Hormon-meghatározások: preanalitikai körülményekből adódó diagnosztikus tévedések Ph.D.értekezés. rövid értekezés + közlemények forma

Átírás

1 Hormon-meghatározások: preanalitikai körülményekből adódó diagnosztikus tévedések Ph.D.értekezés rövid értekezés + közlemények forma A Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Klinikai endokrinológia és kísérletes vonatkozásai c. akkreditált programja keretében Írta: Dr Salamonné Dr Toldy Erzsébet Mint képzés nélküli fokozatszerző a Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola doktorjelöltje Témavezető Prof. Dr. Kovács L. Gábor Egyetemi tanár, az MTA l. tagja Programvezető: Prof. Dr. de Chatel Rudolf Egyetemi tanár, az MTA doktora Prof. Dr. Szilágyi Géza Egyetemi tanár, az MTA doktora Vas megye és Szombathely MJV Markusovszky Kórháza, Egyetemi Oktató Kórház, Központi Laboratórium Szombathely, 2004.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 2 2. CÉLKITŰZÉSEK PAJZSMIRIGY PARAMÉTEREK ELEMZÉSE TERÜLETÉN A TSH mérési módszereken alapuló algoritmus: hormonmérések a rutin beteganyagban Hormonmérések klinikai validitása a szokásostól eltérő fehérje-tartalmú szérumkörnyezetben HYPERPROLACTINAEMIÁS BETEGSZÉRUMOK ELEMZÉSE ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK, ELVÉGZETT VIZSGÁLATOK A PAJZSMIRIGY PARAMÉTEREKKEL KAPCSOLATOS VIZSGÁLATOK Hormonmérések önállóan és együtt a rutin beteganyagban P.m. hormonszintek vizsgálata az átlagostól eltérő fehérje szintű szérumban Magas TBG szintek esetén Csökkent albumin szint -in vivo Csökkent albumin és/vagy alacsony IgG szint- in vitro Laboratóriumi módszerek Egyéb módszerek, illetve fogalmak definiálása PROLACTIN SZINTEK VIZSGÁLATA Betegek Alkalmazott módszerek PEG-precipitáció A PEG precipitációs módszer analitikai validitásának vizsgálata A PEG precipitációs módszer klinikai validításának vizsgálata STATISZTIKAI MÓDSZEREK EREDMÉNYEK PAJZSMIRIGY PARAMÉTEREK ELEMZÉSE Pajzsmirigy diszfunkció szűrésére érkező rutin beteganyagban Hormonmérések együtt vagy külön (algoritmus) Indirekt és direkt szabad hormon meghatározások Szükséges-e a szabad T3 meghatározása? TSH-ra alapozott algoritmus: 2. vagy 3. generációs assay? Pajzsmirigy paraméterek elemzése szokásostól eltérő fehérjeszintek esetében Emelkedett TBG szintek mellett P.m. hormonértékek alacsony albumin és eltérő TBG szintek esetén Pajzsmirigy hormonszintek alacsony albumin és/vagy alacsony IgG szintek esetén A PRL SZINTEK VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI Homogenitási vizsgálat A PEG precipitációs módszer analitikai validitása A hígítás hatása a PEG precipitációs módszerre A nem specifikus precipitáció (NSP) mértéke A macroprolactinaemia gyakorisága, életkor függése A makroprolactinaemia és a hyperprolactinaemia együttes előfordulása A PRL szintek klinikai validitásának vizsgálata MRI leletek összevetése a laboratóriumi leletekkel A hyperprolactinaemia vezető tüneteinek vizsgálata MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK A PAJZSMIRIGY PARAMÉTEREK ELEMZÉSE KAPCSÁN LEVONHATÓ KÖVETKEZTETÉSEK PROLACTIN SZINTEK ELEMZÉSE KAPCSÁN MEGÁLLAPÍTHATÓ TOLDY ERZSÉBET KÖZLEMÉNYEI: AZ ÉRTEKEZÉSSEL KAPCSOLATOS IN EXTENSO KÖZLEMÉNYEK KÖNYVFEJEZETEK, MELYEK A DISSZERTÁCIÓ TÉMÁJÁVAL KAPCSOLATOSAK AZ ÉRTEKEZÉSSEL KAPCSOLATOS NYOMTATÁSBAN MEGJELENT ELŐADÁS-KIVONATOK EGYÉB PUBLIKÁCIÓK, MELYEK NEM ÁLLNAK KAPCSOLATBAN A DISSZERTÁCIÓVAL A DISSZERTÁCIÓVAL KAPCSOLATBAN NEM ÁLLÓ IDÉZHETŐ ELŐADÁSKIVONATOK IDÉZETT IRODALMI HIVATKOZÁSOK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.58 1

3 1. Bevezetés A hormonleletek klinikai értékét sokkal több preanalitikai és analitikai körülmény határozza meg mint a hagyományos laboratóriumi paraméterekét. Ez egyrészt a biomolekulák fiziológiai és patofiziológiai valamint a kémiai sajátosságaiból, másrészt az alkalmazott mikroanalitikai módszer jellegzetes különbözőségeiből adódik. Ezért az eredmények helyes interpretációja feltételezi a preanalitikai tényezők szigorúbb figyelembevételét (53, 59, 112, 7, 14, 15, 29). Tekintettel az alacsony fiziológiás koncentráció-viszonyokra, ma a rutin klinikai laboratóriumokban az endokrin paraméterek meghatározása főként immuno-assay módszerrel történik. Ennek a mérési eljárásnak a jellegzetességei - antitest keresztreakciók, specificitás, méréstechnikával összefüggő szenzitivitási értékek, matrix effektus - miatt a leleten közölt számadat néha téves következtetést engedhet meg. Mindezek eredőjeként, a laboratórium által kibocsátott eredmény több esetben nem csak a meghatározni kívánt analit koncentrációjáról vall, hanem arról a szérumkörnyezetről is, amelyből megmérjük azt. A minta sajátosságaiból adodó preanalitikai eltérések miatt, a plauzibilitási kontroll rendkívül fontos a hormonleletek értékelésekor (58, 59, 65, 84, 7, 29). A disszertáció célja, hogy megvizsgálja az immunanalitikai módszerrel mért két leggyakoribb endokrin betegségcsoport esetében (pajzsmirigy diszfunkciók, hyperprolactinaemia) releváns hormonparamétereket abból a szempontból, hogy mennyire megbízhatóak a diagnózis korrekt felállításához, illetve a terápia nyomonkövetéséhez. Az es években használatba kerültek Magyarországon is a 2. generációs (szuperszenzitív) thyreotrop stimuláló hormon (TSH) mérési módszerek (43, 44, 63, 102). Erre az időszakra esik a szabad triiod-thyronin (ft3) és szabad thyroxin (ft4) hormonokat mérő módszerek bevezetése a rutin klinikai kémiai gyakorlatban (1). A 2. generációs TSH módszert gyorsan követték a vegyszerpiacon a még érzékenyebb 3. és 4. generációs kitek. Ez a forradalmi változás az in vitro pajzsmirigy (p.m.) diagnosztikában szemléletváltozást követelt meg. Ugyanis, ezek az újabb módszerek már több nagyságrenddel alacsonyabb tartományban mérnek, mint a korábbiak, így nemcsak az analitika, hanem a diagnosztika irányába is nagyobb kihívásuk (45, 49, 98, 99, 2, 24). 2

