Kináz gátló molekulák szerkezet - hatás/tulajdonság. összefüggéseinek vizsgálata számított és mért. paraméterek alapján, és alkalmazásuk a

Átírás

1 Kináz gátló molekulák szerkezet - hatás/tulajdonság összefüggéseinek vizsgálata számított és mért paraméterek alapján, és alkalmazásuk a gyógyszertervezésben és a gyógyszerfejlesztésben PhD doktori disszertáció Szigorlati bizottság: Dr. oszál Béla elnök Dr. Hrabák András Opponensek: Dr. Józan Miklós Dr. Molnár László Dr. Keserű György Programvezető: Dr. Mandl József Témavezető: Dr. Kéri György Készítette: Erős Dániel Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola 2005

2 TARTALOM RÖVIDÍTÉSEK LISTÁJA BEVEZETÉS A KÉMIAI SZERKEZET ÉS A FIZIKAI/KÉMIAI ILLETVE BIOLÓGIAI TULAJDOSÁGOK KÖZÖTTI KAPCSOLAT VIZSGÁLATA SZERKEZET ALAPÚ TERVEZÉS LIGADUM ALAPÚ TERVEZÉS (QSAR) QSPR ÉS QSAR MODELLEK OPTIMALIZÁLÁSA AZ ADATBÁZIS ÖSSZEÁLLÍTÁSA A LEÍRÓK (DESZKRIPTOROK) KISZÁMÍTÁSA MODELLÉPÍTÉS Számítási (illesztési) módszerek MLR [19] PCA PLS A LDA A modell optimalizálása D és 2D leíró előszűrési módszerek Az automatikus leíró szelekcióra használt módszerek SAJÁT EREDMÉYEK QSPR MODELLEK A logp modellezése Eredmények Az oldhatóság modellezése Eredmények QSAR MODELLEK Az EGF-receptor gátlóképesség modellezése Eredmények A kinázgátló-szerűség modellezése Eredmények A mutagenicitás modellezése Eredmények IRODALOMJEGYZÉK

3 RÖVIDÍTÉSEK LISTÁJA ADME - Absorption, felszívódás; Distribution, eloszlás; Metabolism, metabolizmus; Excretion, kiválasztás A - mesterséges idegháló módszer BV - többszörös validációs ciklus CADD - számítógéppel támogatott gyógyszertervezés CoMFA - összehasonlító molekulamező analízis ESP - elektrosztatikus potenciál EGF - epidermális növekedési faktor (epidermal growth factor) GA - genetikus algoritmus HTS - nagy áteresztőképességű szűrés IC - információ tartalom KL - kinázgátló-szerűség LDA - lineáris diszkriminancia analízis logp - az oktanol/víz megoszlási hányados tízes alapú logaritmusa logs - a vízolhatóság tízes alapú logaritmusa MAP kináz - mitogén aktivált protein-kináz MIC - minimális gátlási koncentráció MLP - molekuláris lipofilitási potenciál MLR - többváltozós lineáris regresszió analízis DL - normális eloszlás-szerűség PAS - predictive ability scoring (a leíróknak a modell becslőképességében játszott fontossága) PCA - főkomponens-elemzés PCR - főkomponens regresszió PDGFR - trombocitákból származó növekedési faktor-receptor 3

4 PI3 kináz - foszfatidilinozitol-3-kináz PKC - protein kináz C PKI adatbázis - protein kináz-gátlók adatbázisa PLCγ - foszfolipáz C gamma PLS - részleges legkisebb négyzetek módszere PO - perimeter oriented felosztás Q 2 - kereszt-validációs korrelációs együttható QSAR - kvantitatív szerkezet-hatás összefüggések QSPR - kvantitatív szerkezet-(fizikai-kémiai) tulajdonság összefüggések RDD - racionális hatóanyagtervezés SDS - szekvenciális leíró válogatás SEP - a becslés standard hibája SMILES - Simplified Molecular Input Line Entry Specification (A molekulák szerkezetét egy soros formában leíró egyszerűsített képlet) SRE - Spearman-féle rangkorrelációs együttható UD - egyenletes felosztás VEGFR - vaszkuláris endoteliális növekedési faktor receptor 4

5 1. BEVEZETÉS Az 1990-es éveket megelőzően egy-egy hatóanyag megtalálása, felfedezése leggyakrabban a véletlennek volt köszönhető (pl. penicillin). apjainkban a racionális hatóanyag-tervezés korszakát éljük a gyógyszerkutatásban. A dolgozatban bemutatom azokat a QSPR (Quantitative Structure-Property Relationships, Kvantitatív Szerkezet- (fizikai-kémiai) Tulajdonság Összefüggés) és QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships, Kvantitatív Szerkezet-Hatás Összefüggés) módszereket, amelyek fontos szerepet játszanak új, gyógyszerjelölt molekulák megtalálásában ill. szerkezet optimalizálásában, majd ismertetem a PhD munkám során előállított konkrét QSPR és QSAR modelleket. A racionális hatóanyag-tervezés definíciója: molekuláris pathomechanizmussal alátámasztott validált célmolekula ellen a protein 3 dimenziós szerkezete, számítógépes ill. farmakofór modellje alapján tervezett, az orvosi kémia, a kombinatorikus kémia és a klasszikus heterociklusos kémia módszereit felhasználó hatóanyag tervezés és előállítás [1]. A definícióból látszik, hogy legelőször is tisztában kell lennünk a tervezendő molekula hatásmechanizmusával, azaz ismernünk kell azt az enzimet (gyógyszereink többsége valamilyen fehérjén fejti ki a hatását [2]), amelynek gátlásával vagy aktiválásával kívánjuk elérni az adott biológiai hatást. A célmolekula ismertében lehetőség nyílik vezető (lead) molekulák kiválasztására ill. optimalizálására, amelyet követhet a gyógyszerfejlesztési szakasz. A vezető molekula kiválasztásban nagy szerepe van a HTS-nek (High Throughput Screening, agy Áteresztőképességű Szűrés), míg az optimalizálás során előtérbe lépnek a QSPR és QSAR módszerek. A racionális hatóanyag-tervezés vázlatos bemutatása az 1. ábrán látható [1]. Racionális hatóanyag-tervezés Genomika Pathomechanizmus Cél molekula Cél molekula kiválasztás validálás Proteomika egyszerű vagy komplex (> 80% a jeltovábbításban) Kombinatórikus kémia Molekula könyvtárak Racionális molekula -tervezés (3D v. farmakofór) HTS RDD QSAR Vezető molekula kiválsztás Vezető molekula optimalizáció Informatika Automatizáció Gyógyszer fejlesztés 1. ábra A racionális hatóanyag-tervezés sémája 5

