Vasoactiv ágensek cardioprotectiv szerepe myocardialis ischaemia során. Dr. Soós Pál

Átírás

1 Vasoactiv ágensek cardiorotectiv szeree myocardialis ischaemia során Doktori értekezés tézisei Dr. Soós Pál 2006 Témavezető: Dr. Horkay Ferenc, PhD, DSc Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Program: Szív- és érrendszeri betegségek élettana és klinikuma

2

3 1 Bevezetés Élettani körülmények között a koszorúerekben a szívizomszövet metabolikus igényét kielégítő mennyiségű vér áramlik. Ischaemiás szívbetegségekben a myocardium vérellátása elégtelenné válik, melynek oka lehet a csökkent véráramlás (coronaria stenosis vagy occlusio), vagy a megnövekedett erfúziós igény (hyertrohiás myocardium). A myocardialis ischaemia egy lokális hyoxiás állaot, ami alavetően befolyásolja a mitokondriális energiametabolizációs folyamatokat; csökkenti a kreatinfoszfát és ATP szinteket, fokozza a iruvát-laktát átalakulást, ami végül intracellularis acidózishoz vezet. Ezeknek az intracellularis biokémiai változásoknak az eredménye, hogy csökken a myocardialis kontraktilitás, továbbá elektromos vezetési zavarok jönnek létre, szívritmuszavarok alakulhatnak ki. A kontraktilitás csökkenése a erctérfogat romlását okozza, ami első sorban a terhelhetőség csökkenését vonja maga után. A szív umafunkcióján túl számos olyan anyagot is termel, melyek közvetlenül befolyásolják önnön működését vagy részt vesznek szisztémás szabályozó folyamatokban (l: vérnyomás illetve a só- és vízháztartás szabályozásában). Ezek közül legismertebbek a nátriuretikus etidek, az endothelinek, a renin-angiotenzin rendszer egyes komonensei, a nitrogén monoxid (NO), illetve a rostaglandinok. Ezen ágensek hatásai részben a klasszikus endokrin módon érvényesülnek (l. a nátriuretikus etidek); de feltételezhető, hogy a szív kontraktilitására, vérellátására, a sejtosztódásra és a növekedés folyamataira a substatiák többsége közvetlenül, autokrin/arakrin módon is kifejti hatását. Másrészről, számos, nem a szívben termelődő vasoactiv ágens is befolyásolhatja a koszorúerek működését. Az endokrin szabályozás ezen formájára élda a mellékajzsmirigyben termelődő arathormon (PTH) hatása, amely elsődlegesen a csontokból történő Ca ++ mobilizációval, illetve foszfátürítés renalis regulációjával a szervezet Ca ++ és a foszfátháztartásának szabályozásáért felelős. Emellett azonban kimutatták, hogy a PTH-nak vasodilatator, ezáltal hyotensiv hatása is van, illetve növeli a szívfrekvenciát és a bal kamra kontrakciós erejét. A PTH simaizom sejteken található recetorához kötődve, adenil-cikláz aktiválásával fejti ki vasodilatator hatását. A koszorúerek keringésének autoregulációs szabályozásában fontos szereet játszik a nitrogén monoxid. A NO erőteljes vasodilatator hatása mellett gátolja a thrombocyta aggregációt, csökkenti a leukocyta adhéziót és gátolja az erek simaizom-roliferációját. A NO kéződés elsődleges helyei a coronariák endotheliuma, a cardiomyocyták és az endocardialis sejtek, ahol L-argininből kéződik. Az L-arginin-NO tengely fontos szereet játszik az ischaemia-reerfúziós folyamatok során; növeli a ostischaemiás coronariaáramlást, csökkenti az adhéziós molekulák exresszióját, emellett antioxidáns hatása is feltételezhető. Ismert, hogy első sorban a cardiomyocyták, az endocardium és a vascularis endothelium sejtjei kéesek cardioactiv faktorok szintézisére. Míg az endocardium és az endothelium élettani szereét intenzív kutatások vizsgálják, ez ideig kevés figyelmet fordítottak az 1

4 eicardium élettani jelentőségére. Az eicardium külső felszínét mesothelsejtek borítják, melyek fejlődéstanilag azonos eredetűek az endotheliummal, ezért feltételezhető, hogy ezek a sejtek is termelnek cardioactiv faktorokat. Ezek az anyagok az interstitialis folyadék közvetítésével eljuthatnak a ericardialis folyadékba és ott feltehetően a lassú eliminációnak köszönhetően akkumulálódnak. A ericardialis folyadékban így kialakuló magas cardioactiv szubsztancia koncentráció hatást gyakorolhat a szív működésére. Az endocardium és a microvascularis endothelium szívizomra kifejtett hatása, valamint a szívizomsejtek egymás közötti interakciója mellett, az ei- és ericardialis mesothel sejtek által termelt ágensek is jelentősen befolyásolhatják a szívműködést. Mindezek alaján joggal feltételezhető, hogy a szívben több egymással szoros kacsolatban lévő autokrin/arakrin mechanizmus létezhet. Ezen megfontolások alaján vizsgálatainkban a myocardialis ischaemia során cardiorotectiv szereet játszó vasoactiv ágensek hatását elemeztük, a coronaria keringés lokális szabályozása mellett kiemelt figyelmet fordítva a ericardialis tér regulátor funkciójára.

