DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS FRANK KRISZTIÁN

Átírás

1 DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS FRANK KRISZTIÁN KAPOSVÁR 2018

2 KAPOSVÁRI EGYETEM AGRÁR- ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI KAR Állattenyésztés-technológia és Menedzsment Tanszék A doktori iskola vezetője: PROF. DR. KOVÁCS MELINDA az MTA levelező tagja Témavezetők: PROF. DR. HORN PÉTER az MTA rendes tagja PROF. DR. OROSZ LÁSZLÓ az MTA rendes tagja APAI LESZÁRMAZÁSI VONALAK VIZSGÁLATA KÁRPÁT- MEDENCEI GÍMSZARVAS POPULÁCIÓKBAN Készítette: FRANK KRISZTIÁN KAPOSVÁR 2018

3 TARTALOMJEGYZÉK 1. Rövidítések jegyzéke Bevezetés Irodalmi áttekintés A gímszarvas és jelentősége A gímszarvas mitokondriális filogenetikája Gímszarvas populációgenetikai vizsgálatok Gímszarvas genomikai vizsgálatok Mikroszatellita markerek fejlesztése A disszertáció célkitűzései Anyag és módszer Mintavétel és DNS izolálás Bioinformatikai mikroszatellita keresés Ivari kromoszómás STR markerek fejlesztése Populációgenetikai vizsgálatok STR markerekkel Mitokondriális kontroll régió vizsgálata Eredmények és megvitatásuk Bioinformatikai mikroszatellita keresés Ivari kromoszómás STR markerek Ivari kromoszómás vonalak Autoszómás STR markerek Mitokondriális DNS Következtetések és javaslatok Új tudományos eredmények Összefoglalás Summary Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék A disszertáció témaköréből megjelent publikációk A disszertáció témakörén kívüli publikációk Rövid szakmai életrajz Mellékletek

4 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AIC AFLP AMOVA BIC bp cdns cm D DNS dntp EDTA EST Fst, Φst Gbp I K kbp MCMC mrns mtdns NGS PCA PCR Akaike Information Criterion / Akaike-féle információs kritérium Amplified Fragment Length Polymorphism / Amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus Analysis of Molecular Variance / molekuláris varianciaanalízis Bayesian Information Criterion / Bayes-féle információs kritérium bázispár komplementer dezoxiribonukleinsav szál centimorgan Nei-féle haplotípus diverzitás dezoxiribonukleinsav deoxinukleotid-trifoszfát etilén-diamin-tetraecetsav Expressed Sequence Tag / kifejeződő szekvencia címke fixációs indexek gigabázispár Shannon-Weaver információs Index klaszter kilobázispár Markov chain Monte Carlo method / Markov láncú Monte Carlo módszer hírvivő (messenger) RNS mitokondriális DNS Next Generation Sequencing / új generációs szekvenálás Principal Component Analysis / főkomponens analízis Polymerase Chain Reaction / polimeráz láncreakció 2

5 PIC QTL RAPD RFLP SNP SSR STR trns π Polymorphism Information Content / polimorfizmus információ tartalom Quantitative Trait Locus / mennyiségi tulajdonság kialakításában szerepet játszó lókuszok Random Amplification of Polymorphic DNA / polimorfikus DNS véletlenszerű sokszorosítása Restriction Fragment Length Polymorphism / restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus Single Nucleotide Polymorphism / egypontos nukleotidpolimorfizmus Simple Sequence Repeat / egyszerű szekvencia ismétlődés Short Tandem Repeat / rövid tandem ismétlődés transzfer RNS nukleotid diverzitás 3

6 2. BEVEZETÉS A gímszarvas (Cervus elaphus), a magyarok legendás csodaszarvasa, az egyik legelterjedtebb és legismertebb szarvasféle, egyike a legkeresettebb és legértékesebb európai trófeás vadaknak. A magyarországi fauna kiemelkedő tagja, rekord méretű trófeái pedig széles körű érdeklődést keltenek, de ezen túlmenően is jelentős gazdasági, társadalmi és természeti haszonnal bír (Milner et al. 2006, Apollonio et al. 2010, Burbaitė & Csányi 2010). A faj nagy területen elterjedt Európában és Ázsia, valamint Észak-Afrika egyes részein. Elterjedési területének nagy részén gyakori és tömeges előfordulású, bár Közép- és Dél-Európában a populációk fokozódó feldarabolódása figyelhető meg. Egyes területekről pedig eltűnt a túlvadászat, az élőhelyek megszűnése, valamint a nem megfelelő gazdálkodás miatt. Jelenlegi elterjedését sok más európai állatfajhoz hasonlóan a korábbi klimatikus változások is alakították. Közép-Európában a legkorábbi csontleletek a pleisztocénből származnak; a leletek alapján i.e között gyakori volt itt a faj (Sommer et al. 2008, Sommer & Zachos 2009, Carden et al. 2012, Meiri et al. 2013, Stanton et al. 2016). A Kárpát-medence fontos csomópontot jelentett sok állat- illetve növényfaj eljegesedések utáni terjedési útvonalán (Hewitt 2004, Sommer et al. 2008, Sommer & Zachos 2009), ennek megfelelően a gímszarvas is újra benépesítette a területet, és nagy számban megtalálható itt ma is. A gímszarvas sokféle gazdasági, társadalmi és természeti haszonnal bír; jelentős a hobbivadászat, valamint a vadhús előállítás szempontjából is. A vadgazdálkodás és sport vadászat több munkahelyet biztosít, valamint turisztikai hasznot is jelent, látogatók számára szórakozási lehetőség szolgáltatásával. A gímszarvas európai populációinak módszeres genetikai kutatása jelentősen hozzájárulhat a természetvédelmi, valamint vadgazdálkodási ismeretek bővüléséhez. Fontos vadfaj lévén különböző népek mitológiájában és eredetmondáiban is feltűnik, a történelem során a teljes 4

7 elterjedési területén jelentős emberi hatások érték és jelenleg is érik állományait szelektív vadászat, állománygazdálkodás, áttelepítés és az élőhelyek átalakításának, feldarabolásának formájában (Mattioli et al. 2001, Hartl et al. 2003, Milner et al. 2006, Burbaitė & Csányi 2010, Haanes et al. 2010, Olivieri et al. 2014); célzott tenyésztése is megkezdődött az egész világon, hústermékek és agancs készítmények előállítására (Horn 2004, Apollonio et al. 2010, Sonkoly et al. 2013). Magyarországon a gímszarvas vadászatáról és vadaskerti gondozásáról már középkori feljegyzések is tanúskodnak. Szarvas egyedek genetikai úton történő azonosítása fontossá vált igazságügyi és populációgenetikai vizsgálatokban, de a természetvédelmi és állattenyésztési gyakorlatban is (Feulner et al. 2004, Fajardo et al. 2007, Zsolnai et al. 2009, Szabolcsi et al. 2014). Néhány emlős faj esetében, többségében háziasított állatoknál, mint a szarvasmarha, sertés, kutya, már rendelkezésre állnak molekuláris módszerek apasági/anyasági vizsgálatokhoz. Gímszarvas genetikai kutatásokhoz eddig leginkább más szarvasfélékben fejlesztett mikroszatellita markereket adaptáltak (Kuehn et al. 2003, Feulner et al. 2004, Zsolnai et al. 2009, Szabolcsi et al. 2014, Zachos et al. 2016), illetve mitokondriális markereket használtak (Hartl et al. 2003, Feulner et al. 2004, Fajardo et al. 2007, Olivieri et al. 2014). 5

8 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1. A GÍMSZARVAS ÉS JELENTŐSÉGE Rendszertani helyzetét tekintve a gímszarvas a Cetartiodactyla főrend Párosujjú patások (Artiodactyla) rendjébe, azon belül a Szarvasfélék (Cervidae) családjába tartozik (Gilbert et al. 2006, Agnarsson & May-Collado 2008). A Cervidae család jelenlegi taxonómiai álláspont szerint három alcsaládra, Óvilági szarvasformák (Cervinae), Újvilági szarvasformák (Capreolinae) és Víziőzformák (Hydropotinae), tagolódik; 16 nemzetséget és több mint 50 fajt foglal magába (Hassanin & Douzery 2003, Gilbert et al. 2006). Széchenyi Zsigmond (1979) szép leírást ad a különféle szarvasok elterjedéséről és jellemzőiről. A szarvasfélék legkorábbi tagjai a fosszilis leletek alapján Eurázsiában jelentek meg a korai Miocénben, millió évvel ezelőtt (Gentry 1994, Vrba & Schaller 2000, Gilbert et al. 2006). Az Óvilági szarvasformák legnépesebb nemzetsége a Cervus nemzetség, ide tartoznak a szarvasfélék leghíresebb és leginkább reprezentatív tagjai. A nemzetség legősibb leletei a korai Pleisztocénből származnak, 2,5-3 millió évesek (Vrba & Schaller 2000, Di Stefano & Petronio 2002, Pfeiffer 2002). A gímszarvasok a tisztásokkal és rétekkel tarkított lombos-elegyes erdőket kedvelik, a legjobb életteret a folyók árterei biztosítják számukra. Elsősorban lágyszárú növényeket legelnek, azonban tavasszal szívesen fogyasztanak rügyeket, ősszel pedig a makkterméssel egészítik ki étrendjüket, hogy vastag szalonna réteget fejleszthessenek télre (Mátrai & Szemethy 2000, Krojerová- Prokešová et al. 2010, Katona et al. 2013). Rudlikban élnek, amelyek a bőgési időszakot leszámítva csak tehenekből és borjaikból vagy csak bikákból állnak (Szemethy et al. 1999, Catchpole et al. 2004). A gímszarvas, mint nagytestű növényevő, hazai faunánk ökológiai és vadgazdálkodási 6

9 szempontból is nagy jelentőséggel bíró tagja. Egész Európában elterjedt vadászható nagyvad, amelynek európai állománya az elmúlt évszázadban lényegében folyamatosan nőtt. Európai állománya az utóbbi harminc évben 1 millió körüli egyedszámról majdnem megduplázódott, annak ellenére, hogy jelentős antropogén hatások érték a fajt, illetve a vadászati teríték is jelentősen növekedett. Ez az elszaporodás független az ökológiai kondícióktól, a szociokulturális háttértől és a vadászati rendszertől is (Mattioli et al. 2001, Sugár & Barna 2008, Burbaitė & Csányi 2010). Az európai tendenciának megfelelően a magyarországi egyedszám is évtizedek óta emelkedést mutat, az állomány országos létszámát évek óta körülire becsülik (Csányi et al. 2013, 2014a, 2015, 2016), bár a tényleges egyedszám akár még ezeket a becsléseket is felülmúlhatja (Csányi & Tóth 2000, Sugár & Barna 2008). A magyarországi állatok trófea minősége viszont kiemelkedő; számos, hazánkban kilőtt állat szerepel előkelő helyen a nemzetközi ranglistákon, például a méltán világhírű, 1986-ban Gemenc-Karapancsán elejtett gímszarvas bika agancstrófeája. A gímszarvas már évezredek óta fontos alapanyag- és élelmiszerforrás az ember számára (Milner et al. 2006, Apollonio et al. 2010, Burbaitė & Csányi 2010, Fajardo et al. 2007, Olivieri et al. 2014, Kyselý & Pecinovská 2017). Fontos vadfaj lévén populációi régóta jelentős emberi hatásoknak vannak kitéve szelektív vadászat, állománygazdálkodás, áttelepítés és az élőhelyek átalakításának, feldarabolásának formájában (Mattioli et al. 2001, Hartl et al. 2003, Milner et al. 2006, Pérez-Espona et al. 2008, Pérez-Espona et al. 2009, Burbaitė & Csányi 2010, Haanes et al. 2010, Carden et al. 2012, Frantz et al. 2017). Ezen hatások erőteljesen befolyásolták és még most is befolyásolják a populációk összetételét, dinamikáját és genetikáját. Közép-Európában elsősorban vadászati hasznosítása terjedt el, terítéke hazánkban állat körül alakul (Csányi et al. 2013, 2014a, 2015, 2016). Emellett viszont már évszázadok óta foglalkoztak nagyvad állományok hosszú távú fenntartásával (Apollonio et al. 2010); és az elmúlt évtizedben nemzetközi és hazai 7

