Modellpeptidek szintézise Hg(II) ion által katalizált bomlás vizsgálatához

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat SENDULA RÓBERT Modellpeptidek szintézise Hg(II) ion által katalizált bomlás vizsgálatához Témavezető: Süliné Dr. Vargha Helga Készült a ELTE - MTA Peptidkémiai Kutatócsoportjában Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2005.

2 TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék 2 Rövidítések jegyzéke 3 1. Bevezető 4 2. Célkitűzések 5 3. Peptidszintézis Szilárdfázisú peptidszintézis Stratégiák a szilárdfázisú peptidszintézisben 3.2. Modellpeptidek szintézise és tisztítása Anyagok és berendezések Lineáris peptidek szintézise Ciklopeptidek szintézise Peptidek tisztítása Peptidek azonosítása Előzetes bomlásvizsgálatok A dipeptidek bomlásvizsgálata VRK-n 4.2. Lineáris és gyűrűs oligopeptidek bomlásának vizsgálata analítikai HPLC-vel Eredmények összefoglalása Köszönetnyilvánítás Hivatkozások

3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Aaa Ac Boc Bzl DCM DCC DIC DIEA DMF Dnp DMS Fmoc HOBt HPLC MBHA Mob MS OAc TFA TEA TIMP-1 Tos VRK - Tetszőleges aminosav - Acetil - terc-butiloxi-karbonil - Benzil - Diklórmetán - Diciklohexil-karbodiimid - Diizopropil-karbodiimid - Diizopropil-etilamin - N,N-dimetil-formamid - Dinitrofenil -Dimetil-szulfon - Fluorenil-metoxi-karbonil - N-hidroxi-benztriazol - Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia - 4-metil-benzhidrilamin - p-metoxi-benzil - Tömegspektrométer - Acetát - Trifluorecetsav - Trietil-amin - Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases - Tozil - Vékonyréteg-kromatográfia 3

4 1. BEVEZETŐ A TIMP-1 fehérje C-terminális doménjének szintézisekor a teljesen védett peptidről cseppfolyós hidrogén-fluoriddal, az acetamidometil-csoportokat kivéve, az összes védőcsoportot eltávolították. S G Q L K P I C S L C P F V I C T L L Q D T W L H A C C L P R E P G L C T Q L G H S E K G F Q S R E NH 2 W Q S L R S Q I A COOH 1.ábra. TIMP-1 fehérje C-terminális doménje A cisztein acetamidometil védőcsoportjának eltávolításához használt Hg(II) ionokat atomabszorpciós mérések tanúsága szerint többszörös kromatográfiás tisztítás után sem sikerült eltávolítani [1]. Modellkísérletekkel kimutatták, hogy ez a Hg(II) ion szennyeződés mind a HPLC-s tisztítás, mind a ciklizálás körülményei között a peptid bomlását idézi elő [1]. A nyomokban jelentkező bomlásterméket csak a fejlett MS technikának köszönhetően lehetett észrevenni. Hasonló bomlást ciszteintartalmú peptid esetében Garzotti és munkatársai észleltek [2]. Ennek a mellékreakciónak a tanulmányozása nemcsak azért bír jelentőséggel, mert megnehezíti bizonyos szintézis körülmények között előállított peptidek tisztaságának a biztosítását, hanem azért is, mert a reakciónak lehetnek élettani vonatkozási is. Mint az már közismert, a nehézfémek enzimgátló, és ezáltal egészségkárosító hatásúak, amelyre például szolgál a szerinproteázt gátló hatás [3], a neutrofil granulociták aktivitásának gátlása [4], idegsejtek maradandó károsítása [5]. Tanulmányozták a ciszteinre koordinálódó higany (II) ion peptid/fehérje harmadlagos szerkezetmódosító hatását is [3, 6]. Így elképzelhető, hogy ennek a reakciónak a tanulmányozásával egy újabb, nehézfémionok hatásának betudható molekuláris szintű fehérjekárosító mechanizmusra is fény derül. 4

