsgálatával és matematikai eljárások kidolgozásával lehet koncentráció-viszonyait megbecsülni (29). Az élettani folyamatok matematikai modellezésére olyan kisméretű molekulák alkalmasak, melyek jól követhetően (mérhetően) vesznek részt a szabályozó folyamatokban. Ezen megfontolások alapján az adenin-nukleozid rendszer vizsgálata megfelelő választásnak tűnik, mert jelentős szerepe van a koszorúerek metabolikus adaptációjában, emellett a felszabaduló, kis molekulatömegű adenozin (ADO) és inozin (INO) az epicardialis felszínen keresztül szabadon diffundál, a pericardialis térben felhalmozódik és mennyisége ezáltal könnyen meghatározható (30). Feltételezésünk szerint, az epicardialis felszínen történő szabad molekulaáramlás következtében az interstitialis és pericardialis folyadék között egyensúly alakul ki a nukleozidok tekintetében (31). Így, a pericardialis folyadék nukleozid koncentrációja jól reprezentálhatja az interstitialis viszonyokat. Az ADO mind a normál, mind az ischaemiás szívizomsejtekben folyamatosan termelődik, és választódik ki az interstitialis folyadékba. A szívizom ADO termelését az O 2 igény és ellátás közötti egyensúly megbomlása fokozza, ezáltal nő a sinus coronariusba ürített mennyiség. Az ADO fő forrása az intracellularis AMP, aminek a koncentrációja függ az intracellularis ATP mennyiségétől, illetve a sejt energetikai állapotától. Így, ha fokozódik az ATP hidrolízise vagy csökken az ATP szintézis mértéke, a sejt energetikai töltöttsége is csökken, és nő az AMP koncentrációja (32). Az AMP-t az 5 nukleotidáz enzim defoszforilálja, így képződik az ADO. Kimutatták, hogy a sejtek energia szintjét csökkentő ingerek (pl. hypoxia, ischaemia vagy munkavégzés) nagyban fokozzák ezen enzim működését és ezen keresztül serkentik az AMP ADO átalakulást. Az 5 nukleotidáz enzim megtalálható a cytosolban (cytosol 5 nukleotidáz) és a szívizomsejtek felszíni membránján is (ecto 5 nukleotidáz). Ezért ADO 16

18 keletkezhet intracellularisan és extracellularisan is az AMP lebontásával. A cardialis ADO képződés első sorban a szív ereinek endotheliumára és a cardiomyocytákra lokalizálható. Intracellularisan ADO képződhet transzmetiláció útján is, S-adenozil-homocisztein (SAH) hidrolízisével, amely során ADO és homocisztein keletkezik. Ezt a reakciót a SAH hidroláz enzim katalizálja. Az ezen az úton képződő ADO mennyisége nagyjából megfelel annak a mennyiségnek, ami a szívben keletkezik normoxiás állapotban, és úgy tűnik nem változik számottevően hypoxia során (33). Ezek alapján feltételezhetjük, hogy az 5 nukleotidáz általi AMP defoszforiláció a felelős a fokozott ADO képződésért hypoxiás állapotban. Tehát, a transzmetilációs útvonal a hypoxián kívüli állapotok egyik jelentős szabályozó tényezője (34). A két folyamat dinamikáját mutatja a 2. ábra. Epicardium Parietális pericardium Normoxia Hypoxia INTRAVAZÁLIS TÉR MET HCYS SAM ATP ADP INO ADO ADOdeamináz SAH 5 ' nukleotidáz AMP SZÍVIZOMSEJT ADO-deamináz ADO INO C diffúzió C ADO INO ADOdeamináz ADOdeamináz INTERSTICIÁLIS TÉR diffúzió diffúzió ADO INO PERICARDIÁLIS TÉR 2. ábra: Adenin nukleozidok képződése a szív pericapillaris szöveteiben Az ADO inaktiválása három úton történhet: az ADO kináz AMP-vé foszforilálja (így kerülhet vissza az ATP raktárba), az ADO deamináz inozinná alakítja vagy kikerül a keringésbe. Fiziológiás koncentrációban az ADO első sorban AMP-vé alakul, ennél nagyobb koncentrációnál azonban 17

