Baktériumok és fágok genetikája

Átírás

1 Baktériumok és fágok genetikája (az előadás anyaga) Frederick Griffith 1928-ban a Streptococcus pneumoniae baktériummal folytatott kísérletei során fedezte fel, hogy az elölt baktériumokból kiszabadul valamilyen örökítő anyag, amely az élő baktériumokba átkerülhet és megváltoztathatja azok tulajdoságait (1. ábra). Több mint egy évtizeddel később az idős Oswald Avery és munkatársai kísérletei bizonyították, hogy ez az örökítőanyag azonos a DNS-sel. A későbbiekben három olyan felfedezés is történt, amelyek bizonyították, hogy a baktériumok között rendszeres a gének cseréje és mindhárom felfedezésben szerepet játszott Joshua Lederberg ban Tatummal megfigyelte az élő baktériumok közötti génátvitelt, hat évvel később Zinderrel rájöttek, hogy a baktériumok vírusai is képesek géneket átjuttatni egyik baktériumból a másikba, majd 1953-ban Cavalli-Sforzával leírták a baktériumok szexualitásáért felelős F faktort. Mai ismereteink szerint a baktériumok között nagyon intenzív géncsere folyik (2. ábra), ezért a genetikailag semmiféle rokonságot nem mutató baktériumokban is találunk olyan géneket, amelyek nagyfokú szekvencia hasonlóságot (homológiát) mutatnak. Ugyanakkor, két E. coli törzs genomja között nem ritkán akár % eltérés figyelhető meg, különösen, ha eltérő élőhelyekről izoláljuk a sejteket (2. ábra). Mivel a faj fogalom mikroorganizmusok között nehezen értelmezhető, a genom szekvenálás korában új, jól definiálható rendszertani egységet kezdtek használni: az OTU-t. Az operational taxonomic unit a riboszóma kis alegységének RNSét (16S RNS) kódoló gén szekvenciáját veszi alapul. Minden élőlény (a kihalt fajok is) riboszómák segítségével állít elő fehérjéket, a riboszóma szerkezete így a 16S RNS szekvenciája is meglehetősen konzervált. Minél közelebb áll egymáshoz két organizmus, annál közelebbi rokonságban van egymással. Ezen az alapon meg is szerkeszthető az élőlények rendszertana, Az élet fája (3. ábra). A mikrobiális világ rendkívül gazdag, mind formailag, mind anyagcsere tekintetében. Elképesztő környezetekhez is alkalmazkodtak élőlények, az antarktiszi jégvilágtól a mélytengeri black smokerek 130 fokos, kéngőzös pokláig (4-6. ábra). Az egyes élőhelyeken élő mikroorganizmusok génállományát összehasonlítva érdekes kép bontakozik ki: hiába azonosítottak vagy 40 ezer féle baktériumot az emberi bélcsatornában, génállományuk tekintetében ezek nem is annyira különbözőek, összességükben nagyságrendekkel kevesebb génnel rendelkeznek, mint várhatnánk. Ha viszont a bélben élő baktériumok génjeit talaj- vagy óceán-lakó baktérium közösségek génállományaival hasonlítjuk össze, rendkívül nagy eltéréseket tapasztalunk. Az eltérő élőhely eltérő nyersanyagokat kínál, eltérő anyagcserével lehet fennmaradni ehhez eltérő génkészletre van szükség (7-8. ábra). A különböző környezetben élő baktériumok között a pozitív szelekciót biztosító (előnyös) gének gyorsan terjednek, a haszontalan gének pedig rövidesen kivesznek: a genetikailag nagyon eltérő sejtek genomja egyre jobban kezd hasonlítani egymásra. Kivételt képeznek az alapvető háztartási gének, mint pl. a riboszómális gének. A kutatók egy bioinformatikai módszerrel egyes tulajdonságok génjeinek eredetét kezdték kinyomozni és a gének horizontális terjedésére számtalan példát találtak. (Az élőlények