5 2. CÉLKITŰZÉSEK TDK munkám célja olyan modellpeptidek szintézise volt, amelyek alkalmasak lehetnek a Hg(II) acetát hatására végbemenő peptidkötés hasadásnak tanulmányozására. Az eredeti megfigyelés szerint, a szintetikusan előállított TIMP-1 C-terminális domén tömegspektrumában azonosított szennyeződés az Arg 162 -His 163 közötti peptidkötés hasadásával jött létre [1], ezért elsősorban Arg-His szekvenciát tartalmazó peptidek szintézise volt a célom. Az irodalom szerint, a peptideket illetve fehérjéket alkotó aminosavak közül a hisztidin, a cisztein, a glutaminsav illetve az aszparaginsav képes, oldalláncainak funkciós csoportja révén, fémkomplexek képzésére [7, 8, 9]. Így feltételezhető, hogy a fent észlelt Arg-His peptidkötés hasadásában a hisztidin imidazol oldalláncának szerepe van, de nem zárható ki a diszulfidkötés jelenlétének hatása sem, hiszen a TIMP-1 fehérje C-terminális doménje diszulfidhidakat is tartalmaz (1. ábra). A Hg(II) ion által katalizált bomlás tanulmányozásához olyan modellpeptidek előállítására volt szükség, amelyeknek vizsgálatával mind a hisztidin, mind a diszulfidkötés szerepe tisztázható. A modellpeptidek tervezésekor a következő szempontokat vettük figyelembe: 1. H-Arg-His-NH 2 csak a hasadó kötést tartalmazó szabad N-terminálisú dipeptid 2. Ac-Arg-His-NH 2 csak a hasadó kötést tartalmazó védett N-terminálisú dipeptid 3. Arg-His szekvenciát tartalmazó lineáris peptid 4. Arg-His szekvenciát tartalmazó, diszulfidhidas ciklopeptid a TIMP-1 C-terminális egyszerűsített modellje, tartalmazza a bomlásban szerepet játszható Arg-His peptidet és diszulfidhidat 5. Ala-His szekvenciát tartalmazó, diszulfidhidas ciklopeptid a hisztidint megelőző aminosav szerepének vizsgálatára 6. Arg-His szekvenciát nem tartalmazó diszulfidhidas ciklopeptid diszulfidhíd szerepének vizsgálatára Ezeknek a szempontoknak megfelelően az alábbi peptidek bomlását kívántam vizsgálni: H-Arg-His-NH 2 Ac-Arg-His-NH 2 H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH Az itt felsorolt peptidek közül a kutatócsoportban korábban elkészült: H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH 5

6 Az én feladatom pedig a következő vegyületek szintézise volt: H-Arg-His-NH 2 Ac-Arg-His-NH 2 Ezután olyan próba kísérlet elvégezése volt a célom, mellyel azt kívántam megvizsgálni, hogy a tervezett peptidek alkalmasak-e az említett bomlásjelenség reprodukálására. Mivel a TIMP-1 lúgos ph-n (ciklizáláskor) és savas ph-n (kromatográfiás körülmények között) is bomlik, mindkét ph tartományban terveztem próba kísérletet. A savas ph tartományban reakcióközegként a kromatográfiás tisztításban használt A eluens, trifluorecetsav 0,1% -os vizes oldata (ph~2) szolgált. A lúgos ph tartományban reakcióközegnek a ciklizáláshoz használt ammónium-acetát puffert választottam (ph=7,92). 6