5 2 Célkitűzések Nagy betegszámú vizsgálatban tanulmányoztuk a humán ericardialis folyadék ANP koncentráció változását: összehasonlítottuk a myocardialis ischaemia diagnosztikus jeleit mutató és nem mutató betegcsoortok lazma, itvar- és kamraszöveti, illetve ericardialis folyadékbeli ANP koncentrációs viszonyait. vizsgáltuk, milyen hatással van az elégtelen szívműködés súlyossága az ANP termelődésére és felszabadulására. elemeztük a nemek szereét az ANP cardialis hatásainak vonatkozásában. Matematikai modellt készítettünk az interstitialis folyadéktér adenin-nukleozid összetételének leírására: megvizsgáltuk, miként jellemezhetők matematikai modell alaján az interstitialis tér adenin-nukleozid koncentráció viszonyai. vizsgáltuk, meghatározható-e a ericardialis adenin-nukleozid koncentráció ismeretében az interstitialis térben jelenlevő koncentráció. Vizsgáltuk arathormon hatására kialakuló koszorúér dilatációt: tanulmányoztuk a K ATP csatornák szereét a arathormon vascularis hatása során. jellemeztük a K ATP csatornákat secifikusan gátló glibenklamid adására létrejövő vascularis változásokat. Tanulmányoztuk a szisztémásan adott NO rekurzor L-arginin rotektív szereét az ischaemia-reerfúziós károsodások kialakulása során. mély hyothermiás ischaemia alatt leírtuk az L-arginin és lebomlási termékeinek időbeli koncentrációs változásait. jellemeztük a kacsolódó cardialis, ulmonalis és vascularis változásokat. vizsgáltuk az agyhalál során jelentkező endothelialis diszfunkciót és ennek során az L-arginin-NO tengely rotektív szereét a vascularis funkcióra.

6 3 Módszerek 3.1 Humán vizsgálatok Vizsgálatainkba 316, a Semmelweis Egyetem Ér-, és Szívsebészeti Klinikáján szívműtétre kerülő beteget vontunk be. Billentyű-, setum defektusos, és szívtumoros betegek alkották a nem ischaemiás (valvular heart disease, VHD; n=142) kontroll csoortot az ischaemiás szívbetegségben szenvedő (coronary heart disease, CAD; n=174) betegekkel szemben. A betegek átlagéletkora 59±4 év volt. Plazma, ericardialis folyadék, valamint itvari és kamrai szövetminták kerültek biokémiai analízisre. A vérvétel a rutin vizsgálatokkal együtt történt, a szövetminták edig a rutin tevékenység során (vénás kanül behelyezése, kóros billentyű eltávolítása) amúgy is eltávolításra kerülnek, így az elvégzett vizsgálatok a betegek számára semmilyen többletterhelést nem jelentettek. Mintavételre minden esetben a betegek felvilágosítása és belegyezése után került sor. A betegeket csoortosítottuk a New York Heart Association (NYHA) ajánlása szerint; így a NYHA I stádiumba 4, NYHA II stádiumba 178, a NYHA III stádiumba 108 és NYHA IV stádiumba 13 beteg került. 111 koszorúér beteg esett át korábban myocardialis infarctuson, de az esemény minden esetben a műtétnél legalább egy hónaal régebben történt. A billentyű betegeknél koszorúér betegségre sem klinikai tünetek, sem EKG jel, illetve coronarograhiás elváltozás nem utalt. A itvari szövetminták vételére a jobb itvar kanülálásakor került sor. A kamrai szövetmintákat a billentyűműtétek során eltávolított kóros mitralis vitorla aillaris izmából nyertük. A rutin szívsebészeti eljárásoknak köszönhetően a itvari és a kamrai szöveti mintavételi helyek betegenként közel azonos helyzetűek voltak. 3.2 Exerimentális modellek Vizsgálatainkat 37, entobarbitállal altatott, kg közötti, nyitott mellkasú kutyán végeztük. Valamennyi akut kísérletet a laboratóriumi állatok tartására vonatkozó nemzetközi szabályoknak megfelelően végeztük. Na-entobarbitallal történő altatást követően az állatokat endotrachealisan intubáltuk, majd géi lélegeztetést folytattunk. A szisztémás vérnyomás monitorozásához az arteria femoralist rearáltuk és kanüláltuk. Rendszeres vérgáz elemzéssel követtük a ulmonalis és metabolikus státus változását Parathormon coronaria hatásának vizsgálata Haránt thoracotomiát követően a szisztémás araméterek mellett koszorúér áramlásmérést (CBF) mértünk. Vizsgálatainkat két kísérletsorozatban végeztük, a kísérleteket négy fázisra osztottuk. Valamennyi fázisban rendre 0.15, 0.44 és 1.33 nmol PTH dózisokat adtunk 1 ml-es intracoronariás bolusok formájában. Az egyik kísérletsorozatban (n=7), az első, kontroll fázis után glibenklamidot adtunk fázisonként növekvő dózisban, 0.1, 0.3, és 1.0 µmol/erces intracoronariás infúzióban. Mind kontroll fázisban, mind a glibenklamiddal előidézett K ATP csatorna blokád alatt PTH dózishatásgörbéket vettünk fel a PTH fenti dózisaival. Időkontroll kísérletsorozatot (n=6) is végeztünk, melyben glibenklamid helyett fiziológiás sóoldatot infundáltunk. Az első