2 utódjaiknak átadják génjeiket: ez a vertikális terjedés. Ha a gének nem utódokba, hanem idegen élőlényekbe jutnak át, azt nevezzük horizontális génátadásnak (9. ábra). A gének egy része véletlenszerűen kerül át horizontálisan egyik sejtből a másikba, ez történt a Griffith-féle kísérletben, az elpusztult sejt DNS-ét felveszi és integrálja egy másik sejt, az egyes gének véletlenszerűen juthattak át az egyik sejtből a másikba. Vannak azonban olyan gének, amelyeket különleges tulajdonságai hozzásegítenek hatásosabb terjedéshez: ilyenek az ugráló géneknek is nevezett mobilis genetikai elemek. A retrotranszpozonok pl. képesek megsokszorozódni a genomon belül, sokszorosára javítva esélyüket, hogy egy véletlen esemény során átjussanak másik organizmusba (10. ábra). Kialakultak olyan gének is, amelyek a DNS horizontális átjutását elősegítő szerkezetek (szex pilusok) fehérjéit kódolják. Ezek már nem bízzák a vak szerencsére sorsukat, aktív szerepet vállalnak a horizontális génátvitel létrehozásában, a konjugációnak nevezett folyamat kiváltásában (10. ábra, majd részletesen a ábra). Az evolúció évmilliói során gének csoportjai alakultak ki, készen arra, hogy a baktérium számára letális körülmények között önállósodjanak és biztosítsák saját fennmaradásukat (lizogén fágok, 10. és 21. ábra). Még önzőbb gének már a sejtet csak saját maguk szaporítására használják fel (baktérium vírusok = bakteriofágok), bár önálló szaporodásra még képtelenek (10. és 21. ábra). A 11. ábrán a horizontális génátvitel baktériumok közötti mechanizmusait látjuk. Azt a folyamatot, amikor egy elpusztult sejtből kiszabadult DNS darabjait veszi fel a sejt, amelyik ezáltal genetikailag átformálódik = transzformálódik, transzformációnak nevezzük. A két baktériumsejt között kialakuló (egyirányú) aktív génátadást nevezzük konjugációnak (részletesen a ábrákon). Ezt a folyamatot a haploid baktériumok ivari folyamatának is szokták tekinteni, mert az utódsejtek kialakításában nagy szerepe van a rekombinációnak. (De rekombinációra természetesen a többi horizontális génátadási folyamatban is szükség van, mert nélküle az új információ nem lenne képes beépülni a genomba.) Végül a génátvitel harmadik formája a paraziták által (véletlenül) kiváltott transzdukció, amely a fertőző ágens és a gazda sejtek között több rekombinációs lépést is igényel, hogy létre jöhessen a transzdukáló fág, ill, hogy az átvitt gén beépülhessen a recipiens gazdasejtbe. A baktériumok szabad szemmel nem láthatóak, de számos olyan tulajdonságuk van, melyek genetikai célokra felhasználhatóak. A baktériumokat egymástól megkülönböztető jegyeket genetikai markereknek nevezzük, a tulajdonságért felelős géneket maker géneknek (12. ábra). A táptalajon kialakuló baktérium telep (az eredeti sejtből kinövő klón sejtjei) mérete, formája, színe, állaga, esetleg szaga megkülönböztethető. Jellemző az is, hogy milyen anyagcserét folytat, tehát milyen anyagokat tartalmazó táptalajon nő ki, milyen anyagokat termel. Színtelen anyagokat képes-e színesekké átalakítani (vagy fordítva), termel-e savakat, széndioxidot vagy egyéb gázokat, stb. A marker gének között kitüntetett helyet foglalnak el a bioszintetikus utak génjei, ui. ha a sejt pl. nem tud egy bizonyos aminosavat, nukleotidot, vitamint vagy egyéb szerves vegyületet megtermelni, nem képes kinőni az illető anyagot nem tartalmazó táptalajon. Az ilyen mutánsokat auxotróf mutásoknak nevezzük (szemben a vad típusú, prototróf sejtekkel). Az ilyen tulajdonságok alapján könnyű kiszelektálni egyes sejttípusokat, hiszen az egyik életképes, a másik nem. A szelektálható tulajdonságok közül a másik, gyakran alkalmazott marker a rezisztencia megléte vagy hiánya. A sejtek némelyike jobban tolerálja a magas hőmérsékletet,