7 3. PEPTIDSZINTÉZIS A peptideket felépítő aminosavrészek savamídkötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A savamídkötés az egyik aminosav karboxilcsoportja és a másik aminosav aminocsoportja között alakul ki (2. ábra). 2. ábra. A peptidkötés kialakítása (X, Y védőcsoportok) A peptideket alkotó aminosavak száma szerint megkülönböztetünk dipeptideket, tripeptideket, tetrapeptideket és így tovább. A kettőnél több aminosavat tartalmazó peptideket oligopeptideknek is szokták nevezni. A kisebb tagszámú peptidek oldatfázisú előállítására általában lépésenkénti szintézist használnak [10, 11]. Ez magába foglalja a peptidkötés kialakításában nem szereplő funkciós csoportok (az oldallánc funkciós csoportjai) átmeneti megvédését, a peptidkötést létesítő karboxilcsoport előzetes aktiválását, majd a kapcsolást, azaz a peptidkötés kialakítását két aminosav között, végül pedig a védőcsoportok eltávolítását. Az acilező aminosav karboxilcsoportjának aktiválása azt jelenti, hogy az N-védett aminosavat reakcióképes karbonsavszármazékká alakítjuk át. Ennek megfelelően az alábbi peptidszintetikus módszerek ismeretesek: Karbonsavazidos Karbonsavkloridos Vegyes anhidrides Szimmetrikus anhidrides Aktív észteres - in situ aktívészter ( HOBt + DCC ) Karbodiimides Oldatfázisú szintézis esetén az acilezendő aminosav karboxilcsoportját is átmenetileg védeni kell. Erre kiválóan alkalmas az észteresítés, melyet metanolban, hidrogén-klorid jelenlétében lehet kialakitani. A kapcsolás a két aminosav-származék közötti peptidkötés (savamídkötés) kialakítását jelenti. Az acilező ágens, bázis jelenlétében acilezi a szabad N-terminálissal rendelkező aminosavat és védett dipeptid keletkezik. A védőcsoportok eltávolítása a védett peptid C-terminálisáról, ha azt észteresítéssel védtük, híg lúgos hidrolízissel történik. Az N-terminális és a többi, oldallánc funkciós csoportok védőcsoportjának eltávolítása, az alkalmazott védőcsoportok tulajdonságaitól függően történhet egyszerre, vagy szelektíven, a megfelelő reagensek alkalmazásával. 7

8 3.1. Szilárdfázisú peptidszintézis 3. ábra. A szilárdfázisú peptidszintézis elve A peptidek szilárdfázisú szintézisében lényegében két műveletet ismételünk minden lánchosszabbítási ciklusban. Az egyik a védőcsoport eltávolítása a védett peptid aminocsoportjáról, a másik az N- védett és aktivált aminosav hozzákapcsolása a szabaddá vált aminocsoporthoz. Merrifield 1962-ben olyan módszert dolgozott ki, amely később lehetővé tette a folyamat automatizálását. A Merrifield-féle módszer esetében a hordozóként használt gyanta 98% sztirolból és 2% 1,4-divinil-benzolból készült térhálós kopolimer, amely vízben és szerves oldószerekben oldhatatlan. A mikrométer átmérőjű szemcsékből álló műgyanta klórmetilezés után hozzávetőleg 1-2 mmol klórt (aktív helyet) tartalmaz grammonként. Az első N-védett aminosavat a hordozóhoz kapcsolják a karboxilcsoporton keresztül. Ezután következnek a ciklusok: lehasítják az N-terminálisról a védőcsoportot, majd a felszabaduló aminocsoporthoz újabb N-védett aminosavat kapcsolnak. Ezután szükség szerint újabb aminosavak felkapcsolása következhet. A szintézis végén a peptidről lehasítják a védőcsoportokat illetve maga a peptid is lehasad a gyantáról. Az eljárás előnyei közé tartozik, hogy a szintézis közben a reagensek feleslege a melléktermékekkel együtt egyszerűen lemosható a szilárd hordozóra kapcsolt peptid mellől. 8

9 Stratégiák a szilárdfázisú peptidszintézisben A szilárdfázisú peptidszintézis két stratégia szerint történik. A Boc-technika esetén a szintézishez használt védett aminosav N- terminálisát Boc-csoport védi. Innen származik az eljárás neve. Az aminosav oldalláncainak védésére benzil típusú csoportot használnak. A Boc-csoport eltávolítása 30%-os TFA oldattal történik, míg a peptid védőcsoportjainak, és magának a peptidnek a gyantáról való eltávolításához hidrogén-fluoridot használnak. A Fmoc-technika esetén a szintézishez használt védett aminosav N- terminálisát Fmoc-csoport védi. Innen származik az eljárás neve. Az aminosav oldalláncainak védésére terc-butil típusú csoport használnak. A Fmoc-csoport eltávolítása szekunder bázissal, például 20%-os piperidin oldattal történik, míg a peptid védőcsoportjainak, és magának a peptidnek a gyantáról való eltávolításához 95%-os TFA-t használnak. A két stratégia közül az Fmoc-technikával lehet a kíméletesebben előállítani a peptideket. A Boc-technika viszont jóval olcsóbb eljárás. 4.ábra. Szilárdfázisú peptidszintézishez általam használt eszköz 9