10 viszonylatban is fontossá vált a vadhús előállítása, értékesítése és fogyasztása (Fajardo et al. 2007, Ramanzin et al. 2010, Sonkoly et al. 2013, Csányi et al. 2014b). A szarvasok zárttéri, illetve farmszerű körülmények közötti tartása világszerte, így hazánkban is egyre jobban terjedő gazdálkodási forma (Horn 2004, Apollonio et al. 2010), amelyben a Kaposvári Egyetem is országos jelentőségre tett szert a bőszénfai Vadgazdálkodási Tájközpontja révén. Bár a vadhús értéke többnyire elmarad a vadászat bevételei mögött, mégis nagyon fontos élelmiszerről van szó. Maga a vadhús kifejezetten tápláló, magas biológiai és élvezeti értékkel bír (Ramanzin et al. 2010, Bureš et al. 2015), emiatt prémium élelmiszernek tekinthető, a fogyasztás növekedésével az előállítása és értékesítése kiemelt fontosságú iparággá válhat (Ramanzin et al. 2010, Sonkoly et al. 2013) A GÍMSZARVAS MITOKONDRIÁLIS FILOGENETIKÁJA Az utóbbi évtizedekben nagy érdeklődés kísérte a szarvasfélék családjának molekuláris genetikai kutatását. A különböző fajok, populációk és állatfajták genetikai variációinak meghatározására gyakran használt eszköz a mitokondriális DNS (mtdns) vizsgálata, ami használható taxonok közötti filogenetikai kapcsolat becslésére és molekuláris filogenetikai evolúciós elemzésekhez (Feulner et al. 2003, Pitra et al. 2004, Skog et al. 2009, Wada et al. 2010). A mitokondrium kettős szálú cirkuláris DNS-t tartalmaz, melynek mérete emlősökben körülbelül bp (16 kbp), a sejtmagi DNS-től függetlenül replikálódik, és tízszer magasabb a mutációs rátája, így a mutációk felhalmozódhatnak. A mtdns-t a kódoló szakaszokon felül, egy nem kódoló régió, a kontroll régió, vagy más néven D-loop ( Displacement-loop ) alkotja, amely kiemelt fontossággal bír, mivel szekvenciája és hossza változatos a különböző fajok és egyedek között, a benne bekövetkező mutációk pedig 8

11 gyorsan rögzülnek; ezen tulajdonságai miatt használható populációgenetikai vizsgálatokhoz (Fernández-Silva et al. 2003, Feulner et al. 2003, Borowski et al. 2016). Fajok közötti filogenetikai kapcsolatok vizsgálatához kezdetben egyes mitokondriális gének szekvencia variációit használták (Abernethy 1994, Polziehn & Strobeck 1998, Ludt et al. 2004, Pitra et al. 2004), majd a sejtmagi genomban található (nukleáris) gének szekvencia különbségeit is vizsgálni kezdték (Hassanin & Douzery 2003, Gilbert et al. 2006). Az egyes genetikai elemek filogenetikai információtartalma eltérő lehet, így a különböző gének akár eltérő leszármazásokat is mutathatnak (Hassanin & Douzery 2003, Gilbert et al. 2006). A rokonsági viszonyok biztosabb feltárására emiatt inkább több különböző gén együttes vizsgálatával rekonstruálják a filogenetikai leszármazásokat (Hassanin & Douzery 2003, Gilbert et al. 2006). A technológia fejlődése az utóbbi évtizedben lehetővé tette a mitokondriális DNS szekvenciájának meghatározását a mitokondriális genom teljes hosszában (Wada et al. 2010), a szekvenálási technológiák fejlődésével pedig egyre több mitokondriális szekvencia válik nyilvánosan elérhetővé. A teljes mitogenomok felhasználása molekuláris filogenetikai vizsgálatokhoz egyszerűbbé vált, ami a mitokondriális filogenetikai vizsgálatok számának növekedéséhez és a törzsfejlődési viszonyok megbízhatóbb feltárásához vezetett (Wada et al. 2010, Zhang & Zhang 2012, Kumar et al. 2017). A Szarvasfélék családja (Cervidae) jelenlegi taxonómiai álláspont szerint három alcsaládra, Óvilági szarvasformák (Cervinae), Újvilági szarvasformák (Capreolinae) és Víziőzformák (Hydropotinae), tagolódik; 16 nemzetséget és 50-nél több fajt foglal magába (Vrba & Schaller 2000, Pitra et al. 2004). A család kialakulását molekuláris módszerekkel 17,2-27,8 millió évvel ezelőttre datálják (Hassanin & Douzery 2003, Ludt et al. 2004, Pitra et al. 2004, Zhang & Zhang 2012), ami megfelel a korai Miocénből származó leletek korának (Gentry 1994, Vrba & Schaller 2000, Gilbert et al. 2006). A molekuláris 9

12 vizsgálatok megerősítették a család monofiletikus eredetét is (Hassanin & Douzery 2003, Li et al. 2003, Ludt et al. 2004, Gilbert et al. 2006). Az Óvilági szarvasformák legnépesebb nemzetsége a Cervus genus, ide tartoznak a szarvasfélék leghíresebb és leginkább reprezentatív tagjai. A nemzetség a Szarvasfélék Cervini ágához tartozik, amelynek kialakulását 4,2-6,8 millió évvel ezelőttre teszik, a Cervus nemzetségét pedig 2,04-4,7 millió évvel ezelőttre (Randi et al. 2001, Li et al. 2003, Ludt et al. 2004, Pitra et al. 2004, Gilbert et al. 2006, Zhang & Zhang 2012), amely időpontok átfednek a fosszilis rekorddal (Vrba & Schaller 2000, Di Stefano & Petronio 2002). A Cervus elaphus faj taxonómiája régóta viták tárgyát képezi, morfológiai alapon 22 alfaját különböztették meg (Groves & Grubb 1987, Mahmut et al. 2002, Kuznetsova et al. 2012, Kumar et al. 2017). Molekuláris filogenetikai vizsgálatok több alfaj státuszát módosították, és jelentősen átalakították a faj törzsfejlődéséről alkotott képünket. Mitokondriális szekvencia elemzések alapján feltételezhető, hogy a gímszarvas a szikaszarvassal (Cervus nippon) és meglepő módon a Thorold szarvassal is (Przewalskium albirostris) egy nagy fajkomplexet alkot (1. ábra). Ez a fajkomplex két kládra osztható, a nyugati kládba tartoznak az európai, észak-afrikai és tarimi csoportba tartozó gímszarvasok, míg a kelet-ázsiai és amerikai vapitik, a szikaszarvas alfajai és a Thorold szarvas alkotja a keleti kládot (Abernethy 1994, Polziehn & Strobeck 1998, Mahmut et al. 2002, Li et al. 2003, Ludt et al. 2004, Pitra et al. 2004, Kuznetsova et al. 2012, Kumar et al. 2017). A két kládot ma már inkább két különálló fajnak tekintik; az európai gímszarvast a C. elaphus fajhoz, míg vapitiket a C. canadensis fajhoz sorolva (Randi et al. 2001, Polziehn & Strobeck 2002, Ludt et al. 2004, Pitra et al. 2004). A szikaszarvas helyzete bizonytalan ebben a rendszertani felosztásban, leginkább a vapitik legközelebbi testvérfajának tekintik. 10

13 1. ábra. Gímszarvasok filogenetikai fája mitokondriális citokróm b gén szekvenciák alapján (Forrás: Olivieri et al. 2014). A morfológiai különbségek ellenére a fajkomplex tagjai egymással hibridizálnak és mindkét nemből szaporodóképes utódot produkálnak (Abernethy 1994, Goodman et al. 1999), így a C. canadensis / nippon vonal a génáramlás szempontjából egy fajnak tekinthető, vagy a fajszétválás nagyon korai stádiumát reprezentálhatja (Polziehn & Strobeck 2002, Li et al. 2003, Ludt et al. 2004). Az Európában és a Közel-Keleten élő gímszarvasok 11

14 morfológiai alapú felosztása alfajokra sem konzisztens a mitokondriális vizsgálatok eredményével. Mitokondriális szekvenciák alapján nem indokolt az európai gímszarvas alfajok elkülönítése, szemben az észak-afrikai C. e. barbarus, valamint a Tarimi csoportba tartozó C. e. maral, C. e. bactrianus és C. e. yarkandensis alfajokkal (Ludt et al. 2004, Pitra et al. 2004). Európában a középső Pleisztocénben, nagyjából évvel ezelőtt jelentek meg az első gímszarvasok (Lister 1990, Di Stefano & Petronio 2002), amely időpont közel van a fajkomplex nyugati- és keleti klád szétválás becsült időpontjához (Mahmut et al. 2002). A Pleisztocén korszakban történt éghajlat ingadozások, az erős lehűlések (glaciális) és a közöttük lévő enyhébb időszakok (interglaciális), jelentősen befolyásolták az élővilág elterjedését. Európa esetében a mérsékelt övi fajok a lehűlések alatt dél-európai és közelkeleti refúgium területekre szorultak vissza, majd az interglaciális időszakokban tudtak észak felé terjedni (Taberlet et al. 1998, Hewitt 1999, Sommer et al. 2008, Sommer & Zachos 2009, Karaiskou et al. 2014). Ezek a ciklusos változások a fajokban ma is megfigyelhető intraspecifikus genetikai különbségek felhalmozódását okozták, amely genetikai különbségek visszavezethetők az egyes refúgiumokra amelyekből az adott vonalak származnak (Hewitt 2004, Meiri et al. 2013), így alkalmazhatóak az egyes fajok posztglaciális terjedésének feltérképezéséhez. Mitokondriális vizsgálatok alapján Európában ma három gímszarvas leszármazási vonal van jelen; a nyugat-európai (A), a kelet-európai (C) és a mediterrán (B) haplocsoportoknak elkülönült jégkorszaki menedékhelyei lehettek az Ibériai-, a Balkán-, valamint az Appennini-félszigeten (Ludt et al. 2004, Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Meiri et al. 2013, Karaiskou et al. 2014, Krojerová-Prokešová et al. 2015). Az utolsó glaciális után ezekből a refúgium területekről észak felé terjedve népesítették be a szarvasok Európát. Így a nyugat-európai A haplocsoport az Ibériai-félszigettől Franciaországon keresztül északra a Brit-szigetekig és Skandináviáig, kelet felé pedig 12

15 Csehországig, Lengyelországig, Fehéroroszországig jutott (Ludt et al. 2004, Skog et al. 2009, Meiri et al. 2013, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Borowski et al. 2016). A B haplocsoport leginkább Észak-Afrikai elterjedésű volt, Európában csak Szardínia és Korzika szigetén maradt fenn (Zachos et al. 2003, Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011); a kelet-európai C haplocsoport pedig a Balkán-félszigettől észak felé benépesíti egész Kelet-Európát (Ludt et al. 2004, Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Karaiskou et al. 2014, Krojerová-Prokešová et al. 2015). Közép-Európa különösen fontos biogeográfiai régió a rekolonizáció szempontjából, ugyanis sok állat- és növényfaj eljegesedések utáni terjedési útvonala ezen a földrajzi területen találkozik egymással (Hewitt 2004, Sommer et al. 2008, Sommer & Zachos 2009). Gímszarvas esetében is a nyugat-európai A és a kelet-európai C haplocsoport elterjedési területe itt ér össze (Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Markov et al. 2015), és alkot egy érintkezési vagy keveredési zónát, ami az Alpoktól északkelet felé haladva a Balti-tengerig terjedhet (Niedziałkowska et al. 2011, Fickel et al. 2012, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Borowski et al. 2016). Az eddigi vizsgálatokba azonban csak kis számú gímszarvast vontak be a Kárpátmedencéből, így kevés adat áll rendelkezésünkre a faj genetikai struktúrájáról erről a fontos földrajzi területről GÍMSZARVAS POPULÁCIÓGENETIKAI VIZSGÁLATOK A gímszarvasra jellemző a háremtartásos poligín szaporodási rendszer, aminek következtében a hímek szaporodási sikere nagyon változó (Pérez-Espona et al. 2009). A háremtartás miatt a nőstények általában helyhez kötöttek, míg a hímek hajlamosabbak a vándorlásra, így a populációk közötti génáramlás fenntartása is inkább a hímekre hárul (Catchpole et al. 2004, Hoffmann et al. 13

16 2016). Ennek eredménye egy finoman strukturált genetikai mintázat, vagyis a rokonsági viszonyok, illetve allélfrekvenciák szempontjából nem véletlen térbeli elrendeződés (Frantz et al. 2008). Ezen okok miatt a természetvédelmiilletve vadgazdálkodási kezelések potenciális genetikai következményekkel járnak. Éppen ezért a gímszarvas populációk genetikai vizsgálata régóta foglalkoztatja a szakembereket. Az első ilyen irányú vizsgálatoknál még csak külsőleg megfigyelhető morfológiai jellegek álltak a kutatók rendelkezésére (Köller et al. 1988), így ezek a vizsgálatok viszonylag kismértékű és nagyon általános összefüggések megfigyelésére voltak csak alkalmasak. Az 1970-es évek közepétől már izoenzim vizsgálatokat végeztek gímszarvas populációk genetikai diverzitásának vizsgálatára (Bergmann 1976, Hartl et al. 1990), és bár ilyen módon genetikai diverzitás és távolság indexek is számolhatók, a markerek korlátozott variabilitása nem igazán teszi lehetővé a populációk genetikai hátterének alapos vizsgálatát. A genetikai diverzitás valamivel jobb feltárását a restrikciós enzimekkel végzett RFLP ( Restriction Fragment Length Polimorphism ) elemzések tették lehetővé, amit az 1980-as évek végén gímszarvasoknál is végeztek, és közép- valamint nyugat-európai gímszarvasokban az előzőekhez képest magasabb diverzitást tudtak kimutatni (Hartl et al. 1995). A genetika más területei mellett a populációgenetikában is nagy jelentősége volt a mikroszatellita (STR Short Tandem Repeat illetve SSR Simple Sequence Repeat ) markerek felfedezésének és elterjedésének (Litt & Luty 1989). A mikroszatelliták a genomban megtalálható rövid, 2-6 nukleotid hosszúságú, tandem módon ismétlődő motívumok; a lókuszok ismétlődéseinek száma nagy változatosságot mutathat, amely polimorf tulajdonság alkalmassá teszi ezen pontok genetikai markerként történő alkalmazását. Sok kutatási területen használják őket, például populációbiológiai vizsgálatokhoz, genom térképezéshez, betegségekhez kapcsolt gének azonosításához és családfa vizsgálatokhoz, mivel a genom nagy részét lefedik, nagyszámú lókuszon 14