3 extrém ph-t, nehéz fémek ionjainak, mérgeknek, antibiotikumoknak a jelenlétét, stb. ( ábra). A 14. ábrán azt a kísérletet látjuk, amely bizonyította, hogy a baktériumok között rekombinációhoz vezető kölcsönhatás zajlott le. Két auxotróf mutánst kevertek össze (az egyik metionint, a másik leucint nem tudott termelni, ezért egyik sem tudott telepekké nőni minimál táptalajon). Az összekevert kultúrából viszont prototróf telepek is kinőttek, amelyek mindkét aminosav termelésére képesek voltak. A következő ábrán látható Hayes-féle kísérlet már azt is bizonyította, hogy a rekombináns sejtek kialakulásához szükség van a baktériumok között fizikai kontaktus kialakulására is (nem úgy, mint Griffith és Averyék transzformációs kísérleteiben). A további kísérletek azzal a maglepő eredménnyel jártak, hogy csak az egyik baktérium tud a másikon segíteni, fordítva nem megy a dolog. A donor -nak elnevezett sejtek a mikroszkóp alatt szőröseknek mutatkoztak és megfigyelhető volt, hogy a gének átadása során a baktériumsejteket csőszerű képződmény kötötte össze (16. ábra). A donor (hím) és a recipiens (női) sejtek közt lejátszódó folyamat ugyan kevéssé hasonlít a szexuális aktusra (pl. a folyamat lezajlása után a nő gyakran hímmé alakul!), az összekötő berendezést mégis szex-pilusnak hívják. Ezen keresztül jut át a DNS az egyik sejtből a másikban, ahol az vagy lebomlik, vagy rekombinációval beépül a kromoszómába, esetleg fennmarad extrakromoszómálisan. Ma már tudjuk, hogy az egyirányú génátvitel képessége rendszerint egy plazmid (extrakromoszómális cirkuláris DNS, néhány génnel) jelenlétének eredménye, ezt a plazmidot fertilitási plazmidnak, F plazmidnak nevezik. A baktériumsejtekben a kromoszóma mellett gyakran találunk plazmidokat. Ezek a genom legmobilisabb részét képezik és általában olyan előnyös tulajdonságot biztosító géneket hordoznak, amelyek sajátos körülmények között jelentenek pozitív szelekciós előnyt. Ilyenek pl. az antibiotikumokkal (és egyéb mérgező anyagokkal szembeni) rezisztenciát kódoló plazmidok. Ezek a károsító anyag jelenlétében életfontosságúak, de normál körülmények között csak terhet jelentenek a sejteknek, ezért gyorsan el is veszhetnek. A gazdaszervezet megbetegítéséért (és/vagy az immunrendszerrel szemben védelmet jelentő) virulencia gének a kórokozó baktériumokban találhatóak, gyakran virulencia plazmidokon. A degradatív plazmidok olyan enzimek génjeit hordozzák, amelyek ritka (de bőséges) tápanyagforrások, pl. a tengerbe ömlő kőolaj, bálna tetem, stb. hasznosítását teszik lehetővé. A killer (gyilkos) plazmidok pedig a baktériumok közt dúló háborúk eszközei, lényegében baktériumok termelte antibiotikum molekulákat kódolnak (16. ábra). Időnként a baktériumok közötti génátadás több nagyságrenddel megnő (anélkül, hogy a recipiens sejtek hímmé alakulnának). A 17. ábrán bemutatott jelenség mögött az áll, hogy a fertilitás plazmid kis gyakorisággal rekombinálhat a kromoszómával. Ilyenkor a szex piluson nem csak az F plazmid jut át, hanem az egész kromoszómára sor kerülhet, feltéve, hogy az aktus zavartalanul végbemehet. Erre élőben ritkán kerül sor, mert lassú folyamat, kólinál több mint másfél óráig tart! A recipiens sejt csak akkor válik maga is donorrá, ha az utolsóként átadott fertilitás gének is átjutnak a kromoszóma legvégén. Az ilyen, nagy gyakorisággal rekombináló törzseket Hfr (high frequency recombination) törzseknek hívjuk. Az F plazmid kiváltotta konjugáció esetében a recipiens gyakran válik F + hímmé, de ritkán jutnák át kromoszómális gének. A Hfr donorok viszont nagy gyakorisággal juttatnak át kromoszómális géneket, de ritkán jutnak át magunk a fertilitási gének is.