10 3.2. Modellpeptidek szintézise és tisztítása Anyagok és berendezések Szintézishez használt anyagok A Boc-aminosavakat és a szintézishez szükséges analitikai tisztaságú oldószereket, reagenseket a Reanal Finomvegyszergyár Rt.-től szereztük be. A kísérletekben használt szilikagél vékonyréteget (TLC Aluminium Sheets Silica Gel 60 Merck Art ) a Merck től vásároltuk. Analitikai HPLC Az analitikai HPLC-berendezés Knauer modell, oszlop: Phenomenex márkájú, Jupiter tipusú (4µ, C18, 300Å, 250 x 4,6 mm). Félpreparativ HPLC A szemipreparatív HPLC-berendezés Knauer modell, oszlop: Phenomenex márkájú, Jupiter tipusú (10 µ, C18, 300Å, 250 x 10 mm). Tömegspektrométer Bruker Daltonics márkájú Esquire 3000 plus modell Lineáris peptidek szintézise A peptidek előállítását szilárdfázisú peptidszintézissel [12] végeztem BOC stratégiát alkalmazva [13]. A szintéziseknél 1 gramm MBHA (0,7 mmol/g névleses kapacitású) gyantából indultam ki. A kapcsoláshoz a gyanta névleges kapacitásával számolt 3 ekvivalens HOBt és DIC DMF-os oldatából és 3 ekvivalens védett aminosav DCM-os oldatából létrehozott aktív észter oldatot használtam. Az 1 óra kapcsolási idő elteltével a gyantát 5 x DMF-dal majd 3 x DCM-nal mostam. Ninhidrin-teszttel ellenőriztem, hogy teljes mértékben végbement-e a reakció. Ha a tesztoldat bekékül, meg kell ismételni a kapcsolást (pozitív ninhidrin teszt). Viszont, ha az oldat színe citromsárga marad (negatív ninhidrin teszt) eltávolítható a Boc védőcsoport, és felkapcsolható a következő aminosav. A ninhidrin tesztet a következőképpen végeztem: A reakcióedényből kivett 5-10 szem gyantát, krómkénsavazott kémcsőbe tettem, majd sorban hozzácseppentettem a következő reagensek mindegyikéből 1-1 cseppet: g fenol-10 ml absz. etanol, mg KCN 100 ml deszt. víz, g ninhidrin 50 ml absz. etanol A Boc védőcsoport eltávolításához 30% TFA-DCM oldatát használtam 2 perc majd 20 perc reakcióidővel. Ezután 5 x DCM-nal és 3 x DMF-dal való mosás következett. A közömbösítést 5% TEA-DMF oldattal végeztem 3 x 1.5 percig. Újabb mosás következett, 5 x DMF-dal, majd kezdődhetett az újabb aminosav felkapcsolása. A szintézis végeztével a végső hasítást 0 o C-on cseppfolyós HF-dal végeztem 2 órán keresztül gyökfogó elegy jelenlétében (HF:anizol:DMS: p-tiokrezol=10:1:1:0.2 ). Ennek során a peptidről lehasadtak a védőcsoportok illetve maga a peptid is lehasadt a gyantáról. Hasítás után a HF-ot vákuumban ledesztilláltam, majd a visszamaradt anyagot üvegszűrőre öntve éterrel eldörzsöltem. Mostam újabb adag éterrel. Ezután a peptidet 10%-os ecetsavval mostam le a szűrőről. Az így nyert ecetsavas peptid oldatot liofilizáltam. A termelés átlagosan 80-90% volt, a nyerstermékre vonatkoztatva. 10