6 A QSPR és a QSAR módszerek kifejlesztésekor olyan matematikai modelleket állítunk elő, amelyek megteremtik a kapcsolatot a különböző, a molekula szerkezetéből számítható molekuláris paraméterek (az ú. n. leírók vagy deszkriptorok) és a molekula fizikai-kémiai tulajdonságai ill. biológiai hatékonysága között. agyon fontos, hogy ezeket a modelleket statisztikus módszereknek tekintsük, mert egyrészt előállításuk nagy elemszámú mintát igényel, másrészt az eredményeket a megfelelő módon kell tudnunk értékelni. A becsült értékekben megmutatkozó kis eltéréseket nem szabad túlmagyarázni, ezek a módszerek inkább a nagyobb tendenciák felderítésére alkalmasak. A modellek kifejlesztése után, amennyiben azok megbízhatóak, lehetőségünk nyílik különböző molekulakönyvtárak virtuális szűrésére [3]. Ezek a molekulakönyvtárak származhatnak egyrészt kereskedelmi adatbázisokból (pl. Dictionary of Drugs, ACD (Available Chemicals Directory), Chemical Abstracts Service, Beilstein Crossfire, kombinatorikus kémiával foglalkozó cégek adatbázisai, stb.), másrészt tartalmazhatnak virtuális szintézissel előállított molekulákat [4]. Virtuális szintézisre alkalmas szoftver pl. a CombiLibMaker (TRIPOS), vagy az MDL Project. A virtuális szűrés legnagyobb előnye, hogy nem igényel megszintetizált molekulákat, csak a virtuális molekulák az adott modellben szereplő leíróinak kiszámítására van szükség, és a becsülendő paraméter kiszámítható. Fontos azonban, hogy a molekulák megszintetizálhatóak legyenek, hiszen egy a valóságban nem ill. nagyon nehezen előállítható vegyület esetében nem számíthatunk arra, hogy a molekulából gyógyszer lesz. Ez a feltétel a kereskedelmi adatbázisoknál biztosítva van, a virtuális szintézis esetében pedig a virtuális kémiai reakciók tervezésekor gondoskodni kell arról, hogy az algoritmus előállítható molekulákat generáljon. Virtuális szűréseket tipikusan olyan céllal szoktak alkalmazni, hogy a nagyméretű molekulakönyvtárak méretét úgy csökkentsék kezelhető méretűre, hogy közben a potenciális jó anyagok relatív gyakorisága megnőjön. Az ily módon leszűkített adatbázisok esetében a tíz százalékos találati arány (hit rate) már elfogadható [5]. Az irodalomban igen nagy számú QSPR/QSAR vizsgálat található meg, ám ezek túlnyomó többsége egy-egy konkrét vegyületcsalád adataira épül. Mivel a virtuális szűrésre olyan modellekre van szükség, amelyek kémiailag változatos, diverz struktúrák tulajdonságait is megbízhatóan képesek becsülni, fontos, hogy a kiindulási molekulahalmazunk is diverz legyen. Minél diverzebb a kiindulási adatbázisunk, annál 6

7 nagyobb valószínűséggel fog a modellünk új, ismeretlen szerkezeti elemeket tartalmazó molekulák becslésében is megfelelően teljesíteni. A dolgozatban bemutatott, virtuális szűrésre is alkalmas modelleket két nagy csoportra lehet osztani. Az első csoportba tartoznak a QSAR becslések. Egy gyógyszer keresésekor érthetően az a legfontosabb, hogy az anyagnak legyen biológiai hatása, kötődjön a célmolekulához és megfelelő módon befolyásolja annak működését. Tehát a biológiai hatás becslésének kell az elsődleges szűrőnek lennie. A további szűrők pedig a különböző egyéb gyógyszer-szerűséget biztosító tulajdonságokat vizsgálják, elsősorban QSPR alapú becslések felhasználásával. Ezeknek a másodlagos szűrők segítségével a megfelelő ADME (Absorption, Felszívódás; Distribution, Eloszlás; Metabolism, Metabolizmus; Excretion, Kiválasztás) paraméterekkel rendelkező molekulákat választhatjuk ki, tehát azokat a vegyületeket, amelyek megfelelő farmakokinetikai tulajdonságokkal rendelkeznek, képesek felszívódni, eljutni a célmolekulához, stb. A gyógyszerjelölt molekulák jelentős része nem megfelelő ADME tulajdonságok miatt bukik el a gyógyszerfejlesztés különböző fázisaiban. Minél hamarabb szabadulunk meg ezektől az anyagoktól, annál több időt, pénzt és fáradtságot spórolunk meg magunknak. Kutatás Vezető molekula Fejlesztés Alapkutatás Felfedező kutatás Preklinikai fázis Klinikai fázisok I II III Törzskönyvezés Évek Költség (%) 4% 15% 10% 15% 22% 31% 3% 100% % 2. ábra A gyógyszerkutatás/fejlesztés szakaszai 7

8 A 2. ábra [6] bemutatja a gyógyszerkutatás/fejlesztés egyes szakaszait. Az ábrából kiderül, hogy ha még a preklinikai fázis előtt elvetjük a nem megfelelő molekulákat, akkor kb. a költségek 80%-át takaríthatjuk meg. Fontos egyéb szűrő lehet még a toxicitási és a mutagenicitási becslés is. A végső cél az, hogy ezen összetett virtuális szűrőrendszerek segítségével hatékony, gyógyászati célokra alkalmas (szájon át alkalmazható, nem toxikus, kevés mellékhatással rendelkező, stb.) potenciális gyógyszerjelölt molekulákat tudjunk kiválasztani virtuális molekulakönyvtárakból. Az ismert célmolekulák legnagyobb része a jeltovábbításban vesz részt. Kutatások szerint a betegségek (daganatok, gyulladások, érelmeszesedés, stb.) túlnyomó hányadát valamilyen jeltovábbítási probléma, pl. "fals" proliferációs jel okozza [7, 8]. A jeltovábbításban résztvevő molekulák nagyon fontos csoportját a fehérjék foszforilációját végző protein kinázok alkotják. A protein kinázok a foszforilált aminosav szerint tovább oszthatók tirozin kinázokra és szerin/treonin kinázokra. A daganatos megbetegedések kóroktanában gyakran kimutatható valamely növekedési faktor kóros hatása. Az EGF receptora, amely a receptor tirozin kinázok közé tartozik, az egyik legjobban tanulmányozott célmolekula. Az EGFR és a hasonló szerkezetű tirozin kinázok (pl. PDGFR, VEGFR) gátlása bizonyos daganatos megbetegedések hatékony terápiáját jelenti. Disszertációm célja, hogy bemutassam a racionális gyógyszertervezés ligandum alapú becslés ágának módszereit és működését, valamint hogy bemutassam azokat a virtuális szűrésre is alkalmas QSPR illetve QSAR modelleket, amelyek előállításában négy éves PhD munkám során részt vettem. A modellek az alábbiak szerint csoportosíthatóak: 1. Fizikai-kémiai paraméterek becslése (QSPR modellek) a) megoszlási hányados logaritmusa (logp), b) vízoldhatóság logaritmusa (logs). 2. Biológiai / farmakológiai / ADME paraméterek becslése (QSAR modellek) a) EGF-receptor gátló képesség, b) kinázgátló-szerűség, c) mutagenicitás. Ezek a modellek várhatóan hatékony szűrőnek fognak bizonyulni nagy méretű molekulakönyvtárakból hatékony protein tirozin-kináz gátló molekulák kiválasztásában. 8