7 kísérletsorozathoz hasonlóan itt is PTH dózis-hatásgörbéket vettünk fel mind a négy fázisban. A koszorúér relaxáció mértékének jellemzésére az ér rezisztencia recirokát, a vascularis konduktancia araméterét alkalmaztuk. Értékét a coronariaáramlás és az artériás nyomás hányadosából kéeztük az egyedi adatok alaján. Az így nyert coronaria konduktancia görbék alatti területet jelöltük coronaria konduktancia többletnek. A koronária konduktancia többlet az a nyomástól független virtuális lusz áramlási volumen, amely a vasodilatator válasz során keletkezik. Értékét a konduktancia görbék integrálásával számítottuk L-arginin hatása hyothermiás ischaemiát követő reerfúzió során Kísérleteinkben a motoros szívműtétek során létrehozott hyothermiát modelleztük, ezért minden állaton felfüggesztettük a szívműködést, egy órán át fenntartottuk az extracororalis keringést, majd elhagytuk a szívmotort. A cardioulmonalis byass (CPB) bevezetése után a testhőmérsékletet 28 C-ra hűtöttük. Az aorta lefogása után a szívet 25 ml/kg HTK oldattal állítottuk meg, melynek összetétele mmolban: 15 NaCl, 9 KCl, 4 MgCl 2, 6 H 2 O, 18 histidin hydroclorid monohydrat, 180 histidin, 2 trytohan, 30 mannitol, CaCl 2, 1 kalium-hydrogen-2-oxoentandioat és H 2 O. A szívmegállás alatt a szívmotor áramlása 100 ml/kg/min volt, így a erfúziós nyomás nem esett Hgmm alá a CPB során. A szívmegállás 60. ercében az aortát felengedtük és a keringető rendszer normothermiás vérével reerfundáltuk a szívet. Hat állatnak az aorta felengedésekor - a reerfúzió kezdetekor - 40 mg/kg L-arginint adtunk intravénás bolusban, majd további 20 ercig intravénás infúzióban 3 mg/kg fenntartó dózisban. Másik hat állat kontrollként fiziológiás sóoldatot kaott, ugyanezen rotokoll szerint. Minden állat inotro támogatási igény nélkül leszoktatható volt a szívmotorról az aorta felengedését követő 20 ercen belül. A bal és jobb kamrai systolés és diasztolés nyomásokat valamint volumeneket egy 6F Millar konduktancia katéterrel mértük. A reload recruitable stroke work (PRSW) számításával a kontraktilitás egy reloadtól független mérőszámát kalkuláltuk. A koszorúér áramlást a bal elülső leszálló coronarián mértük. Az coronariák endothelium-deendens dilatatioját acetilkolin (ACH, 10-7 M), endothelium-indeendens dilatatioját nátrium-nitrorussid (SNP, 10-4 M) intracoronariás adásával vizsgáltuk L-arginin hatása agyhalál állaotában Kísérleteinkben az agyhalál állaotát mesterséges intracranialis agynyomás-fokozódás létrehozásával értük el. A koonyát átfúrva egy Foley-katétert helyeztünk a subduralis térbe, majd a katéter ballonját 25 ml fiziológiás sóoldattal gyorsan felfújtuk. Hat állat 40 mg/kg L-arginin kezelést kaott az agyhalál beálltát követő 60. ercben, amit a kísérletek végéig (az agyhalál indukcióját követő 180 erc) folytattunk. Hat másik állat hasonló rotokoll szerint fiziológiás sóoldatot kaott, ezek szolgáltak kontrollként. Lateralis thoracotomiát követően mértük a felszálló aorta véráramlását, illetve a bal kamrai szisztolés és diasztolés nyomásokat valamint volumen értékeket. Vena cava occlusiókat végezve nyomás-térfogat görbe-sorozatokat készítettünk. Ezek alaján számítottuk a végszisztolés nyomás-térfogat arányszámot (end-systolic ressure-volume relationshi, ESPVR) és a reload recruitable stroke work -öt, a kontraktilitás egy reloadtól független

8 mérőszámát. A koszorúér áramlást a bal elülső leszálló coronarián mértük. Az coronariák endothelium-deendens dilatatióját acetilkolin (ACH, 10-7 M), endothelium-indeendens dilatatioját nátrium-nitrorossid (SNP, 10-4 M) intracoronariás adásával vizsgáltuk. 3.3 Biokémiai vizsgálatok ANP koncentráció meghatározása Az ANP extrakcióját és RIA vizsgálatát leíró módszer röviden a következő: a ericardialis folyadék- és lazma minták tisztítása és szükség esetén koncentrálása SePak C18- as kromatográfiás oszlook használatával történt. A minták vegyhatását 10%-os trifluoroacetáttal H 4-ig savasítottuk, és az előzőleg metanollal és trietanolamin-acetát ufferral (TEA, 20 mm, H4) aktivált SePak C18-as cartridge-okra vittük fel. Az extraktumokat liofilizáltuk és RIA ufferben újra oldottuk. Az így kaott oldatokkal két árhuzamos radioimmuno-assay mérés történt. RIA-hoz a mintákat secifikus nyúl antiszérummal (1:25000 végleges hígítás) inkubáltuk. Inkubálás után az immunkomlexeket birka antiszérummal reciitáltuk és centrifugáltuk. A standard görbe felvételéhez szintetikus humán ANP-t használtunk. Az ANP tracer [ 125 I]-el jelzett humán ANP[99-126] volt. A szöveti mintákat 4 M-os guanidin tiocyanat-tal (1:10 w/w) homogenizáltuk. Ezt követően a itvari minták 1:10000, a kamrai minták 1:100 arányban lettek felhigítva, és RIA-val mérve. A HPLC analízishez a liofilizált lazma és ericardialis folyadék mintákat visszaoldottuk 40%-os acetonitrilt és 0.1%-os trifluoroacetátot tartalmazó vizes oldatba, majd azt egy 7.8x300 mm-es ProteinPak 125 gél-filtrációs HPLC oszlora vittük fel, és ugyanezzel az oldattal oldottuk le. A frakciókat 30 másodercenként gyűjtöttük, liofilizáltuk, RIA-ufferben oldottuk, majd RIA-val mértük L-arginin szint mérése A lazma L-arginin szintjének meghatározása során a mintákat 0.5 M-os borsavval oldottuk és kation-cserélő cartridge-on futtattuk. Internal standarnak 250 µm-os l- monometilarginin-t (l-nma) használtunk. A minta futtatása után a cartridge-ot hatszor 1 ml desztillált vízzel, majd háromszor 1mL 12.5 mm Na-acetát ufferrel (H 4.5) átmostuk. A megkötött aminosavakat 1 ml 250 mm Na-acetáttal (H 8.5) eluáltuk a cartridge-ról. A mintából 160 µl-t szobahőmérsékleten 2 ercig összekevertünk 40 µl o-hthal-dialdehid (OPA) reagenssel, majd kiegészítettük 1 µl mercatoetanollal és 5 ercig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A HPLC/fluorescenciás analízis során Merck LiChrosher 100 RP-18 oszloot használtunk. Az izokratikus eluáció 10 mm KH 2 PO 4 (H 5.85)/ acetonitril/metanol/tetrahidrofuran [80:9.5:9.5:1 (v/v/v/v)] oldattal 1 ml/min áramlás mellett történt. A minták L-arginin szintjének meghatározása a HPLC görbe alatti területek nagysága alaján, eredeti L-arginin standardhoz (100 µm) viszonyítva történt.