11 5.ábra. H-Arg-His-NH 2 és Ac- Arg-His-NH 2 szintézise 11

12 6. ábra. Ac-Cys-Ser-Ala-His-Leu-Cys-NH 2 szintézise 12

13 7. ábra. Ac-Cys-Ser-Arg-His-Leu-Cys-NH 2 szintézise 13

14 Ciklopeptidek szintézise A peptidek ciklizálására, ami jelen esetben a diszulfidkötés kialakítását jelenti, az irodalomban több lehetőséget találtam [14]. Ezt áttanulmányozva a levegőn való oxidálás mellett döntöttem. Részben azért, mert ebben az esetben csak a puffert kell eltávolítani a ciklopeptid mellől, részben pedig azért mert viszonylag kis mennyiségű peptid esetében ez a módszer is megfelelő hatékonyságú. A peptidek oxidálását ammónium-acetát pufferben, ph=7,92-en 48 órán át levegőn való kevertetéssel végeztem. A reakcióelegy koncentrációja 1mg peptid /cm 3. A ciklizálás előrehaladását analitikai HPLC-vel követtem. A termelés általában 90-95% volt a nyerstermékre vonatkoztatva. 8. ábra. A diszulfidhíd kialakítása oxidálással Peptidek tisztítása A peptidek tisztítását fordított fázisú szemipreparatív HPLC oszlopon, gradiens elúciós programmal végeztem. Gradiens: a B eluens aránya 1% -ról 40%-ra lineárisan növekedett 30 perc alatt. A eluens 0,1% TFA vizes oldat, B eluens acetonitril:víz = 80:20 elegye, amely 0,1%TFA-t tartalmazott. Az így nyert, tisztított peptidek tisztaságát analitikai HPLC-n, azonosítását tömegspektrum alapján végeztem. Az analitikai méréseket is gradiens elúciós programmal végeztem. Gradiens: a B eluens aránya 1% -ról 40%-ra lineárisan növekedett 30 perc alatt. A eluens 0,1% TFA vizes oldat, B eluens acetonitril:víz = 80:20 elegye amely 0,1%TFA-t tartalmazott. A tisztított peptid általában 70-80%-a volt a nyersterméknek Peptidek azonosítása A szemipreparatív HPLC oszlopról begyűjtött, tisztitott peptidet tartalmazó frakciót liofilizáltam, tömegspektroszkópiával mért tömeg alapján azonosítottam a molekulát (1. táblázat), majd a tisztaságát analitikai HPLC-n ellenőriztem (ld ábra A-val jelzett kromatogammjai). 1. táblázat. A peptidek azonosítása tömegspektrum alapján. PEPTID ÖSSZEGKÉPLET SZÁMOLT MÉRT M [M+H] + H-Arg-His-NH 2 C 12 H 22 N 8 O 2 310,0 311,2 Ac-Arg-His-NH 2 C 14 H 25 N 8 O 3 352,0 353,2 C 26 H 41 N 8 O 8 S 2 673,3 674,0 C 29 H 48 N 11 O 8 S 2 757,3 758,0 14

15 4. ELŐZETES BOMLÁSVIZSGÁLATOK A megszintetizált, HPLC-n megtisztított peptidekkel próba kísérleteket végeztem. Az eredeti megfigyelés szerint a peptid ciklizálásakor (lúgos ph) és kromatográfiás körülmények között (savas ph) is bomlik. Ezért mindkét ph tartományban meg terveztem vizsgálni, reprodukáljáke az említett bomlás jelenséget, az általam készített modellpeptidek. A savas ph tartományban reakcióközegnek a kromatográfiás tisztításban használt A eluenst használtam (továbbiakban savas oldat), amely trifluorecetsav 0,1%-os vizes oldata (ph~ 2). A lúgos ph tartományban reakcióközegnek a ciklizáláshoz használt ammónium-acetát puffert (továbbiakban lúgos oldat) használtam. (ph=7,92). A vizsgált peptidekből 1-1 mg-ot oldottam fel 1 cm 3, savas illetve lúgos reakcióközegben. Ezután 5 ekvivalens Hg(II) acetátot adtam az oldatokhoz. A reakcióelegyeket 20 órát állni hagytam. Az oldatokból általában a reakció folyamán fehér csapadék vált ki. A reakcióidő elteltével a reakcióelegyeket lecentrifugáltam, majd a felülúszóból mintát vettem és analitikai HPLC-n megnéztem, történt-e változás a peptidekkel. A H-Arg-His-NH 2 és az Ac-Arg-His-NH 2 esetében a HPLC helyett szilikagél vékonyrétegen követtem a reakciót, mert az ilyen kisméretű peptidek az általam alkalmazott HPLC eluensben az oldószer fronttól megegyező retenciós idővel bírnak. A bomlásvizsgálatokhoz kontrollként a peptidek savas és lúgos oldatát használtam Hg(II) acetát hozzáadása nélkül 20 óra reakció idő eltelte után. Az oldatok esetleges betöményedése, illetve a ph változás elkerülése érdekében, kupakkal zárható üvegedényeket használtam A dipeptidek bomlásvizsgálata VRK-val: A dipeptidek előzetes bomlásvizsgálatának eredménye a 9. ábrán látható. 9. ábra H-Arg-His-NH 2 és Ac- Arg-His-NH 2 bomlásvizsgálata VRK-val. 15