4 A prolactin (PRL) meghatározás területén az elmúlt 10 évben három szempontból történt változás. A molekulára nézve egyre specifikusabb, egyre szélesebb méréstartományú, alternatív (nem radioaktív) anyaggal jelölt teljesen automatizált módszer került forgalomba. Mindezek a változások korszerűsítették az analitikát, de nem oldották meg a PRL szint mérésének azt a preanalitikai adottságból adódó hibáját, mely a molekula immunreaktivitása és biológiai aktivítása közötti eltérésből adódik (50, 51, 16). Ezért a módszerek zöme többé-kevésbé méri a biológiailag inaktív makroprolactin (MPRL) molekulát is. Ez a preanalitikai körülmény klinikai szempontból elengedhetetlenné teszi a szérumban jelenlévő különféle PRL molekulák szelektív analitikáját (65, 92, 93, 96). 2. Célkitűzések 2.1. Pajzsmirigy paraméterek elemzése területén A TSH mérési módszereken alapuló kivizsgálási stratégia: hormonmérések együtt, vagy külön a rutin beteganyagban? Ebben a témakörben a következőkre kerestem választ: milyen volt megyénkben a pajzsmirigy paraméterek vizsgálati kérésének gyakorlata, az érzékenyebb TSH módszerre alapozott, in vitro kivizsgálási stratégia bevezetése előtt és után? a p.m. hormonmérési módszerek közül, melyik szolgáltatja a megbízhatóbb eredményt: az indirekt származtatott (szabad hormon index) értékek vagy a közvetlenül mért szabad hormonszintek (direkt szabad hormon assay)? milyen gyakran észlelhetünk betegeinknél T3 toxikózist a különböző módszerekkel; szükséges-e az ft3 meghatározása? több klinikai információt nyújtanak-e a 3. generációs TSH módszerek a 2. generációs módszerekhez képest, illetve megváltoztatják-e a korábban alkalmazott szűrési stratégiát? A fenti válaszok ismeretében kialakítani a gyakorlat számára a legmegfelelőbb in vitro algoritmust. 3

5 Az eltérő módszerekkel mért p.m. hormonfrakciók klinikai validitásának vizsgálata a szokásostól eltérő fehérje-tartalmú szérumkörnyezetben. Azokat a gyakrabban előforduló klinikai szituációkat elemeztem, amelyek a két releváns transzportprotein [thyroxin binding globulin (TBG), albumin] szérumszintjében okoznak változást. A következő kérdéseket tettem fel: a normálistól eltérő TBG szint befolyásolja-e a különböző elven működő, szabad pajzsmirigy hormont mérő módszerekkel kapott eredményt? befolyásolja-e a szérum albumin, illetve IgG szintje a mért szabad hormonértékeket? 2.2. Hyperprolactinaemiás betegszérumok elemzése Célom volt, hogy a rutinban alkalmazott immuno-assay módszerrel nyert PRL szérumszinteket tovább vizsgáljam abból a célból, hogy a molekula immunreaktivitása és a biológiai aktivitása közötti különbségre fény derüljön. Ezért a következőket elemeztem: a hyperprolactinaemiás szérumok PRL szintjeit a nagy molekulatömegű MPRL eliminációja előtt és után. az alkalmazott precipitációs módszer analitikai validitását ellenőriztem, a hígítás és a nem specifikus precipitáció szempontjából. a szabad PRL mérési eljárás klinikai validitását vizsgáltam a rutin klinikai gyakorlatban előforduló betegekben. 3. Anyagok és módszerek, elvégzett vizsgálatok 3.1. A pajzsmirigy paraméterekkel kapcsolatos vizsgálatok Hormonmérések önállóan és együtt a rutin beteganyagban Vizsgálatok összesen (2 293 nő, 344 férfi) beteg esetében történtek. Pajzsmirigyre ható gyógyszeres kezelés alatt (methimazol, L-thyroxin) állt összesen 648 beteg (1-4) ben négy hónapon át p.m. vizsgálat céljából a laboratóriumunkba érkező mintákat (1482 nő és 238 férfi) elemezve felmértem megyénkben a p.m. paraméterek vizsgálatkérési gyakorlatát. A vizsgálatokhoz 150 euthyreoid véradó szolgáltatta a kontroll csoportot. Elemeztem az egyes p.m. diszfunkciók előfordulási 4

6 gyakoriságát, valamint a betegek hormonszintjeit a methimazollal, illetve L- thyroxinnal kezelt és a nem kezelt betegcsoportban (1). 150 esetben összevetettem az indirekt és a direkt úton meghatározott szabad p.m. hormoneredményeket. A vizsgálatot olyan betegekben végeztem, akiknek a TSH szintje szubnormális (<0,3 mu/l), illetve a referencia tartomány alsó határánál (0,3-0,6 mu/l) volt (1). Elemeztem 171 alacsony TSH szintű (<0,42 mu/l) és emellett a referencia tartományba eső ft4 szintű beteg szérumát azzal a céllal, hogy megvizsgáljam mennyire segítik a T3 hyperthyreosis felismerését a direkt (ft3) és az indirekt (ft3i) úton mért ft3 meghatározások (6). Megvizsgáltam az érzékenyebb 3. generációs TSH teszttel is 446 szérumot, melyekben a 2. generációs módszerrel nem detektálható (<0,06 mu/l), illetve szubnormális (<0,42 mu/l) TSH szinteket mértem. Elemeztem a két módszer szezitivitását, specificitását. Vizsgáltam a nagyon alacsony TSH értékek klinikai tartalmát. Arra a kérdésre kívántam választ kapni, hogy érdemes-e algoritmusunkat 2. generációs módszer helyett az érzékenyebb, de drágább 3. generációs TSH módszerre alapozni (26, 28)? P.m. hormonszintek vizsgálata az átlagostól eltérő fehérje szintű szérumban Ebben a témakörben összesen 344 szérumot vizsgáltam meg Magas TBG szintek esetén Elemeztem 234 euthyreoid nő szérumát. Magas TBG szintje (> 325 nmol/l) volt 155 gravidának (gestaciós hét: 16. és 32.) valamint 44 antikoncepienst szedő nőnek. A normális TBG szintű ( nmol/l) kontrollt 35 egészséges fiatal véradó szolgáltatta (6, 12) Csökkent albumin szint -in vivo A csökkent albumin szintű (<34 g/l) szérumkörnyezetet 44 alkoholos cirrhosisban szenvedő beteg szolgáltatta. Klinikai stádiumuk alapján Child szerinti A-C kategóriába tartoztak (80). A kontroll csoportként 33 egészséges egyén széruma szolgált (5, 18). 5

7 Csökkent albumin és/vagy alacsony IgG szint- in vitro Kísérletet végeztem 33 olyan beteg szérumával, akik súlyos betegségben - cirrhosis, nephrosis, humorális immundefficiencia szenvedtek. A 13 nephrosis szindrómában megbetegedettnek alacsony albumin (<34 g/l), illetve csökkent IgG szintjük (<10 g/l) volt. A 12 cirrhosisban szenvedő beteg alacsony albumin és normál IgG szinttel rendelkezett. A humorális immundeficienciában szenvedő esetek széruma alacsony IgG szint melletti normál albuminszinttel volt jellemezhető. Az alacsony IgG tartalmú szérumokhoz négy lépésben (3,5-17,8 g/l) adtam exogén IgG-t (Humaglobin 5%, HUMAN) mialatt a szérumok albumin szintje közel állandó maradt (42,8 ±3,8 g/l). Az alacsony albumin szintű csoportba tartozó egyedi szérumokhoz négy lépcsőben, (24,6-50,8 g/l) adtam 25%-os humán albumin oldatot (Albumin, HUMAN), mialatt az IgG koncentráció állandó maradt (14.6 ±2.5 g/l). Így összesen 162 eltérő albumin, illetve IgG szintű szérum mintát nyertem. A manipulált szérumokból vortexelés és inkubálás (30 perc, szobahőmérsékleten) után egy mérési sorozaton belül (intra-assay) mértem a p.m. hormonokat. Két különböző immunkémiai elven működő módszert alkalmaztam az ft4, ft3, TSH hormonok meghatározásához. Emellett meghatároztam minden mintából az albumin és IgG szinteket (13, 33, 34) Laboratóriumi módszerek Valamennyi vizsgált paramétert a rutinban alkalmazott módszerrel analizáltam, az alábbi eljárások szerint: Az albumin szintek mérése kolorimetriás végpontos (Hitachi 917, Roche), az IgG meghatározás lézer detektálású nefelometriás automatizált módszerrel (Nephelometer Analyzer II. DADE Behring) történt. A TSH meghatározásokat az alábbi módszerekkel végeztem el: - IFMA (immunofluorometrikus assay, DELFIA, Pharmacia) 2. és 3. generációs assay, - ELISA (enzim linked immuno-sorbent assay, ES 300-as automata, Roche) 2. generációs assay, - MEIA (mikropartikuláris enzim immuno-assay, AxSYM automata, Abbott) 2. generációs assay, 6