4 Az a tény, hogy a Hfr törzsek az F plazmid beépülési helyétől kezdve, mindig azonos sorrendben juttatják át a géneket, és a konjugáció szétrázással bármikor megszakítható, lehetőséget adott a kutatóknak az E. coli génsorrendjének megállapítására. A ábrán látható, hogy az egyes gének megjelenése a recipiensben jól mérhető, a sorrend könnyen megállapítható volt. Az eredményt máshová integrálódott F plazmidot tartalmazó Hfr-ekkel validálni lehetett: az ellenkező irányban, vagy más helyekről induló konjugációk mindig azonos génsorrendet adtak (20. ábra). A konjugációval kapcsolatban a legfontosabb megjegyzés az, hogy a horizontális géntranszfer módjai közül messze kimagaslik hatékonyság tekintetében, orvosi szempontból is a legfontosabb folyamat (21. ábra). A sokféle antibiotikumnak ellenálló, gyógyíthatatlan betegségeket okozó baktérium törzsek kialakulása mögött a legtöbb esetben a konjugáció áll, amely segíti a rezisztencia- és virulencia gének gyors terjedését. Fentebb szóltunk már azokról a géncsoportokról, amelyek ugyan a bakterális genom részeiként sokszorozódnak a baktérium szaporodása során, de képesek megsokszorozódva túlélni a baktériumot, ha a sejt túlélését a körülmények veszélyeztetik. Ezek a lizogén fágok, amelyek a kromoszóma részeként is, és önálló fág részecskékként is megjelennek (22. ábra). A molekuláris genetikai kialakulásában nagy szerepe volt a fággenetikai kutatásoknak. A fágoknak elég kevés fenotípusa lehet, nincs színük, szaguk, anyagcseréjük, vagy szaporodnak, vagy nem (23. ábra). De a kutatók rájöttek arra, hogy különleges mutánsok, un. kondicionális mutánsok belőlük is kialakíthatóak. A kondicionális mutáció azt jelenti, hogy a mutációnak bizonyos körülmények között nincs fenotípusa, más körülmények között viszont van, pl. a fágok esetén szaporodni tud, vagy nem tud. A kondicionális mutáció rendszerint egy fehérje valamelyik aminosvát érinti, amelynek fontos szerepe van a fehérje stabilitása, működése szempontjából. Alacsonyabb hőmérsékleten jó a szerkezete, de könnyen denaturálódik, szerkezetét veszti néhány C fokkal magasabb hőmérsékleten (24. ábra). A lizogén fág DNS-e a fertőzést követően integrálódik a kromoszómába, távozáskor kivágódik a kromoszómából. Mindkét rekombinációs lépésnél előfordulhatnak hibák, és ritkán az is előfordul, hogy a kivágódó fág egyik saját génje helyett egy gazda DNS darabot visz magával. Természetesen az ilyen fág szaporodásra alkalmatlan (defektív fág), de fertőzni tud. A megfertőzött sejt DNS-ébe rekombinálva bejuttathatja az előző gazdából származó gént: így a horizontális génátvitel eszközévé válik ( ábra). Mivel a lizogén fág integrálódása mindig egy adott helyre történik (attachment site, att), hibás kivágódáskor természetesen elsősorban a közvetlen szomszéd géneket tudja magával vinni. A horizontális génátvitelnek ezt a módját ezért speciális transzdukciónak nevezzük (26. ábra). Persze a fág DNS-e rekombinálódhat a genom egyéb darabjaival is, de ennek gyakorisága már igazán elenyésző. Ilyenkor azonban a fág nem csak szomszédos géneket vihet magával, hanem bármely gént, ezért ezt a ritka jelenséget általános transzdukciónak nevezzük (27. ábra). Azt hihetnők, hogy ezeknek a múlt századi felfedezéseknek ma már vajmi kevés jelentősége van. A helyzet azonban az, hogy modern molekuláris biológiai eszközökkel újra kutatva ezeket a jelenségeket rendkívül fontos orvosbiológiai dolgokat deríthetünk ki. A kórokozó baktériumokban tucatnyi virulencia gént találunk, vagy virulencia plazmidokon, vagy kromoszómában kialakult un. virulencia szigeteken. Immunrendszerünk rendkívül hatásos védelmet biztosít a kórokozókkal szemben, de azért aadnak olyan baktériumok, amelyek szellemes trükköket fejlesztettek ki az évmilliók során, hogy kijátsszák az immunrendszer egyes

5 mechanizmusait ( ábra). Ha ismerjük azokat a géneket, az általuk kódolt fehérjék szerkezetét, feladatát, amelyek a patogenitásban (megbetegítésben) fontos szerepet játszanak, akkor a gyógyszerfejlesztők tudják, mely célpontok ellen kell új, hatékony hatóanyagokat keresni. Óriási jeletőséggel bírnak a rezisztencia plazmidok és rezisztencia gének is a kórokozók elleni védelemben. Ha ismerjük ezek működését, tudunk olyan hatóanyagokat fejleszteni, amelyek ellen nem képesek megvédeni a kórokozókat a rezisztencia gének által kódolt fehérjék. A milliárdnyi különböző baktérium közül elenyészően kevés képes az embert megbetegíteni. De még ma is emberek milliói halnk meg bakteriális betegségekben. Egyes sikeres kórokozók, mint pl. a tuberkulózist okozó Mycobacterium, vagy a gyomorban élő Helicobacter a 6-7 milliárdnyi emberiség közel felét(!) meg tudja fertőzni még ma is. A baktérium genetika és a gyógyszerfejlesztés előtt még szép feladatok állnak.