19 deaminálódik, és inozin lesz belőle. Az ADO átalakulhat adeninné is, amiből utána ugyancsak AMP lehet. Ez a mentő (salvage) út szintén az intracellularis adenin nukleotid raktárak feltöltődését szolgálja. Az ADO képződése az 5 nukleotidáz által történhet a szívizomsejtekben, az endothel sejtekben, illetve a vörösvértestekben, azonban az ADO deamináz megtalálható extracellularisan is (34). INO a szívben az ADO deamináz hatására képződik elsősorban akkor, amikor az ADO a fiziológiás koncentrációt meghaladó mennyiségben van jelen. Az INO lebomlása során hypoxantinná alakul, amely foszforilálódik és IMP-vé alakul. Az IMP-ből transzmetiláció során AMP keletkezik, mely az intracellularis nukleotid raktár feltöltését szolgálja. Feltételezésünk szerint az öt legfontosabb paraméter (myocardialis, endothelialis, pericardialis, vénás keringési és interstitialis ADO koncentráció) egymással szoros összefüggésben változik. Amennyiben a köztük fennálló kapcsolatot helyesen, kellő pontossággal le tudjuk írni, akkor egy ismeretlen érték a többi ismeretében kiszámítható. 3.3 Parathormon (PTH) A humán parathyreoidea-hormon, (parathormon, PTH) 84 aminosavat tartalmazó lineáris polipeptid. A szervezet kalcium homeosztázisának fenntartásában betöltött szerepe jól ismert. Ugyanakkor számos kísérlet kimutatta a PTH, és annak biológiailag aktív aminoterminális fragmentjének, a PTH 3. ábra: A parathormon [1-34] szerkezete (1-34)-nak vasodilatator, következetesen hypotensiv hatását (35). Crass és munkatársai elsőként figyelték meg, hogy intracoronariásan adott PTH dózisfüggő vasodilatatiót hoz létre (36). Később leírták, hogy a peptid nagyobb dózisai növelik a 18

20 szívfrekvenciát és a bal kamra kontrakciós erejét is (37). Nyilvánvalóvá vált, hogy a PTH vasoactiv peptid, mely szignifikáns cardiovascularis hatásokkal is rendelkezik Vascularis hatások A PTH vascularis hatását jellemző irodalmi adatok szerint a peptid számos érterületen fejt ki értágító hatást, a különböző artériás szegmentek válaszkészsége azonban eltérő (38). A peptid gyakorlatilag hatástalannak bizonyult izolált impedanciaerek (pl. az aorta) relaxálásában, hatása főként a kisartériákra és precapillaris erekre korlátozódik (39). A vasodilatatiót nem gátolják sem az alfa- és béta adrenerg, kolinerg-, dopaminerg-, sem a hisztaminerg-receptor antagonisták, és a hatás közvetítésében az endogén vasoactiv mediátorok szerepét is kizárták (40,41). Nickols és munkatársainak sikerült azonosítani az ér simaizomsejteken lévő PTH receptorokat (39). A hormon vascularis hatása tehát szintén valódi (a PTH klasszikus célsejtjein lévő receptorokhoz mindenben hasonló) PTH receptorokon keresztül valósul meg, és PTH receptor antagonistákkal kompetitíven gátolható. A PTH vascularis simaizomra kifejtett relaxáló hatása kifejtéséhez nem igényel intakt endotheliumot, és nem függ az endothel sejtekből felszabaduló EDRF (endothelium-derived relaxing factor) -tól sem. Hatása tehát az ér simaizomsejtekre kifejtett direkt hatásnak tulajdonítható (39,40). Mindmáig tisztázatlan azonban a vasodilatatio sejtszintű hatásmechanizmusa. Egyes adatok szerint a vasodilatator képesség legalábbis részben az adenil-cikláz stimulálása révén valósul meg. A PTH (1-34) ugyanis mind simaizom szövetmintában, mind izolált simaizomsejtekben serkenti a ciklikus AMP (camp) képződését (42). Más kutatócsoportok viszont az intracellularis Ca ++ tartalom változásának tulajdonítanak jelentőséget a peptid indukálta érrelaxáció kialakulásában. A feszültség-függő Ca csatorna blokkolásának eredményeként létrejövő sejten belüli szabad kalciumszint csökkenés szintén magyarázhatja a peptid indukálta 19