9 3.3.3 Nitrit és nitrát szint meghatározások A lazma nitrit és nitrát koncentrációit ELISA módszerrel határoztuk meg. A nitrát és nitrit elemek együttes koncentrációját (nitrát&nitrit) a nitrát reduktáz enzim által katalizált nitrátnitrit átalakulást követően mértük. A vizsgált minták 540 nm-en mért otikai denzitását (OD 540 ) standard nitrát&nitrit és nitrit oldatok OD 540 -hoz hasonlítottuk. A nitrát koncentrációkat a nitrát&nitrit és nitrit koncentrációk különbsége alaján határoztuk meg. 3.4 Komartmentalizációs matematikai modell A ericardialis folyadéktér dinamikáját jellemző modell az anyagmegmaradás törvényére éül. A modell a kailláris szövetet öt struktúrára osztja: a kailláris lumene, endothel sejtek, myocardialis arenchima-sejtek, interstitialis folyadék és eicardialis transszudátum. A komartmentek anyagcserefolyamatait egyszerűsített matematikai kéletekkel írtuk le. A modell feléítéséhez és a araméterek beállításához több részkísérlet elvégzésére volt szükség, amik csak a modell egy-egy araméteréről, illetve részfolyamatáról adnak információt. A modell készítésekor ezeket a korábbi méréseket részben az irodalom alaján, részben saját eredményeinkből gyűjtöttük össze. Modellünk felállításakor az adenin-nukleozid rendszer alkotóinak metabolizmusát és kinetikáját vettük figyelembe. 3.5 Statisztikai módszerek Parametrikus adatok elemzése során az eredményeket átlag ± átlag standard hiba (átlag ± SEM) formában adtuk meg, az adatcsoortok közötti összehasonlításokra (egy és kétmintás) T-róbákat és Pearson-analízist alkalmaztunk. Nem arametrikus adatok esetén az eredményeket medián és ercentilisek formájában adtuk meg, emellett Wilcoxon-róbát, Mann-Whithey tesztet és Searman-analízist alkalmaztunk az egyes csoortok összehasonlítására. Az ismétlődő mérések során történt változások leírására varianciaanlízist (ANOVA) alkalmaztunk. Szignifikancia szintnek az általánosan elfogadott <0.05 értéket választottuk.

10 4 Eredmények 4.1 Pericardialis és szöveti ANP szintek elemzése Szívműtétre került betegek ericardialis folyadékában mért ANP koncentrációk (1. ábra) egy nagyságrenddel (kb szer) magasabbnak mutatkoztak, mint a megfelelő vénás lazmában mértek (<0.001). P<0.001 P< ANP (g/ml) ANP (g/ml) VP PF 1 VP PF Billentyű betegek Koszorúér betegek 1. ábra: A vénás lazma (VP) és a ericardialis folyadék (PF) ANP koncentrációi a két betegcsoortban. Minden kör egy beteget jelöl. A vízszintes vonal a mediánt mutatja. Az ANP szintek logaritmikus skálán vannak feltüntetve. A vizsgált mintánként összesített eredményeinket az 1. táblázat mutatja. Továbbá, az ANP koncentrációkat a betegek NYHA stádiumának függvényében elemezve erősen szignifikáns korrelációt találtunk a szív funkcionális stádiumának romlása és a lazma ANP szintek emelkedése között (r=0.401; <0.001). Hasonló, de kevésbé szignifikáns összefüggés volt kimutatható a NYHA stádiumok és a itvari (r=0.169; <0.05), illetve a kamrai (r=0.313; <0.05) szöveti ANP koncentrációk között. Nemek szerint csoortosítva a betegeket, szignifikánsan (<0.05) magasabb lazma ANP koncentrációkat mértünk nőkben (25.2 ( ) g/ml), mint férfiakban (19.8 ( ) g/ml). Ehhez hasonló, de nagyobb mértékű különbség (<0.001) mutatkozott a itvari szöveti ANP koncentrációkban a nők (414.6 ( )) ng/mg és a férfiak (105.4 ( ) ng/mg) között. Azoknál a betegeknél, akik átestek myocardialis infarctuson, szignifikánsan (<0.05) alacsonyabb ericardialis ANP szintek voltak mérhetők (202.6 ( ) g/ml), mint azoknál, akik nem estek át infarctuson (257.1 ( ) g/ml).