6 Baktériumok és fágok genetikája Kiegészítő anyag Speciális előnye a mikrobiális rendszereknek, hogy olcsón, nagyszámú utódot lehet fenntartani és átvizsgálni, ezért segítségükkel a nagyon ritka genetikai események is tanulmányozhatók. Látni fogjuk, hogy különösen igaz ez a bakteriofágokra. Ez tette lehetővé olyan alapvető genetikai folyamatok tanulmányozását, mint a mutációképződés, rekombináció, DNS-fehérje kölcsönhatás. A baktérium és fággenetika fejlődése megalapozta a molekuláris klónozást (génsebészet), és megteremtette minden genom megismerésének lehetőségét, hiszen ennek alapfeltétele volt a klónozó vektorok kifejlesztése. A baktériumok prokarióta szervezetek, nincs sejtmagjuk, haploidok, genomjukat általában egy, kör alakú kromoszóma, valamint változó méretű és példányszámú plazmidok alkothatják. A genetikai információ átvitel konjugáció, transzdukció vagy transzformáció segítségével történik. A konjugáció sok esetben fajok között is végbemehet, aminek eredménye a horizontális géntranszfer. Ennek a folyamatnak jelentős szerepe van a bakteriális genomok fejlődésében. Mint látni fogjuk, egyedülálló az is, hogy a rekombinációs folyamatoknál, nagyon sokszor, nem két teljes haploid genom van jelen, hanem ún. parciális diploidok képződnek. A bakteriofágok (fágok) a baktériumok vírusai. Nukleinsav és fehérjeburok alkotja őket, genomjuk haploid, egy lineáris vagy cirkuláris kromoszómájuk van. Lizogén vagy lítikus úton szaporodhatnak. Genetikai rekombináció a lítikus ciklusban, kevert fertőzés esetén jöhet létre két eltérő genotípusú bakteriofág között. Genetikai markerek baktériumokban prototróf "vad típusú" baktérium, minimál táptalajon képes nőni szén- és nitrogénforrás, sók, víz jelenlétében. A minimális tápigény fajonként eltérő lehet (nitrogénkötő, fotoszintetizáló, aerob, anaerob, stb fajok esetében). auxotróf - mutáns baktérium, amelynek külön tápigénye van a vad típushoz képest. Például nem képes egy adott aminosavat, nukleotidot, vitamint, stb. előállítani. rezisztencia markerek - szűkebb értelemben antibiotikum rezisztencia (pl. sterptomycin rezisztencia). A rezisztencia oka lehet egy mutáció megjelenése, ami az antibiotikum hatását akadályozza, de lehet egy extra gén, géncsoport megjelenése is, amely az antibiotikum semlegesítését végző apparátust kódol (módosító enzimek, transzport fehérjék). Tágabb értelemben bármilyen környezeti tényezővel szembeni ellenállóképesség lehet (ozmotikus, ph, nehézfém, UV, hő, detergensek, bakteriofág), amelyet egy mutáció vagy egy gén megjelenése idézhet elő. egyéb markerek - motilitás, telepmorfológia, szín (pl. enzimaktivitás kimutatása színreakcióval), szelektálható markerek - ha egy vad típusú vagy egy mutáns allél megjelenése előnyt jelent a baktériumnak, akkor a megfelelő szelekciós körülményeket biztosítva ki lehet válogatni az

7 allélt hordozó baktériumokat (csak az egyik allélt hordozó sejtek képesek növekedni és telepet képezni szelektív körülmények között). látható markerek - a vad vagy mutáns allélt hordozó egyed növekedésében nincs kölönbség, de az eltérő genotípusú baktérium (kolónia) más színű vagy kimutatható pl. festéssel Rekombináció baktériumokban Joshua Lederberg és Edward Tatum (1946.) kísérletei bizonyították először, hogy van rekombináció baktériumokban is. Többszörösen auxotróf törzseket kevertek össze: A törzs ( met-, bio ) x B törzs ( thr, leu-, thi) Összekeverés után, minimál táptalajon kis gyakorisággal (10-7 ) telepek jelentek meg. Ezekről feltételezték, hogy prototróf rekombinánsok utódai. A kontroll kísérletekben ahol a két törzset külön-külön szélesztették a minimál táptalajra telep sohasem jelent meg. Igy biztosak lehettek abban, hogy nem a mutációk reverziójáról van szó. Ennek több mutáció esetében különben is nagyon kicsi a valószínűsége. A fertilitási (F) faktor felfedezése William Hayes (1953) kísérleteket végzett a transzfer (információ átvitel) irányának megállapítására. Az egyik szülő elölésére streptomycin antibiotikumot alkalmazott. A streptomicinre érzékeny törzsek fehérjeszintézisét gátolja az antibiotikum. Ha az antibiotikum megfelelő ideig jelen van, akkor a sejt már nem képes szaporodni, de egy ideig vegetál és a keresztezésben "aktív" (Ebben az esetben a keresztezésben részt vevő törzsek egyike sem rezisztens). Csak az egyik törzs elölése akadályozta meg a rekombinánsok keletkezését. Tehát a transzfer nem volt kétirányú! "Szexuális" kölönbség van a törzsek között: az A = donor törzs ("male"), a B = recipiens törzs ("female"). Később kiderült, hogy a fertilitási tulajdonság (viszonylag nagy gyakorisággal) elveszhet, függetlenül a baktérium egyéb tulajdonságaitól. Újabb keresztezési kísérletekben azt is bizonyították, hogy a fertilitási tulajdonság függetlenül más markerektől nagy gyakorisággal átjut a donor sejtből a recipiensbe. Tehát van egy fertilitási (F) faktor, amely sokkal gyakrabban jut át a donorból a recipiensbe, mint az egyéb markerek. A donor törzs ezt tartalmazza (F + ), a recipiens törzsben ez a faktor nincs jelen, ezért azt F - törzsnek hívjuk. A Hfr törzsek Luca Cavalli-Sforza egy kísérletében véletlenszerűen ezerszer több rekombináns jelent meg a szokásosnál. A kísérletben alkalmazott donor törzs megtartotta ezt a tulajdonságát. Ezért elnevezték Hfr törzsnek (high frequency recombination). Ez lett később a Hfr C donor. A felfedezést követően nagyszámú Hfr törzset izoláltak és ez felgyorsította az E. coli genetikai térképének elkészítését.