8 - ECLMA (elektro-kemiluminometrikus immuno assay Elecsys 2010 automata, Roche) 3. generációs assay. A totál thyroxin (TT4) és a totál trijódthyronin (TT3) mérését FIA (fluoroimmunoassay, DELFIA, Pharmacia) módszerrel végeztem. T3 Uptake (T3U) meghatározásához talcum absorpciós, házikészítésű kötőfehérjereceptor módszert (RA) - I 125 -izotóppal jelölt T3-at (Izotópkutató KFT, Budapest) használva a kötőhelyek telítéséhez - alkalmaztam. A TBG és a thyroxin kötő kapacitás (TBK) meghatározásokhoz ELISA-módszert (ES 300 automata, Roche) használtam. Az ft4 és az ft3 meghatározásokat többféle módszerrel is elvégeztem. Immunkémiai elveik szerint csoportosítva a következő direkt szabad hormon meghatározási módszereket alkalmaztam: - egylépéses tracer analóg módszer (ELISA, ES-300, Roche); - kétlépéses visszatitrálásos félautomata (FIA, DELFIA, Pharmacia) és teljesen automatizált (MEIA, AxSYM, Abbott) módszerek; - egylépéses antitest jelölésű manuális módszer radio-immuno-assay (RIA, Izotóp Intézet KFT, Budapest); - egylépéses antitestjelölésű kompetitiv, szekvenciális telítési analízis, sztreptavidin-biotin elválasztású elektro-kemilumineszcens assay (ECLIA), automatizált módszer (Elecsys 2010, Roche). Az indirekt mért szabad hormonszinteket (szabad hormon-indexek) a totál hormonszintekből és valamelyik kötőkapacitásra utaló paraméterből (TBG, T3U, TBK) az alábbi matematikai egyenlet szerint származtattam: - szabad T4 index (ft4i = TT4xT3U, vagy TT4/TBG, vagy TT4/TBK); - szabad T3 index (ft3i = TT3xT3U). A konverzió (T4-T3 átalakulás) változások jellemzésére a ft4/ft3, illetve ft3/ft4 és a TT3/TT4 hányadost képeztem. A TPO-Ab (thyreoidea peroxidase antitest), illetve a Tg-Ab (thyreoglobulin antitest) mérése ECLIA (Elecsys 2010, Roche) módszerrel történt Egyéb módszerek, illetve fogalmak definiálása In vitro algoritmus: 7

9 A szenzitív TSH mérési módszerre alapozott algoritmust az 1. ábra szemlélteti. Biokémiai alapja az ép hypothalamo-hypophyseális rendszer és a pajzsmirigy működése közötti feed-back mechanizmus (63, 64, 66, 98, 100, 109, 102, 99). Vizsgálataim során ezt az algoritmust az alkalmazott módszerek tekintetében korszerüsítettük a kedvező tapasztalataink alapján (1-4). Ábramagyarázat: normális: mért érték a referencia tartományon belül; magas: referencia tartomány felső határa ± analitikai bizonytalanság (%), alacsony: a referencia tartomány alsó határa ± analitikai bizonytalanság (%). 1. ábra Pajzsmirigy in vitro kivizsgálási algoritmus Analitikai bizonytalanság: magában foglalja a módszer szisztémás hibáját (intra-assay mért torzítási adatokat), valamint a különböző napokon mért véletlen (inter assay) hibából adodó eltérést, s mindezt %-ban fejezi ki. A pajzsmirigy megbetegedések diagnózisához, az anamnézist és fizikális vizsgálati leletet, képalkotó eljárásokat, (ultrahang, scintigrafia) aspirációs cytológiai leletet, esetenként antitest vizsgálati eredményt használtam fel. 8

10 Euthyreosisosnak minősült minden olyan eset, akinél a p.m. diszfunkcióra utaló klinikai jel nem állt fenn, valamint anamnézis és fizikális vizsgálat valamint, a referencia tartományban lévő TSH szint is a normális funkciót igazolta. Szubklinikus hyperthyreosisosnak ítéltünk minden olyan esetet, akinek a TSH szintje szubnormális vagy szupprimált volt, de a ft4, ft3 szintjei a referencia tartományon belül voltak, s e mellett a klinikai tünetei sem jelezték egyértelműen a hyperthyreosist. Manifeszt hyperthyreosisos csoportba soroltunk minden olyan beteget, akinek a klasszikus p.m. hyperfunkcióra utaló tünetei jelentkeztek, valamint ezt a biokémiai markerekkel (TSH alacsony és ft4, illetve ft3 emelkedett) is alá tudtunk támasztani. A T3 hyperthyreosis (T3 toxikózisos) a manifeszt hyperthyreosisnak az a fajtája, amikor szubnormális, vagy szupprimált TSH mellett a beteg ft4 szintje normális, míg a ft3 szintje magas. Szubnormális hormonszint: ha a mért érték a referencia tartomány alá esik. Szupprimált hormonszint: ha a hormonszint a funkcionális szenzitivitás alatt van (24). Diszkordáns lelet: ugyanazon hormonfrakcióra utaló paraméterek nem egybehangzó értéke (pl. egyik a referencia tartomány felett, másik a referencia tartományban). Feed-back mechanizmusba nem illő lelet: a centrális és perifériás hormonértékek egymáshoz viszonyított változása nem magyarázható a jól ismert negatív visszacsatolással PRL szintek vizsgálata Betegek A laboratóriumba PRL vizsgálati kéréssel érkező 5561 szérumból összesen 1015 esetben (18%) volt a PRL szint >700 mu/l. Ezekben a hyperprolactinaemiás szérumokban (980 nő, 35 férfi) határoztam meg a polyetilen-glycolos (PEG) precipitációt követően, a keringő összes biológiailag aktív PRL monomer frakcióját. Kezdetben elemeztem az enyhén emelkedett ( mu/l) PRL szintű szérumokat is (n=36). Mivel ezek között egy esetben sem volt MPRL jelentős mennyiségben kimutatható, ezért csak a >700 mu/l PRL szintű szérumokat tanulmányoztam tovább. A minták nagyobb része az alapellátásból, járóbeteg szakellátásokból, kisebb hányada pedig a kórházak fekvőbeteg osztályairól érkezett. Vizsgáltam a macroprolactinaemia gyakoriságát és a méréséhez alkalmazott precipitációs módszer analitikai és klinikai 9