9 2. A KÉMIAI SZERKEZET ÉS A FIZIKAI/KÉMIAI ILLETVE BIOLÓGIAI TULAJDOSÁGOK KÖZÖTTI KAPCSOLAT VIZSGÁLATA A kutatókat régóta foglalkoztatja az a kérdés, hogy vajon milyen kapcsolat van az anyagok molekuláris szerkezete és különböző (fizikai-kémiai, biológiai, stb.) tulajdonságaik között. Ebben a fejezetben bemutatom azt a két megközelítést, amely megkísérli feltárni ezt a bizonyos kapcsolatot, főként a szerkezet-biológiai tulajdonság összefüggésekre koncentrálva. A szerkezet-fizikai-kémiai tulajdonság összefüggések vizsgálata lényegében hasonló elveken alapul (itt most leginkább a QSPR és a QSAR eljárások közötti hasonlóságokra gondolok). A gyógyszerkémiai és rokon tudományok, és a számítástechnika igen látványos fejlődésének köszönhetően az 1990-es évektől kezdve kialakulhattak a számítógéppel támogatott gyógyszertervezés (CADD, Computer Assisted Drug Design) módszerei. Alapvetően kétféle megközelítés létezik a címben szereplő összefüggések vizsgálatában. Az ez egyik elmélet a célmolekula 3 dimenziós szerkezetén alapul (binding site structure-based design, szerkezet alapú tervezés), míg a másik a célmolekulára ható kismolekulák struktúráján (ligand-based design, ligandum alapú tervezés). Mivel a dolgozatban bemutatott vizsgálatok a ligandum alapú tervezés elméletén alapulnak, a szerkezet alapú tervezéssel csak a következő alfejezetben foglalkozom röviden. 2.1 Szerkezet alapú tervezés A szerkezet alapú tervezés alapját képző kulcs-zár elmélet több, mint 100 éve látott napvilágot Paul Erlich és Emil Fischer munkássága nyomán [9]. A szellemes és szemléletes elmélet segítségével a receptor-ligandum kölcsönhatások érthetőbbé és jobban értelmezhetőbbé válnak. Az utóbbi évtizedben a szerkezeti biológia és a számítástechnika gyors előretörése lehetővé tette, hogy a megfelelő ismeretek birtokában a kutatók kulcsokat tervezzenek a zárhoz, azaz hogy adott, ismert szerkezetű célmolekulához jól kötődő molekulákat állítsanak elő. A célmolekula 3D szerkezete lehet kísérletesen meghatározott (általában röntgen krisztallográfiával vagy MR-rel), 9

10 vagy lehet homológia modellezéssel (homology modelling) számolt [10]. A dokkoló eljárások a célmolekula kötőhelyének 3D szerkezetén alapulnak, és a potenciális ligandumok kötési módjának, erősségének becslésére szolgálnak. A dokkoló eljárásokat három nagy csoportra lehet osztani: a) komplementer alapú dokkolás b) molekuladinamika és Monte-Carlo algoritmus alapú dokkolás c) fragmens alapú dokkolás. Számos, dokkolásra kifejlesztett szoftver lelhető fel a piacon, mint például a DOCK [11], LUDI [12], FlexX [13] nevű programok. A szerkezet alapú dokkolás hátrányai közé tartozik, hogy a számítások eléggé időigényesek, hiszen makromolekulák térszerkezetével kell számolni, illetve hogy e módszerek a kötődés erejét vizsgálják. Ezzel kapcsolatban az alábbi problémák merülhetnek fel: 1. Ha egy hatóanyag kötődik egy fehérjéhez, hatása lehet gátló vagy serkentő, de az is előfordulhat, hogy a kötődés ellenére egyáltalán nincs hatása a funkcióra. 2. Hasonló hatású ligandumok esetén lehet, hogy valójában egészen más helyen kötődnek a fehérjéhez. 3. A fehérjék szerkezetét, és ezért funkcióját is nagy mértékben befolyásolja a környezetük (pl. membránban helyezkednek-e el, vagy hogy jelen vannak-e bizonyos hősokkfehérjék, amelyek a fehérjék szerkezetének kialakításában és stabilizálásában játszanak fontos szerepet [14]). A számítási kapacitás jelenleg még nem teszi lehetővé, hogy ilyen komplex hatásokat is figyelembe tudjunk venni a számítások során, ezért azok sok esetben túlegyszerűsítettek lehetnek. 2.2 Ligandum alapú tervezés (QSAR) A QSAR modellek nem a célmolekula, hanem a célmolekulán ható kismolekulák szerkezeté(i)n alapulnak, a hasonló hatású vegyületek közötti szerkezeti átfedéseket, azonosságokat helyezik a vizsgálatok középpontjába. A célmolekula 3D szerkezetére tehát nincs szükség. A QSAR módszerek egyik előnye a szerkezet alapú tervezéssel szemben, hogy a molekulamodellezés szintjén csak kis molekulatömegű anyagokkal kell foglalkozni, és nem makromolekulákkal, ezért ezek az eljárások kevesebb számítási időt igényelnek. Meyer és Overton a már XIX. század végén rámutattak a lipofilitás és a biológiai aktivitás közötti összefüggésre. Felfedezték, hogy a szerves vegyületek 10

11 sejtmembránon keresztüli áthatoló képessége összefügg az olaj/víz megoszlási hányadosukkal [15, 16]. A témával később C. Hansch foglalkozott részletesen, kutatásaival megalapozva a QSAR vizsgálatok térhódítását, így jelentősen hozzájárult a gyógyszertervezés fejlődéséhez. Már Hansch munkásságát megelőzően is voltak kísérletek a biológiai hatás és a molekulaszerkezet közötti kapcsolat pontos leírására. Ez a törekvés jelenik meg a Crum-Brown és Fraser által felállított egyszerű egyenletben [17], amely már 1868-ban megszületett: Φ = fc (1) Φ = biológiai hatás C = kémiai szerkezet Az egyenletben szereplő C a molekula kémiai szerkezetére jellemző számszerű adat, de tartalmára vonatkozóan akkor még nem voltak megfelelő tudományos ismeretek ben Hansch kutatásai nyomán vált világossá, hogy milyen molekuláris paramétereket kell szerepeltetni az egyenletben ahhoz, hogy a szerkezet-hatás függvény korrekt leírását kapjuk. Ezek: lipofilitási tényező, elektromos tényező és sztérikus tényező [18]. log1/c = a (logp) 2 + b logp + c δ + d Es + e (2) log 1/C = biológiai aktivitás, ahol C = a standard biológiai válasz létrehozásához szükséges koncentráció (pl.: ED 50, IC 50, MIC, stb.) P = oktanol/víz megoszlási hányados (lipofilitási tényező) δ = Hammett konstans (elektromos tényező) Es = Taft-féle sztérikus tényező a-e =az egyenlet regresszió alapján számolt konstansai. A kutatási eredmények bebizonyították, hogy a lipofilitás jól korrelál a biológiai aktivitással, és számszerű jellemzésére a megoszlási hányados logaritmusa (logp) a legalkalmasabb QSAR vizsgálatokban. Az egyenletből látszik, hogy a hatáserősség és a lipofilitás között parabolikus összefüggés van, tehát a logp-aktivitás függvénynek maximuma van (ez a jelenség a molekula ADME tulajdonságaival hozható 11