21 érrelaxációt (43,44). E kétfajta megközelítés egymással látszatra éppen ellentétes irányultságú, noha mindkettőre vannak bizonyítékok. Jelen vizsgálataink kiindulópontjaként a magunk részéről felvetettük, hogy a hiányzó, a többoldalú hatásmechanizmust integráló elem a peptidnek a membrán ATP-függő K + csatornára (K ATP ) kifejtett effektusa lehet K ATP csatornák szerepe a coronariakeringés szabályozásában A K ATP csatornák, melyek szerepét a coronaria keringés modulálásában számos vizsgálati eredmény bizonyítja (45,46,47), univerzális alkotóelemei a sejtmembránnak, és mivel nem feszültség-, hanem anyagcsere-függő struktúrák, igen sajátos sejtmembrán elemet képviselnek. Feltételezhetően a cellularis metabolikus folyamatok és a plazmamembrán elektromos aktivitása közötti kapocs szerepét töltik be. Közös jellemzőjük, hogy az intracellularis ATP hiánya esetén nyitva vannak, annak jelenlétében viszont záródnak. Ezek alapján feltételezhető, hogy a koszorúsereken hypoxiás hatásra lejátszódó adaptáció folyamatok az ATP szenzitív kálium csatornákon keresztül valósulnak meg. A mechanizmus leegyszerűsítve a következő: A koszorúér simaizomsejtek K ATP csatornáinak megnyílása K kiáramlás révén hyperpolarizálja a sejtet. A membránpotenciál növekedése a feszültségfüggő Ca csatornák záródását eredményezi. Ha e csatornákon keresztül megszűnik a Ca beáramlás, az intracellularis Ca szint csökken, és ez a coronaria simaizom relaxációjához vezet. A következmény tehát koszorúér dilatáció, amely véráramlás növekedést eredményez. A K ATP membráncsatorna megnyílásának elindítója az intracellularis ATP szint csökkenése, és erre a "mutatóra" csatolódik vissza negatív feedbackként a koszorúér áramlás növekedése (48). Vizsgálataink során a PTH által kiváltott coronaria dilatatio változását vizsgáltuk a K ATP csatornát specifikusan blokkoló glibenklamid adása mellett. 20

22 3.4 L-arginin Az L-arginin aminosav a NO prekurzor molekulája. L-argininből és molekuláris oxigénből a nitrogén-monoxid-szintáz (NOS) enzim hatására NO képződik (49). A NOS-nak három formája ismert. Az egyik az élettani körülmények között elsősorban endothelsejtekben, cardiomyocytákban és endocardialis sejtekben állandóan jelenlevő, kalcium hatására aktiválódó, konstitucionális forma (enos), ami felelős a folyamatos NO termelésért és kibocsátásért. A másik, a kóros körülmények (pl.: fertőzések, gyulladások, tumor) hatására expresszálódó, indukálható enzimforma (inos), ami első sorban macrophagokban, lymphocytákban és a vascularis simaizomban képződik. Az inos lényegesen nagyobb mennyiségű NO termelésére képes és feltehetően közreműködik az immunrendszer védekező mechanizmusában. Ezek mellett ismert még az idegsejtek NO képzéséért felelős izoforma, az nnos (50). A NO lebomlása során oxidálódik és nitritté alakul, majd oxigenált hemoglobin hatására gyorsan nitrát lesz belőle (51). A NO intracellularis jelátvitelben betöltött szerepét közel 30 évvel ezelőtt írták le (52), és 1998-ban orvosi és élettani Nobeldíjjal jutalmazták Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro és Ferid Murad gyógyszerkutatókat, akik kimutatták, hogy a NO az élő szervezet fontos, funkcionális alkotó eleme, ingerközvetítő szignálja. Az elmúlt évtizedekben számos vizsgálat foglalkozott a NO keringés szabályozásában elfoglalt helyével, majd az atherosclerosis megelőzésében játszott szerepével. Kimutatták jelentőségét az értónus regulációjában; a reaktív 4. ábra: az L-arginin lebontása és a NO degradációja hyperaemia, a myogen vasodilatatio, az 21