11 Vénás Pericardialis Pitvari Kamrai lazma folyadék Korreláció szövet szövet Korreláció Billentyűbetegek (VHD) (g/ml) 28.4 ( ) (g/ml) ( ) r = (ng/mg) # ( ) (ng/mg) 0.4 ( ) r = Koszorúér betegek (CAD) 19.8 ( ) ( ) r = # ( ) 1.0 ( ) r = táblázat: ANP koncentrációk összehasonlítása betegcsoortok és vizsgálati minták szerint (medián és ercentilisek formájában). <0.001 vs. megfelelő vénás lazma; <0.05; # <0.001 vs. megfelelő kamrai szövet; <0.05 vs. billentyűbetegek 4.2 Az interstitialis és ericardialis folyadéktér dinamikája adenin nukleozid koncentrációk alaján Matematikai modellünk alkalmazásával felállítható egy, az egyes komartmentek anyagcseréjét leíró egyenletrendszer. Ennek segítségével meghatározható a szöveti elemek adenozin (ADO) anyagcseréje és a komartmentek közötti molekulatranszort. A lazma ADO koncentráció változása az időben: C t FL C PS g = V x V PSecl ( C Cisf ) ( C Cec ) C + D 2 ahol az egyenlet jobb oldalán az első tag a lazma ADO koncentráció változását írja le a kailláris hosszában. A második tag a lazma és az interstitialis folyadék közötti, a harmadik tag a lazma és az endothelsejt közötti ADO diffúziót jelöli (a lazma szemszögéből). A negyedik tag a lazma saját ADO metabolizmusára vonatkozik. Az utolsó tag a lazmában levő anyagok tengely irányú diszerzióját jelöli. Az endothelsejtben az ADO koncentráció változása az időben: C t ec PS = V' ecl ec 2 PS eca Gec C ( Cec C ) ( Cec Cisf ) Cec + Dec 2 V' ec V ahol az egyenlet jobb oldalán az első tag az endothelsejt és a lazma közötti, a második tag az endothelsejt és az interstitialis folyadék közötti ADO diffúziót jelöli (az endothelsejt szemszögéből). A harmadik tag az endothelsejt saját ADO metabolizmusát jelöli. A negyedik tag az ADO diszerzióját jelöli a sejten belül. Az interstitialis folyadékban az ADO koncentráció változása az időben: C isf t PS g = V' isf V' ec ahol az egyenlet jobb oldalán az első tag az interstitialis folyadék és a lazma közötti, a második tag az interstitialis folyadék és az endothelsejt közötti, a harmadik tag edig az interstitialis folyadék és a arenchymasejt közötti ADO diffúziót jelöli (az interstitium szemszögéből). A negyedik tag az interstitialis folyadék saját metabolizmusát jelöli. Az ötödik tag ismét a diszerziót jellemzi, az interstitiumon belül. G V x ec 2 C x PSeca c isf ( Cisf C ) ( Cisf Cec ) ( Cisf C c ) Cisf + Disf 2 V' isf PS V' isf G V' isf 2 C x isf

12 A arenchymasejtekben az ADO koncentráció változása az időben: C c t = PS V' c c G c ( Cc Cisf ) C c + Dc 2 V' c 2 C x c ahol az egyenlet jobb oldalán az első tag a arenchymasejt és az interstitialis folyadék közötti ADO diffúziót jelöli (a arenchymasejt szemszögéből). A második tag a arenchymasejt intracellularis metabolizmusára utal, míg az utolsó tag a sejten belüli diszerziót jelöli. Az eicardialis transzszudátumban az ADO koncentráció változása az időben: C t transz PS = V ' transz transz Gransz ( Cransz Cisf ) Cransz V ' ransz ahol az egyenlet jobb oldalán az első tag a transzszudátum és az interstitialis folyadék közötti ADO diffúziót jelöli (az eicardialis transzszudátum szemszögéből). A második tag a transzszudátum ADO metabolizmusára utal. A transzszudátumból ADO csere csak az interstitiumba történik. Az interstitiumból viszont az ADO az endothel sejtekbe, a cardiomyocytákba, kaillárisokba, illetve vissza a transzszudátumba is juthat. A megoldás egyszerűsítése végett a további két kitételt tettük: a modellben a kaillárisokban áramló folyadék sebességrofilját nem araboloid alakúnak, hanem minden ontjában azonos sebességűnek vettük. Ezzel elhanyagolhattuk a tengely irányú diffúzió, illetve diszerzió mennyiségét (az egyenletekben D); így D értékét nullának vettük. Emellett tovább egyszerűsítettük a megoldást, azzal, hogy a kailláris és környezete között egyensúlyi állaotot feltételeztünk (l. konstans infúzió adása mellett). Így az egyenletek bal oldalán nulla állt. (C: koncentráció (mol/cm 3 ; L: kaillárishossz (cm)) Az egyenleteinkben alkalmazott membránermeabilitást (PS) és a metabolikus termékek clearance-ét leíró (G) értékek kísérletes úton meghatározhatók, illetve az irodalomban megtalálhatók. A szöveti áramlásra (F P ) szintén található irodalmi adat. Egységnyi kaillárishosszra tehát, a kaott öt egyenletből az öt változó nagysága meghatározható, és mivel mind a vérlazma ADO koncentrációja, mind a ericardialis folyadékban mért ADO koncentráció klinikailag mérhető araméter, adatainkból az interstitialis folyadék adenozin koncentrációját egy adott esetben megbecsülhetjük. 4.3 Parathormon hatás a coronariákon Az intracoronariásan adott PTH (1-34) önmagában jelentősen, hatásmaximumán (0.44 nmol dózisban) mintegy 2.5 szeresére kées fokozni a coronariaáramlást a kiindulási értékhez kéest. A PTH által kiváltott koszorúér dilatatio mellett nagyobb dózisok alkalmazása során szisztémás hyotensiv válasz is megfigyelhető volt. A jelenséget jól jellemzi az összes kísérlet adatainak összegzése (2. ábra). A hatásmaximumokat értékelve jól megfigyelhető, hogy a növekvő dózisú PTH valamennyi fázisban fokozta a coronariaáramlást, csökkentette a szisztémás vérnyomást és növelte a szívfrekvenciát. A kontroll fázishoz viszonyítva glibenklamid háttérinfúziója szignifikánsan csökkentette a PTH minden egyes dózisának áramlásfokozó hatását. A glibenklamid növekvő dózisú adása és a PTH-ra adott válasz csökkenésének mértéke között azonban nem észleltünk egyértelmű arányosságot. A vérnyomás és szívfrekvencia válaszoknál szignifikáns