17 megtalálhatók, multiallélosak és kodominánsan öröklődnek (Edwards et al. 1991, Valdes et al. 1993, Yu et al. 2011, Castoe et al. 2012, Cai et al. 2013, Fernandez-Silva et al. 2013). Az STR ismétlődő szekvenciák elnevezése az ismétlődő motívum hossza alapján di-, tri-, tetra-, penta- illetve hexanukleotid, melyek a nevüknek megfelelően 2, 3, 4, 5 vagy 6 nukleotidból állnak. Napjainkban a humán igazságügyi genetikában elsősorban a tetranukleotid ismétlődéseket használják (Edwards et al. 1991, Szabolcsi et al. 2014), a nemhumán populációgenetikai vizsgálatokban azonban még a dinukleotid markerek a dominánsak (Zsolnai et al. 2009, Kalia et al. 2011, Cai et al. 2013, Szabolcsi et al. 2014). Gímszarvas esetében az 1990-es évek óta használnak mikroszatellita markereket populációk genetikai diverzitásának felmérésére, populációk közötti genetikai távolság és génáramlás vizsgálatára. A kezdetben leginkább Németországra és Franciaországra kiterjedő kutatások megállapították, hogy az állományok genetikai változatossága más nagytestű és tág elterjedési területű patásokhoz hasonlóan magas, és a különböző populációk genetikai elkülönülése a közöttük lévő földrajzi távolság függvényében alakul (Kuehn et al. 2003, Frantz et al. 2006). A későbbiekben Európa más részein végzett vizsgálatok szintén magas genetikai diverzitást és finom térbeli genetikai strukturáltságot találtak (Kuehn et al. 2004, Pérez-Espona et al. 2008, Szabolcsi et al. 2014, Radko et al. 2014, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Hoffmann et al. 2016), ami általánosan jellemző az európai gímszarvasokra (Zachos et al. 2016, Frantz et al. 2017). Az egymással szomszédos populációk genetikai vizsgálata lehetővé tette az alpopulációs szintű genetikai elkülönülés kimutatását és vizsgálatát, így alkalmas volt idegen eredetű állatok kiszűrésére (Frantz et al. 2006, Szabolcsi et al. 2014); mitokondriális szekvencia elemzésekkel kiegészítve pedig alfaj szintű genetikai izolációt is képes volt igazolni (Zachos et al. 2003, Feulner et al. 2004). Ezek a kutatások tovább haladva a különböző eredetű leszármazási vonalak között kialakuló érintkezési 15

18 vagy keveredési zónák vizsgálatához vezettek. Így a cseh-német országhatár régiójában kimutatták, hogy a különböző leszármazási vonalak ebben a zónában a szomszédos populációkból származó állatok vándorlása által természetes módon keverednek egymással (Fickel et al. 2012, Krojerová- Prokešová et al. 2015). Az elzárt populációk beltenyésztettségének kimutatása (Zachos et al. 2007, Mukesh et al. 2013) mellett az egyedek genetikai azonosítása szintén fontossá vált, igazságügyi, valamint állattenyésztési szempontból is, ezért gímszarvas apasági vizsgálatra és egyedazonosításra alkalmas markerszetteket is fejlesztettek (Zsolnai et al. 2009, Szabolcsi et al. 2014). A technológia fejlődésével évtizedes vagy akár évszázados agancs trófeák vizsgálata is lehetővé vált, így a populáció demográfiai változásai összekapcsolhatóak lettek a genetikai diverzitás és struktúra változásával (Hoffmann et al. 2016, Willems et al. 2016). Az utóbbi években már Európa szintű STR adatbázisok létrehozásán dolgoznak, amelyek alkalmasak lehetnek populációk genetikai diverzitásának és a közöttük lévő genetikai izoláció vizsgálatára (Zachos et al. 2016), illetve a populációk közötti diszperzió, vagy akár az állatok illegális áttelepítésének kimutatására is (Frantz et al. 2017), ami jelentős hatással lesz a vadgazdálkodási kezelések alkalmazására GÍMSZARVAS GENOMIKAI VIZSGÁLATOK A genomika az élő szervezetek genomjának felépítését, szerveződését és működését vizsgáló tudományterület, ami az 1980-as években alakult ki (Kuska 1998). Bár adott élőlények teljes örökítő anyagának, azaz genomjának megismerése egészen a kariotípusok meghatározásáig (Gustavsson & Sundt 1968, Herzog 1987, Frohlich et al. 2017) vezethető vissza, a DNS szekvencia szintű vizsgálatát a szekvenálási technológiák kifejlesztése (Sanger et al. 1977) tette lehetővé. Kariotipizálással, azaz az egyed kromoszómáinak alak és 16

19 nagyság szerinti meghatározása segítségével állapították meg a diploid kromoszómaszámot gímszarvasban (2n=68) és egyéb szarvasfélékben is (Gustavsson & Sundt 1968, Herzog 1987). A technológiák fejlődésével pedig a szarvasmarhához illetve más közeli rokon fajokhoz képest történt kromoszóma átrendeződések is feltérképezhetővé váltak, az evolúciós kapcsolatok tanulmányozására (Broom et al. 1996, Huang et al. 2006, Frohlich et al. 2017) A különböző molekuláris markerek kifejlesztése, illetve ezek felhasználásával történő genetikai térképezés jelentette a genom megismerésének következő lépcsőfokát. A gímszarvas genetikai térképét gímszarvas és milu (Elaphurus davidianus) fajhibridek segítségével határozták meg. A milu a gím legtávolabbi rokona a szarvasfélék családjában amivel még szaporodóképes utódokat alakít ki. Kezdetben mindösszesen 17 genetikai markert használtak a térképezéshez, öt fehérje izoformáit és 12 emberből, egérből illetve szarvasmarhából származó RFLP markert (Tate et al. 1995). Ez a kezdetleges térkép nem volt alkalmas géntérképezésre, de néhány kromoszómaátrendeződés kimutatható volt (Broom et al. 1996). Ennek a géntérképezési projektnek a fejlődése egy részletesebb kapcsoltsági térkép összeállításához vezetett, amely már 621 különböző marker (229 AFLP, 153 mikroszatellita, 150 RFLP, 73 EST marker és 16 fehérje) helyzetét határozta meg; a 34 gímszarvas kapcsoltsági csoport így 2532,2 cm hosszúságot fedett le (Slate et al. 2002a). Gím- és Dávid szarvas fajhibrideket használtak a szarvasok testméretével és növekedésével (Tate et al. 1998, Goosen et al. 1999, Maqbool et al. 2007), valamint a nemi éréssel és agancsfejlődéssel (Goosen et al. 2000) összefüggést mutató régiók felderítéséhez is. A kapcsoltsági térkép 93 markerének segítségével vadon élő gímszarvasokban is végeztek QTL térképezést (Slate et al. 2002b). A genom részletesebb vizsgálatát az SNP ( Single Nucleotide Polimorphism ) markerek elterjedése tette lehetővé, főleg a nagy áteresztőképességű SNP-chip 17

20 technológia kifejlesztése után (Wang et al. 1998). Kezdetben a szarvasok vizsgálatokhoz haszonállatokban fejlesztett SNP paneleket tartalmazó chipeket használtak (Hayes & Latch 2012, Kharzinova et al. 2015), mivel a szarvasfélék kevesebb gazdasági értéket képviseltek (Seabury et al. 2011). Például szarvasmarhára fejlesztett SNP markerekkel vizsgáltak öszvérszarvasokat (Odocoileus hemionus) és fehérfarkú szarvasokat (Odocoileus virginianus) Észak-Amerikában (Hayes & Latch 2012), szarvasmarha és juh SNP-k segítségével pedig oroszországi rénszarvasokat (Rangifer tarandus) kis számban (Kharzinova et al. 2015). Az utóbbi években már kifejezetten szarvasokra is fejlesztenek SNP szetteket; fehérfarkú szarvasra (Seabury et al. 2011), gímszarvasra (Huisman et al. 2016, Johnston et al. 2017) illetve szikaszarvasra (Ba et al. 2017), annak ellenére, hogy részletes referencia genom nem állt rendelkezésre ezen fajokhoz; de a technológia fejlődése további kutatási és fejlesztési irányokat vet fel (Nichols & Spong 2017). Az új generációs szekvenálási (NGS) technológiák elterjedése genomikai robbanáshoz vezetett, lehetővé téve a teljes genom szekvencia szintű elemzését. Az első generációs genomszekvencia összeillesztések és annotációk jelentős szerepet játszottak a vizsgált fajok biológiájának valamint filogenetikai kapcsolatainak feltárásában (Wang et al. 1998, Seabury et al. 2011, Molnár et al. 2014, Koepfli et al. 2015). A szarvasfélék családjának tagjai közül korábban egyetlen faj genomszekvenciáját sem annotálták egy referencia genom összeállításához szükséges mértékben, bár szekvenálási projektek indultak szarvasokon is. Az első ilyen projekt a fehérfarkú szarvast érintette, eredetileg nagyjából 4 millió bp-nyi szakaszt sikerült a szarvasmarha referencia segítségével meghatározni, de csak alacsony lefedettséggel (Seabury et al. 2011), viszont a faj genomszekvenciáját folyamatosan pontosítják. Kínában a szikaszarvas genomját sikerült összeállítani 2,7 Gbp nagyságban, bár a szekvenciák nincsenek kromoszómákhoz rendelve (Ba et al. 18

21 2017). Bár referencia genomszekvenciákat nem publikáltak, jelenleg is folyamatban van különböző szarvasfélék genomjának meghatározása (Koepfli et al. 2015, Johnson et al. 2017). A genomszekvenálások eredményeként kapott hosszabb-rövidebb szekvencia összeillesztéseket elsősorban SNP markerek térképezéséhez és fejlesztéséhez használják (Seabury et al. 2011, Ba et al. 2017, Johnson et al. 2017), további felhasználást jelent a különböző gének felderítése (Seabury et al. 2011, Koepfli et al. 2015). Gének azonosítására illetve expressziós mintázatuk felderítését korábban is végezték szarvasban (Gyurján et al. 2007, Molnár et al. 2007, Borsy et al. 2009, Stéger et al. 2010), de a szekvenálási technológiák fejlődésével a génműködés vizsgálata is egyszerűbbé és gyorsabbá vált. Transzkriptom, azaz RNS (Yao et al. 2012) valamint mikrorns szekvenálással (Ba et al. 2016) is vizsgálták az agancsfejlődésben szerepet játszó géneket szikaszarvasban. Ezek a gének átfedést mutatnak a gímszarvasban talált agancsfejlődésben szerepet játszó génekkel (Molnár et al. 2007, Stéger et al. 2010). A szikaszarvas transzriptomikai vizsgálatát pedig tovább bővítették (Jia et al. 2016), várhatóan a jövőben az ilyen vizsgálatok más szarvasokban is gyakoribbá válnak MIKROSZATELLITA MARKEREK FEJLESZTÉSE Az STR markerek alkalmazásának legnagyobb hátulütője, hogy új fajok vizsgálatához új markerek fejlesztése szükséges. Az STR markerek fejlesztésnek legegyszerűbb módja a rokon fajokban leírt mikroszatellita primerek adaptálása a vizsgálandó fajra (Kalia et al. 2011, Mukesh et al. 2013, Senan et al. 2014, Szabolcsi et al. 2014). A markerek fajok közötti átvitele nyilvánvalóan csak olyan fajoknál lehetséges, amelyek rokonsági körébe tartozó fajban már vannak leírt markerek; a kereszt-amplifikáció eredménye 19