11 validitását. Elemeztem az eredményeket a nem specifikus precipitációval történő korrekció előtt és után. (10, 11) Alkalmazott módszerek PEG-precipitáció Az MPRL eliminációját PEG precipitációs módszerrel végeztem Smith és Leslie szerint (79, 95, 10, 11). Minden szérumhoz azonos volumenű, 25%-os PEG oldatot adtam (PEG 6000 kda, FLUKA AG, Svájc). Keverést követően a csöveket fél óráig inkubáltam szobahőmérsékleten. A centrifugálást (4 0 C-on, 30 percig, 4000 rpm fordulatnál) követően a felülúszóban mértem a PRL-t ECLIA módszerrel (Elecsys 2010, Roche). A referencia tartomány nők esetében: mu/l, férfiak esetében: mu/l (miu/l=21,2 x ng/ml). A két PRL értékből visszanyerési %-ot [%= (PRL PEG kezelés után mu/l / PRL PEG kezelés előtt mu/l) x 100] számoltam. Eredmények értékelése: macroprolactinaemiásnak (MPRLs) minősítettem azokat a szérumokat, amelyekben az összes PRL legalább 60%-át a MPRL tette ki és a PEG kezelést követő PRL szint a referencia tartományba került. A tényleges hyperprolactinaemiás (thprl) csoportba azok kerültek, akik a >40%-os visszanyerési értékkel rendelkeztek amellett, hogy monomer PRL szintjük a referencia tartomány fölött maradt. A visszanyerési % határértéket részben a saját betegeink kapcsán nyert tapasztalatra, részben korábbi irodalmi adatokra támaszkodva határoztam meg (79, 92, 95). A MPRLs és thprl együtt fordult elő azokban, akiknek a PRL visszanyerése <40% volt, s emellett a monomer PRL szintjük a referencia tartomány fölött maradt. Ezeket az eseteket a klinikai validitás vizsgálatakor a thprl csoportba soroltam. Normo-szabad prolactinaemiásnak minősült az a beteg, akinek PRL visszanyerése nagyobb volt 60 %-nál, de a monomer PRL szintje a referencia tartományon belül volt A PEG precipitációs módszer analitikai validitásának vizsgálata A hígítás hatását úgy vizsgáltam, hogy összevetettem az assay pufferrel (assay diluent, Roche) higított minták PRL szintjeit a natív szérumból mért PRL koncentrációkkal 245 szérum esetében, ezzel ellenőrizve, hogy a PEG-precipitációs 10

12 módszer kivitelezésekor szükségszerűen kivitelezett hígítás kihat-e a módszer pontosságára. A nem specifikus precipitáció (NSP) ellenőrzése céljából a PEG-es kezelést elvégeztem rekombináns PRL-t tartalmazó (3. IRP WHO referencia standard, Roche) standard mintákon (n=24). Az NSP ismeretében korrigáltam a PEG precipitációt követő mintákban mért monomer PRL szinteket, s ezt a korrigált értéket neveztem el Sapin (91) nyomán szabad PRL -nek (f-prl= PRL monomer mu/l ± NSP) A PEG precipitációs módszer klinikai validításának vizsgálata A klinikai validitás megállapítása céljából elemeztem a MPRLs és a thprl csoportban a képalkotó (sella MRI) leleteket, a hyperprolactinaemia vezető tüneteit (galactorrhoea, infertilitás, amenorrhoea), valamint a hyperprolactinaemiával járó egyéb tüneteket illetve tünetcsoportokat (fejfájás, acne, hirsutismus, alopecia, policystas ovarium syndroma) (10, 11). A hyperprolactinaemia differenciálásához az anamnézis, illetve a gyógyszerszedési szokások ismerete is segítettek. A tanulmány retrospektív jellege miatt a betegek gyógyszerszedési szokásairól csak 209 esetben tudtam megbízható adatokhoz jutni: bromocriptint szedett 55, antikoncipienst, illetve ösztrogén tartalmú készítményt 56, L- thyroxint 4, triciklikus antidepresszánst 5 beteg, 89 beteg semmilyen gyógyszert nem szedett saját bevallása és kezelőorvosa szerint Statisztikai módszerek Eredményeimet 95%-os konfidencia intervallumnál homogenitási vizsgálatot követően variancia és regressziós analízissel és egy, illetve kétmintás t-próbával dolgoztam fel. A non-parametrikus kiértékelésekhez a klasszikus Khi 2 számolást végeztem el. A biometriai számoláshoz Statgraph (USA), illetve az utóbbi 5 év adatainak feldolgozásakor Statistica for Windows (Microsoft) programcsomagot használtam. 11

13 4. Eredmények 4.1. Pajzsmirigy paraméterek elemzése Pajzsmirigy diszfunkció szűrésére érkező rutin beteganyag Hormonmérések együtt vagy külön (algoritmus, rutin beeteganyag) Az 1990-es vizsgálatkérési szokások szerint, beteg szérumából összesen p.m. irányú (TSH: 2 598, TT4:,TT3, T3U mindhárom külön-külön: 4 575) vizsgálatot végzett el a laboratórium. Az érzékeny TSH módszerre alapozott algoritmus bevezetése után 43 %-al csökkent az egy betegre eső in vitro tesztek száma (1). A nem kezelt betegek közül, euthyreosis 76 %-ban, a hyperthyreosis 12 %-ban a hypothyreosis 1,5 %-ban, a szubklinikus hypo ill. hyperthyreoid 4 ill. 6 %-ban fordult elő. Ezekben a betegekben a feed back-be nem illő hormon eredményeket összesen 0,4 %-ban tapasztaltam (1). A thyreostaticumot szedő esetek közül euthyreosisos volt 38 %, hyperthyreosisosnak minősült 23 %, a szubklinikus hyperthyreosis 19 %-ban fordult elő. A methimazollal kezelt betegek 18 %-ban iatrogén hypothyreosisosnak bizonyultak. Ezekben az esetekben a feed back-be nem illő hormon eredmény 2 %-ban fordult elő (1). A thyreostaticummal kezelt betegcsoportban 4-5-ször gyakrabban (p<0,01) tapasztaltam a TSH szint és p.m. hormonszintek alapján, feed-backbe nem illő esetet, mint a nem kezelteknél (1,4) Indirekt és direkt szabad hormon meghatározások A közvetlenül mért szabad hormonszinteket összevetve a totál hormonszintekkel, illetve a szabad hormonindexekkel, összességében ellentmondásos leletet a T4 szintek tekintetében 45 %-ban (ft4 vs. TT4) ill. 30 %-ban (ft4 vs. ft4i) találtam. A methimazollal kezelt betegekben a diszkordáns lelet az ft4-index és az ft4 között gyakrabban (38 %) fordult elő (2. ábra) mint a nem kezelt (21 %) esetekben (1). A hormon indexek és a közvetlenül mért szabad hormonértékek között csak közepes erősségű pozitív (nem kezelt csoportban: r = + 0,8 kezelt betegekben: r= + 0,6), korrelációkat kaptam (p<0,001). A logtsh és az ft4 között szignifikáns (r= - 0,27, p<0,01) negatív korreláció igazolódott, míg a logtsh és az ft4i között ezt az összefüggést nem tudtam igazolni. 12

14 Szükséges-e a szabad T3 meghatározása? Az ft3 és TT3 között gyenge (r= + 0,36; p < 0,001), a szabad T3-index és az ft3 között közepesen erős (r= + 0,58; p < 0,001) korrelációt találtam. A feed back-be nem illő TSH és perifériás hormonértékeket összesen 23 betegben tapasztaltam a 171 esetből. Míg a logtsh-tt3 és a logtsh-ft3i között nem kaptam szignifikáns korrelációt, addig a logtsh és a ft3 értékek között igazolódott a szignifikáns (p<0,01) negatív korreláció (r = - 0,21). Elemeztem a különböző módon mért T3 frakciókat a leletazonosság szempontjából is. Az ft3 és TT3 leletek a kezelt betegekben csak 65 %-ban, a nem kezelt esetekben 71 %-ban szolgáltattak azonos információt (alacsony-alacsony, normális-normális, magasmagas) (1,4). Az ft3i és a közvetlenül mért ft3 közötti leleteltérés a thyreostaticummal kezelt esetekben kétszer gyakrabban (44 %) fordult elő, mint a p.m.-re ható szert nem szedő (19 %) betegekben (2. ábra). nem kezelt n=162 methimazollal kezelt n=88 ft4i-ft4 ft3i-ft eltérő leletek %-os előfordulása 2. ábra Leleteltérések a szabad hormon indexek és szabad hormonszintek között A pajzsmirigy betegek T3-szintjeit a 3. ábra szemlélteti. Szignifikánsan magasabb (p<0,001) T3 értéket a manifeszt hyperthyreosisos betegekben csak a közvetlenül mért szabad hormon szintek esetében tudtam igazolni. Ugyanez a jelenség jellemző a thyreostaticummal kezelt esetekre is (4). Az ft3-értékek a kezeléstől függetlenül szignifikánsan magasabbak a többi csoport értékeihez képest. A manifeszt hyperthyreosisos betegek között a nem kezelteknél 7 (33 %), a thyreostaticummal 13