13 változást nem figyeltünk meg a blokád után. A 3. ábra a konduktancia-többlet értékek változásával jellemzi a PTH értágító hatását. A dózis hatás görbék jelentős ellaosodása jelzi azt a szignifikáns és erős gátlást, amit a glibenklamid a PTH okozta koszorúér tágulatra kifejt, és aminek mértéke számottevően meghaladja a PTH időkontrollos vizsgálatokban taasztalt gyengébb hatáscsökkenését. Kontroll Glibenklamid i.c. (µmol/min) Coronaria áramlás ( %) < Artériás vérnyomás ( %) Szívfrekvencia ( %) Parathormon ic. (nmol) 2. ábra: Változások a coronariaáramlásban, a vérnyomásban és a szívfrekvenciában PTH 0.15, 0.44 és 1.33 nmol dózisainak intracoronariás (ic.) adása után a kísérlet négy fázisában: kontroll fázisban és glibenklamid 0.1, 0.3 illetve 1.0 µmol/min dózisának ic. adása mellett. ml/mmhg Kontroll Glibenklamid i.c. (µmol/min) < 0.05 < 0.05 < Parathormon i.c. (nmol) 3. ábra: A coronaria konduktancia-többlet változása PTH hatására ( = időkontroll vizsgálatok, = K ATP csatorna blokád alatt, szignifikáns különbségek a kontroll görbékhez viszonyítva) Szisztémás L-arginin hatása a reerfúzióra A hemodinamikai araméterek változását a 2. táblázat mutatja. A szívfrekvencia nem változott sem a kontroll, sem az L-arginin csoortban. A CPB alatti artériás közényomás

14 (MAP) 55.1±7.3 Hgmm volt a kontroll csoortban és 58.2±3.3 Hgmm az L-arginin csoortban (P=N.S.). A coronariaáramlás (CBF) a reerfúzió végére a kontroll csoortban felére lecsökkent (<0.05), hasonló CBF csökkenést L-arginin adása mellett azonban nem lehetett kimutatni. kiindulás 40 min reerfúzió Kontroll L-arginin Kontroll L-arginin szívfrekvencia (ütés/min) art. közényomás (Hgmm) 132.1± ± ± ± ± ± ± ±13.2 CO (L/min) 2.5± ± ± ±0.3 coronariaáramlás (ml/min) 42.3± ± ± ± táblázat: Hemodinamikai araméterek kiindulási és 60 erc szívmegállást majd 40 erc reerfúziót követő értékei. ( <0.05 vs. kiindulás, <0.05 vs. kontroll) A kiindulási PRSW értékek mindkét kamrára vonatkoztatva a fiziológiás tartományban voltak. A bal kamra kiindulási PRSW értéke 63.1±10.3 kerg volt a kontroll csoortban, és 48.8±8.5 kerg az L-arginin csoortban. A jobb kamra kiindulási PRSW értéke 21.1±6.6 kerg volt a kontroll csoortban, és 26.1±4.8 kerg az L-arginin csoortban. A kontroll csoort bal kamrai PRSW értéke szignifikánsan csökkent (-25%), míg az L-arginin csoortban nagyjából változatlan maradt (=N.S.) a 60 erc ischaemiás és 40 erc reerfúziós fázist követően (4. ábra). Hasonlóan jobb kontraktilitás volt kimutatható a jobb kamra esetében is, azonban itt nem volt szignifikáns különbség a két csoort között. kontroll L-arginin <0.05 L-arginin vs. kontroll PRSW, relatív változás (%) bal kamra jobb kamra 4. ábra: A PRSW relatív változása 60 erc ischaemia és 40 erc reerfúzió során a bal kamrában és a jobb kamrában. Az acetilkolinnal létrehozott endothel deendens vasodilatatio szignifikáns csökkenést mutatott a kontroll csoortban a reerfúziót követően, azonban az L-arginin csoortban az ACH hatására nem jött létre szignifikáns vasodilatatio-csökkenés a reerfúzió végére (5. ábra). A natrium-nitroussid hatására létrejött endothelium-indeendens vasodilatatio nem