23 acetilkolin és a bradykinin hatás mind NO mediálta folyamatok (53). Emellett bizonyítást nyert, hogy az ischaemiás prekondíció jelenségében is meghatározó tényező; az első és a második védelmi ablakok (first and second window of protection) élettani folyamataiban a reperfúziós aritmiák kialakulásának gátlásával és coronariaáramlás fokozásával (54,55). Továbbá leírták, hogy a NO-független vasodilatatio (metabolikus vagy myogen hatás) fokozza a nyíróerőt az erekben, ez enos aktivációt indukál, ennek hatására fokozódik a NO kiválasztás és a továbbiakban ez tartja fent a vasodilatatiot (56). Emellett a NO fizikai terhelés alatt is fontos regulátor szerepet játszhat, mert a fokozott nyíróerő és az emelkedett pulzusnyomás fokozza a NO-szintézist (57). Az L-arginin-NO tengely fontos szerepet játszik az ischaemia-reperfúziós folyamatok során (58), vazodilatátor hatása mellett gátolja a thrombocyta aggregációt, csökkenti a leukocyta adhéziót, gátolja az erek simaizom-proliferációját és antioxidáns hatása is feltételezhető (59,60) Protektív hatás a reperfúziós károsodás ellen Az ischaemiás-reperfúziós károsodás ismert jelenség a szívsebészetben. A myocardium teljesítőképessége a műtétet követő első néhány órában nem csak a betegek perioperatív állapotát határozza meg, hanem befolyásolja a hosszú távú kilátásokat is. Az ischaemia és a reperfúzió során kialakuló myocardialis károsodások és kontraktilitás csökkenés mellett egyre inkább elfogadott, hogy a szív egészének túlélése a megfelelő szöveti perfúzió, tehát a kielégítő mikrocirkuláció függvénye. Több vizsgálat bizonyítja, hogy a microvasculatura védelme mellett csökkenhet a reperfúziós károsodás (61,62,63). A microvascularis válaszkészség megőrzése különösen fontos a hosszan tartó hypothermiás szívműtétek során. Bár a NO szerepe a cardiovascularis rendszer fiziológiás folyamataiban jól jellemezhető, patofiziológiás állapotokban betöltött funkciója jórészt tisztázatlan. Egyrészről fokozza a postischaemiás véráramlást és 22

24 csökkenti a no-reflow fenomént (amikor az újrainduló véráramlás ellenére sem következik be szöveti reperfúzió), gátolja a leukocyta adhéziót, emellett (superoxid) szabadgyököket köt meg (64,65). Másrészről a NO káros hatásairól is beszámoltak ischaemia-reperfúzió során;pl. negatív inotrop hatás vagy a peroxinitrit képződés gátlása (66). Összességében úgy tűnik, hogy NO prekurzorok alkalmazása új cardioprotectiv koncepciót jelenthet az ischaemiás-reperfúziós károsodások során, melynek lényege, hogy a NO prekurzorok első sorban a reperfúziós fázisban hatnak, és a (micro)vascularis funkció védelmével már a reperfúzió során segítik a myocardium megfelelő felépülését Protektív hatás agyhalál állapotában A szívtranszplantációt követő endotheliális diszfunkció gyakran előforduló jelenség és jelentősen befolyásolja a reperfúziós károsodást, illetve a graft kilökődését (67). Az endotheliális funkció megőrzése tehát alapvető fontosságú a graft gyógyulása szempontjából (63). Az ischaemiásreperfúziós folyamat során kialakuló endothel károsodás szerepet játszik a graft ereinek vasculopathiájában, és így nagy mértékben befolyásolja a szívtranszplantáció sikerét (68,69). A szívtranszplantációt követően jelentkező endotheliális dysfunctio kialakulásában feltehetően szerepet játszik a donor állapota, illetve az agyhalál beálltával a donor szervezetben lezajló cardiovascularis változások (70). A magas intracranialis nyomással, gyorsan létrehozott agyhalál hyperdinámiás keringési reakciót okoz, aminek hátterében átmeneti szimpatikus kisülések, kb. 100-szoros plazma katekolaminszint emelkedés áll (71). Ezt hemodinamikai instabilitás kíséri jelentős vérnyomáseséssel, coronariaáramlás csökkenéssel és hormonális változásokkal (69,70,71,72). A keringési instabilitást feltehetően a katekolaminok indukálta primer cardialis károsodás okozza, de kiváltó okként felvetődött a szimpatikus tónus hirtelen elvesztésével kialakuló nagyfokú szisztémás vascularis rezisztencia csökkenés is (70,73). Továbbá kimutatták, hogy az 23