8 A géntérképezés lehetősége Elie Wollman és Francois Jacob (1957.) tanulmányozta az F-faktor és más genetikai markerek átjutását a Hfr x F - keresztezéseknél. Bevezették a "megszakított párosodás" (interrupted mating) módszert, ahol a donor és recipiens összekeverését követően meghatározott időnként mintát vettek, erőteljesen megkeverték egy turmixgép segítségével, majd szelektív táptalajra szélesztették, illetve vizsgálták az utódokban a különböző genetikai markerek megjelenését. A kísérletek segítségével kimutatták, hogy egy adott Hfr törzs esetében a markerek átjutása meghatározott időbeli sorrendben történik. A genetikai rendszer kiépítése Az átjutási idő és a rekombináns kategóriák meghatározásával lehetővé vált a baktérium kromoszómáján a gének elhelyezkedésének vizsgálata, azaz genetikai térképezése. A "perctérképezés" a megszakított párosodás segítségével lehetővé teszi, hogy egymástól nagyobb távolságra elhelyezkedő, több perc különbséggel átjutó gének sorrendjét meghatározzák. Már kis számú marker alkalmazásával is meg lehet szerkeszteni egy kezdetleges genetikai térképet, ha a markerek viszonylag random helyezkednek el a kromoszómán. A genetikai térképezés feltétele a megfelelően nagy "mutánspark" létrehozása, és olyan donor illetve recipiens törzsek konstruálása, amelyek az izolált új mutációk térképezését lehetővé teszik. Az E. coli mutációk térképezésére különböző Hfr törzseket (donor) izoláltak és ezekkel végeztek perctérképezést. Kiderült, hogy sok esetben a gének átjutási sorrendje nem egyezett meg. Ugyanazokat a mutációkat alkalmazva a különböző Hfr izolátumokkal végzett kísérletekben más és más volt az első átjutó gén, néha az átadás iránya is, de a gének sorrendje nem változott. Ha feltételezzük, hogy az egyes Hfr törzsekben az F-faktor más helyről és irányban indíthatja kromoszóma átvitelt a recipiensbe, akkor minden esetben ugyanaz a kör alakú (cirkuláris) kromoszómatérkép szerkeszthető meg. Tehát az E. coli kromoszómája kör alakú. Újabb és újabb mutációk izolálásával és térképhelyzetének meghatározásával a genetikai térképet egyre pontosabbá tették. Az F-plazmid szerkezete Ahogy az előzőekben láttuk, a kromoszómatranszfer során az F-plazmid több helyre is beépülhet és az integráció irányítottságától függően jutnak át az első kromoszómális markerek az (O, pontosabban orit ) régió után, amely itt a transzfer kezdőpontját, origóját jelenti. Utoljára az ún. fertilitási gének jutnak át, ezért ha a plazmid integrálódott a kromoszómába ennek az eseménynek nagyon kicsi az esélye. Nagy valószínűséggel előbb megszakad a konjugáció. A Hfr törzsek esetében az F-plazmid eleve kromoszómába integrálódott formában van jelen. Ezért sokkal nagyobb a kromoszómatranszfer gyakorisága, és ezért nincs általában donor tulajdonság (fertilitási régió) átjutás. Az önálló replikonként jelen lévő F-plazmidnál a helyzet éppen fordított. A donor tulajdonság nagy gyakorisággal átjut, mert az orit és fertilitási régiót nem választja el egy teljes kromoszóma.

9 Az R-faktorok Más baktériumok kromoszómatérképét számos esetben ún. R-faktorokból (rezisztencia faktorok) származó, széles gazdaspecifitású konjugatív plazmidok segítségével készítették el, amelyek számos antibiotikum hatástalanítását kódolhatják. Ezek a plazmidok szintén sok pontról indíthatnak kromoszóma átvitelt, de nem izolálható esetükben Hfr jellegű törzs. A transzfer így magas kromoszóma átviteli frekvencia esetén is véletlenszerű, tehát nem alkalmas perctérképezésre. Ebben az esetben egy kiválasztott (szelektált) marker és egy vagy több nem szelektált marker együttes "átjutásának" (kapcsoltságának) a gyakoriságát lehet mérni. Minél közelebb van két marker egymáshoz, annál kisebb közöttük a crossing over bekövetkezésének a valószínűsége, tehát annál nagyobb a szelektált és a nem szelektált marker kapcsoltsága. Mivel a "kapcsoltsági" érték fordítottan arányos két marker távolságával, ezért az egyes kapcsoltsági adatok nem adhatók össze. Bakteriofágok A bakteriofágokkal (továbbiakban fágokkal) a genetikai munka egyszerű, anyagigénye is szerény, mégis alapvető fontosságú eredmények születtek az E. coli T2 és T4 fágokkal történő kísérletekből (Benzer és Brenner munkái), nem is beszélve a lambda fággal kapcsolatos későbbi eredményekről. A fág táptalaja a megfelelő gazdabaktérium, amelyet egy lágyabb, ún. fedőagar réteg hordoz. A fedő réteg 0,8 % agart tartalmaz, amelybe kb. 40 o C-os folyékony állapotában belekeverik a baktériumot és a megfelelően higított fágot. A fágok a növekvő "baktériumpázsiton" szaporodnak. Egy fágrészecske fertőzése után néhány órával kiszabaduló utódok megfertőzik a közeli baktériumokat és több cikluson keresztül így alakul ki a baktériumpázsiton a "tarfolt" (plaque v. magyarul plakk). Nagyon kevés fenotípus köthető a plakkhoz. Lehet kicsi vagy nagy, zavaros (turbid) és tiszta (clear). Ez utóbbi kettő azt jelzi, hogy a fág nem képes minden baktériumot elpusztítani a tarfolt területén (turbid plaque) vagy képes erre (clear plaque). A fágokat jellemezi a gazdaspecifitás, a "host range", amely azt jelzi, hogy a fág (vagy annak mutánsa) mely baktériumtörzsön képes szaporodni. A legtöbb fággénben létrehozott mutáció "letális" azaz lehetetlenné teszi a fág szaporodását. Mivel a fágok haploid genommal rendelkeznek, ezért ezek a mutációk csak akkor detektálhatók és tarthatók fent, ha feltételesen letálisak, azaz van olyan körülmény (hőmérséklet vagy baktériumgazda), amely a mutáció ellenére megengedi a mutáns fág szaporodását ("permisszív" körülmények). Nagyon sok fágmutáció hőérzékeny (ts = thermosensitive) mutáció, amely csak magasabb hőmérsékleten (37-42 o C) eredményezi pl. egy életfontosságú fehérje instabilitását ("restriktív" hőmérséklet). Egy fág lehetséges szaporodási módjait a lizogén és a litikus ciklus. Nem minden fág tud lizogén úton szaporodni (profággá alakulni), csak a "temperált" vagy mérsékelt fágok. Ezek képesek speciális transzdukcióra (lásd később). Más fágok (virulens fágok) csak litikus úton sokszorozódnak. Lizogén szaporodás: a fág DNS beépül a baktérium kromoszóma egy adott pontjára és a fág DNS (profág) a baktérium DNS-sel egyidőben, annak részeként replikálódik vagy a kromoszómától

10 függetlenül, a plazmidokhoz hasonlóan replikálódik és így alakít ki lizogén állapotot (pl. a lambda vagy P1 E. coli fág). Lítikus fágszaporodáskor a fágfertőzés után a fág DNS replikálódik a gazda kromoszómától függetlenül, szintetizálódnak előbb a korai majd a késői fágfehérjék és az elkészült fágrészecskék, általában a baktériumsejt lízise útján, kiszabadulnak a baktériumból. Ezt követően ismételten fertőznek. Vannak olyan fágok, amelyek gazda géneket juttatnak át egyik baktériumból a másikba. A folyamatot általános transzdukciónak nevezzük, mert bármelyik gazda gén átvitele egyforma (nagyon kicsi) gyakorisággal fordul elő. Ebben az esetben a fágrészecskék érése során a kialakuló fágfejbe, nagyon ritkán és véletlenszerűen bakteriális DNS kerül. A legtöbb fág nem hordoz bakteriális DNS-t. A bakteriális DNS-t hordozó fágrészecske fertőzőképes (azaz képes a benne lévő DNS bejuttatására), de természetesen szaporodásra képtelen (elvesztett fág géneket). Olyan, mint egy trójai faló, az idegen DNS általa jut be a baktériumsejtbe és rekombináció után a bejuttatott marker (gén) kicserélődhet a baktériumtörzsben lévő eredeti génnel. Megfelelő szelekciós rendszer esetén a rekombinánsok kimutathatók. Speciális transzdukció A speciális transzdukció esetén a transzdukáló fág csak néhány meghatározott kromoszómális marker átvitelére képes. A jelenséget a lambda fág E. coli rendszeren fedezték fel és tanulmányozták behatóbban. A lambda fág, mint temperált fág, profágként a baktérium kromoszóma specális helyén (attb) képes integrálódni a genomba. Hibás kivágódás esetén az attb régió közelében lévő pl. gal gén részévé válhat a fággenomnak, de csak ezt a baktériumgént képes a fág a recipiensbe átjuttatni. Ez a transzdukáló fág egy defektív fág, a lambda dgal, mivel fággének maradtak a kivágódás helyén. Ez a fág nem tud ismét integrálódni, csak, ha egy "helper fág" segít ebben, amely hordozza a defektív fág hiányzó génjeit. A transzdukáló fág tehát csak a gal gént és közvetlen környezetét hordozza. A transzformáció felfedezése Frederick Griffith 1928-ban fedezte fel a jelenséget Streptococcus (Pneumococus) törzsekkel végzett kísérletezés közben. A Streptococcus pneumoniae S variánsa (smooth = síma) a beoltott egereket megbetegítette, míg az R variáns (rough = durva, rücskös) nem. Ha az S variánst hőkezelte, szintén nem okozott betegséget, de a hőkezelt S és az élő R variáns összekeverése után megjelent ismét a patogén S variáns. Az anyagot, amely az R variánst S variánssá alakította Griffith "transforming principle" néven emlegette, kémiai természetével nem volt tisztában. A DNS a "transforming principle"! Oswald Avery, 1944-ben végzett kísérleteket hasonló Stereptococcus rendszeren, azzal a kölönbséggel, hogy megpróbálta a transzformáló anyagot azonosítani. Az S variáns baktérium fehérje, poliszacharid, lipid, RNS- és DNS-molekulái közül csak a DNS bizonyult hatékonynak a transzformációs kísérletekben. Igy Avery volt az első, aki bizonyította, hogy az örökletes anyag a DNS, a géneknek a DNS-molekulán kell elhelyezkedniük.

11 A különböző baktériumok génjeinek megismerése ma is fontos kutatási cél. Most azonban a speciális tulajdonságokat hordozó gének kerültek az érdeklődés középpontjába. Meg kell ismernünk a patogén, kórokozó prganizmusok virulencia génjeit, amelyek segítségével betegségeket tudnak okozni. A szimbionta vagy extrém körülmények között élő fajoknál szeretnénk azokat a géneket megismerni, amelyek a különleges környezethez való alkalmazkodásban játszanak szerepet. A baktérium genomok evolúciója Az előzőekben láthattuk, hogy a baktériumok genomjának fejlődését döntő mértékben segítik a széles gazdaspecifitású, konjugatív plazmidok, az aktív transzformációs mechanizmusok, és részben a bakteriofágok is. Nemcsak fajon belül, hanem fajok között is lehetővé teszik a hasznos gének cseréjét, "kifejlesztését". Egy baktérium fajon belül akár 30 % eltérés is lehet a gének számát, milyenségét illetően. Genetikai információ átadás tekintetében elmosódnak a faj határai. A horizontális géntranszfer révén távoli fajok között is áramlik a genetikai információ. A genomprojektek eredményeként világossá vált, hogy számos esetben egy bakteriális genom (kromoszóma) jelentős része idegen eredetű, más baktériumfajokból származó géneket tartalmaz. A baktériumok világában ezért nem használható a faj fogalma. Az "idegen" gének gyorsabb áramlását és kromoszómától független fennmaradását segítik a konjugatív plazmidok, ha azok az adott fajban képesek önálló replikációra. Így a bejutott gének megmaradása nem igényel rekombinációs folyamatokat. Ennek orvosi jelentősége azért igen nagy, mert mind a rezisztencia gének (pl. antibiotikumokkal, antibakteriális vegyületekel szembeni ellenállóság), mind a betegség okozásáért felelős gének (virulencia gének) képesek átjutni egyik baktériumból a másikba.