16 4.2. Lineáris és gyűrűs oligopeptidek bomlásának vizsgálata analítikai HPLC-vel 10. ábra. H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid, C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (a, kiindulási anyag, b, higany komplex), D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 eki. Hg(II) ion jelenlétében (a, kiindulási anyag, b, higany komplex ) Megfigyelések: savas közegben: elfogyott a kiindulási anyag, nem történt bomlás, viszont keletkezett Hg tartalmú komplex. lúgos közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nem történt bomlás, viszont itt is keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 16

17 11. ábra HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (nem értékelhető a kromatogramm) D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (b, kiindulási anyag, d, higany tartalmú komplex, a,c, azonosításra váró bomlástermékek) Megfigyelések: savas közegben: nem értékelhető a HPLC kromatogramm. lúgos közegben: elfogyott a kiindulási anyag, megfigyelhető bomlás, keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 17

18 12. ábra HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid, C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (c, kiindulási anyag, b, higany tartalmú komplex, a,d, azonosításra váró bomlástermékek) D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (c, kiindulási anyag, b, higany tartalmú komplex, a,d azonosításra váró bomlástermékek) Megfigyelések: savas közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett egy kevés Hg tartalmú komplex. lúgos közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 18

19 13. ábra HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (c- kiindulási anyag, a,b,d, azonosításra váró bomlástermékek) D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (a, higany komplex, c, kiindulási anyag, b,d azonosításra váró bomlástermékek) Megfigyelések: savas közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett Hg tartalmú komplex. lúgos közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 19

20 EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA A Hg(II) ionok által katalizált peptidbomlás vizsgálatára szilárd fázisú peptidszintézissal, Bocstratégia alkalmazásával lineáris, majd esetenként diszulfidhíd kialakításával ciklusos modellpeptideket állítottam elő. A megszintetizált peptidek tisztítását szemipreparatív HPLCvel, fordítot fázisú oszlopon, gradiens programmal végeztem. Az így nyert peptidek azonosítása tömegspektrométeriával történt, tisztaságukat analitikai HPLC-vel ellenőriztem. A peptidek bomlásvizsgálatára két ph-n, savas illetve lúgos reakciókörülmények között 5 ekvivalens Hg(II) ionok jelenlétében előkísérleteket végeztem. A reakcióelegy felülúszójából 20 óra eltelte után vettem mintát. A bomlást H-Arg-His-NH 2 és Ac-Arg-His- NH 2 esetében vékonyrétegen, a többi peptidnél analitikai HPLC-vel követtem. Az analitikai HPLC diagramon megjelenő csúcsokat szemipreparatív HPLC-vel elválasztottam. Az így elkülönített frakciók egy részét liofilizálás után tömegspektrometriás vizsgálatoknak vetettem alá. Az előzetes bomlásvizsgálat eredményeit a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat. A peptidek 5ekv Hg(II) jelenlétében végzett előzetes bomlásvizsgálatának eredményei. Peptidek ph Maradt-e Csapadék Komplex Bomlás kiind.anyag képződés képződés H-Arg-His-NH 2 ~ , Ac-Arg-His-NH 2 ~ , H-Phe-Glu-Ser-Arg-His-OH ~ , ~ , ~ , ~ , Az előállított peptidek közül: a. komplexet képezett a Hg(II) ionokkal, de nem bomlott: H-Arg-His-NH 2, Ac-Arg-His-NH 2 és H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH b. komplexet képezett a Hg(II) ionokkal és bomlást is mutatott: és c. bizonyos mértékű higany komplexképződés mellett bomlás is megfigyelhető volt. 20