25 agyhalál állapota a hemodinamikai megingás mellett csökkenti a coronariaáramlást és súlyos endotheliális dysfunkciót okoz (69). A direkt endotheliális szöveti károsodás hátterében katekolamin hatás, illetve a gyorsan kimerülő hormonális működés állhat (71,72). Agyhalál állapotában tehát, olyan humoralis változások lépnek fel, melyek során komoly hemodinamikai instabilitás jelentkezik, és ez a koszorúerek véráramlását, illetve a coronariák endothelialis funkcióját befolyásolhatja. 24

26 4 Célkitűzések Nagy betegszámú vizsgálatban tanulmányoztuk a humán pericardialis folyadék ANP koncentráció változását: összehasonlítottuk a myocardialis ischaemia diagnosztikus jeleit mutató és nem mutató betegcsoportok plazma, pitvar- és kamraszöveti, illetve pericardialis folyadékbeli ANP koncentrációs viszonyait. vizsgáltuk, milyen hatással van az elégtelen szívműködés súlyossága az ANP termelődésére és felszabadulására. elemeztük a nemek szerepét az ANP cardialis hatásainak vonatkozásában. Matematikai modellt készítettünk az interstitialis folyadéktér adeninnukleozid összetételének leírására: megvizsgáltuk, miként jellemezhetők matematikai modell alapján az interstitialis tér adenin-nukleozid koncentráció viszonyai. vizsgáltuk, meghatározható-e a pericardialis adenin-nukleozid koncentráció ismeretében az interstitialis térben jelenlevő koncentráció. Vizsgáltuk parathormon hatására kialakuló koszorúér dilatációt: tanulmányoztuk a K ATP csatornák szerepét a parathormon vascularis hatása során. jellemeztük a K ATP csatornákat specifikusan gátló glibenklamid adására létrejövő vascularis változásokat. Tanulmányoztuk a szisztémásan adott NO prekurzor L-arginin protektív szerepét az ischaemia-reperfúziós károsodások kialakulása során: mély hypothermiás ischaemia alatt leírtuk az L-arginin és lebomlási termékeinek időbeli koncentrációs változásait. 25

27 jellemeztük a kapcsolódó cardialis, pulmonalis és vascularis változásokat. vizsgáltuk az agyhalál során jelentkező endothelialis diszfunkciót és ennek során az L-arginin-NO tengely protektív szerepét a vascularis funkcióra. 26