22 viszont kétséges, ezen felül akár jelentős munka és költség ráfordítást igényelhet a primerek adaptálása (Zane et al. 2002, Kalia et al. 2011). Amennyiben nincs lehetőség STR-ek adaptálására teljesen új markerek fejlesztése szükséges, ami a mikroszatelliták alkalmazásának kezdeti időszakában alapvető volt. Új STR markerek fejlesztése korábban DNS szekvencia adatbázisokban lefolytatott keresés (Thiel et al. 2003), vagy molekuláris biológiai izolációs módszerek révén azonosított ismétlődésekből indult ki (Williams et al. 1990, Edwards et al. 1991). Kezdetben a markerfejlesztés genomi könyvtárak átnézésével, a klónok ismétlődést tartalmazó próbához történő hibridizációja alapján végzett válogatásával történt (Rassmann et al. 1991). Ez a módszer nyilvánvalóan nagy munka és költség igényű, a genomi könyvtár létrehozásához szükséges klónozáshoz és transzformációhoz szakértelem szükséges, a markerfejlesztés hatékonysága pedig elég alacsony (Zane et al. 2002). A hatékonyság növelésére az ismétlődő motívumot tartalmazó szekvenciák feldúsításával próbálkoztak a genomi könyvtár készítése során egy PCR alapú primer extenziós lépéssel (Ostrander et al. 1992). A beiktatott lépések miatt a módszer hosszadalmas és kifejezetten munkaigényes, a markerfejlesztés hatékonysága pedig nem javult jelentősen, így ez a protokoll nem terjedt el (Zane et al. 2002). Az ismétlődést tartalmazó szekvenciák feldúsításának másik módja szelektív hibridizáción alapul (Karagyozov et al. 1993). Ebben az esetben a genomi könyvtár készítése után egy hibridizációs lépés az ismétlődést tartalmazó fragmentek szelektív feldúsítását eredményezi, a fragmentek ezután vektorba építhetőek és egy PCR lépéssel felszaporíthatóak (Zane et al. 2002, Kalia et al. 2011). A könyvtárkészítés elkerülése és az ismétlődések szűrésének egyszerűsítése céljából RAPD ( Random Amplification of Polymorphic DNA ) primerek alkalmazásával próbálkoztak (Williams et al. 1990). Ebből fejlődött ki egy PCR alapú markerfejlesztési protokoll, ami genom fragmentek RAPD primerekkel történő felszaporítása után az ismétlődést tartalmazó 20

23 szekvenciák hibridizációjából áll (Lunt et al. 1999), így egyszerűbb és gyorsabb lett a markerfejlesztés. A genomi könyvtárakon alapuló módszerekkel szemben a DNS szekvencia adatbázisok szűrése ismétlődő motívumokra lényegesen kevesebb laboratóriumi munkát igényel a markerfejlesztés során, viszont korábban elvégzett szekvencia meghatározáson alapul. Szerencsére gén karakterizációs projektek rengeteg cdns könyvtár szekvenciájának meghatározásához és nyilvános adatbázisba történő feltöltéséhez vezettek. Sok génről átíródó egyszálú mrns szekvenciáját meghatározták, az ilyen nukleotid hosszú szekvenciák tulajdonképpen az expresszálódó génekről készült pillanatképnek tekinthetők, ezeket EST ( Expressed Sequence Tag ) szekvenciáknak nevezik (Thiel et al. 2003, Kalia et al. 2011, Senan et al. 2014). Több informatikai szoftvert fejlesztettek adatbázisokban történő mikroszatellita kereséshez, ilyenek például a TROLL (Castelo et al. 2002), a MISA (Thiel et al. 2003), a SciRoKo (Kofler et al. 2007), a MSATCOMMANDER (Faircloth 2008), a PolySSR (Tang et al. 2008) vagy a QDD (Meglécz et al. 2010). Ez a megközelítés gyorsan és kis munkaigénnyel eredményez viszonylag nagy mennyiségű polimorf STR marker jelöltet (Thiel et al. 2003, Kalia et al. 2011, Senan et al. 2014), így igen népszerűvé tudott válni. Az ilyen módon fejlesztett markerek a gének átíródó régiójában helyezkednek el, ezért genikus mikroszatellita vagy EST-SSR néven hivatkoznak ezekre, hogy megkülönböztessék a nem kódoló régióban található mikroszatellitáktól. Mivel egy-egy gén átíródó régiójában találhatók tökéletesen kapcsoltak az adott génhez, a kódoló régiók konzerváltsága miatt több fajban is alkalmazhatók, ugyanezen okból viszont alacsonyabb polimorfizmust mutatnak, azaz kevésbé hatékonyak rokon genotípusok elkülönítésében, mint a nem kódoló régióba eső STR-ek (Kalia et al. 2011, Senan et al. 2014). Az új generációs szekvenálási technológiák jelentősen megváltoztatták a biológiai kutatások több területét, többek között a mikroszatellita markerek 21

24 fejlesztését is. A módszerek nagy áteresztőképessége viszonylag rövid idő alatt nagy adatmennyiséget generál, és az adatok informatikai feldolgozásával mikroszatellita markerek fejlesztéséhez is használható adathalmazt kapunk (Sharma et al. 2007, Kalia et al 2011, Yu et al. 2011, Cai et al. 2013, Fernandez-Silva et al. 2013). A korábban említett, szekvencia adatbázisokban történő mikroszatellita kereséshez fejlesztett szoftverek, mint a TROLL (Castelo et al. 2002), a MISA (Thiel et al. 2003), a SciRoKo (Kofler et al. 2007), a MSATCOMMANDER (Faircloth 2008), a PolySSR (Tang et al. 2008) vagy a QDD (Meglécz et al. 2010), a genom szekvenálási projektekből származó szekvencia adatokban is képesek az ismétlődések felderítésére (Sharma et al. 2007). Alapvetően kétféle megközelítés áll rendelkezésre az NGS adatok feldolgozására. A Seq-to-SSR vagyis szekvencia-marker megközelítésnél a genomszevenálásból származó nyers szekvenciákat közvetlenül használják mikroszatellita keresésre (Yu et al. 2011, Castoe et al. 2012, Cai et al. 2013). Mivel a nyers szekvencia readek rövid szekvenciák, ennél a módszernél nem minden ismétlődéshez találnak a primer tervezéshez megfelelő határoló régiót (Castoe et al. 2012). Ennek a problémának a kikerülésére a Seq-Assembly-SSR vagyis szekvencia-illesztés-marker megközelítés esetén a nyers szekvenciákat először genom illesztéshez használják, ami hosszabb egybefüggő szekvencia darabokat eredményez, és ezeken a szekvenciákon futtatják a mikroszatellita keresést (Cai et al. 2013). Így a mikroszatelliták felderítésének hatékonysága jelentősen megnövekszik, viszont a genom illesztés nagy számítástechnikai kapacitást igényel, és meg is hosszabbítja a folyamatot a Seq-to-SSR megközelítéshez képest. Az utóbbi években az NGS projektek számának növekedésével a bioinformatikai markerfejlesztés is egyre népszerűbbé vált és jelentősen egyszerűsítette új STR markerek fejlesztésének folyamatát (Sharma et al. 2007, Yu et al. 2011, Castoe et al. 2012, Cai et al. 2013), leginkább a nem-modell fajok esetében, amelyeknél nem is állnak rendelkezésre genomi könyvtárak hagyományos 22

25 mikroszatellita fejlesztési eljárásokhoz. Így már több különböző rendszertani csoportba tartozó fajnál használták ezt a módszert új mikroszatellita markerek fejlesztésére, és a fejlesztett markerek tesztelésére; a módszer várhatóan az igen közeli jövőben teljesen ki is szoríthatja a hagyományos markerfejlesztési eljárásokat. A gímszarvasban tervezett markerfejlesztési munkát is a genomszekvencia meghatározása, illetve a bioinformatikai genomillesztés előzte meg illetve tette lehetővé. A markerfejlesztéstől függetlenül a genomillesztés pontosítása, a szekvencia darabok kromoszómához rendelésén is tovább dolgoztunk; így sikerült meghatároznunk az első gímszarvas referencia genomot (CerEla1.0), ami az NCBI adatbankjában is elérhető az MKHE hozzáférési számon. 23

26 4. A DISSZERTÁCIÓ CÉLKITŰZÉSEI Az állattenyésztési gyakorlat és a molekuláris szintű alapkutatások kapcsolódása teremtette meg jelenlegi munkánk bázisát, melynek célja egy egyedi gímszarvas DNS-profil felállítására alkalmas genetikai marker készlet kialakítása, és gyakorlati felhasználásra történő adaptációja. Munkám elsődlegesen olyan ivari kromoszómás mikroszatellita markerek fejlesztése, melyek lehetővé tennék gímszarvas apai vonalak részletes feltérképezését és nyomon követését. Ezen vizsgálatokat összevetném mitokondrium D-loop szekvencia adatokkal, így a populációk diverzitásának felmérését, illetve a leszármazási vonalak követését is pontosítanám. Munkám során alapvető fontosságú volt a gímszarvas genom szekvenciájának meghatározása, mely szekvenálási adatok az NCBI adatbankjába is feltöltésre kerültek (MKHE ); továbbá a CerEla1.0 referencia genomszekvencia is elérhető a GenBankban. A munka során a következő alapvető célokat tűztem ki. 1) Genom szevenálásból származó adatokból bioinformatikailag feltérképezni a gímszarvas genomban (CerEla1.0) található mikroszatellita markereket, és a megfelelő lókuszokra PCR vizsgálathoz használható primereket tervezni. 2) A tervezett primer párok közül ivari kromoszómás markerek válogatása, tesztelése és optimalizálása PCR alapú genotipizálási eljáráshoz. 3) A fejlesztett markerek segítségével magyarországi gímszarvas populációk egyedeinek genotipizálása genetikai diverzitás felmérése, valamint apai leszármazási vonalak feltérképezésére. 4) Az újonnan fejlesztett markerekkel kapott diverzitásmutatók összevetése autoszómás mikroszatellita markerekkel kapott diverzitás értékekkel, illetve a mitokondriális kontroll régió szekvencia analízisével kapott eredményekkel. 24

27 5. ANYAG ÉS MÓDSZER 5.1. MINTAVÉTEL ÉS DNS IZOLÁLÁS A markerfejlesztés alapját képező genomszekvencia meghatározásához, valamint a markerek teszteléséhez a Kaposvári Egyetem Vadgazdálkodási Tájközpontból (Bőszénfa, Somogy megye) származó, zártkertben tartott és nevelt gímszarvas bikák vérmintáit használtam fel. A vérvételt képzett állatorvos végezte 7 bikából, az állatok alapvető egészségügyi kezelésének részeként. A vérmintákat 9 ml-es EDTA borítású vérvételi csövekbe gyűjtötték és felhasználásig -20 C-on tároltuk. Az ivari kromoszómás markerek teszteléséhez ezen túlmenően a vérvételen átesett fiatal bikák anyaállatából, összesen 5 tehénből, szőrminták gyűjtése is történt. A szőrminták tárolása száraz borítékban, a mintavétel után a lehető leghamarabbi lefagyasztást követően -20 C-on történt. A populációgenetikai vizsgálatokhoz legálisan szervezett vadászatok során terítékre került gímszarvas bikákból történt szövet mintavétel a 2014/2015-ös vadászati szezonban. A mintavétel során 123 gím bikából történt harántcsíkolt izomszövet (hús) gyűjtése abszolút etanolt tartalmazó mintavételi csövekbe. A szövetminták adatait a laborba érkezéskor az általunk vezetett biobankban rögzítettük, a szövetmintákat felhasználásig -20 C-on tároltuk. Teljes genomi DNS izolálása vérmintákból Duplicα Prep Automated DNA/RNA Extraction System (EuroClone, Olaszország), a tüszővel rendelkező szőrszálakból QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Németország), az izomszövet mintákból pedig Genomic DNA Mini Kit (Geneaid Biotech, Tajvan) segítségével történt, a gyártók utasításait követve. Az izolált DNS minták mennyiségét és minőségét NanoDrop (Thermo Scientific, USA) készülékkel ellenőriztem, majd felhasználásig -20 C-on tároltuk azokat. A genomszekvencia meghatározásához szükséges DNS mintákat hígítatlanul 25

28 használtuk, a PCR vizsgálatokhoz pedig desztillált vízzel 15 ng/μl koncentrációra hígítottam a mintákat, és a hígított DNS mintákat használtam BIOINFORMATIKAI MIKROSZATELLITA KERESÉS A bioinformatikai markerfejlesztés alapját a genomszekvenálás eredményeként kapott szekvenciák (readek) de novo illesztésével kialakult összefüggő genomszakaszok (scaffoldok) jelentették. Ezek teljes hossza bp, scaffoldba rendezve. Időközben a scaffoldok kromoszómákba rendezése is megtörtént, így kialakult az első gímszarvas referencia genom, a CerEla1.0; de a munkám kezdetén még a scaffoldok jelentették a markerfejlesztés alapját. Így az ismétlődő motívumok (mikroszatelliták) szűrése a scaffold szekvenciákon történt, QDD Perl szkript csomag (Meglécz et al. 2010) segítségével. A mikroszatellita szűréshez mononukleotidok estében 10, dinukleotidok esetében 7, trinukleotidok esetében 5, tetra-, penta- és hexanukleotidok esetében 3-3 minimális ismétlődésszám lett beállítva, legalább 200 bp határoló régióval mindkét oldalon. Az egyéb paramétereket alapbeállításon hagytam. A mindkét oldalon legalább 80 bp hosszúságú határoló régióval rendelkező egyedi lókuszokra Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000) segítségével terveztem primereket. A tervezési beállítások közül a primerek hossza nukleotid, 21 nukleotid optimummal, a primerek tapadási hőmérséklete C, 60 C optimummal, a termék mérete pedig bp között lett megadva; az egyéb alapbeállításokon nem változtattam. A gímszarvas genom összeállított X és Y kromoszómájára eső scaffoldok szarvasmarha referenciához illesztése BLAST (Altschul et al. 1990) program segítségével történt, az összeállított gímszarvas X és Y kromoszóma ellenőrzése céljából. A mikroszatellita adatbázisunkat ezután az ezen X és Y 26