15 mutatott különbséget a kísérlet menete során, illetve a vizsgált csoortok között (5. ábra). acetil-kolin (Ach) kiindulás 40min re. Na-nitrorussid (SNP) kiindulás 40min re. kontroll L-arginin 5. ábra: Vascularis funkció vizsgálata a coronariákon. ( <0.05 vs. kiindulás, <0.05 vs. kontroll) Az L-arginin szintek változását a erifériás vérben mutatja a 6. ábra. A kiindulási L-arginin koncentráció a kutyák lazmájában azonos nagyságrendben volt, mint a humán lazmában ( µmol/l) leírt. A NO oxidációja során nitrit és nitrát keletkezik. E két anyag lazmakoncentrációja megfelelő indikátora az L-arginin lebomlásának. L-arginin adása után a lazma nitrit koncentrációja szignifikánsan megemelkedett és a reerfúziós fázis során végig magasabb maradt, mint a kontroll csoortban. A lazma nitrát szintek mindkét csoortban közel változatlanok maradtak a szívmegállás során, de a reerfúzió kezdetén az L-arginin csoort nitrát koncentrációi szignifikánsan megemelkedtek, és ez a különbség a kísérlet végéig fennállt.

16 kontroll L-arginin L-arginin (µ mol) kiindulás 20CA 60CA 20re 40re kontroll L-arginin Nitrit (µ mol) kiindulás 20CA 60CA 20re 40re kontroll L-arginin Nitrát (µ mol) kiindulás 20CA 60CA 20re 40re 6. ábra: Az NO rekurzor L-arginin (fent), illetve az NO metabolit nitrit (közéen) és nitrát (lent) koncentrációváltozásai 60 erces szívmegállás (CA) és 40 erces reerfúziót követően. ( <0.05 vs. kiindulás, <0.05 vs. kontroll) 4.5 L-arginin vascularis hatásai agyhalál állaotában Az agyhalál indukciója egy hyerdynam reakciót okozott, melynek során a legtöbb vizsgált hemodinamikai araméter (szívfrekvencia, aortanyomás, dp/dt max, erctérfogat) nagysága nőtt, a bal kamrai végdiasztolés nyomás edig csökkent. Az akut fázist követően az aortanyomás szignifikánsan lecsökkent, amit követett a bal kamrai szisztolés nyomás és a dp/dt max csökkenése. A erctérfogat a kiindulási értékre tért vissza, és közel azonos szinten maradt. Az ESPVR és a PRSW meredeksége, tehát a kontraktilitás reloadtól független mutatói, szignifikánsan növekedtek az akut fázis során, majd 30 erc múltán a kiindulási értékek szintjén stabilizálódtak (7. ábra). Ezt követően ismét lassú csökkenés indult, ami 3 óra után vált szignifikánssá.

17 7. ábra: Az ESPVR és a PRSW meredekségének időbeli változása a kísérletek során. (B=kiindulás; t3, t5, t180 az agyhalál beálltától eltelt időt jelölik ercben; <0.05 vs. kiindulás, <0.05 vs. kontroll) 8. ábra: Alsó rész: coronariaáramlás (CBF) időbeli változása (B=kiindulás; t3, t5, t180 az agyhalál beálltától eltelt időt jelölik ercben). Felső rész: a coronariaáramlás százalékos változása acetilkolin (ACH) és natrium-nitrorussid (SNP) adását követően a kísérletek elején és 3 órával az agyhalál beállta után. ( <0.05 vs. kiindulás, <0.05 vs. kontroll) A coronariaáramlás árhuzamosan változott a hemodinamikai araméterekkel (8. ábra). Az akut fázis során a CBF kb. háromszorosára nőtt, majd csökkenni kezdett, végül a kiindulási értéknél szignifikánsan alacsonyabb szinten állt meg. Az SNP-vel kiváltott endothelium-indeendens vasodilatatio változatlan maradt a kísérlet során, és nem volt kimutatható különbség a két csoort között (8. ábra). A kiinduláskor végzett vizsgálatok

18 során az acetilkolin endothel-deendens vasodilatatiót hozott létre, azonban az agyhalált követő vizsgálatok a coronariaáramlás szignifikáns csökkenését mutatták, ami inkább vasoconstrictióra utal. A kiindulási értékek, a hyerdinam reakció és a hemodinamikai araméterek hasonlóan alakultak mindekét csoortban mielőtt az L-arginin adását megkezdtük. L-arginin adását követően ellentétben a kontroll csoorttal a coronariaáramlás, az aortanyomás, a bal kamrai szisztolés nyomás, a +dp/dt max és a -dp/dt max, illetve az ESPVR és a PRSW meredekség a kiindulási értékre tért vissza (7. ábra). L-arginin adása nem befolyásolta az endothel-indeendens vasodilatatiót, emellett az endothel-deendens vasodilatatio sem csökkent szemben a kontroll kísérletekkel a kísérletek végéig (8. ábra, <0.05 vs. kontroll). A kiindulási nitrit&nitrát szintek nem különböztek a két csoort között. A kontroll csoortban a kísérletek során időbeli változás sem volt kimutatható a nitrit&nitrát lazmakoncentrációkban. Ezzel szemben az L-argininnel kezelt csoortban az infúzió indítását követő azonnali L-arginin lazmakoncentráció emelkedést egy késleltetett nitrit&nitrát szintemelkedés követte (9. ábra). 9. ábra: Plazma L-arginin (balra) és nitrit&nitrát (jobbra) koncentrációk a kísérletek kezdetén (B) és 90, illetve 180 erccel az agyhalál beállta után. ( <0.05 vs. kiindulás, <0.05 vs. kontroll)