28 5 Módszerek 5.1 Humán vizsgálatok Vizsgálatainkba 316, a Semmelweis Egyetem Ér-, és Szívsebészeti Klinikáján szívműtétre kerülő beteget vontunk be. Billentyű-, septum defektusos, és szívtumoros betegek alkották a nem ischaemiás (VHD; n=142) kontroll csoportot az ischaemiás szívbetegségben szenvedő (CAD; n=174) betegekkel szemben. Kiválasztásuk során csak az a szempont érvényesült, hogy minél szélesebb diagnosztikus skálán mozogjanak. A betegek átlagéletkora 59±4 év volt. Plazma, pericardialis folyadék, valamint pitvari és kamrai szövetminták kerültek biokémiai analízisre. A vérvétel a rutin vizsgálatokkal együtt történt, a szövetminták pedig a rutin tevékenység során (vénás kanül behelyezése, billentyű eltávolítása) amúgy is eltávolításra kerülnek, így az elvégzett vizsgálatok a betegek számára semmilyen többletterhelést nem jelentettek. Mintavételre minden esetben a betegek felvilágosítása és belegyezése után került sor. A betegeket csoportosítottuk a New York Heart Association (NYHA) ajánlása szerint; így a NYHA I stádiumba 4, NYHA II stádiumba 178, a NYHA III stádiumba 108 és NYHA IV stádiumba 13 beteg került. (Tizenhárom esetben nem állt rendelkezésre információ a beteg NYHA statusáról.) 111 koszorúér beteg esett át korábban myocardialis infarctuson, de az esemény minden esetben a műtétnél legalább egy hónappal régebben történt. A billentyű betegeknél koszorúér betegségre sem klinikai tünetek, sem EKG jel, illetve coronarographiás elváltozás nem utalt. A műtét előtt minden beteg részesült a kórállapotának megfelelő gyógyszeres kezelésben (ACE-gátlók, diuretikumok, digitalis, β-blokkolók, nitrátok). Az altatás minden betegnél azonos módon, midazolam, fentanyl és ketalar iv. adásával történt. Az anaesthesia fenntartására diazepam, fentanyl és droperidol szolgált, az izomrelaxációt pancuronium biztosította. 27

29 A mellkas feltárása (median sternotomia), majd a pericardiumzsák megnyitása után 4-8 ml pericardialis folyadékot gyűjtöttünk egy hajlékony kanül segítségével steril fecskendőbe. Kizárólag vérmentes folyadékmintákat használtunk fel biokémiai meghatározásra. A műtétek során a pericardialis folyadék vételével párhuzamosan szisztémás vénás vért is gyűjtöttünk, heparint és dipyridamol+ehna-t tartalmazó fecskendőbe. Mind a pericardialis folyadékot, mind a vérmintákat azonnal centrifugáltuk, és -20 ºC-on tároltuk a biokémiai mérésekig. A pitvari szövetminták vételére a jobb pitvar kanülálásakor került sor. A kamrai szövetmintákat a billentyűműtétek során eltávolított kóros mitralis vitorla papillaris izmából nyertük. A rutin szívsebészeti eljárásoknak köszönhetően a pitvari és a kamrai szöveti mintavételi helyek betegenként közel azonos helyzetűek voltak. A szövetmintákat ezt követően folyékony nitrogénben -80 ºC-on tároltuk a további vizsgálatokig. 5.2 Experimentális modellek Vizsgálatainkat 37, pentobarbitállal altatott, kg közötti, nyitott mellkasú kutyán végeztük. Valamennyi akut kísérletet a laboratóriumi állatok tartására vonatkozó nemzetközi szabályoknak megfelelően végeztük. Na-pentobarbitallal történő altatást követően az állatokat endotrachealisan intubáltuk, majd gépi lélegeztetést folytattunk. A szisztémás vérnyomás monitorozásához az arteria femoralist preparáltuk és kanüláltuk. Rendszeres vérgáz elemzéssel követtük a pulmonalis és metabolikus státus változását Parathormon coronaria hatásának vizsgálata A kísérleti állatokon haránt thoracotomiát végeztünk az ötödik bordaközben és a szívet a megnyitott pericardiumban függesztettük fel. A koszorúér áramlást (CBF) a bal elülső leszálló coronarián mértük. Az áramlásmérő fejtől distalisan az eret egy vékony tűvel (23G) pungáltuk a 28