29 kromoszómás régiókkal szűrtem az ivari kromoszómás mikroszatelliták kiválogatására. Ezen szűréseket saját Perl szkriptek segítségével végeztem IVARI KROMOSZÓMÁS STR MARKEREK FEJLESZTÉSE Az ivari kromoszómás mikroszatelliták közül 18 lókuszt, valamint a rájuk tervezett primereket választottam ki genetikai vizsgálatokhoz. UCSC In-Silico PCR adatbázis ( Speir et al. 2016) segítségével ellenőriztem, hogy a kiválasztott primer párok szarvasmarha referencián is X illetve Y kromoszómán adnak terméket. Az Y kromoszóma fajok közötti nagyfokú konzervációja miatt (Gallagher & Womack 1992, Murphy et al. 1999) a szarvasmarha ivari kromoszómára térképeződő primerekről joggal feltételezhetjük, hogy gímszarvasban is a megfelelő kromoszómára bekötve adnak PCR terméket. Ezután a kiválasztott primereket egyesével teszteltem gímszarvas DNS mintákon. Az egyedi PCR-ek során detektálható terméket adó primerpárokat nagyság szerint két 8-8 primer párt tartalmazó multiplex rendszerbe rendeztem, és az így kapott multiplexeket optimalizáltam PCR vizsgálathoz. A markerek egyedi ellenőrzéséhez a vérvételen átesett bőszénfai bikák mintáit használtam, a multiplexek optimalizálásához pedig az egyik gím tenyészbika 5 bikaborjának valamint a fiatal bikák anyaállatának mintáit dolgoztam fel; a mintaszettel kapott eredményeken ellenőriztem a markerek öröklődését is. Az optimalizált multiplexek 15 μl végtérfogatban lettek összemérve, 45 ng templát DNS mintát, 1 QIAGEN Multiplex PCR Master Mixet (QIAGEN, Németország) és optimalizált mennyiségű primert ( mm) tartalmaztak, desztillált vízzel hígítva. Az amplifikáció GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) készülékben zajlott, egy kezdeti 15 perces lépéssel 95 ºC-on, amit 29 ciklus követett az alábbi lépésekből 30 másodperc 27

30 94 ºC, 90 másodperc 60 ºC és 60 másodperc 72 ºC, egy végső extenzióval 60 perc 60 ºC. A későbbi populációgenetikai vizsgálatokhoz is ezt a protokollt használtam. Az egyedi reakciók sikerességét, azaz, hogy adott PCR eredményezett-e terméket, agaróz gélelektroforézis segítségével értékeltem, 2%-os agaróz gélben, GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Scientific, USA) segítségével POPULÁCIÓGENETIKAI VIZSGÁLATOK STR MARKEREKKEL A populációgenetikai vizsgálatokhoz 130 gímszarvas bika mintát dolgoztam fel, 5 különböző élőhelyről (Bőszénfa N=7; Lábod N=21, Vajszló N=15, Gemenc N=51, Zemplén N=36). Az ivari kromoszómás mikroszatellitákat tartalmazó multiplexek esetében a már ismertetett optimalizált PCR protokoll alapján végeztem a vizsgálatokat, Szabolcsi és munkatársai (2014) által fejlesztett autoszómás mikroszatellita multiplexek vizsgálatakor pedig a leírt protokollt követtem, annyi változtatással, hogy ezek a reakciók is QIAGEN Multiplex PCR Kit (QIAGEN, Németország) használatával lettek összemérve. Az amplifikáció GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) készülékben zajlott, az ivari kromoszómás multiplexek esetében a korábban ismertetett programmal, az autoszómás multiplexek esetében az eredeti szerzők protokollja alapján (Szabolcsi et al. 2014). Az STR markerek vizsgálatához fluoreszcensen jelölt primereket használtunk, a PCR termékek detektálása az allélméretek meghatározásához kapilláris elektroforézissel történt egy ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) segítségével. Az elektroferogrammok PeakScanner szoftver (Applied Biosystems, USA) segítségével lettek feldolgozva, az állatok genotípusait Excel táblázatban rögzítettem, és a különböző szükséges formátumokra alakítás is ebből a genotípus táblázatból történt a GenAlEx Excel bővítmény 28

31 (Peakall & Smouse 2012) segítségével. A nullallélok és genotipizálási hibák feltárására MICRO-CHECKER programot (Van Oosterhout et al. 2004) használtam. A CERVUS program Identity Analysis (Kalinowski et al. 2007) opciója segítségével ellenőriztem a minta szettet a megegyező genotípusok kiszűrésére. Az egyedi genotípusok alapján az allélgyakoriságok, valamint ivari kromoszómás mikroszatelliták esetében a haplotípus gyakoriságok meghatározása, továbbá az alléldiverzitások és heterozigozitás értékek számítását CERVUS (Kalinowski et al. 2007) és GenAlEx (Peakall & Smouse 2012) segítségével végeztem. A Hardy-Weinberg egyensúly eltéréseit exactteszt (Guo & Thomson 1992) alkalmazásával és Bonferroni-korrekcióval vizsgáltam CERVUS (Kalinowski et al. 2007) használatával. Az allélgyakoriságok alapján Shannon-Weaver diverzitás indexet, haplotípus gyakoriságok alapján pedig Nei-féle haplotípus diverzitás értéket (Nei & Tajima 1981) számoltam a genetikai sokszínűség meghatározására a GenAlExben (Peakall & Smouse 2012). Az egyedi genotípusokat főkomponens analízissel (PCA) és klaszteranalízissel is értékeltem, az egyedek populációhoz rendelése céljából. A PCA számítása a varianciakovariancia mátrixból történt Jaccard index alapján, a klaszteranalízist Jaccard hasonlósági index párosított csoport algoritmussal végeztem PAST program (Hammer et al. 2000) segítségével. A genetikai struktúra vizsgálatát a Structure program algoritmusával (Pritchard et al. 2000) is elvégeztem. Az elemzés az admixture modell használatával, korreláló allélgyakoriságok beállítás mellett futott ismétléses burn-in periódus után ismétléssel egytől hétig terjedő K értékig, minden K értékre 3 független futással. A genetikai klaszterek legvalószínűbb számának megállapításához a likelihood score értékét, valamint a második deriváltjának változását (Evanno et al. 2005) határoztam meg Structure Harvester (Earl & vonholdt 2012) segítségével. 29

32 5.5. MITOKONDRIÁLIS KONTROLL RÉGIÓ VIZSGÁLATA A mitokondriális kontroll régió vizsgálatához a teljes D-loopot és az azt határoló két trns gén részleges szekvenciáját tartalmazó 1014 bp-os szakaszt szaporítottam fel L-Pro és H-Phe primerekkel (Fickel et al. 2012). A reakciók 25 μl végtérfogatban lettek összemérve, 60 ng templát DNS, 1 Phusion HF Buffer (Thermo Scientific, USA), 0,4 U Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase enzim (Thermo Scientific, USA), az egyes dntp-ből 0,8-0,8 mm és a primerekből 0.28 mm tartalommal, desztillált vízzel hígítva. Az amplifikáció GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) készülékben zajlott, egy kezdeti 30 másodperces lépéssel 98 ºC-on, amit 35 ciklus követett az alábbi lépésekből 30 másodperc 98 ºC, 30 másodperc 62,5 ºC és 70 másodperc 72 ºC, egy végső extenziós lépéssel 5 perc 72 ºC. A reakciók sikerességét, agaróz gélelektroforézis segítségével értékeltem, 2%- os agaróz gélben, GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific, USA) segítségével. A PCR termékeket Gel/PCR Fragments Extraction Kit (Geneaid Biotech, Tajvan) segítségével tisztítottam, majd a szekvenciájuk meghatározása Sanger-féle láncterminációs módszerrel történt mindkét irányból, az amplifikációhoz is használt primerekkel, egy ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) készüléken. A szekvenciák feldolgozásához DNAStar (DNASTAR Inc., USA) programcsomag SeqMan modulját használtam. A mitokondriális DNS nehéz láncának nukleotid szekvenciáit MEGA6 (Tamura et al. 2013) szoftver ClustalW algoritmusával illesztettem egymáshoz. A haplotípusok meghatározásához, valamint a populációk összehasonlításához DnaSP (Librado & Rozas 2009) programot használtam. A szekvenciák közötti filogenetikai kapcsolatok feltárása Markov láncú Monte Carlo (MCMC) ismétlések segítségével történt a BEAST (Drummond et al. 2012) beépített Bayesi algoritmusával; ismétléssel, az első ismétlést burn-in periódusként használva. 30

33 6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 6.1. BIOINFORMATIKAI MIKROSZATELLITA KERESÉS A teljes gímszarvas genomban összesen mikroszatellita motívumot azonosítottam lókuszon (2. ábra), a mikroszatellita motívumokat tartalmazó lista a Mezőgazdasági Biotechnológiai Központ (MBK) szerverén ( elérhető. A mikroszatelliták közül lókusz egyszerű ismétlődést tartalmaz, lókusz pedig összetett ismétlődést, azaz legalább kettő ismétlődő motívum található egymástól 100 bp távolságon belül. A mononukleotid ismétlődések voltak a leggyakoribbak ( db; 45,65%), amit sorban a tetranukleotid ( db; 26,06%), dinukleotid ( db; 12,97%), pentanukleotid ( db; 10,26%), trinukleotid ( db; 3,74%) és hexanukleotid ( db; 1,32%) STR-ek követtek (3. ábra). Ettől eltérően korábbi szakirodalmakban a di- és trinukleotid motívumok nagyobb számot mutattak a tetranukleotid lókuszoknál gerincesek genomjában (Sharma et al. 2007, Sarika et al. 2013, Yu et al. 2011, Liu et al. 2017). Ez az eltérés adódhat abból, hogy a korábbi kutatásokban más módszereket használtak a mikroszatelliták detektálására. A tetranukleotid ismétlődések magas aránya azért fontos, mert technikailag az ilyen markerek allélhosszúságainak értékelése a legkönnyebb (Edwards et al. 1991, Szabolcsi et al. 2014), ami előnyös a genetikai vizsgálatok szempontjából. A különböző hosszúságú ismétlődéseken belül a leggyakoribb motívumok a C/G (mononukleotidok 56,7%-a), a CA/TG (dinukleotidok 30,2%-a), az AGC/GCT (trinukleotidok 22,8%-a), AAAT/ATTT (tetranukleotidok 12,3%-a), ACTGA/TCAGT (pentanukleotidok 29,1%-a) és AAAAAC/GTTTTT (hexanukleotidok 6,8%-a) voltak. Primer tervezés lókuszra történt, primer szekvenciákat listája szintén elérhető az MBK szerverén ( Jelenleg ez a 31

34 legnagyobb ismert gímszarvas STR marker adatbázis, amely későbbi populációgenetikai vizsgálatokhoz szükséges markerek fejlesztésére is használható, így nagyban megkönnyítheti a kutatók munkáját. Az STR-ek filogenetikailag rokon fajok közötti nagyfokú konzerváltsága miatt (Goodman et al. 1999, Szabolcsi et al. 2014, Willems et al. 2016) mind gímszarvas mind más szarvasfélék, például őz, dámszarvas, szikaszarvas, esetében hasznos lehet ez az adatbázis. Az összes scaffold közül 1779 illeszkedett a szarvasmarha X referencia kromoszómára, 78 pedig az Y kromoszómára. Ezek alapján a gímszarvas X kromoszómán mikroszatellita lókusz, az Y kromoszómán pedig 714 lókusz található (4. ábra). A bioinformatikai markerfejlesztés a genomi szekvenciák felhasználásával jelentősen egyszerűsítette új STR markerek fejlesztését, a hagyományos módszerekhez képest jelentősen rövidebb idő alatt sikerült nagy mennyiségű potenciális markerjelöltet találni, így ezzel a módszerrel lényegesen időhatékonyabb a markerfejlesztés folyamata (Sharma et al. 2007, Yu et al. 2011, Castoe et al. 2012, Cai et al. 2013). 32

35 2. ábra. A gímszarvas genomban található mikroszatellita motívumok száma; mono - mononukleotid, di - dinukleotid, tri - trinukleotid, tetra - tetranukleotid, penta - pentanukleotid, hexa - hexanukleotid ismétlődések. 3. ábra. A gímszarvas genomban található mikroszatellita motívumok aránya; mono - mononukleotid, di - dinukleotid, tri - trinukleotid, tetra - tetranukleotid, penta - pentanukleotid, hexa - hexanukleotid ismétlődések. 4. ábra. A gímszarvas nemi kromoszómákon található mikroszatellita motívumok száma; mono - mononukleotid, di - dinukleotid, tri - trinukleotid, tetra - tetranukleotid, penta - pentanukleotid, hexa - hexanukleotid ismétlődések. 33