15 kezelteknél 11 esetben (58 %) állt fenn ft3 hyperthyreosis. A 18 ft3 hyperthyreosisos beteg TSH értéke 15 esetben szupprimált volt. A toxikus adenomában szenvedő betegeink ft3 átlagértéke (8,3 ±0,9 pmol/l) szignifikánsan (p<0,01) magasabb a másik kettő (immunhyperthyreosis, struma nodosa) betegcsoporthoz, illetve a kontroll csoport (6,4 ±0,1 pmol/l) átlagértékeihez képest. Ilyen fokú eltérést a TT3 és az ft3-index esetében nem tudtam igazolni (6). Az ft4/ft3 hányadosról általában leszögezhető, hogy a non selectiv béta blokkolót szedőknél a legmagasabb (3,4 ±1,3) (4). Ezzel szemben a thyreostaticummal kezelt betegekben tendenciózusan alacsonyabb az ft4/ft3 hányados a nem kezelt betegek hányadosához képest. Ezt a jelenséget matematikailag is szignifikánsnak (p<0,01) találtam a methimazollal kezelt (1,9± 0,3) és a nem kezelt (2,7 ±1,8 ) Graves-Basedow kóros betegek között (4). Nem kezelt csoport (n=105) T3i, TT3 nmol/l, ft3 pmol/l Euthyreosis n=31 Szubklinikus hyperthyreosis n=48 Manifeszt hyperthyreosis n=21 N.S N.S. TT3 T3i ft3 p< 0,001 jelmagyarázat: az oszlopok a matematikai átlagértéket, az y-hibasávok a standard hibát jelzik. 3. ábra T3 szintek átlagértékei a három klinikai csoportban. 14

16 nem kezelt n=62 methimazollal kezelt n=42 ft ft3i 3 12 TT % 5% 10% 15% 20% 25% 30% 4. ábra A T3 toxikózos gyakoriságának módszerfüggése. A T3 toxikózis előfordulási gyakoriságában módszerfüggés tapasztalható, s ennek mértéke a kezeléstől is függ (4. ábra). A 316 nem kezelt betegnek szubnormális, illetve szupprimált TSH értéke volt. Közülük az ft4 érték alapján 254 beteg manifeszt hyperthyreosisosnak minősült. A fennmaradó 62 esetből a TT3 ill. ft3i mérések alapján T3 hyperthyreosisa volt 4 illetve 2 betegnek, míg a szabad T3 eredmények értelmében 7 eset bizonyult T3 toxikózisnak (4. ábra). A methimazollal kezelt esetek közül 150 betegnek volt normál érték alatti TSH eredménye, közülük 108 beteg ft4 értéke emelkedett volt. A fennmaradó 42 betegünknél (4. ábra) a TT3 és ft3i alapján 3, illetve 5, a szabad T3 eredmények szerint 11 esetben igazolódott a T3 hyperthyreosis ténye. Az adatok jól szemléltetik, hogy a totál hormonszintek alapján nincs különbség a kezelt és a nem kezelt csoport között, míg az ft3i eredmények szerint közel 3,7-szer, az ft3 szintek alapján 2,3-szer gyakrabban fordul elő a methimazollal kezelt betegekben a T3 toxikózis a nem kezelt betegekhez képest. A szubnormális TSH értékű betegekben (4) a T3 toxikózist 5 %-ban észleltem. Egy korábbi tanulmányban T3 hyperthyreosist a manifeszt hyperthyreoid csoportban 6 %- ban tapasztaltam, az utóbbi esetek mindegyikének toxikus adenomája volt (1). A p. m. diszfunkció szűrésére érkezett valamennyi (n=2100) mintából összesen 18 esetben (0,9 %) igazolódott az ft3 értékek alapján T3 toxikózis (4). 15

17 TSH-ra alapozott algoritmus: 2. vagy 3. generációs assay? A 3. generációs assay funkcionális szenzitivitását (TSH: >0,014 mu/l) figyelembevéve, a 2. generációs TSH teszttel nem detektálható szintek a 3. generációs módszerrel 61 %-ban mérhetővé váltak. A 2. generációs módszerrel már detektálható, de szubnormálisnak (<0,42 mu/l) ítélt TSH szintek (n=187) közül 104 esetben (56 %) a TSH a referencia tartományba került a 3. generációs módszerrel mérve (26, 28). A két TSH assay alapján eltérően besorolható esetekből 97 mintában kétféle módszerrel is egybehangzóan referencia tartományban lévő ft4 és ft3 értékeket kaptam. Így az eltérő leletek a 3. generációs TSH assay értelmében euthyreoidnak minősültek, míg a 2. generációs assay eredményei alapján szubklinikus hyperthyreoidok voltak (5. ábra). A 2. generációs módszernél a 100 %-os szenzitivitási érték 80 %-os specificitás mellett adódott. Ezzel szemben a 3. generációs TSH assay 97 %-os specificitás mellett 100 %-os szenzitivitást biztosít. Vizsgáltam a klinikai szenzitivitást és specificitást mindkét módszerrel a manifeszt és a szubklinikus hyperthyreosis elkülönítésének lehetősége érdekében. A 3. generációs módszer esetében 0,019 mu/l TSH határérték figyelembevételekor kaptam 91 %-os szenzitivitást, de csak 66 %-os specificitás mellett (26, 28) n=268 2.gen.TSH assay 3.gen.TSH assay 70 gyakoriság % n=97 n= n=0 0 Euthyreoid Szubklinikus hyperthyreoid Manifeszt hyperthyreoid 5. ábra A 322 eset besorolása a két módszerrel mért TSH és a perifériás szabad hormonszintjeik alapján 16

18 A manifeszt és a szubklinikus hyperthyreosisos csoport TSH szintjei között a szignifikáns különbség kifejezettebb az érzékenyebb 3. generációs módszerrel mérve (6.ábra). A methimazollal nem kezelt betegekben a TSH szintek (6./A ábra) élesebben elkülönülnek (p<0,001) a manifeszt és a szubklinikus betegek között, mint a thyreostaticummal kezelt (p<0,01) (6/B ábra) esetekben (2, 26, 28). Nem kezelt betegek (n=217) TSH mu/l 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Szubklinikus hyperthyreosis (n=200) M anife szt hype rthyre osis (n=17) 0,184 0,049 p<0,001 0,22 0,01 2. generáció 3. generáció TSH mu/l 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Kezelt betegek (n=80) Szubklinikus hype rthyre osis (n=68) M anife szt hype rthyre osis (n=12) 0,132 0,126 p<0,01 0,041 0, generáció 3. generáció 6/A-B. ábra. TSH szintek a manifeszt és a szubklinikus hyperthyreoid csoportban 17