30 szerek intracoronariás adásához, mely manőver a basalis áramlási paramétereket nem befolyásolta. Vizsgálatainkat két kísérletsorozatban végeztük, a kísérleteket négy fázisra osztottuk. Valamennyi fázisban rendre 0.15, 0.44 és 1.33 nmol PTH dózisokat adtunk 1 ml-es intracoronariás bolusok formájában. Az egyik kísérletsorozatban (n=7), az első, kontroll fázis után glibenklamidot adtunk fázisonként növekvő dózisban, 0.1, 0.3, és 1.0 μmol/perces intracoronariás infúzióban. Mind kontroll fázisban, mind a glibenklamiddal előidézett K ATP csatorna blokád alatt PTH dózis-hatásgörbéket vettünk fel a PTH fenti dózisaival. A kísérletek jelentős időigénye miatt a PTH esetleges hatásvesztésével is számolni kellett, ezért egy időkontroll kísérlet sorozatot (n=6) is végeztünk, melyben glibenklamid helyett fiziológiás sóoldatot infundáltunk. Az első kísérletsorozathoz hasonlóan itt is PTH dózis-hatásgörbéket vettünk fel mind a négy fázisban. Az egyes beavatkozások előtt megvártuk a PTH bolus hatások lecsengését, azaz valamennyi cardiovascularis paraméter visszatérését a kiindulási szintre. A kísérletek során szintetikus, szarvasmarha parathyreoid hormon fragmentet PTH [1-34] (Sigma, USA) alkalmaztunk. A koszorúér relaxáció mértékének jellemzésére az ér rezisztencia reciprokát, a vascularis konduktancia paraméterét alkalmaztuk. Értékét a coronariaáramlás és az artériás nyomás hányadosából képeztük az egyedi adatok alapján. Az így nyert coronaria konduktancia görbék alatti területet jelöltük coronaria konduktancia többletnek. A koronária konduktancia többlet az a nyomástól független virtuális plusz áramlási volumen, amely a vasodilatator válasz során keletkezik. Értékét a konduktancia görbék integrálásával számítottuk L-arginin hatása hypothermiás ischaemiát követő reperfúzió során Kísérleteinkben a motoros szívműtétek során létrehozott hypothermiát modelleztük, ezért minden állaton felfüggesztettük a szívműködést, egy órán át fenntartottuk az extracorporalis keringést, majd elhagytuk a 29

31 szívmotort. A beavatkozásokhoz anterolateralis thoracotomiát és pericardiotomiát követően izoláltuk a nagyereket, majd az artériás kanült a bal arteria subclaviába, a vénás kanült a jobb pitvarba helyeztük. Az extracorporalis keringés emellett állt még egy hőcserélőből, egy vénás reservoir-ból, egy roller pumpából és egy membrán oxigenátorból. A cardiopulmonalis bypass (CPB) bevezetése után a testhőmérsékletet 28 C-ra hűtöttük. Az aorta lefogása után a szívet 25 ml/kg HTK oldattal állítottuk meg, melynek összetétele mmolban: 15 NaCl, 9 KCl, 4 MgCl 2, 6 H 2 O, 18 histidin hydroclorid monohydrat, 180 histidin, 2 tryptophan, 30 mannitol, CaCl 2, 1 kalium-hydrogen-2-oxopentandioat és H 2 O. A szívmegállás alatt a szívmotor áramlása 100 ml/kg/min volt, így a perfúziós nyomás nem esett Hgmm alá a CPB során. Húsz perccel az aorta felengedése előtt megkezdtük a felmelegítést. A szívmegállás 60. percében az aortát felengedtük és a keringető rendszer normothermiás vérével reperfundáltuk a szívet. Szükség esetén DC cardioversiót végeztünk a szív újraindításához. Hat állatnak az aorta felengedésekor a reperfúzió kezdetekor - 40 mg/kg L-arginint (Merck, Németország) adtunk intravénás bolusban, majd további 20 percig intravénás infúzióban 3 mg/kg fenntartó dózisban. Másik hat állat kontrollként fiziológiás sóoldatot kapott, ugyanezen protokoll szerint. Minden állat inotrop támogatási igény nélkül leszoktatható volt a szívmotorról az aorta felengedését követő 20 percen belül. Kísérleti protokollunk szerint minden állat 60 percig volt extracorporalis keringésen, ebből 40 percen át állt a szív, az aorta felengedését követően pedig 40 perc reperfúziós szak következett. A bal és jobb kamrai systolés és diasztolés nyomásokat valamint volumeneket egy 6F Millar konduktancia katéterrel mértük, amit a bal kamra csúcsán, illetve az arteria pulmonalis felől vezettünk fel. Vena cava occlusiókat végezve nyomás-térfogat görbe-sorozatokat készítettünk. A preload recruitable stroke work (PRSW) számításával a kontraktilitás egy preloadtól független mérőszámát kalkuláltuk. A koszorúér áramlást a bal elülső leszálló coronarián mértük. Az coronariák endothelium-dependens 30