36 6.2. IVARI KROMOSZÓMÁS STR MARKEREK Az ivari kromoszómás markerek közül 18 lókuszra tervezett primer párt választottam ki genetikai vizsgálatokhoz. A primerek válogatásánál fontos szempont volt, hogy a bioinformatikailag prediktált terméknagyságok eltérőek legyenek, illetve törekedtem a kisebb méretű (300 bp alatti) termékek kiválasztására, mivel ezek értékelése degradált mintákból is működhet (Szabolcsi et al. 2014). A primer párok közül 3 nem adott értékelhető PCR terméket, ezért azokat a további vizsgálatokhoz nem használtam. Így a fejlesztett markerek több mint 83%-a használhatónak bizonyult, ami jobb hatékonyságot jelent mint amit hagyományos mikroszatellita markerfejlesztési módszerekkel el tudtak érni (Zane et al. 2002, Thiel et al. 2003). Az elővizsgálatokat követően működőképesnek bizonyuló 15 primer párt a PCR termékek nagysága szerint két 8 primer párt tartalmazó multiplex rendszerbe rendeztem, a legnagyobb terméket adó primer párt mindkét multiplexben használva. A primerek szekvenciája, fluoreszcens jelölése, kromoszóma lokalizációja és a PCR termékek mérettartománya az 1. táblázatban látható. Az alkalmazott markerek nagy száma és az átfedő terméknagyságok miatt volt szükség a markerek két multiplexbe rendezésére. Ezen lókuszok közül 13 mutatott az eddig levizsgált gímszarvas mintákon polimorfizmust, azaz legalább két eltérő nagyságú allélt. Az egy lókuszon található allélek száma 1 és 6 között változott, az átlagos allélszám 3,3 volt (1. táblázat). A számított átlagos géndiverzitás érték 0,27, a legmagasabb géndiverzitást a Cel_010 marker mutatta, a legalacsonyabbat a két monomorf marker, Cel_002 és Cel_015 (2. táblázat). A két monomorf marker 0 géndiverzitás értékének oka a polimorfizmus hiánya. A Cel_010 marker magas diverzitását pedig a lókuszon található allélek magas száma okozza; 6 különböző nagyságú allélt detektáltam ezen a lókuszon. 34

37 Az Y kromoszómás mikroszatelliták géndiverzitása, mint a markerek információtartalmának mértéke, megfeleltethető az autoszómás mikroszatelliták esetében használt kizárási valószínűség értékeknek (Kayser et al. 1997), ami a markerek használhatóságát mutatja. Ezek alapján a fejlesztett ivari kromoszómás markerek, a monomorf lókuszokat leszámítva, közepesen informatív markereknek tekinthetők, amelyek géndiverzitás értéke 0,25 és 0,5 közötti. Az ivari kromoszómák öröklődése miatt az ivari kromoszómás lókuszokon az egyes allélek nem véletlenszerű kombinációban határoznak meg egy adott DNS-profilt, hanem kapcsoltan öröklődnek (Spurdle & Jenkins 1992, Jobling et al. 1997). Így a markerek együttes megbízhatósága növekedhet, így alkalmassá téve ezeket a markereket populációgenetikai felhasználásra. Megemlítendő, hogy a Cel_010 marker esetében bizonyos egyedek heterozigozitást mutattak, azaz két eltérő allélt tudtam detektálni. Mivel a vizsgálatban gímszarvas bikákat genotipizáltam, és heterozigozitás csak ezen a lókuszon volt jelen, feltételezhető, hogy a lókusz az ivari kromoszómák rekombinálódó régiójában található. A lehetséges rekombinációs események miatt a lókuszon található allélok öröklődése nem egyértelműen kapcsolható az X vagy Y kromoszómához, ezért ezt a markert a további vizsgálatoknál nem vettem figyelembe. 35

38 1. táblázat. A gímszarvas ivari kromoszómás mikroszatelliták elnevezése (STR), kromoszóma lokalizációja (Kr), a használt primerek szekvenciája (F és R) és fluoreszcens jelölése, továbbá a multiplex reakció (MP), a levizsgált minták száma (N), detektált allélek száma (N A) és mérettartománya bázispárban megadva. STR Kr Primer szekvencia (5-3 ) Jelölés MP N N A Méret Cel_001 X F: GCCATCTGCCTGGTGAAG PET R: CTCATCTCTGTCCGTAAACAAGG Cel_002 X F: TGCTTTAGGCAAATTCCTATTGT R: TTTGGTCTTATCCCCACCA 6-FAM Cel_003 X F: CCCTCCCTCCCTTCTTCCTT VIC R: TGTGTTCACTGAAGGATCTGTT Cel_004 X F: TCTTCTCTCCCTCTTAGGCACA NED R: AAGAGAGTGGAGATGTAGGTGT Cel_005 X F: ATGCCATGCTCACGTGTCT R: TTGGCTAAACTCGCCTGAGC PET Cel_006 X F: TTGCTGTTCTCTACCCCAGAA R: AGAGATTCATTCAGTCACCAAGTA 6-FAM Cel_007 X F: CCCTCTCCAGAAATAATGCTATTAACA VIC R: GCTTAGTGTAGTGCCTGGCA Cel_008 X F: CAAGTGGTTGGTTCAGATGCT NED R: TGGGAAGCCCAAATAATACCT Cel_009 X F: TGGCTTGGCTCCATATGCAT R: CCCAAAGGTGTGCTGTCTACA NED Cel_010* X/Y F: AAATCCAACAATGCTTCATCC R: CCCATGTGATCATGGTATATAATCT VIC Cel_011 X F: ATCTGGTTAGTCACTGTATTTCATTCC PET R: AAGAACCAGCACAGCCAGATAA Cel_012 Y F: AAATAGCTGAGACATGGGAGTC PET R: CCCTGCCATACCATCAGA Cel_013 Y F: CAGGCATATTTGCATCAGAA VIC R: ACCTCACCATTCTCTCACCTTC Cel_014 Y F: GAAAGCAAAATATAAATTTGAAGAACA R: TCCACTTCTTGGTTTTCAGAGA NED Cel_015 Y F: CCCCTGCAGTGGAAACAC R: CAAACCTAAACAGCACAAGCA 6-FAM * A marker esetében bizonyos egyedek heterozigozitást mutattak, azaz két eltérő allélt hordoztak, feltételezhető, hogy ez a lókusz az ivari kromoszómák rekombinálódó régiójában található. A lehetséges rekombinációs események miatt a lókuszon található allélok öröklődése nem egyértelműen kapcsolható az X vagy Y kromoszómához, ezért ezt a markert a további vizsgálatoknál nem vettem figyelembe. 36

39 2. táblázat. A gímszarvas ivari kromoszómás mikroszatellita markerek géndiverzitás értékei. STR Géndiverzitás Cel_001 0,120 Cel_002 0,000 Cel_003 0,045 Cel_004 0,341 Cel_005 0,030 Cel_006 0,074 Cel_007 0,621 Cel_008 0,304 Cel_009 0,145 Cel_010 0,662 Cel_011 0,575 Cel_012 0,387 Cel_013 0,306 Cel_014 0,000 Cel_015 0,554 Átlagos 0,270 37

40 Az egyes markerek allélgyakoriság eloszlását a 5. és 6. ábra mutatja földrajzi régiónként. A Cel_12 marker kivételével egy populációban, a többi Y kromoszómás marker allélgyakoriságai unimodális eloszlást mutatnak egy gyakori alléllal és egy-két szomszédos alléllal. Ez a fajta eloszlás általános az Y kromoszómás markerek esetében (de Knijff et al. 1997), és jól illeszkedik a mikroszatelliták stepwise mutációs modelljéhez, amely új allélek keletkezését egyetlen ismétlődés kiesésével vagy hozzátoldódásával magyarázza (Ohta & Kimura 1973, Valdes et al. 1993). Az X kromoszómás markerek allélgyakoriságai is hasonlóan alakultak. 5. ábra. Az Y kromoszómákon található 4 mikroszatellita marker allélgyakoriság eloszlása magyarországi gímszarvas populációkban. A kis grafikonok Y tengelye az allégyakoriságokat, X tengelye az allélhosszokat mutatja. 38

41 6. ábra. Az X kromoszómákon található 10 mikroszatellita marker allélgyakoriság eloszlása magyarországi gímszarvas populációkban. Minden kis grafikonon az Y tengely az allégyakoriságokat az X tengely az allélhosszokat mutatja. 39

42 6.3. IVARI KROMOSZÓMÁS VONALAK Az ivari kromoszómás vonalak vizsgálatát a markerek öröklődésének ellenőrzésével kezdtem. Ehhez egy bőszénfai gímszarvas bika, valamint 5 bikaborja és azok anyaállatának mintáin végeztem. Az anyaállatok ismertek voltak, de a Szabolcsi és munkatársai (2014) által fejlesztett autoszómás STR markerekkel is ellenőriztem. Az autoszómás STR-ek egy szülő ismeretében a második szülőre számított egyedazonosítási valószínűsége (PIPar), alapján a borjú-anya párok megfeleltetése nagyon valószínű volt (3. táblázat). A leggyengébb megfeleltetés is csak 10-6 nagyságrendű tévesztést adott az anyaállatra, egy nem levezethető alléllal, a többi esetben pedig minden allél levezethető volt az ismert szülőpártól. A szülőpárok és utódaik vizsgálata is megerősítette, hogy a fejlesztett markerek ivari kromoszómákra esnek, a várt mintázat szerint a borjakban talált allélek az Y kromoszómás markerek esetében az apa alléljaival, az X kromoszómás markerek esetében az anya alléljaival egyeztek meg, aminek a szemléltetése a 4. táblázatban látható. 3. táblázat. A gímszarvas borjak anyasági vizsgálata autoszómás mikroszatellita markerek alapján, a szülőpártól nem levezethető markerek (Mismatch) számának és a tévesztési valószínűség (PI Par) megadásával. Borjú Tehén Mismatch azonosító azonosító PI Par 1526 C , C , C , C , C ,

43 4. táblázat. Az ivari kromoszómás markerek öröklődésének szemléltetése az allélnagyságok megadásával egy-egy gímszarvas szülőpár és bika borjuk esetében. STR Cel_001 Cel_002 Cel_003 Cel_004 Cel_005 Cel_006 Cel_007 Cel_008 Cel_009 Kr X X X X X X X X X Cel_010 X/Y Cel_011 Cel_012 X Y Tehén Borjú Bika Borjú Tehén (C7248) (1526) (CS4300) (1528) (C7006) 92 bp 94 bp 98 bp 98 bp 98 bp 98 bp 98 bp 114 bp 114 bp 114 bp 114 bp 114 bp 114 bp 114 bp 132 bp 132 bp 132 bp 132 bp 132 bp 136 bp 132 bp 152 bp 152 bp 152 bp 152 bp *154 bp 154 bp 154 bp 209 bp 212 bp 212 bp 212 bp 212 bp 212 bp 212 bp 99 bp 99 bp 101 bp 101 bp 101 bp 101 bp 101 bp 117 bp 125 bp *117 bp 121 bp *117 bp 117 bp 121 bp 134 bp 136 bp *134 bp 136 bp 136 bp 136 bp 136 bp 154 bp 158 bp 158 bp 158 bp 158 bp 158 bp 158 bp 229 bp *229 bp 231 bp 231 bp 231 bp 235 bp 231 bp 231 bp 231 bp 231 bp 291 bp 295 bp *295 bp 297 bp 297 bp 295 bp 297 bp bp 288 bp 288 bp Cel_013 Y bp 375 bp 375 bp - Cel_014 Y bp 416 bp 416 bp - Cel_015 Y bp 457 bp 457 bp - * A jelölt X kromoszómás allélek a bikában nem voltak jelen, csak az anyától eredhetnek. 41