12 összefüggésbe leginkább, de a lipofilitás természetesen hatással van a receptorkötődésre is). A QSAR módszerek tehát megpróbálják korreláltatni a biológiai aktivitással a különböző molekuláris paramétereket. A végső cél az, hogy ezáltal megfelelő modelleket állítsunk elő, amelyekkel új molekulák aktivitását lehet megbecsülni. Két különböző megközelítést lehet alkalmazni, a 2D (klasszikus) és a 3D QSAR-t. 2D (klasszikus) QSAR A klasszikus QSAR vizsgálatok a molekulák 2 dimenziós szerkezeti adatain alapulnak. Az elnevezéssel némileg ellentmondó módon manapság már ú. n. 3 dimenziós leírókat (ilyenek a molekula 3 dimenziós szerkezetének ismeretében számítható leírók) is használhatunk, ez az eljárás azonban nem tévesztendő össze a 3D QSAR módszerekkel! Ezen módszereknek az az alapja, hogy különböző, a molekulaszerkezetből számolt molekuláris tulajdonságokat használunk a molekula globális tulajdonságainak leírására, ill. vizsgálhatjuk, hogy a különböző szubsztituensek milyen módon befolyásolják a molekula globális tulajdonságait. Az egyenletekben indikátor változók használata is lehetséges, amelyek jelezhetik pl. egyes funkciós csoportok jelenlétét/hiányát, de alkalmazhatunk molekuláris ujjlenyomatokat is. A QSAR egyenletek többféle statisztikai módszer alapján állíthatók elő, pl. a legelterjedtebben alkalmazott többváltozós regresszió analízissel [19]. A klasszikus QSAR módszerek és a dolgozatban bemutatott konkrét modellek alapját képező QSAR és QSPR eljárások elvi alapjainak részletes bemutatásával a 3. fejezet foglalkozik. 3D QSAR A dolgozat gyakorlati részében nem alkalmaztuk a 3D QSAR módszereit, ezért ezekről csak egy vázlatos összefoglalás következik: A klasszikus QSAR módszerei gyakran csak molekulák homológ soraira alkalmazhatóak, a különböző lead molekulák köré csoportosuló származékok közös modellezésénél nehézségek adódhatnak (a dolgozatban bemutatott vizsgálatok a klasszikus QSAR elvén alapulnak, de igyekeztünk ezt a hátrányos tulajdonságot 12

13 kiküszöbölni a modellezés során). A 3D QSAR modellek a ligandumok biológiai hatását a molekulák 3D térben számolt tulajdonságaikkal hozzák összefüggésbe. Az egyik leggyakrabban használt módszer a CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis, összehasonlító molekulamező analízis) [20]. A CoMFA alapgondolata az, hogy az intermolekuláris kölcsönhatási energia a ligandum és a receptor között összefüggésben van a sztérikus, elektrosztatikus, hidrogén kötő és hidrofób molekulamezőkkel. Ezeket a kölcsönhatási energiákat számítják ki a ligandum és az ú. n. hipotetikus próba atomok között, amelyek bizonyos számú rácspontokban helyezkednek el. A eredmények egy mátrixba rendezhetők, amelynek minden sora egy molekulának, minden oszlopa egy bizonyos rácspontban számolt kölcsönhatási energiának felel meg, egy további oszlop pedig a biológiai aktivitás adatokat tartalmazza. Ily módon általában több ezer molekuláris leíró keletkezik, ez a szám sokszorosan meghaladja a molekulák számát, azaz a probléma alulhatározott (underdetermined). Az adatok többváltozós regresszió analízissel történő elemzése ezért elvileg helytelen lenne. A részleges legkisebb négyzetek módszere (PLS, Partial Least Squares) áthidalja ezt a problémát (a PLS elvének bemutatására a 3. fejezetben kerül sor). A CoMFA eljárás sematikus bemutatása a 3. ábrán látható. 3. ábra A CoMFA módszer vázlata [10] 13

14 A CoMFA modellekből származtatott és validált QSAR egyenleteket azután új molekulák biológiai hatásának predikciójára lehet használni. A CoMFA modellek grafikusan is ábrázolhatóak, mint koefficiens kontúr térképek, ami segíthet új molekulák tervezésében. A legnagyobb nehézség a CoMFA és vele rokon módszerek alkalmazásában a bioaktív konformerek megtalálása és a molekulák megfelelő helyzetben való elhelyezése (szuperimpozíció) a rácsban. Ezt a problémát kiküszöbölik a közelmúltban kifejlesztett eljárások, mint pl. a WHIM [21], EVA [22], COMMA (Comparative Molecular Moment Analysis) [23]. Ezeknél a módszereknél a 3D leírók függetlenek a molekulák orientációjától és nem igényelnek szuperimpozíciót sem. Igaz azonban, hogy a leírók igen érzékenyek a molekulák konformáció-változásaira, és a bioaktív konformerek megtalálása még mindig nagy nehézséget okoz. További hátránya ezeknek az új módszereknek a CoMFA-val szemben a modellek nehéz interpretálhatósága, mivel a 3D grafikus megjelenítés itt jelen pillanatban még nem lehetséges. 14

15 3. QSPR ÉS QSAR MODELLEK OPTIMALIZÁLÁSA Ebben a fejezetben bemutatom azokat az eszközöket és számítási módszereket, amelyeket különböző QSPR/QSAR modellek előállításához kell, illetve lehet használni. Az optimalizálás során az első lépés egy megfelelő adatbázis létrehozása, amely tartalmazza a molekulák szerkezeti képleteit és annak a paraméternek a kísérletesen meghatározott értékeit, amelyre szeretnénk, hogy becsülni tudjon a modell. A következő lépés a molekuláris leírók kiszámítása, ezt valamilyen szoftver segítségével valósítjuk meg. Ezután következik a modell optimalizálás, amelynek legfontosabb mozzanata a leírók válogatása különböző algoritmusok felhasználásával. Végül a kapott legjobb modell validálása következik, amikor megvizsgáljuk, hogy modellünk prediktív ereje megfelelő-e. A 4. ábrán a modellezés folyamatábrája látható. A legjobb modell kiválasztása után (az új molekulák 3D szerkezetének és a modellben szereplő leíróinak kiszámítását követően, az ábrán erre utal a szaggatott vonal) következhet a virtuális szűrés, amikor is becslést végzünk az új molekulák vizsgált paraméterére. Forrás (irodalom, saját adatok) Mért adat Képlet sdf fájl Adatbázis (ISISBase) sdf fájl 3D szerkezet kiszámítása (COCORD, MOE) Leírók számítása (Dragon, MOE, 3DET) sdf/drg fájl Adatbázis (ISISBase) Modellek: MLR PLS A Kereskedelmi adatbázisok Virtuális szintézis Ismert gyógyszerek Új molekulák adatbázisa (ISISBase) Validálás Virtuális szűrés Kiválasztott modell 4. ábra A modellezés folyamatábrája 15

16 3.1 Az adatbázis összeállítása Az első és talán a legfontosabb lépés a modellkészítés során a megfelelő adatbázis összeállítása. Az adatbázisnak minimálisan tartalmaznia kell a molekulák szerkezetét és a becsülendő paraméter kísérleti értékeit. A nyers kísérleti adatokat először általában valamilyen matematikai transzformációnak vetjük alá, ez leggyakrabban logaritmálást jelent (pl. IC50 -> pic50 átalakítás). Ez az átalakítás a modellezés szempontjából fontos, mert a transzformáció eredményeképp adataink eloszlása általában jobban fog hasonlítani a normális eloszláshoz (ennek magyarázatát ld. alább). A logaritmálás normalizáló hatását az 5. ábra mutatja be: P adatok normalitás vizsgálata logp adatok normalitás vizsgálata Gyakoriság Gyakoriság E E E E E E E E E E P logp ormal Probability Plot ormal Probability Plot P adatok normalitás vizsgálata logp adatok normalitás vizsgálata Expected ormal Value Expected ormal Value E6 0 5E6 1E7 1.5E7 2E7 2.5E7 3E7 3.5E7 4E Értékek (P) 5. ábra A logaritmálás hatása az adatok normalitására Értékek (logp) Az ábra felső részén a megoszlási hányados (P) és a logp értékek eloszlásának összehasonlítása látszik, hisztogramok segítségével. Az adatok a később bemutatásra kerülő logp becslő modell adatbázisából származnak (n=625). A normalitás ellenőrzésére az ú. n. normal probability plot rajz (ábra alsó része) is igen alkalmas, amit könnyen elkészíthetünk a Statistica programmal [24]. Az adatok akkor tekinthetők 16