19 5 Következtetések A myocardialis cardiorotectio lehetőségeit human és exerimentalis modelleken vizsgálva demonstráltuk, hogy vasoactiv ágensek ischaemia során mind a lokális, mind a szisztémás szintű védekező mechanizmusokban fontos szereet játszhatnak. A ericardialis folyadék ANP koncentrációs viszonyainak nagy beteganyagon végzett vizsgálata során megállaítottuk, hogy a ericardialis folyadékban egy nagyságreddel magasabb ANP szintek mérhetők, mint a lazmában. Ezt a különbséget részben okozhatja myocardialis ischaemia, azonban a jelenség klinikai jelentősége megfontolandó. A itvari és kamrai szöveti ANP koncentrációk között több mint két nagyságrendnyi különbséget taasztaltunk. Továbbá kimutattuk, hogy a nők itvari szívizomszövetében magasabb ANP koncentrációk mérhetők, mint a férfiakéban, ami felveti a két nem közötti nátriuretikus etid regulációs folyamatok különbözőségét. Ellentétben a lazma ANP koncentrációval, az intraericardialis ANP szint (ami jól jellemezheti az interstitialis ANP koncentrációt) nem korrelál a szívfunkció csökkenésének súlyosságával, ami felveti az ANP lokálisan eltérő arakrin regulációs szereét a ericardialis folyadékban. Eredményeink alaján az interstitialis (arakrin) és a keringésben megtalálható (endokrin) ANP biológiai funkciója valószínűleg eltérő, azonban a szabályozás e két eleme egy közös és egymást jól kiegészítő élettani rendszert alkot. Az interstitialis folyadék adenin-nukleozid koncentrációjának meghatározására matematikai modellt alkottunk, melynek alaja, hogy kisméretű molekulák esetében a ericardialis folyadék jól tükrözi az interstitialis komartment koncentrációviszonyait. Modellünkkel a lazmában és a ericardialis folyadékban mért koncentrációk alaján megbecsülhetők az adenin-nukleozidok interstitialis szintjei. Matematikai modellünk a későbbiek során alaul szolgálhat más molekulák komartmentális eloszlásának vizsgálatára is, amennyiben a vizsgált anyag metabolizációjáról és transzort folyamatiról kellő ismeretekkel rendelkezünk. Parathormonnal végzett kísérleteinkben a szer hatására elhúzódó, dózisfüggően növekvő coronariaáramlást taasztaltunk. Megállaítottuk, hogy a K ATP csatornát secifikusan blokkoló glibenklamid hatására a PTH által kiváltott koszorúér tágulat jelentősen és szignifikánsan csökkent. Eredményeink valószínűsítik az ér simaizomsejt K ATP csatornáinak jelentős szereét a PTH okozta coronaria dilatáció létrejöttében. Elkézelhetőnek tartjuk azt is, hogy a PTH koszorúértágító hatása során az irodalomban eddig közölt camp rendszert és L-tíusú Ca csatorna inaktivációt involváló reakcióutak mellett a K ATP csatornák integratív kulcsszereet kanak a etid cellularis hatásmechanizmusának kibontakozásában.

20 A NO rekurzor L-arginin cardiovascularis rotektív hatásának exerimentalis vizsgálata során demonstráltuk, hogy L-arginin adásával csökkenhet a reerfúziós károsodás és javulhat az endothelialis funkció hyothermiás ischaemiát és reerfúziót követően is. A NO rekurzorok adása új konceció a cardiorotectio terén, és első sorban a reerfúziós atofiziológiás folyamatok megelőzésére szolgál. Vizsgálatainkban az L-arginin reerfúzió során még szisztémásan adva is javította a szívműködést. Az L-arginin intravénás adásának további előnye lehet, hogy az érrendszer távolabbi ontjain is javítja az endothelfunkciót. Ezáltal a NO rekurzor szeree a cardiorotectio lokális szervi szintjéről globális egész szervezetet érintő szintre emelkedhet. Emellett kimutattuk, hogy az agyhalál jelenségéhez kacsolódó súlyos endothelialis diszfunkció kialakulása megakadályozható L-arginin alkalmazásával, sőt L-arginin hatására nő a kontraktilitás és általános hemodinamikai javulás érhető el. Megfigyeléseink alaján lehetőség nyílik a transzlantációs donorok endothelialis funkciójának javítására, és ezáltal a donorkaacitás növelésére.

21 6 Az értekezésben felhasznált közlemények jegyzéke Fazekas R, Soos P, Kekesi V, Fazekas L, Juhasz-Nagy S: A arathormon hatása a koszorúerekre. Cardiologia Hungarica 2000;2: Soos P: Emelkedett itvari nátriuretikus etid koncentráció a humán ericardialis folyadéktérben: vizsgálatok szívsebészeti betegekben. Cardiologia Hungarica 2001;2: Soos P, Juhasz-Nagy A, Ruskoaho H, Hartyanszky I, Merkely B, Toth M, Horkay F: Locally different role of atrial natriuretic etide (ANP) in the ericardial fluid. Life Sci 2002;71: Fazekas R, Soos P, Kekesi V, Fazekas L, Juhasz-Nagy A: The coronary effects of arathyroid hormone. Horm Res 2004;61: Soos, P: Az állati szervek folyadékrendszereinek dinamizmusa: komartmentalizációs szívmodell. Magyar Biológiai Társaság XXV.Vándorgyűlés előadások összefoglalói 2004; Soos P, Andrasi T, Buhmann V, Kohl B, Vahl C, Hagl S, Szabo G: Myocardial rotection after systemic alication of L-arginine during reerfusion. J Cardiovasc Pharmacol 2004;43: Szabo G, Soos P, Heger U, Mandera S, Buhmann V, Bahrle S, Kohl B, Hagl S: L-arginine imroves endothelial and myocardial function after brain death. Translantation 2006;82: