Peptidek (savamidok) szintézise. feladat: a szintéziskor elvben csak egy mól vizet kell elvonni peptidkötésenként, ám az ördög a részletekben rejlik.

Átírás

1 Peptidek (savamidok) szintézise feladat: a szintéziskor elvben csak egy mól vizet kell elvonni peptidkötésenként, ám az ördög a részletekben rejlik. 1

2 avamidok (peptidek) szintézise és hidrolízise megfigyelés: A reakció kvázi formális, ha szoba T-n és p ~7 en próbálkozunk, ugyanis ilyen körülmények között nem acilezés, hanem sóképzés megy csupán végbe: kérdés: hová megy szívesebben proton? - az ½ negatív - atomra, vagy a - -atom nemkötő elektronpárjára? válasz: kvázi kvantitatív módon a -atomra megy a proton. magyarázat: a nagyobb e vonzó oxigén atomtörzs a saját nemkötő 2 e -párját jobban vonzza, mint azt a semleges teszi. Viszont ekkor a már nem nukleofíl és ezért nem lesz A reakció, s 2 végeredményben nem lesz acilezés. (Kajtár 384)

3 memo: vizes közegben a sok proton csak egy kicsit vándorol, s a kapott új rendszer (acetát és ónium só) összességében nem csak a protonnak, de minden más komponensnek is kedvezőbb lesz. (Kajtár 397) memo: óvatos hevítés mellett ugyan lehet amid kötést létrehozni, de ez nem lehet a szintetikus megoldás! hidrolízis: vízzel az amidok (p ~7) alig-alig hidrolizálnak: memo: Ez elvben jó mert így a peptidek és fehérjék stabilak vízben. pl: Az -F-F-F-G- peptid esetében a Gly 25 o on 7 éves felezési idővel hidrolizál ( s -1 ). JA, 1988, 110,

4 Amidok lúgos hidrolízise (kiválóan megy); vázlatos mechanizmus: Amidok savas hidrolízise (kiválóan megy); vázlatos mechanizmus: memo: tehát a hidrolízis erdeményes ha a p nem neutrális! 4

5 elyes preparatív stratégia az amid-kötés kialakítására : zinte mindig egy aktivált karbonilvegyületen keresztül, ahol X egy jó távozó csoport! 1) savkloridon át: memo: a savklorid előállításának vázlatos mechanizmusa (Ad + E): 5

6 2) savanhidriden át: 3) aktívészteren át: memo: amidok bázikus hidrolízise észter köztiterméken át: R 2 Q R Q R + 2 Q amid és alkoxid észter és amin R 3 R 3 R + 3 észter és hidroxidion 6 karboxilát és alkohol

7 Minden szintézis termodinamikai lejt-menet :DG<0 kell legyen A reaktánsok B termék G <0 termék reaktánsok G >0 Termodinamikai szempontból a szintézis végbemehet Termodinamikai szempontból a szintézis nem mehet végbe Karbonsav + amid : B-eset, a reakció nem mehet végbe! G >0 7

8 Minden szintézis termodinamikai lejt-menet :DG<0 kell legyen A reaktánsok B termék G <0 termék reaktánsok G >0 Termodinamikai szempontból a szintézis végbemehet Termodinamikai szempontból a szintézis nem mehet végbe Karbonsav + amid + l 2 : A-eset, a reakció végbemegy! l l G <0 + l l 8

9 A termodinamikai lejt-menet szükséges, de nem elégséges feltétele a reakció előfordulásának! A reakciógát magassága is fontos! G # alacsony G # magas a magas a gát, katalizátor segítségével csökkenthetjük! G # magas G # alacsonyabb katalizátor (enzim) 9

10 Polipeptid szintézis; eredményes kapcsolás, de rossz stratégia pl. állítsuk elő az -Ala-Gly- dipeptidet Valójában a terméklista sokkal bővebb: Az Ala-Gly mellett kapunk még Ala-Ala-, Ala-Ala-Gly, Ala-Ala-Ala, stb. Termékeket. 3 + (1) l (2) A G AG AA etc. AAG magyarázat: az acilezőszer az Ala-l, ám az acilezi nem csak a Gly-t de önmagát is, és így megjelenik az Ala-Ala-l acilezőszer és az.. megoldás: - terminális aktíválás plusz -terminális védelem. AAA 10

11 Lehetséges dipeptidek száma: 2 2 =4: B A Lehetséges tripeptidek száma: 2 3 =8: megoldás: -terminális védelem, majd - terminális aktíválás és kapcsolás. 11

12 Polipeptid szintézis, lépésről lépésre: cél: álljtsuk elő pl. a --B-A- tripeptidet: B A kapcsolás B A hasítás B A kapcsolás B A hasítás 12

13 Az -terminális (aminocsoport) védelme: 2 l Boc 2 di-terc-butil-dikarbonát l Z-l benzil-oxi-karbonil-klorid 3 5 Fmoc-l 9-fluorenil-metil-oxi-klorid Boc 2-3 terc-butoxi-karbonil-azid 13

14 Az -terminális (aminocsoport) védelme: 1) A Boc-védőcsoport 1.1.) kialakítása: p ~

15 memo: -Boc-l, nem igazán jó mert bomlik - Boc- 3 igen jól használható ám robbanékony - Boc 2 (Boc-anhidrid) bár drágább és pazarló mégis igen kedvelt. + 2 R 25 o R Boc 2 di-terc-butil-dikarbonát aminosav Boc-csoporttal terc-butil-oxi-karbonil-csoporttal védett aminosav védõcsoport eltávolítása l vagy F 3 / ecetsav, 25 o R 1.2.) Védőcsoport eltávolítás: - savas hidrolízis - 2 -nek (Pd/) ellenáll (tehát a Z- védelemre ortogonális) 15

16 A Boc-védőcsoport eltávolításának (hasításának) mechanizmusa (savval-kiváltott (elektrofil) elimináció) : peptid

17 2) Az Fmos-védőcsoport 2.1) kialakítása: p ~ ) eltávolítás: - savas közegben stabil - 20% piperidin /DMF eltávolítható (Z- és Boc- védelemre ortogonális) 17

18 Összefoglalás: az Fmos-védőcsoport bevitele és eltávolítása 18

19 Az Fmoc-védőcsoport lehasításának mechanizmusa: (Bázissal- (nukleofillal) kiváltott elimináció): : peptid memo: a hajtóerő oka, hogy a kialakuló anion esetében az aromacitás kiterjed a mol. egészére 19

20 3) Az Z-védőcsoport kialakítása és használata: 20

21 Az -terminális (aminocsoport) védelme: 1) A Metil- etilészter kialakítása és használata: - reakció sósavas metanollal (etanollal), s kapjuk az aminosav metil(etil) észter hidroklorid sóját (tipikusan kristályos vegyület) - l 2 + alkohol jó alternatíva Eltávolítás: - nem hasítja: Br/Ac, TFA, katalitikus hidrogénezés,... - eltávolítás elszappanosítással (veszélye a racemizáció) 2) A Benzilészter kialakítása és használata: - Tos-l és benzilalkohol eltávolítás: -Br/Ac vagy TFA vagy katalitikus hidrogénezés R 2 / Pd + R benzil-észter 3) A Terc-butilészter kialakítása és használata 21

22 Karboxil-védőcsoportok: összefoglalás védőcsoport bevitele benzil-észter (Bn, Bzl) Bz benzoil!!! 2 terc-butil-észter (tbu) védőcsoport lehasítása 2 /Pd- TFA/DM (F 3 ) 22

23 Aminosavak összekapcsolása 1) aktívészteres aktíváláson át: Fmoc Aaa X pl.x= p-nitrofenil-észter pentafluorfenil-észter pentaklórfenil-észter -hidroxiszukcinimid-észter Q 2 Fmoc Aaa p Bodánszky M. Bodánszky Miklós (GYKI) ase Western Reserve Uviversity, olumbus, 23

24 Aminosavak összekapcsolása 2) karbonsavazid aktíváláson át: Fmoc Aaa 3 Fmoc-Aaa- 3 Q 3 : : : : : : 24

25 Aminosavak összekapcsolása 3) Karbodiimiddel vagy vízelvonó szerrel + + Diciklohexilkarbodiimid; DI Diizopropilkarbodiimid, DI 25

26 A mechanizmus részletei: Fmoc Aaa 1 Q == Q Fmoc Aaa 1 + Q == Q Q = Q Fmoc Aaa Q =-Q 2 Aaa 2 R Fmoc-Aaa 1 -Aaa 2 -R Fmoc Aaa Aaa 2 R + Q Q (kiválik) 26

27 Aminosavak összekapcsolása 4) Vegyesanhidrid aktíváláson át: A karboxilcsoport aktiválása: Kapcsolás vegyesanhidriden át: 27

28 Az oldatfázisú peptidszintézis elemi lépései: memo: a módszer jó, a kapcsolás szelektív, de az eljárás elég lassú. 28

29 zilárdfázisú peptidszintézis Robert B. Merrifield, 1963 D 1984 Boc K + Q 1 + l 2 P oupling Deblocking Boc 2 P Q 1 oupling Boc X Q 2 Deblocking Boc 2 P Q 2 Q 1 3, 4,...n Final cleavage 29

30 B A kapcsolás B A 30

31 Peptid szintézis szilárd fázison: -terminális védőcsoportok: korábban: Boc-stratégia ma: Fmoc-stratégia 2 R hasítás 20% DMF hasítás TFA 31

32 zilárd fázisú peptidszintézis: 32

33 33

34 Összefoglalás és általánosítás: Linkerre kötés: A szintézis befejező lépései: 34

35 A szilárdfázisú peptidszintézis: előnyök és hátrányok Makropórusú gélmátrix eterogén reakció lassú Könnyű feldolgozás agy reagens felesleg (3 7x) Automata szintetizáló készülék Ribonukleáz (124) lépés, hozam: 17% PL Kitermelés (>99,9%) 35

36 Elméleti hozamok egymást követő reakciólépések után: Kitermelés (%) egy- egy lépés esetén kapcsolások száma , ,0 98,0 97,0 99,0 98,0 97, ,2 74,0 95, , ,8 21,5 90,0 81, , , ,1 4,23 85, , ,88 0,76 80,0 64, , , ,15 0,12 75, ,0 7,51 5,63 0,32 0,02 70,0 49, , ,23 5,76 4,03 2,82 0,08 65, ,54 4,90 3,19 2,07 1,35 0,02 60,0 36, ,0 7,80 4,70 2,80 1,70 1,10 0,60 55, ,20 5,00 2,80 1,50 0,8 0,5 0,3 50,0 25,0 13 6,30 3,10 1,50 0,78 0,4 0,20 0,10 36

37 Az aminosav sorrend és a polipepek azonosítása (szekvenálása): Pl: idrolízis (6M l/24ó) után kationcserélő gyanta, amin az aminosavak a bázikus karakterük szerint adszorbeálódnak a legbázikusabbak lesznek legtovább az oszlopon : R R' Elúciós profil, majd kimutatás R'' R'"

38 38

39 Az aminoterminális jellegzetes reakciója; a ninhidrin teszt indán-1,2,3-trion ninhidrin memo: Pro és yp másként reagál a ninhidrinnel; a kapott termék máshol abszorbeál: 39

40 Az aminosav sorrend; a szekvenálás: 40

41 1) Az Edman-lebontás: R' + 2 etc. p9 fenil-izotiocianát R R' etc. savas hasítás + + instabil intermedier R' R R jelölt polipeptid hõ átrendezõdés f eniltiohidantoin(pt) PL-vel azonosítható R Pehr Victor Edman ( ) 3 + etc. egy aminosavval rövidebb polipeptid memo: akár egy 60-as peptidet is meg lehet így szekvenálni 41

42 Az Edman-lebontás javasolt kémiai mechanizmusa: fenilizotiocianát 2 R R' etc. p9 R R' savas hasítás etc. R R' etc. 2 R R' etc. 2 + R etc. proton transzfer R' R R' etc. R R' etc. +.cte 3 R' 2 R R f eniltiohidantoin(pt) PL-vel azonosítható További részletek a címen R 42

43 tandard PT-aminosavak; azonosítás RP-PL Procise cl D Q T G E dmptu A 500 fmol PT tandard Y P R M V dptu W dpu F I K L pmtc mm olumn Technology 500 fmol PT tandard D Q T G E A R Y P M V dptu W F I K L

44 2) anger-féle -terminális meghatározás Frederick anger 1958 obel-díj Az inzulin szekvenálása memo: 2 aromás σ-komplexek + l l l l l lassú gyors

45 éhány éredkes peptid és peptidhormon: 1) A glutation: - tripeptid - szokatlan peptidkötés G (Glu) ys Gly 2 2 Glu ys Gly G 45

46 Fiziológiás szerep: - Aminosav-transzport a sejtmembránon át - scavenger/ gyökfogó - Fe 2+ /hemoglobin 2 GG Glutation reduktáz 46

47 Az oxidáció a normál méregtelenítő metabolizmus része: Az oxidálódott aflatoxin nukleofil szubsztitúciós reakció során kapcsolódik a glutationhoz, s így jóval polárisabbá válik. A vízoldható tioéter kiürül. 47

48 Peptidhormonok: 1) xytocin 2) Vazopresszin ys Tyr Ile ys Tyr Phe Gln Gln ys Asn ys Asn Pro Leu Gly 2 Pro Arg Gly 2 méhizom-összehúzódás tejkiáramlás az emlőmirigyből antidiuretikus hatás víz-újrafelvétel a vesébe vérerek -összehúzódás vérnyomás-szabályozás 48

49 Az oxitocin és a vazopresszin elsődleges szerkezete: oxitocin vazopresszin leucin arginin izoleucin 2 f enilalanin 49

50 Vincent du Vigneaud, obel-díj 1955 oxitocin, vazopresszin szintézis 50

51 3) Preproinsulin és az inzulin: a hasnyálmirigy hormonja, ami a cukor metabolizmust szabályozza 33-peptid peptid anger (1953) elsőnek (10 év munka) a marha inzulint szekvenálta meg 24 Inzulin: (A és B lánc, összesen 51 as.) 51