19 Összegezve a TSH szenzitív módszerekre alapozott algoritmust az eredményeink és a lehetőségeink szerint alakítottuk folyamatosan az elmúlt 13 év során (7. ábra). Az algoritmus gyakorlatának bevezetése előtti időhöz (100 %) képest, az egy betegre eső in vitro tesztek száma közel felére (57 %) csökkent. Az egy betegre eső vizsgálatszám változása (%) Algoritmus előtt 100% Algoritmus bevezetése után 2.gen. TSH + T4i, T3i 57% 2.gen. TSH + ft4, ft3 +TPO-Ab* 3.gen.TSH + ft4, ft3 + TPO-Ab* 47% 43% Ábramagyarázat: az oszlopok az 1990-es évektől számolt egy betegre eső vizsgálatszám %-ban kifejezett változását ábrázolja *(3) 7. ábra In vitro tesztek számának és minőségének változása az elmúlt 12 évben 18

20 Pajzsmirigy paraméterek elemzése szokásostól eltérő fehérjeszintek mellett Emelkedett TBG szintek mellett A mért p.m. paraméterek összesített eredményeit az 1. táblázat összegzi. A kontroll csoporthoz képest a fokozott ösztrogén expozíciónak kitett három euthyreoid csoport TBG szintje szignifikánsan magasabb. Feltűnő, hogy a p.m. paraméterek többsége szignifikánsan eltér a kontroll csoport átlagértékétől. Csak a 16. gesztációs hétben lévő terhesekben nem tér el jelentősen a TSH, a TBK-val számolt ft4i, valamint az ft3 és az ft3i. Az antikoncipienst szedő csoportban csak a TSH az ft3i és a TT3/TT4 hányados nem tér el szignifikánsan a kontrolltól (6, 12). Az ft4 átlagértékek - amelyeket három különböző elven mérő szabad T4 módszerrel nyertem - a magas TBG szintű csoport mindegyikében (16. és 32. heti terhesek, antikoncipiens szedők) szignifikánsan (p < 0,001) alacsonyabbak a kontroll csoporthoz képest (8. ábra). Ez a különbség a 32. hétben lévő gravidáknál és az egylépéses tracer analóg módszerrel a legkifejezettebb (kontroll 15,6 ± 2.8; antikoncipienst szedő: 12,5 ± 2,3 ; 16. trimester: 10.4 ± 1,4; 32. trimester: 6,5 ± 1,1 pmol/l). A kontrolltól való eltérés a kétlépéses assay esetében a legkisebb (6, 12). 25 ft4elisa ft4ria ft4meia 20 N.S. p<0.001 p<0.001 p<0.001 ft4 (pmol/l) ábra Szabad Kontroll T4 szintek Antikoncipienst magas TBG szintű Gravida szérumkörnyezetben. a 16. Gravida a 32. szedő hétben hétben Rövidítések: MEIA: kétlépéses, ELISA: egylépéses tracer analóg, RIA: egylépéses antitest jelölt. 8. ábra Három módszerrel mért ft4 szintek, eltérő TBG szintű szérumokban 19

21 PARAMÉTER Kontroll Anticoncipienst szedő Gravida: 16. hétben Gravida: 32. hétben Az ANOVA adatai (mértékegység) n átlag ± SD n átlag ± SD n átlag ± SD n átlag ± SD F p < df TBG (nmol/l) 227 ± ± 61 a 448 ± 60 a, b 634 ± 90 a, b, c 313,5 0,001 3; 230 TSH (mu/l) ± ,4 ± 0,7 83 1,6 ± 0,8 72 1,7 ± 0,7 a, b 4,6 0,05 3; 230 ft4elisa (pmol/l) 15,6 ± 2, ,5 ± 2,3 a 74 10,4 ± 1,4 a, b 29 6,5 ± 1,1 a, b, c 127,1 3;178 ft4meia 31 16,3 ± 2, ,2 ± 1,9 a 44 14,3 ± 1,3 a 72 11,4 ± 1,5 a, b, c 71,6 3;160 (pmol/l) 0,001 ft4ria 24 16,1 ± 2, ,2 ± 1,2 a 33 12,7 ± 1,8 a 65 8,5 ± 2,0 a, b, c 116,8 3;135 (pmol/l) TT4 (nmol/l) 97 ± ± 22 a 133 ± 24 a 23,1 2;89 ft4iu (nmol/l) 97 ± ± 22 a 84 ± 14 a, b 18,3 2;89 ft4ibc (nmol/l) 85 ± ± 15 a 90 ± 16 3,8 0,05 2;89 ft3 (pmol/l) 21 6,5 ± 0,6 32 7,3 ± 0,8 a 6,8 ± 0,8 b 8,1 2;89 ft3i (nmol/l) 1,9 ± 0,3 32 2,0 ± 0,3 39 1,8 ± 0,3 b Nincs adat 5,5 0,01 2;89 TT3 (nmol/l) 31 2,0 ± 0,3 32 2,4 ± 0,4 a 2,8 ± 0,5 a, b 30,1 0,001 2;99 TT3/TT4ratio 19,7 ± 2, ,7 ± 3,4 21,8 ± 4,8 a, b 5,5 0,01 2;89 *1000 ft3/ft4 ratio 21 0,41 ± 0, ,56 ± 0,09 a 0,68 ± 0,13 a, b 50,6 0,001 2;89 Szignifikáns különbség a kontrolltól, b antikoncipienst szedő csoporttól, c a 16. hetes terhes csoporttól (ANOVA: variancia analízist követő páronkénti összehasonlítás). Rövidítések: TBG =thyroxin binding globulin, TSH = thyreoid-stimulaló hormon, ft4elisa = free thyroxin egylépéses tracer analóg módszer, ft4meia = ft4 antigén-jelölt kétlépéses mikropartikuláris enzim immuno-assay, ft4ria = ft4 egylépéses antitest -jelölt radioimmuno-assay, TT4 = total thyroxin, ft4iu = free thyroxin index :TT4 x T3U = triiodothyronine uptake, ft4ibc = szabad T4 index : TT4/TBK, ft3 = free triiodothyronine, ft3i = free triiodothyronine index : TT3x T3U, TT3 = total triiodothyronin. N = esetszám, ± SD = standard deviáció 1.táblázat Pajzsmirigy paraméterek értékei eltérő TBG szintű euthyreoid nőkben

22 A TBG szintek és az ft4 értékek között erős negatív korrelációt kaptam az egylépéses módszerek esetében (2. táblázat). Ugyanakkor a ft4 és a TSH szintek logaritmusa közötti negatív korreláció (r= -0,34) a kétlépéses módszernél volt a legerősebb PARAMÉTER (N = 94) ft4elisa ft4ria ft4meia r r r LogTSH -0,26* -0,27* -0,34** TBG -0,83** -0,81** -0,67** Magyarázat: **p<0,001, *p<0,05, N = mérések száma, r = korrelációs koefficiens, logtsh = TSH logaritmusa, ft4elisa = free thyroxin tracer analóg egylépéses, ft4meia = ft4 kétlépéses assay, ft4ria = ft4 egylépéses antitest jelölt radioimmunoassay. 2. táblázat A szabad T4 és a TBG, illetve a TSH logaritmusa közötti korrelációk a három módszer alkalmazása esetén. Elemzések a referencia tartomány szempontjából A 16. heti terhesek csoportjában az elvárt normális ft4 szintet a kétlépéses módszer minden esetben igazolta. Ugyanebben a csoportban az egylépéses tracer analóg módszer 82 %-ban, az antitest jelölésű assay 13 %-ban nyújtott tévesen alacsony ft4 értéket. Míg a 32. hétben lévő terhesek esetében hypothyreotikus érték a tracer analóg módszerrel minden esetben (100 %), az antitest jelölésűnél 86 %-ban, míg a kétlépéses módszernél csak 3 %-ban fordult elő. A normál tartományon belül maradtak minden esetben a TSH, az ft3i és az ft3 valamint a szabad thyroxin indexek. Referencia érték feletti TT4-et a 16. gesztációs hétben 23 %-ban az antikoncipienst szedőknél 6 %-ban. Emelkedett TT3 szint a terhesekben 51 %, az antikoncipienst szedőknél 16 % volt P.m. hormonértékek alacsony albumin és eltérő TBG szintek esetén A klinikailag euthyreoid alkoholos májcirrhosisban szenvedő betegek hormonkötőkapacítására utaló paraméterei eltérnek szignifikánsan a kontroll csoporttól, kivéve a TBG szinteket (9. ábra). 21