17 normális eloszlásúnak, ha az átló mentén helyezkednek el. Az ábrán világosan látszik, hogy esetünkben a logaritmikus transzformáció valóban normalizáló hatású. A kísérleti értékek származhatnak az irodalomból és lehetnek saját mérések eredményei is. A 4. fejezetben bemutatásra kerülő modellek készítésekor az adatbázisok összeállítására az ISISBase [25] nevű programot használtam, amely kémiai adatbázisok készítésére és kezelésére kifejlesztett szoftver. A program alkalmas a kémiai képletek bevitelére és számos fájlformátumban való tárolásukra is, ezenkívül rendelkezik egy rugalmas keresési opcióval is, amely lehetővé tesz pl. szubstruktúra kereséseket is. A molekulák szerkezeti képletének bevitelére az ISISDraw [26] program szolgál, amely szintén az MDL által kiadott programcsomagban található, a két program igen felhasználóbarát módon kommunikál egymással. Annak érdekében, hogy a majdani modell megfelelő stabilitású, konzisztens és virtuális szűrésre alkalmas legyen, adatbázisunknak számos kritériumnak kell megfelelnie: - Az adatbázisban viszonylag sok adatnak kell szerepelnie. A QSAR/QSPR módszerek alapvetően statisztikai eljárások, ezért azok optimális működéséhez biztosítani kell a megfelelő mintaszámot. Ez a gyakorlatban azt jelenti, hogy legalább adatra van szükség a modellezéshez, és minél több adatunk van, annál jobb. - Az adatoknak természetesen megbízhatónak kell lenniük, lehetőség szerint csak a legkisebb hibával terhelt adatokat célszerű felhasználni. Előnyös, ha az adatbázisban szereplő adatok egy laboratóriumból származnak, de irodalmi adatbázis esetében ez sokszor nem biztosítható. Különösen fontos ez a QSAR esetében, mert a biológiai adatok eleve nagy hibával (akár 50 százalék is lehet) terheltek. A kapott modellek becslési hibája elvileg soha nem lehet alacsonyabb a mérési adatok hibájánál. - Az adatbázisnak kémiailag diverz struktúrákat, azaz változatos molekulákat kell tartalmaznia, annak érdekében, hogy a kapott modell generalizáló-képessége jó legyen. Ez azt jelenti, hogy nem célszerű egy-egy homológ sor alapján modelleket készíteni, mert akkor az új alapvázzal rendelkező molekulák paraméter becslése megbízhatatlan lesz, tehát a modell nem lesz alkalmas virtuális szűrésre. - Az adatoknak hasonló okokból a lehető legtágabb intervallumot kell lefednie, azaz pl. QSAR esetében szükségünk van nagyon aktív és hatástalan (= alacsony aktivitású) molekulákra is. 17

18 - Előnyös, ha az adataink normális eloszlásúak, de legalábbis megközelítik a normális eloszlást, mert az említett statisztikai eljárások ilyen típusú adatok elemzésére lettek kifejlesztve. Az adataink normalitásának ellenőrzésére használhatjuk pl. a Shapiro-Wilk`s W-tesztet [27]. Amennyiben 3D leírókat is fel szeretnénk használni a modellezés során, először ki kell számolnunk a molekulák 3D szerkezetét (2D->3D konverzió). agyon fontos, hogy valamilyen gyors módszert válasszunk, hiszen ellenkező esetben a virtuális szűrés sebessége nagy mértékben csökkenne. A COCORD [28, 29] és a MOE [30] programok megfelelő gyorsasággal és kielégítő pontossággal végzik el az átalakítást, mert viszonylag egyszerű számításokat (a COCORD kísérletes adatokból eredeztetett szabályrendszert használ, a MOE energia minimalizálást végez) alkalmaznak. Meg kell említenem, hogy az ilyen módon előállított három dimenziós szerkezetek nem azonosak valamilyen kitüntetett konformerrel, pl. a bioaktív konformerrel, ami hátránya ezeknek a módszereknek. Azonban a COCORD által alkalmazott egységes szabályrendszer biztosítja, hogy az átalakított molekulák szerkezete közötti hasonlóságok a három dimenziós szerkezetek konformációja közötti hasonlóságban is megjelenjenek [31]. Az ilyen módon átalakított képleteket ezután visszaolvassuk az adatbázisba, és következhet a leírók kiszámítása. Az adatbázis és a fent említett programok, valamint a leíró számító programok között az adatokat sdf (structure definition file) formátumban közvetítjük. 3.2 A leírók (deszkriptorok) kiszámítása Mint a bevezetőben említettem, a leírók azok a molekulaszerkezetből számolt molekuláris paraméterek, amelyekkel az egyes molekulákat reprezentáljuk a különböző QSPR/QSAR modellekben. A modellezés tulajdonképpen a leírók mátrixa és a modellezett tulajdonság vektora közötti függvényszerű kapcsolat feltárása. A predikció során pedig becslést végzünk új molekulák kérdéses tulajdonságára a kapott modell és az új molekulák leíróinak ismeretében. A leírókkal szemben alapkövetelmény, hogy jól definiáltak legyenek és számításuk reprodukálható legyen. 18

19 A leírókat nagyon sokféle szempont szerint lehet osztályozni, leginkább a dimenziószám szerinti csoportosítás terjedt el. Léteznek 0D, 1D, 2D és 3D leírók, a dimenziószám itt arra utal, hogy a leíró kiszámításához milyen szintű információra van szükség a molekula szerkezetéről. Pl. egy 3D leíró kiszámításához a molekula három dimenziós szerkezete szolgál alapul. Az 1. táblázat a leírók ilyen módon történő csoportosítását szemlélteti, a droperidol példáján bemutatva. Leíró típusa Molekula reprezentációja Képlet 0D Összegképlet C22H22F3O2 1D 2D SMILES-kód Konstitúciós képlet Fc1ccc(cc1)C(=O)CCC1CC- -C(=CC1)1c2c(cccc2)C1=O O O F Leíró példa itrogén atomok száma Oxocsoportok száma Wiener index 3D 3D szerkezet Térfogat 1. táblázat A leírók csoportosítása dimenziószám szerint A három dimenziós leírók alkalmazásakor fokozott körültekintéssel kell eljárnunk, mivel azok értéke jelentősen függ a felhasznált három dimenziós szerkezettől. Modellező programunk ugyanis csak egyetlen optimalizált konformációt tud felhasználni, amelynek a térbeli elrendeződését - tapasztalataink szerint - nagy mértékben befolyásolja a kiinduláskor berajzolt 2 dimenziós szerkezet orientációja. Kimutatható, hogy ugyanazon molekula esetében a különbözőféleképpen berajzolt 19

20 kiindulási képletek olyan 3D leíró-tereket adnak eredményül, amelyek akár egy nagyságrendnyi eltérést is eredményezhetnek a becsült paraméterben. Ezen problémán felül a 3D szerkezetek kiszámítása igen időigényes is, ezért virtuális szűrésre szánt modell esetében célszerű csak 0, 1, 2D leírókat felhasználni (ettől a javaslattól a logs modellezésekor eltekintettünk, mert tudományos közlésre a lehető legjobban becslő modellt szerettük volna előállítani). A szoftverpiacon számos, leírók számítására kifejlesztett program található meg. Modellezési munkáim során leginkább az alábbi három programmal végeztem a leírók számítását: Dragon [32], MOE [30] és 3DET [33]. A leírókat három program felépítése alapján mutatom be részletesebben. Dragon A program ingyenesen letölthető az internetről, a program szerzői szívesen meghallgatják és teljesítik a felhasználók igényeit, kéréseit a programmal kapcsolatban. Az internetes verzión kívül létezik kereskedelmi változat is, ezt néhány kiegészítő funkcióval egészítették ki. Összesen 1612 leírót tudunk kiszámítani a Dragon 4.1-es verziójával, ezeket a program 20 nagyobb csoportba sorolja. A 2. táblázatban bemutatom a legfontosabb leírókat. A 0D, 1D, 2D és 3D leíró csoportokon kívül a program egy Egyéb csoportot is tartalmaz (ld. 2. táblázat). Az interneten elérhető a Dragon által kiszámolt molekuláris leírók részletesebb listája [34]. A program sokféle bemeneti fájlt elfogad, mi az sdf fájlformátumot használjuk általában. Ennek előnye, hogy gyakorlatilag korlátlan számú molekula adatait tartalmazhatja, és az ISISBase adatbázisból nagyon egyszerűen kiíratható. A számítások végeredményeként egy drg kiterjesztésű fájlt kapunk, amit könnyen fel tudunk dolgozni a modellező szoftverben. 20

21 Dimenziószám Leíró csoport Példák Hivatkozás konstitúciós (a molekulatömeg, átlagos molekulatömeg, különböző atom- és kötéstípusok 0D konnektivitástól és a előfordulási száma a molekulában, konformációtól független) különböző atomi tulajdonságok (pl. atomi [35] leírók (48 db.) polarizálhatóság) összege/átlaga a molekulában, stb. 1D 2D 3D Egyéb funkciós csoportok (121 db.) Ghose-Crippen féle ( atomcentered ) fragmensek (120 db.) topológiai leírók (119 db.) különböző funkciós csoportok (pl. - COOH, -H 2 stb.) előfordulási száma a molekulában a Ghose-Crippen által definiált 120 atom-centered fragmens előfordulási száma a molekulában a molekula gráfjából számolt indexek (pl. Zagreb index, Wiener index, stb.) [36] [37, 38, 39] molekuláris walk and path count leírók (47 db.) a molekula gráfjából számolt indexek [40] BCUT leírók (64 db.) mátrix számításokból származtatott leírók [41] Galvez topológiai töltés indexek (21 db.) topológiai töltés index [42] 2D autokorrelációk (96 db.) a molekula gráfjából számolt leírók [43] konnektivitási indexek (33 a molekuláris gráf éleinek fokából db.) számolt leírók [44] információs indexek (47 db.) a molekula információtartalmából számolt leírók [45, 46, 47, 48] edge adjacency indexek az edge adjacency mátrixból (107 db.) származtatott leírók [45, 49] sajátérték alapú leírók (44 a molekuláris gráfból származtatott db.) mátrixok sajátértékeiből számolt leírók [50, 51] Randic-féle molekuláris profilok (41 db). Randic-féle molekuláris profil [52] geometriai leírók (74 db.) RDF leírók (150 db.) különböző, konformációfüggő leírók (pl. a geometriai távolságok összege bizonyos atomtípusok között) különböző interatomi távolságokon alapuló radiális bázisfüggvényekkel számolt leírók 3D-MoRSE leírók (160 db.) Gasteiger-féle 3D leírók [55] WHIM leírók (99 db.) Az atomok koordinátáinak kovariancia mátrixának 3 főkomponenséből számolt leírók [56] GETAWAY leírók (197 db.) (regressziós modellekkel számolt) molekuláris tulajdonságok (10 db.) töltés leírók (14 db.) 2. táblázat A Dragon által számolt leírók [53] [54] Todeschini-féle 3D leírók [57] molekuláris refrakció, poláris felület (PSA, Polar Surface Area), Moriguchi módszere számolt logp a molekula töltésviszonyait jellemző leírók [36, 58, 59] [60] 21

22 MOE A MOE (Molecular Operating Environment) programot a Chemical Computing Group fejlesztette ki, és számos molekulamodellezéssel kapcsolatos opció található meg benne. Így többek között a bevitt szerkezetekhez hidrogéneket adhatunk, majd elvégezhetjük a 2D->3D átalakítást, és egy QSAR modul is be van építve, stb. A QSAR modulban van lehetőség a leírók kiszámítására. A program összesen 191 leíró kiszámítására alkalmas, amelyeket a szerzők három nagy csoportba soroltak be: 2D, i3d (internal 3D), x3d (external 3D) leírók. A 2D leírók kiszámításához csak az atomokra és kapcsolódási sorrendjükre vonatkozó információ szükséges, a 3D leírók számításához szükség van továbbá az atomok 3 dimenziós koordinátáira is. A 2D leírókat az alábbi alcsoportokra osztja a program: fizikai tulajdonságok, atom- és kötésszámok, Kier-Hall konnektivitási indexek [44], mátrix számításokból származtatott leírók, farmakofór atomtípus leírók, részleges töltés leírók. A 3D leírókat pedig a következő csoportokra osztja: potenciális energia leírók, térfogati és felszíni leírók, konformáció-függő töltés leírók. A MOE szintén alkalmas az sdf fájl fogadására, amibe a kiszámolt leírók beilleszthetők. 3DET A későbbiekben bemutatásra kerülő 3DET4W [61] DOS környezetben futtatható változatát, a 3DET [33] című programot Kövesdi István (EGIS) fejlesztette elsősorban A (Artificial eural etwork, Mesterséges idegháló) alapú számítások elvégzésére, de ezen kívül leírók generálására is alkalmas. A szabadalmi védettség [62] alatt álló programot a szerző használatra rendelkezésünkre bocsátotta, munkám során a felmerült kérdéseket és a program fejlesztésével kapcsolatos javaslataimat rendszeresen megbeszéltük. A program által számolható leírókat a 3. táblázat foglalja össze. A 3DET input fájlja szintén sdf formátumú, eredményfájlként azonban rögtön a modellezésre használt 3DET4W program [61] által használt xyd (x, y data file; az x itt a leíró-mátrixra az y pedig a kísérleti adatok vektorára utal) formátumot szolgáltatja. 22

23 Leíró Leírószám Hivatkozás Molekulatömeg 1 Molekula térfogata, oldószer által kiterjesztett térfogat 2 [63, 64, 65] Molekula felszíne, oldószer által elérhető felszín, oldószer által kiterjesztett felszín 3 [66, 63, 64] Globularitás 1 [67] WHIM leírók 7x7=49 [68] Polarizálhatóság 1 [69, 70] Dipólus momentum 1 [71] Hildebrand oldhatósági paraméter 1 [72] Telítetlenségi szám 1 Forgatható kötések szabadsági fokainak száma 1 [73] Wiener index 1 [74] Randic index 1 [75] HDSA1, HDSA2, HASA1, HASA2 hidrogén kötés leírók 4 [76] Gravitációs index 1 [76] Topológiai elektronikus index 1 [76] Q, QO, QO, QTOT Bodor töltés leírók 4 [77] ESP (Elektrosztatikus Potenciál) minimum, maximum és átlagos értéke a molekula van der Waals felszínén 3 [69] MLP (Molekuláris Lipofilitási Potenciál) minimum, maximum és átlagos értéke a molekula van der Waals 3 [78] felszínén Az egyes atomtípusok előfordulási száma a molekulában 38 [70] Elektrosztatikus hidrogén kötési bázicitás és aciditás 4 [79] maximuma (EBA, EAC) és összege (ETBA, ETAC) HOMO energia, LUMO energia (AM1) 2 [79] Broto-Moreau féle hidrofóbicitás 1 [80] Az atomi -tömeg, -helyzet, -elektronegativitás, -helyi töltés, -polarizálhatóság, -elektrotopológiai index, -pí funkcionalitás auto-korrelációs függvényei 1-től 7 Angstromig 6 lépésben Az atomi -tömeg, -helyzet, -elektronegativitás, -helyi töltés, -polarizálhatóság, -elektrotopológiai index, -pí funkcionalitás és valamely atomtípus pár-korrelációs függvényei 1-től 7 Angstromig 6 lépésben Bármely atomtípus pár- és auto-korrelációs függvényei a 2D vagy 3D térben 1-től 7 Angstromig 6 lépésben 3. táblázat A 3DET leírói [81] 7x(6)=42 [80] (7x38)x(6)=1596 [80] 741x(6)=4446 [80] 3.3 Modellépítés Munkám során a modellezési feladatokat az AutoQSAR [82], a már említett 3DET4W [61] és a Statistica [24] programokkal valósítottam meg. Az AutoQSAR program a 3DET4W elődjének tekinthető és működési elvük lényegében megegyezik, ezért csak az utóbbit ismertetem. A modellépítés vázlata a 6. ábrán látható. A 3DET4W program jelenleg még csak néhány egyszerű leíró (pl. molekulatömeg, különböző atomtípusok száma, stb.) kiszámítására alkalmas, ezért a leírókat az előző 23

24 fejezetben ismertetett programokkal számítjuk ki, a közeljövőben azonban lehetőség lesz a programon belüli leíró számításra is. A leíró számoló programokkal előállított eredményfájlok beolvasása után azokat át kell alakítani a 3DET4W által használt xyd formátumba. Az xyd fájl elkészítése és megnyitása után a leírók előválogatása következik, majd az xyd fájl felosztása egy tanuló és egy ellenőrző készletre. A modell elkészítése során kizárólag a tanuló készletben található molekulákat használjuk fel. Kiszámolt leírókat és adatokat tartalmazó fájl (sdf/drg) 3DET4W Átalakítás xyd fájlformátumba xyd fájl megnyitása Modell optimalizálás Leírók előválogatása xyd fájl felosztása Leírók válogatása (GA, SDS) Tanuló készlet Ellenőrző készlet modellek A legjobb modell kiválasztása legjobb modell Validálás Modell elfogadása nem igen Jó a modell? 6. ábra A modell optimalizálás folyamatábrája Az ellenőrző készletben lévő molekulákat csak a folyamat végén, a kiválasztott legjobb modell végső ellenőrzésére szabad felhasználni, és ezeknek a molekuláknak a becslési 24

25 statisztikájával fogjuk jellemezni a modellünket. Általában molekuláink 1/3-át, 1/4-ét különítjük el az ellenőrző készletbe ú. n. külső validáció céljára. Ezután a tanuló készlet molekuláit felhasználva (a tanuló készletet még tovább osztva belső tanuló készletre és belső validációs készletekre) optimalizáljuk a modellt, azaz kiválasztjuk a legjobb modellt (amely a legjobban becsüli az adott illesztésben nem szereplő molekulákat) eredményező leíró-halmazt GA (Genetic Algorithm, Genetikus Algoritmus) vagy SDS (Sequential Descriptor Selection, Szekvenciális Leíró Válogatás) módszerrel. A GA vagy a SDS futása alatt lehetőségünk van a legjobb modelleket egy ú. n. modell bankba gyűjteni, majd a modell bankból kiválaszthatjuk a legjobb modellt egy validációs ciklus (BV, Bootstrap Validaton) alkalmazásával. Végül kiszámítjuk az ellenőrző készlet becslési statisztikáit. Az ú.n. bináris QSAR (binary QSAR) lényegét tekintve nagyon hasonló a klasszikus QSAR-hez, a legfontosabb különbség köztük az, hogy a bináris QSAR esetében a becsülendő paraméter nem folytonos, hanem bináris jellegű. Valójában tehát osztályozásról van szó. A bináris változók olyan speciális diszkrét változók, amelyek csak két értéket vehetnek fel, a 0 és az 1 értékeket [83]. Ilyen változó lehet például az anyag biológiai hatásosságát jellemző változó. Ez a változó tehát két értéket vehet fel, amit így kódolunk az elemzés számára, hogy: az adott vizsgálatban 0 = hatástalan, 1 = hatásos. A hatástalan ill. a hatásos molekulákat egy előre definiált aktivitási küszöb-érték (treshold) alapján lehet szétválasztani (pl. 0, ha az IC50 > 10 µm; egyébként 1). A két csoportot célszerű úgy kialakítani, hogy az elemszámuk közel azonos legyen, de legalábbis nagyságrendileg egyezzenek. Erre statisztikai megfontolások miatt van szükség. A dolgozatban bemutatott bináris QSAR modellek számításait részben a 3DET4W programmal, részben a Statistica program lineáris diszkriminancia analízis (LDA) moduljával végeztem. Az LDA módszer ismertetése a fejezetben található. 25

26 3.3.1 Számítási (illesztési) módszerek A 3DET4W-ben háromféle illesztési módszert alkalmazhatunk, ezek: MLR (Multiple Linear Regression analysis, Többváltozós lineáris regresszió analízis), PLS (Partial Least Squares method, Részleges legkisebb négyzetek módszere), A (Artificial eural etwork, Mesterséges idegháló). Az MLR, mivel csak lineáris összefüggések felismerésére alkalmas, a leggyorsabb, de egyben a legkevésbé pontos eljárás. A PLS-sel az MLR-nél valamivel lassabban állíthatunk elő modelleket, amelyek várhatóan jobbak lesznek az MLR-nél. A három módszer közül az A a legpontosabb általában (mert a neurális hálók kiválóan alkalmasak nem-lineáris függvények illesztésére is), viszont az általunk használt 3DET4W [61] programban az A a leglassabb algoritmus. A következőkben e három módszer ismertetése következik MLR [19] Kétváltozós lineáris regresszió Két változó közötti kapcsolatot leíró lineáris egyenlet alakja: y = a + bx, (3) ahol y a függő változó (a becsült paraméter), x a független változó (egy leíró), a az y tengely metszete, b az egyenlet meredeksége (az α szög tangense) (ld. 7. ábra). 26

27 y y = a+bx α a x 7. ábra A lineáris egyenlet értelmezése Az egyenletet az y változó x változóra vonatkozó regressziós egyenletének nevezzük. A pontokra legjobban illeszkedő egyenes megkeresésekor azt az egyenest kell kiválasztani a számos egyenes közül, amelyek esetében a megfigyelési adatoknak a regressziós egyenestől mért átlagos eltérése a legkisebb (Y Di a reziduum) (ld. 8. ábra) y (x n,y n ) (x 2,y 2 ) Y Dn Y D2 Y D1 (x 1,y 1 ) x 8. ábra Mérési pontok eltérése a regressziós egyenestől Az egyenes megkeresésére a négyzetes átlagot használjuk, és magát a görbeillesztési eljárást leggyakrabban a legkisebb négyzetek módszerével végezzük. Legyen a keresett regressziós függvény alakja (a ^ jelenti az egyenlet által becsült y értéket) ŷ = a +bx. (4) A feladat úgy meghatározni az egyenlet paramétereit (a, b), hogy az Y Di értékek eltérésének négyzetösszege minimális legyen: 27

28 Y D = Σ (y i - ŷ) 2 => minimális. (5) Az egyenletbe a regressziós függvény általános alakját behelyettesítve: Y D = Σ (y i a + bx i ) 2 => minimális (6) kifejezést kapjuk. A feltételeknek eleget tevő a és b értéket szélsőérték-számítással kapjuk meg: b = i= 1 ( x x)( y i i= 1 ( x x) i i y) 2 (7) és a = y bx (8) A b paraméter jelentése: az X független változó egységnyi változása milyen nagyságú változást okoz az Y függő változóban. Az a értéke a tengelymetszet magasságát adja. Többváltozós regressziószámítás A kétváltozós regresszió tulajdonságai egyszerűen általánosíthatók három vagy több változó egyidejű vizsgálatára is. Ilyen esetben az egyenlet alakja: ahol X i : különböző regressziós változók, a i : regressziós együtthatók. y = a 0 + a 1 X 1 + a 2 X a X, (9) 28

29 A független változók között nemcsak folytonos, hanem nominális (dummy változók) változók is megengedettek. A többváltozós vizsgálatok, vagyis több változó bevonása értékesebb, komplexebb vizsgálat, mivel a nyerhető információ is sokoldalúbb. Azonban azt is szem előtt kell tartani, hogy több változó esetén az eredmény nehezebben értelmezhető. A többváltozós lineáris regresszió analízisnél az egyik legfontosabb szempont, hogy az X i változók (azaz a leírók) függetlenek legyenek egymástól, vagyis a változók között ne legyen kapcsolat. A problémát multikollinearitásnak nevezzük. Multikollinearitás fellépésekor ugyanis az illesztés bizonytalan, megbízhatatlan lesz. A multikollinearitás vizsgálatára a változók korrelációs mátrixának determinánsa is felhasználható PCA A multikollinearitás problémájának kiküszöbölésére gyakran alkalmazott módszer a PCA (Principal Component Analysis, Főkomponens-elemzés) [84]. A főkomponens-elemzés célja az X paramétereket (azaz a leírókat) annyi kisszámú, közös (általános) faktor segítségével kifejezni, amennyire csak lehetséges. A modellkészítés során az egymással többé-kevésbé korrelált leírókat lehetőség van csak néhány, lehetőleg egymással korrelálatlan változóval helyettesíteni. Tehát a kiindulási X mátrix leíróinak és a vizsgált tulajdonság közötti összefüggések vizsgálatának megkönnyítésére a leírókat egy olyan transzformációnak vetjük alá, amely új, korrelálatlan változókat eredményez. Ezek az új változók a főkomponensek, amelyek az eredeti változók lineáris kombinációi, és úgy vannak sorba rendezve, hogy elöl állnak azok, amelyek az eredeti változók együttes varianciájának legnagyobb részéért felelősek. A leírt transzformáció ortogonális, azaz a kapott főkomponensek korrelálatlanok lesznek. A főkomponens-elemzés alapgondolata az, hogy az eredeti X mátrixot két mátrix szorzatával adjuk meg. Bizonyos követelményeknek megfelelve (ortogonalitás, normálás) a felbontás egyértelműen eredményezi a főkomponens-együttható (loading)(p) és a főkomponens (score)(t) mátrixokat. 29

30 X = TP T (10) Más szavakkal, az X mátrix vektorait leképezzük (vetítjük) egy kisebb, a dimenziós altérbe a P T vetítési mátrix (loading) segítségével, és ez a leképezés megadja az objektumok koordinátáit ebben a T hipersíkban (score). Tehát főkomponens-elemzésnek két előnyös tulajdonsága van a modellező szempontjából. Az egyik, hogy alkalmazása után megszűnnek a multikollinearitás által okozott problémák, a másik pedig, hogy használatával a változók, leírók száma jelentősen csökkenthető. A sok-sok leíró által hordozott információ néhány új változóba sűrűsödik. agyon fontos ugyanis, hogy a kapott modellünk a lehető legkevesebb változót használja fel a becslésre, mert az csak ily módon lesz stabil, megbízható. A főkomponens-elemzés hátránya, hogy általában a kapott főkomponensek absztrakt változók, és nehéz hozzájuk valódi fizikai tartalmat rendelni, ezért a kapott eredmények nehezen értelmezhetőek. Munkám során a főkomponens-elemzést leginkább gyors előtesztelésekre szoktam használni. Ilyenkor elvégzem a főkomponensek kiszámítását, és mivel így kevés változóm lesz, ami a modell optimalizálást jelentősen gyorsítja kiszámolok egy gyors modellt. Ezt az eljárást az irodalomban főkomponens-regressziónak (PCR, Principal Component Regression) nevezik. A kapott eredmény képet adhat arról, hogy az adott modell hozzávetőlegesen milyen statisztikai paraméterekkel fog rendelkezni (a PCA-val előállított gyors modell általában persze gyengébb, mint a később kiszámított optimális modell) PLS A PLS (Partial Least Squares method, Részleges Legkisebb égyzetek módszere) [85] széles körben alkalmazott technika a többváltozós adatanalízisben, különösen akkor használatos, ha felmerül a multikollinearitás problémája. A PLS technika az MLR-nél megbízhatóbban használható sok, zajjal terhelt, egymással nagymértékben korreláló és még esetlegesen hiányos változó esetén is. A PLS alkalmazásának célja, hogy a leírók X mátrixát összefüggésbe hozzuk a becsülendő paraméter(ek) vektorával vagy mátrixával szintén egy lineáris transzformáció 30

31 felhasználásával (újabban megjelentek a nem-lineáris PLS alkalmazások is [86]). A lineáris PLS regresszió segítségével lehetőségünk van néhány új, ú. n. rejtett változó kiszámítására. Ezek a rejtett változók korrelálatlanok, tehát ortogonálisak. A PCA-nál alkalmazott számítási módszerrel szemben itt az X adatmátrixot nem kettő, hanem három mátrix szorzatára bontjuk, a PLS esetében az y vektort vagy az Y mátrixot is figyelembe vesszük. A két adatmátrix azon nem megfigyelt (rejtett, látens) változóit keressük, amelyek között a korreláció a lehető legnagyobb. A két adatmátrix közötti kapcsolatot rejtett változóikon keresztül határozzuk meg, feltételezve, hogy közöttük lineáris kapcsolat áll fenn. A PLS-t a PCR-hez hasonlítva elmondhatjuk, hogy a PLS általában jobb eredményeket ad (kisebb hibát és jobb értelmezhetőséget is), mert a függő változó(k)ban meglévő információt is fölhasználjuk a becslés során. Ha a függő változó nagyon pontatlan, a PLS komponensek nehezen értelmezhetők lesznek. Mint azt már korábban említettem, a PLS modellek az MLR modelleknél általában megbízhatóbbak és stabilabbak, a modell optimalizálás sebessége viszont csekély mértékben lassul a PLS esetében az MLR-hez képest A Mesterséges intelligencia kutatások eredményeként a kutatók létrehoztak egy tanulási képességgel rendelkező új modellt, az Artifical eural etwork-öt (A; mesterséges neurális háló módszer) [87]. Elnevezése onnan származik, hogy rendszerének felépítése az emberi agy tevékenységét próbálja meg szimulálni. Az agy neuronjai az A-ben az ún. egységeknek (units) felelnek meg. Az egységek között összeköttetések (links) vannak, ezek biztosítják az egységek közötti kapcsolatot. Minden összeköttetésnek van egy numerikus súlya (weight, w), amelynek a számértéke arányos a link által összekötött két egység közötti kapcsolat erősségével. A tanulási folyamat tulajdonképpen a súlyok változtatásán keresztül valósul meg. Minden egységnek van egy kimenő értéke (output) és vannak bemenő értékei (inputs), ezek is numerikus adatok. A bemenő értékek mennyisége, azaz hogy hány darab inputja van egy egységnek, az A struktúrájából következik. Az egységeknek három alapvető funkciója van: 31