44 Ezek után az ivari kromoszómás vonalak vizsgálatát 5 populációból származó 130 gímszarvas bikán végeztem. A rekombináció hiánya miatt az ivari kromoszómás lókuszokon az egyes allélek nem véletlenszerű kombinációban határoznak meg egy adott DNS-profilt, mivel kapcsoltan öröklődnek. A kapcsolt allélek specifikus kombinációját haplotípusnak nevezzük (Jobling et al. 1997), Y kromoszómás populációs és evolúciós felmérések esetén informatívabb a haplotípus-gyakoriságokkal számolni az autoszómás rendszereknél használatos allélgyakoriságokkal szemben (Spurdle & Jenkins 1992, Kayser et al. 1997). A vizsgált gímszarvas bikákban 19 különböző Y kromoszómás vonalat (7. ábra és 1. melléklet), valamint 76 különböző X kromoszóma haplotípust (8. ábra és 3. melléklet) tudtam elkülöníteni. A 19 Y kromoszómás vonal közül 11 csak egy-egy populációban volt jelen, a többi vonal viszont több populációban is megfigyelhető volt. A leggyakoribb Y kromoszómás vonalba (Y_04) 50 egyed tartozott, ez a vonal mindegyik vizsgált vadon élő populációban jelen volt. Ezen túl még egy Y kromoszómás vonal (Y_01) volt 43 egyedben megfigyelhető, a vad populációk mellett a 7 vizsgált bőszénfai farmi gímszarvas mintából 6 szintén ezt a haplotípust hordozta. A többi vonalhoz csak néhány egyed tartozott, ezek gyakorisága jóval alacsonyabb volt. Az Y kromoszómás vonalak alacsony száma arra utal, hogy az egyes populációk néhány alapító bikára vezethetők vissza. A lábodi populációban csak 5, a vajszlói populációban csak 4 Y kromoszómás vonalat találtam, ezek között volt a két leggyakoribb vonal (Y_01 és Y_04), amelyekhez mindkét populációban a bikák több mint 80%-a tartozott. A gemenci és a zempléni populációkban ennél nagyobb változatosság volt jelen, Gemencen 10, a Zempléni hegységben 11 haplotípussal (5. táblázat). Ebben a két populációban is az Y_01 és Y_04 vonal fordult elő a legnagyobb gyakorisággal, de kevésbé voltak dominánsak mint Lábodon vagy Vajszlón. Zemplénben a leggyakoribb Y kromoszómás vonal is csak a bikák 36%-ban fordult elő. Az egyes 42

45 populációkban jelentősen eltért az egyes Y kromoszómás vonalak gyakorisága. Ezt főleg az unikális (csak egy populációban előforduló) haplotípusok okozták. Az ilyen egyedi haplotípusok magas diverzitásra utalnak, bár az alacsony mintaszámok torzíthatják a diverzitás értékét. A Neiféle haplotípus diverzitásra a zempléni mintákban kaptam a legmagasabb értéket, a bőszénfai mintákban a legalacsonyabbat. A bőszénfai minták esetében az alacsony diverzitást az alacsony mintaszám mellett az okozza, hogy a vizsgált 7 bika közül 6 ugyanazt a haplotípust mutatta, ami nem meglepő, mivel a vizsgált állatok közül 5 fiatal bika az egyik vizsgált tenyészbika utóda volt. Így tulajdonképpen ebben az állományban erősen torzított mintavétel után két Y kromoszómás vonal volt kimutatható (1. melléklet és 2. melléklet). Ez a két leszármazási vonal nem csak a zártkerti állatokban, hanem a környező természetes populációkban is jelen volt, így legalábbis ez a hét bika nem különült el a közeli populációktól. 5. táblázat. Y valamint X kromoszómás haplotípusok száma (N H), Y és X kromoszóma haplotípus diverzitás (D) és a markerekre összesített Shannon-Weaver Index (I) értéke magyarországi gímszarvas populációkban. Y kromoszóma X kromoszóma Populáció N N H D N H D I Bőszénfa 7 2 0, ,000 0,205 Lábod , ,976 0,401 Vajszló , ,000 0,345 Gemenc , ,973 0,405 Zemplén , ,979 0,689 43

46 Az Y kromoszóma vonalak filogenetikai fája (7. ábra) két ágra ágazik, azaz két klád jelenlétére utal. Ez azt jelenti, hogy a magyarországi gímszarvasokban két apai leszármazási ág van jelen. Az I. kládot az Y_11 és Y_19 közötti vonalak alkotják, a II. kládot pedig az Y_01 és Y_10 közöttiek. Az Y kromoszómás vonalak filogenetikai helyzete, azaz, hogy a fa melyik ágán helyezkednek el, nem mutat egyezést a bikák földrajzi eredetével; a filogenetikai fa mindkét ágán találhatók mind a Dunántúlról mind a Zemplénihegységből származó állatok. Az Y_03, Y_07, Y_15, Y_17 és Y_19 vonalakat csak zempléni állatokban, míg az Y_06, Y_08, Y_09, Y_11, Y_12, Y_13, Y_14 és Y_18 vonalakat csak a dunántúli populációkban detektáltam, a többi vonal mindkét régióban jelen volt. A földrajzi távolság ellenére a populációk között, legalábbis a bikák esetében genetikai keveredés figyelhető meg, amit a bikák vándorlási hajlama okozhat (Szemethy et al. 1999, Catchpole et al. 2004, Frantz et al. 2008, Hoffmann et al. 2016). Ugyan a keveredést okozhatnák emberi betelepítések is, ha az egyik leszármazási vonalhoz tartozó állatokat az emberek telepítették a Kárpát-medencébe. A faj fontossága miatt évszázados múltja van gímszarvas egyedek áttelepítésének (Haanes et al. 2010, Carden et al. 2012, Stanton et al. 2016, Frantz et al. 2017), ami kifejezetten érintette a bikákat (Apollonio et al. 2010), de ennek az Y kromoszómás vonalakra gyakorolt hatásáról ezidáig nem áll rendelkezésre vizsgálat. Mivel az Y kromoszómás vonalakról nincsenek referencia minták melyek segítségével a vonalak európai eredetét vizsgálhatnám, egyelőre nem lehet megmondani, hogy melyik leszármazási vonal honnan származik. 44

47 7. ábra. Magyarországi gímszarvas Y kromoszómás vonalak. A színek az egyedek származási helyét jelölik; lila - Bőszénfa, sötétkék - Lábod, világoskék - Vajszló, zöld - Gemenc, piros - Zemplén. 45

48 8. ábra. Magyarországi gímszarvas X kromoszómás vonalak. A színek az egyedek származási helyét jelölik; lila - Bőszénfa, sötétkék - Lábod, világoskék - Vajszló, zöld - Gemenc, piros - Zemplén. 46

49 9. ábra. Magyarországi gímszarvas Y kromoszómás vonalak. A körök mérete arányos a haplotípusba tartozó egyedek számával, a színek az egyedek származási helyét jelölik; lila - Bőszénfa, sötétkék - Lábod, világoskék - Vajszló, zöld - Gemenc, piros - Zemplén. 10. ábra. Magyarországi gímszarvas X kromoszómás vonalak. A körök mérete arányos a haplotípusba tartozó egyedek számával, a színek az egyedek származási helyét jelölik; lila - Bőszénfa, sötétkék - Lábod, világoskék - Vajszló, zöld - Gemenc, piros - Zemplén. 47

50 Az ivari kromoszómás markerek által meghatározott haplotípusok segítségével az egymáshoz kapcsolódó populációk genetikai struktúrája és genetikai kapcsolata is vizsgálható (Roewer et al. 1996, de Knijjf et al. 1997). A populációk közötti páronkénti közös Y vonalak, és ezek gyakorisága alapján számított egyezési valószínűségek az 6. táblázatban láthatók. A legtöbb közös Y kromoszóma vonalat a gemenci és a zempléni populáció között találtam, bár megjegyzendő, hogy a többi populáció esetében az alacsony mintaszámok miatt a közös haplotípusok száma alulbecsült lehet. A közös vonalak rendkívül alacsony száma ellenére a populációk egyezési valószínűségei viszonylag magas értéket mutatnak. Bár ez nem túl meglepő, ha figyelembe vesszük a mintavétel korlátozott földrajzi léptékét; távolabbi populációk vizsgálata esetében határozottabb elkülönülést várhatunk (de Knijjf et al. 1997). Szintén befolyásolja az egyezési valószínűségeket, hogy a két leggyakoribb Y kromoszómás vonal szinte az összes populációban megtalálható és nagyon gyakori, így ez minden összehasonlítás esetében felfelé mozdítja az egyezési valószínűségek értékét. A lábodi, vajszlói és gemenci populációk apai vonalai nagyobb hasonlóságot mutatnak egymással, míg a zempléni populáció ezektől valamennyire különbözik. Az X kromoszómás haplotípusok nagy száma miatt a haplotípusok többsége, 55 haplotípus, csak egy-egy állatban volt megtalálható, ami legalább egy nagyságrenddel kisebb egyezési valószínűségeket eredményez (7. táblázat), azaz így a populációk jobban elválaszthatók. Meglepő módon a legtöbb közös X kromoszómás haplotípuson a lábodi és a zempléni populáció osztozik, a legkevesebben pedig a lábodi és a vajszlói. Ez szöges ellentétben van a populációk földrajzi távolságával, bár itt is meg kell jegyezni, hogy a lábodi és vajszlói minták alacsony száma miatt ezek az eredmények torzítottak lehetnek. Ezen adatok alapján úgy tűnik, hogy a populációk anyai vonalai jobban különböznek egymástól, mint az apai vonalaik. Erre számítani is lehetett, mivel a gímszarvas bikák hajlamosak a vándorlásra, míg a tehenekre inkább a 48

51 területhűség jellemző (Szemethy et al. 1999, Catchpole et al. 2004, Frantz et al. 2008, Hoffmann et al. 2016). 6. táblázat. Közös Y kromoszóma vonalak az egyes magyarországi gímszarvas populációk között (az átló fölött) és a populációk egyezési valószínűsége (az átló alatt). Bőszénfa Lábod Vajszló Gemenc Zemplén Bőszénfa Lábod 0, Vajszló 0,2857 0, Gemenc 0,1849 0,3436 0, Zemplén 0,3095 0,2037 0,1926 0, táblázat. Közös X kromoszóma haplotípusok az egyes magyarországi gímszarvas populációk között (átló fölött) és a populációk egyezési valószínűsége (átló alatt). Bőszénfa Lábod Vajszló Gemenc Zemplén Bőszénfa Lábod 0, Vajszló 0,0190 0, Gemenc 0,0252 0,0131 0, Zemplén 0,0198 0,0198 0,0074 0, A populációk struktúrájának további vizsgálatára molekuláris varianciaanalízist (AMOVA) végeztem a populációk közötti genetikai variabilitást mutató Φst értékek becslésére. Az Y kromoszómás vonalak esetében a teljes genetikai variabilitás nagy része (87%) az egyedek között található, csak 13%-át okozza a populációk közötti variabilitás (8. táblázat). A populációk az apai vonalaik alapján szignifikánsan különböznek egymástól (Φst = 0,131, p < 0,001). A különböző populációk páronkénti összehasonlításával az apai vonalak elkülönülésének pontosabb 49

52 feltérképezését is elvégeztem. A páronkénti összehasonlítások alapján minden vadon élő populáció különbözik a többitől (minden p 0,04; 9. táblázat). Azaz már ez a négy újonnan fejlesztett Y kromoszómás markerrel leírható haplotípusok alkalmasak a közeli gímszarvas populációk elválasztására. 8. táblázat. Molekuláris varianciaanalízis (AMOVA) szerinti variancia Y kromoszómás STR marker alapján a magyarországi gímszarvasokban. Variancia forrás df SS MS Variancia Populációk között 4 94,355 23,589 0,779 13% Egyedek között ,076 5,185 5,185 87% Teljes ,431 5, % 9. táblázat. Y kromoszóma vonalak AMOVA vizsgálatának eredményei magyarországi gímszarvas populációkban; Φst (átló alatt) és szignifikancia értékek (átló fölött). Bőszénfa Lábod Vajszló Gemenc Zemplén Bőszénfa - 0,024 0,377 0,121 0,078 Lábod 0,166-0,025 0,007 0,040 Vajszló 0,001 0,123-0,015 0,029 Gemenc 0,065 0,133 0,135-0,017 Zemplén 0,064 0,071 0,113 0,063-50

53 6.4. AUTOSZÓMÁS STR MARKEREK A Szabolcsi és munkatársai (2014) által fejlesztett autoszómás STR-ek segítségével is genotipizáltam az ivari kromoszómás markerekkel levizsgált 130 gímszarvasbikát. Az autoszómás markerek esetében relatíve magas diverzitást tapasztaltam, az egy lókuszon található allélek száma 6 és 18 között változott, az átlagos allélszám 13,8 volt (10. táblázat). A markerek közül a C229 lókuszon volt a legkisebb a talált allélok száma (NA = 6), amit már a markerek fejlesztésekor is leírtak (Szabolcsi et al. 2014); a többi marker esetében viszont 10 fölött volt a talált allélek száma. Ez a magas alléldiverzitás megfelel a közép-európai gímszarvasokban leírt értékeknek, és kifejezetten előnyös populációgenetikai vizsgálatokhoz (Zsolnai et al. 2009, Szabolcsi et al. 2014, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Hoffmann et al. 2016, Zachos et al. 2016). A már említett C229 kivételével minden STR esetében a heterozigozitás értékek is magasak voltak, az átlagos várt heterozigozitás 0,833, az átlagos megfigyelt heterozigozitás értéke pedig 0,759. Ezek az értékek megfelelnek a markerekkel korábban genotipizált magyarországi gímszarvasok heterozigozitásának (Szabolcsi et al. 2014), és nem különböznek jelentősen vad gímszarvas populációk heterozigozitásától (Radko et al. 2014, Krojerová- Prokešová et al. 2015, Hoffmann et al. 2016, Willems et al. 2016, Zachos et al. 2016). A C229 esetében az alacsony heterozigozitás oka az volt, hogy a 111 bp hosszúságú allél allélgyakorisága kifejezetten magas volt, 0,7 (11. ábra), ráadásul a 130 vizsgált állatból 69 homozigóta volt erre az allélra. Ennek ellenére elmondható, hogy összességében sem ezen a lókuszon, sem a többi marker esetében nem tapasztaltam szignifikáns eltérést a Hardy-Weinberg egyensúlytól. A C229 marker kivételével a lókuszokra számított diverzitás indexek (PIC és Shannon-Weaver index) értékei is kifejezetten magasnak adódtak, és hasonlóan alakultak a markerek adaptálásakor leírt értékekhez (Szabolcsi et al. 2014). A PIC lókuszonkénti értéke 0,456 és 0,904 között 51