23 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 *p<0,05 **p<0,001 Kontroll n=33 Cirrhosis n=40 * * N.S. T3U TBK TBG/100 nmol/l ** Albumin g/dl Ábramagyarázat: * p<0,05; **p<0,001 szignifikáns eltérés a kontrolltól. 9. ábra Eltérések a hormonkötő kapacitás alkoholos cirrhosisban Ezen kívül a kontroll csoporthoz képest szignifikánsan magasabb értékeket találtunk a cirrhosisos betegekben a TT4/TT3 hányadosban, míg szignifikánsan alacsonyabb értékeket kaptunk a TT3, ft3i, valamint a kétlépéses módszerrel mért ft3 értékekben (részletes adatokat itt nem közlöm, ld. 5. közlemény). A cirrhosis klinikai stádiumával (Child A-C) jó korrelációt mutatott az TT3, T3i, valamint a TT4/TT3 hányados (10.A-B. ábra). Elemzések a referencia tartomány szempontjából Kórosan magas TSH szint a cirrhosisos betegek között 13 %-ban fordult elő. A TT4 mérésekor 8 %-ban, az ft4 meghatározásakor 30 %-ban, a TT3 esetén 55 %-ban az ft3i eredményeiben 48 %-ban, az egylépéses ft3 módszerrel 20 %-ban, míg a kétlépéses ft3 módszernél 30 %-ban tapasztaltam kórosan alacsony értéket (11. ábra). A cirrhosis klinikai súlyosságával összhangban a referencia tartomány alatti p.m. leleteket csak a TT3 esetében találtunk (12. ábra). 22

24 A.) TT3 ft3i 2,5 2 2,2 2,1 TT3, ft3i (nmol/l) 1,5 1 0,5 1,5* 1,5* 1,2* 1.2* 0.9** 0,7**** 0 Kontroll Child A Child B Child C B.) **** 120 TT4/TT *** (*szignifikáns különbség a kontrolltól, **kontroll és a Child A, ***a kontroll és a Child C, **** mindhárom csoporttól) 0 Kontroll n=33 Child A n=17 Child B n=13 Child C n=5 10. ábra A cirrhosis klinikai stádiuma és a T3 szintek (A), valamint a TT4/TT3 hányados (B) közötti összefüggés 23

25 ft3 (egylépéses) ft3 (kétlépéses) ft3i TT3 ft4 ft4i TT Normál tartomány alatti lelet (%) 11. ábra Referencia tartomány alatti pajzsmirigy hormonértékek alkoholos májcirrhosisban Child A n=17 Child B n=13 Child C n=5 Normál tartomány alatti leletek gyakorisága (%) TBG ft4 TT3 ft3 12. ábra Normál tartomány alatti leletek előfordulása a cirrhosis klinikai súlyosságával 24

26 Pajzsmirigy hormonszintek alacsony albumin és/vagy alacsony IgG szintek esetén- in vitro manipuláció (13) A torzítás mértéke az ft4 értékekben, úgy az IgG (3. táblázat), mind az albumin (4. táblázat) szint növelésével szignifikáns pozitív korrelációt mutatott. Hormon MEIA N r p Görbe meredeksége ECLIA N r p Görbe meredeksége ft ,58 <0,001 0, ,51 <0,01 0,003 ft <0,01 0, ,77 <0,001 0,019 ECLIA: egylépéses és MEIA: kétlépéses módszer 3. táblázat: Korrelációk a hormonok torzítási mértéke és a szérum IgG koncentráció között Hormon MEIA N r p Görbe meredeksége ECLIA N r p Görbe meredeksége ft ,89 <0,001 0, ,71 <0,001 0,011 ft ,79 <0,001 0, ,76 <0,001 0,045 ECLIA: egylépéses és MEIA: kétlépéses 4. táblázat Korrelációk a hormonok torzítási mértéke és a szérum albumin szintek között Az IgG-vel történt manipuláció esetében a szabad hormonszintekben tapasztalt torzítások mértéke nem haladta meg a 10 %-ot. Azonban az albumin szint növelésével 60 %-os pozitív irányú torzítások is tapasztalhatók (13. ábra). Megállapítható, hogy az ft4 szintek tekintetében mindkét fehérjeszint változásra szignifikánsan érzékenyebben reagál a MEIA módszer, mint az ECLIA módszer. Az ft3 úgy az IgG szinttel (3. táblázat), mint az albumin koncentrációval (4. táblázat) pozitív korrelációt mutat, de a torzítások mértéke eltérő (IgG: 8-30 % vs. 25

27 albumin: %). Az ft3 szintek torzítása szignifikánsan nagyobb az ECLIA módszer esetében, mint az MEIA módszernél, s ez különbség mindkét fehérjemanipuláció esetében kimutatható (14. ábra). A.) MEIA ECLIA 8 6 ft4 torzítás % ,5 ±0,6 6,8 ±0,3 10,5 ±0,4 14,2 ±0,2 17,8 ±0,3 IgG koncentráció (g/l) B.) 80 ft4 torzítás % ,0 ±0,9 35,0 ±0,6 42,0 ±0,6 47,0 ±0,8 51,0 ±1,0 Albumin koncentráció (g/l) Szignifikáns különbség a két módszer között: A: ANOVA: F=9,56, df=1, p<0,001 B: ANOVA: F=24,9, df=1, p<0,0001 Szignifikáns eltérés a fehérjefrakciók növelésével: A: ANOVA: F=6,36, df=4, p<0,001 B: ANOVA: F=120,7, df=4, p<0, ábra Torzítások az ft4 szintekben az IgG (A) és az albumin (B) koncentráció növelésével 26

28 A.) 40 MEIA ECLIA ft3 torzítás % ,5 ±0,6 6,8 ±0,3 10,5 ±0,4 14,2 ±0,2 17,8 ±0,3 IgG koncentráció (g/l) B.) ft3 torzítás % ,0 ±0,9 35,0 ±0,6 42,0 ±0,6 47,0 ±0,8 51,0 ±1,0 Albumin konce ntráció (g/l) Szignifikáns különbség a két módszer között: A: ANOVA: F=4,85, df=1, p<0,05, B: ANOVA: F=3,9, df=1 p<0,05; Szignifikáns különbség az albumin szint növelésére: A: ANOVA F=14,4, df= 4, p<0,0001; B: ANOVA F=81,2, df=4, p<0, ábra Torzítások az ft3 szintekben, növelve a szérumban az IgG (A) és az albumin (B) koncentrációt A TSH szintekben a torzítás mértéke nem haladta meg a 10 %-ot, viszont az albumin koncentráció és az ECLIA módszer torzításai között szignifikáns pozitív korrelációt (r=0,62, p<0,001) kaptam. 27

29 A. ft4 torzítás % (ECLIA) B. ft4 torzítás % (M EIA) C ft3 torzítás % (ECLIA) alacsony IgG normális IgG Albumin (g/l) 80 p<0, Albumin (g/l) Albumin (g/l) D ft3 torzítás % (MEIA) p<0,05 p<0, Albumin (g/l) Szignifikáns eltérés (P<0,05) az alacsony és a normális IgG szintű szérumok között 15. ábra Albumin okozta torzítás mértéke a szabad hormonszintekben alacsony és normális IgG szintű szérumokban. 28