21 Az fenti bomlásvizsgálatok eredményei alapján a következő következtetéseket vontam le: 1. A hisztidin aminosavat tartalmazó peptidek komplexet képeznek a higany ionokkal, mint ahogy arra már korábbi irodalomban is rámutattak [8]. 2. Az Arg-His szekvenciától függetlenül, csak a diszulfidhidat tartalmazó peptidek esetében volt bomlás megfigyelhető. Az előzetes bomlásvizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy az általunk tervezett modellpeptidek alkalmasak a peptidek Hg(II) ion által katalizált bomlás további részletes tanulmányozásához. 21

22 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Süliné Dr. Vargha Helga tanárnőnek a témavezetésért Továbbá: Dr. Schlosser Gittának a tömegspektrumok felvételéért Dr. Mező Gábornak, Bai Katalinnak, Szabó Ildikónak és Gali Irénnek a HPLC készüléken végzett munkában nyújtott segítségért 22

23 HIVATKOZÁSOK [1] Bódi J, Mihala N, Hajnal A, Medzihradszky KF, Süli-Vargha H : Synthesis of the C- terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), J. Pep. Sci. 9 (7): JUL 2003 [2] Garzotti M, Rovatti L, Hamdan M : Investigation of bombolitin complexes with mercury by liquid chromatography tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectr. 12 (2): [3] Gourinath S, Degenhardt M, Eschenburg S, Moore K, Delucas LJ, Betzel C, Singh TP:Mercury induced modifications in the stereochemistry of the active site through Cys-73 in a serine protease - Crystal structure of the complex of a partially modified proteinase K with mercury at 1.8 angstrom resolution Indian J. Biochemistry & Biophysics 38 (5): OCT 2001 [4] Worth RG, Esper RM, Warra NS, Kindzelskii AL, Rosenspire AJ, Todd RF, Petty HR: Mercury inhibition of neutrophil activity: Evidence of aberrant cellular signalling and incoherent cellular metabolism Scandinavian J. Immunology 53 (1): JAN 2001 [5] Olivieri G, Brack C, Muller-Spahn F, Stahelin HB, Herrmann M, Renard P, Brockhaus M, Hock C: Mercury induces cell cytotoxicity and oxidative stress and increases beta-amyloid secretion and tau phosphorylation in SHSY5Y neuroblastoma cells Journal of Neurochemistry 74 (1): JAN 2000 [6] Yamamura T, Watanabe T, Kikuchi A, Yamane T, Ushiyama M, Hirota H : Conformation control of peptides by metal ions. Coordination conformation correlation observed in a model for Cys-X-Y-Cys/M2+ in proteins Inorg. Chem. 36 (21): OCT [7] Matzapetakis M, Farrer BT, Weng TC, Hemmingsen L, Penner-Hahn JE, Pecoraro VL: Comparison of the binding of cadmium(ii), mercury(ii), and arsenic(iii) to the de novo designed peptides TRI L12C and TRI L16C, J. Am. Chem. Soc. 124 (27): JUL [8] Vassiliki Magafa, George Stavropoulos, Panayiotis Tsiveriotis, Nick Hadjiliaddis : Interaction of Hg (II) with tetrapeptides containing cysteinyl and histidinyl residues, Inorg. Chem. Acta 272. ( 1998 ) 7-17 [9] Yamamura T, Watanabe T, Kkikuchi A, Ushiyama M, Koba yashi T, Hiroto H : Confirmation control of model peptides by metal-ions.1. CYS-X-Y-CYS and linear coordination, J. Phys. Chem. 99 (15): APR 13, 1995 [10] Medzihradszky Kálmán: A természetes peptidek szintézise (A kémia újabb eredményei 3. kötet), Akadémia Kiadó, Budapest, 1970 [11] Bajusz Sándor: Peptidszintézis (A kémia újabb eredményei 47. kötet), Akadémia Kiadó, Budapest, 1980 [12] J.M. Stewart, J.D. Young: Solid phase peptide synthesis (Freeman and Co.San Francisco, 1969), (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984) [13] E. Atherton, R.C. Sheppard: Solid phase peptide synthesis: practical approach (IRL Press, Oxford, England, 1989) [14] David Andreu, Fernando Albericio, Núria A. Solé, Mark C. Munson, Marc Ferrer, and George Barany: Formacion of Disulfide Bonds in Synthetic Peptides and Proteins (Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Synthesis Protocols, Edited by: M.W. Pennington and B.M. Dunn Copyright 1994 Humana Press Inc., Tolova NY 23