30 Mindkét szabad hormonszintnél az alacsony IgG szintű szérumkörnyezetben a MEIA módszerrel mért, in vitro albumin szint növelésével előidézett torzítások szignifikánsan (p<0,05) magasabbak, mint a normál IgG szintű mintákban (15. ábra) A PRL szintek vizsgálatának eredményei Homogenitási vizsgálat Az enyhén emelkedett ( mu/l) PRL szintű szérumok visszanyerési %-ának (10, 11) hisztogramja közel normális, míg a magas (>700 mu/l) PRL szintű eseteké bimodális eloszlású (16. ábra). Esetszám Esetszám 31 enyhén emelkedett ( mu/l) PRL szintû beteg PRL visszanyerési % 254 eset: >700 mu/l PRL szinttel PRL visszanyerési % felsõ határa 16. ábra A visszanyerési %-ok hisztogramja enyhén emelkedett (A) és magas (B) PRL szintek esetén 29

31 A betegek PRL szintjének átlaga a PEG kezelés előtt szignifikánsan magasabb, mint a PEG kezelés után (5. táblázat). Szignifikáns eltérés volt a PEG kezelést követően a felülúszóból mért és a nem specifikus precipitációval (NSP) korrigált szabad PRL szintek között. N=745 PRL átlag ± S.D. mu/l Minimum PRL mu/l Maximum PRL mu/l Natív szérumban 1478 ± PEG kezelést követően 953 ±952** Szabad PRL* 1040 ±1030*** *NSP-vel korrigált, S.D.: standard deviáció, ** szignifikáns (p<0,001) eltérés a natív szérumban mért értéktől, *** szignifikáns (p<0,001) eltérés a PEG kezelést követő szinttől. 5.táblázat A szérumok PRL szintjei a PEG kezelés előtt és után A PEG precipitációs módszer analitikai validitása A hígítás hatása a PEG precipitációs módszerre. A natív és a higított mintákban mért PRL szintek között nagyon szoros szignifikáns korrelációt (r=0,99) kaptam (17. ábra). PRL szint a higított szérumban (mu/l) N=245 PRL higított (mu/l)= * PRL (mu/l) a natív szérumban r = 0.99 p < 0, PRL szint a natív szérumban (mu/l) 17. ábra Korreláció a natív és a higított PRL szintek között. 30

32 A nem specifikus precipitáció (NSP) mértéke A három különböző gyártási számú humán rekombináns PRL-t tartalmazó standard mintán végzett PEG precipitáció eredményeként az NSP mértékét széles tartományban (minimum:-32%, maximum +21%) tapasztaltam (6. táblázat). Feltűnő, hogy az egyes mérési sorozatok között ugyanazon gyártási számú standard mintán belül is nagy eltérések adódtak a célértéktől. Gyártási sorozat Mérések száma PRL mu/l Natív standard Átlag ±S.D. PRL mu/l PEG kezelést követően Átlag ±S.D. Eltérés a célértéktől % Átlag ±S.D. Min. Eltérés % Max. Eltérés % ± ±217 (+) 7 ± ± ±105 (-) 8 ± ± ±297 (-)11 ± táblázat A PEG precipitáció hatása a humán rekombináns PRL-t tartalmazó standard szérumokra A macroprolactinaemia gyakorisága, életkor függése Az MPRLs gyakorisága a >700 mu/l PRL szintű betegek szérumában 21,3-23 %-ban igazolódott. Az MPRLs csoportban a natív (PEG kezelés előtti) PRL szérum szintek PRLtartományát megvizsgálva (18. ábra) megállapítható, hogy a 215 MPRLs beteg PRL 31

33 szintje mu/l közé estek. A gyakoriság a PRL szint növekedésével jelentősen lecsökkent. Többségük (60%) a mu/l PRL tartományba esik (10). N= Gyakoriság (%) >5000 natív PRL szintek mu/l 18. ábra A macroprolactinaemiás esetek PRL szintjeinek megoszlása A nőkben az életkor előrehaladásával szignifikánsan (p<0,01) gyakrabban fordul elő az MPRLs. A fiatal életkorúakhoz képest gyakrabban fordul elő már a életév közötti csoportban is (19.ábra), s a gyakoriság 45 év felett tovább növekszik (10, 11). * p <0,001 >45 év (n=105) év (n=215) év (n=400) 14% 23%* 37%* 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% A macroprolactinaemia előfordulása Szignifikáns (P<0,001) eltérés a fiatalabb csoporttól 19. ábra Az MPRLs előfordulása és az életkor összefüggése 32

34 A makroprolactinaemia és a hyperprolactinaemia együttes előfordulása Korábbi tanulmányunk során 59 MPRLs szérum közül 9 esetben (15 %) fordult elő hogy a biológiailag aktív PRL frakció is magas maradt a PEG precipitációt követően (10, 11). Ezt a jelenséget későbbi vizsgálatom során (nagyobb esetszámon és az NSP korrekciót követően) 28 %-os (43/156) gyakorisággal tapasztaltam. Ezekben az esetekben a szabad PRL átlagértéke 750 ±286 mu/l volt. Ugyanakkor >60 % PRL visszanyerés mellett 589 betegből 30 esetben (5 %) a szabad PRL szint normalizálódott (normo-szabad prolactinaemia: 465 ±96 mu/l) A PRL szintek klinikai validitásának vizsgálata MRI leletek összevetése a laboratóriumi leletekkel A koponya és hypophysis MRI vizsgálatok eredményeit a 7. táblázat foglalja össze. A pozitív MRI leletet szignifikánsan (p<0,01) több esetben (36%) fordult elő a thprlcsoportban, mint a MPRLs-csoportban (10%). Az utóbbi csoportban csak microadenoma fordult elő, míg macroadenoma, vagy egyéb, súlyosabb, a hypothalamohypophyseális régiót érintő térfoglaló folyamat nem volt bizonyítható. Koponya és hypophysis MRI-lelet MPRLs (n=41) thprl (n=82) n % n % Negatív ** Microadenoma ** 1 Macroadenoma Egyéb eltérés (meningeoma, craniopharingeoma, Rathke tasak cysta) Az összes MRI eltérés ** **χ 2 teszt: szignifikáns (p <0,01) különbség a thprl és a MPRL csoportok között 1 Két beteg a thprl mellett MPRLs is volt 7. táblázat MRI során észlelt morfológiai eltérések a magas PRL szintű betegekben a szabad PRL számolása előtt (n=123) 33

35 Ezt az elemzést a szabad PRL szintek bevezetése után is elvégeztem 133 beteg MRI leletei alapján. Említésre méltó különbséget az MPRLs csoportban tapasztaltam egyedül, amikor is a mikroadenoma előfordulása felére lecsökkent (5 %) A hyperprolactinaemia vezető tüneteinek vizsgálata A galactorrhoea és infertilitás szignifikánsan (p<0,01) magasabb számban fordult elő a thprl betegek között (8. táblázat). Az amenorrhoea előfordulása kétszer nagyobb volt thprl csoportban, mint a MPRLs betegek között. Szignifikánsan (p<0,02) magasabb számban fordult elő galactorrhoea és infertilitás a thprl eseteiben. Az amenorrhoea előfordulása kétszer nagyobb volt (6%, 8/141) thprl-ben, mint a MPRLs-ben (3 %, 1/32) de ez az eltérés nem szignifikáns. Egyéb vérzési rendellenesség, mint raromenorrhoea a MPRLs csoportban 50 %-ban (8/16), a thprl-s esetekben 33 %-ban (20/60) fordult elő (10-11). Betegcsoport Galactorrhoea Infertilitás Amenorrhoea (n=208) Igen Nem (n=128) Igen Nem (n=173) Igen Nem MPRLs n % 2 4 % % % 31 thprl n % % * 44 % * 6 % *Szignifikáns (p <0,02) eltérés a MPRLs betegktől (χ 2 teszt) táblázat A hyperprolactinaemia vezető tüneteinek előfordulása a két csoportban 34