54 változott, a markerekre összesített értéke pedig 0,815. A Shannon-Weaver index értékei lókuszonként 1,004 és 2,552 között voltak, az összes marker átlagában pedig 2,131 (10. táblázat). Az alkalmazott markerek a PIC alapján nagyon informatívnak (Silos Moraes de Castro e Souza et al. 2012), a Shannon-Weaver index alapján pedig nagyon diverznek számítanak (Hennink & Zeven 1991), azaz kifejezetten alkalmasak populációgenetikai vizsgálatokhoz, akár kismértékű különbségek kimutatására is. 10. táblázat. A gímszarvas autoszómás mikroszatelliták (STR), a levizsgált gímszarvas minták száma (N), detektált allélek száma (N A), megfigyelt és várt heterozigozitás értékek (H O és H E), eltérés a Hardy-Weinberg egyensúlytól (HWE), Polymorphism Information Content (PIC), valamint Shannon-Weaver diverzitás index (I) értékek markerenként és a 10 markerre összesítve. NS = nem szignifikáns. STR N N A H O H E HWE PIC I C ,400 0,485 NS 0,456 1,004 T ,931 0,909 NS 0,898 2,552 T ,938 0,914 NS 0,904 2,538 T ,800 0,847 NS 0,825 2,023 T ,892 0,846 NS 0,824 2,027 T ,738 0,859 NS 0,840 2,171 T ,623 0,899 NS 0,886 2,391 T ,731 0,883 NS 0,868 2,368 C ,700 0,844 NS 0,825 2,121 T ,838 0,844 NS 0,825 2,112 Átlag ,8 0,759 0,833 0,815 2,131 52

55 A heterozigozitás és alléldiverzitás értékek populációnként is hasonló tartományban mozogtak, mint a teljes minta szettre számítva (11. táblázat). A legalacsonyabb alléldiverzitás értéket (NA = 5,7) a bőszénfai bikákban tapasztaltam, ami az alacsony mintaszámot figyelembe véve nem meglepő, és nem feltétlenül reprezentálja a teljes állományt. A legmagasabb alléldiverzitás a zempléni populációban volt megfigyelhető (NA = 10,7), de a többi populációban is ezt közelítő értékek jelentkeztek. Az autoszómás markerek alléldiverzitása magasabb volt az ivari kromoszómás STR-ek alléldiverzitásánál, de ezeknél a markereknél várható is az ivari kromoszómás markerekhez képest nagyobb allélszám (Valdes et al. 1993, Jobling et al. 1997). A genetikai diverzitás mutatók közül a PIC átlagos értéke populációnként 0,640 és 0,805 között változott, a bőszénfai állatoknál volt a legalacsonyabb, a zempléni populációban pedig a legmagasabb. A Shannon- Weaver index 1,415 és 2,031 között változott, a PIC-hez hasonló tendenciával. A kapott értékek alapján a magyarországi gímszarvas állomány genetikai diverzitása kiemelkedően magas, leginkább a Közép-Európa környező területein tapasztalt genetikai diverzitáshoz hasonlítható (Kuehn et al. 2003, Radko et al. 2014, Szabolcsi et al. 2014, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Hoffmann et al. 2016, Zachos et al. 2016). A genetikai diverzitás mutatók populációnkénti alakulása hasonló tendenciát mutat autoszómás STR-ek esetében, mint az ivari kromoszómás markerekkel, ez is arra utal, hogy az újonnan fejlesztett ivari kromoszómás markerek jól használhatóak populációgenetikai vizsgálatokhoz. Az autoszómás STR-ek esetében kiemelendő még a populációnként számított egyedazonosítási valószínűség ( probability of identity ), ami a markerek egyedazonosítási megbízhatóságát mutatja, elsősorban igazságügyi célból történő felhasználás során. Ez az érték két véletlenszerűen kiválasztott egyed genotípusának megegyezési valószínűségét fejezi ki; azaz tulajdonképpen a téves egyedazonosítás valószínűségét is (Edwards et al. 1991, Caniglia et al. 53

56 2010, Lorenzini et al. 2011). Minél kisebb ez a valószínűség, annál biztosabb az egyedazonosítás. Ennek az értéke a bőszénfai bikákban a legmagasabb, ami nem meglepő a korlátozott mintaszámot és a minták közötti magas rokonsági fokot tekintve, azaz ebben az állományban lenne a legbizonytalanabb az egyedazonosítás, de még itt is nagyjából tízmilliárd egyedenként fordulhat elő téves azonosítás, ami elég nagy megbízhatóságot jelent (Szabolcsi et al. 2014). A vadon élő populációkban ennél még legalább 3 nagyságrenddel jobb megbízhatóságot kaptam, ami már igazságügyi vonatkozásban is megfelelő és nagyon megbízható markerekre utal. Ezek a számok közelítenek a markerek adaptálásakor kapott értékekhez (Szabolcsi et al. 2014), és a gímszarvasnál alkalmazott más marker szettek megbízhatóságával is vetekednek (Mukesh et al. 2013, Radko et al. 2014, Hoffmann et al. 2016, Zachos et al. 2016). 11. táblázat. Autoszómás STR markerekkel megvizsgált egyedek száma (N), a detektált átlagos allélszám (N A), megfigyelt és várt heterozigozitás értékek (H O és H E), Polymorphism Information Content (PIC), Shannon-Weaver diverzitás index (I) valamint Probability of Identity (PI) értékek magyarországi gímszarvas populációkban. Populáció N N A H O H E PIC I PI Bőszénfa 7 5,7 0,829 0,722 0,640 1,415 8, Lábod 21 9,6 0,767 0,812 0,772 1,901 2, Vajszló 15 8,7 0,807 0,833 0,782 1,881 1, Gemenc 51 9,6 0,735 0,792 0,761 1,837 8, Zemplén 36 10,6 0,755 0,832 0,805 2,031 1,

57 11. ábra. Autoszómás STR markerek allélgyakoriság eloszlása a magyarországi gímszarvas populációkban. 55

58 12. ábra. Autoszómás STR markerek allélgyakoriság eloszlása a magyarországi gímszarvas populációkban. 56

59 Populációnként megvizsgálva az egyes lókuszokon tapasztalható allélgyakoriságokat (11. és 12. ábra), akár jelentős különbségek is tapasztalhatók egyes lókuszokon a populációk között. Ez arra utalhat, hogy a populációk genetikailag nem igazán érintkeznek egymással, nincs nagyfokú génáramlás közöttük. A genetikai strukturáltság vizsgálatára első lépésben AMOVA vizsgálatot végeztem. Az autoszómás STR markerek genetikai variabilitásának nagy része (90%) az egyedeken belül található, az egyedek közötti variabilitás csak 6%, a populációk közötti variabilitás pedig csak 4% a teljes variabilitáson belül (12. táblázat). A populációk szignifikánsan különböznek egymástól (Fst = 0,040, p < 0,001). A különböző populációk páronkénti összehasonlítása alapján csak a vajszlói és lábodi populáció között nincs szignifikáns elkülönülés (Fst = 0,005, p = 0,185), a többi populáció szignifikánsan különbözik egymástól (minden p 0,002; 13. táblázat). 12. táblázat. Molekuláris varianciaanalízis (AMOVA) szerinti variancia 10 autoszómás STR marker alapján a magyarországi gímszarvasokban. Variancia forrás df SS MS Variancia Populációk között 4 49,139 12,285 0,169 4% Egyedek között ,084 4,289 0,246 6% Egyedeken belül ,500 3,796 3,796 90% Teljes ,723 4, % 13. táblázat. Autoszómás STR markerek AMOVA vizsgálatának eredményei magyarországi gímszarvas populációkban; Fst (átló alatt) és szignifikancia értékek (átló fölött). Bőszénfa Lábod Vajszló Gemenc Zemplén Bőszénfa - 0,001 0,001 0,001 0,001 Lábod 0,096-0,185 0,001 0,001 Vajszló 0,074 0,005-0,001 0,002 Gemenc 0,102 0,028 0,024-0,001 Zemplén 0,068 0,035 0,019 0,045-57

60 A populációk genetikai strukturáltságának további vizsgálatára főkomponens analízist (PCA) végeztem. A PCA egy alapvető statisztikai eljárás sokdimenziós változók kisebb dimenziójú megjelenítésére (Novembre & Stephens 2008); gyakran alkalmazzák genetikai adatok feldolgozására. A PCA ábráján az egyedi genotípusok által lefedett terület az adott populáció kétdimenziós genetikai vetülete, több csoport vizsgálata esetén a lefedett területek nagysága és egymáshoz viszonyított helyzete a populációk genetikai struktúráját jellemzi. A PCA alapján az egyes populációk nem válnak el teljesen, de kisfokú elkülönülés feltételezhető közöttük (13. ábra). A gemenci, lábodi és vajszlói populációk nagyrészt átfednek, de Zemplén kissé elkülönül ezektől. A bőszénfai állatok pedig kevert állományra utalnak. A szélső pontok által határolt sokszögek nagysága alapján a gemenci populáció genetikai diverzitása a legnagyobb, a legkisebb a diverzitás pedig a bőszénfai bikák esetében jelentkezik, a többi sokszög területe ezek között van, és nagyjából megegyezik. Ez a tendencia megfelel a diverzitás indexek esetében láthatóknak (10. táblázat), és genetikailag diverz populációkra utal, melyek között génáramlás van, azaz genetikailag nem függetlenek egymástól. 58

61 13. ábra. Magyarországi gímszarvas populációk főkomponens analízis ábrája autoszómás STR markerek alapján. A körök egyedi genotípusok, a színek az egyedek származási helyét jelölik; lila - Bőszénfa, sötétkék - Lábod, világoskék - Vajszló, zöld - Gemenc, piros - Zemplén. 14. ábra. Az autoszómás STR markerek alapján számított log-valószínűség értékei (L) és azok változása (DeltaK) egymás utáni klasztereknél Structure analízis alapján. 59

62 15. ábra. Magyarországi gímszarvas populációk STRUCTURE klaszteranalízis ábrája autoszómás STR markerek alapján. 60

63 A Structure program a legmagasabb átlagos valószínűség értéket ( likelihood score ) kettő és három genetikai egység (K = 2 illetve K = 3) esetében számított, ami két illetve három alpopuláció meglétét valószínűsíti; míg a log Pr érték második deriváltjának változása K = 5 esetében volt a legalacsonyabb, ami öt alpopuláció létezésére utal (14. ábra). Viszont az egyedi genotípusok klaszterezése (15. ábra) nem mutat egyértelmű alpopulációkra utaló elkülönülést, leginkább csak kevert genotípusok láthatók. A legegyértelműbb a bőszénfai állatok elkülönítése, amelyek kettőtől öt klaszterig történő csoportosítás esetén különböznek a környező populációktól, K = 2 és K = 3 esetében inkább a zempléni populációra hasonlítanak, K = 4 és K = 5 esetében viszont már külön klasztert alkotnak. Mivel ezek az állatok közeli rokonai egymásnak nem meglepő, hogy jobban hasonlítanak egymásra és elkülönülnek a többi populációtól. Három vagy több csoport feltételezése esetén a gemenci populáció is egy viszonylag jól elkülönülő egységet alkot, míg a többi populáció inkább kevert állománynak tűnik. Az autoszómás STR-ek alapján a zempléni populáció különbözik a dunántúli állományoktól, bár háromnál több klaszter esetében leginkább egy kevert populációnak tűnik. A különböző módszerekkel kapott nem egyértelmű, illetve kismértékben eltérő eredmények azt mutatják, hogy a populációk genetikai struktúrája egy komplex jelenség, melynek értelmezése igen bonyolult lehet. A különböző módszerek és algoritmusok ennek különböző vetületeit képesek megragadni. Az autoszómás STR markerekkel kapott eredmények alapján a dunántúli vadon élő populációk kismértékben strukturált állománynak tűnnek, amelyek között bizonyos fokú genetikai kapcsolat feltételezhető, ami a populációk genetikai elhatárolását jelentősen nehezíti, a közöttük lévő határvonalat elmossa (Frantz et al. 2008, Fickel et al. 2012, Radko et al. 2014, Zachos et al. 2016). Ebben a régióban a gemenci állomány tűnik a genetikailag leginkább diverznek, ami akár a terület kiemelkedő élőhelyi adottságaira is visszavezethető és az elejtett állatok trófea minőségében is megmutatkozik 61

64 (Sugár & Barna 2008, Csányi et al. 2014a). A zempléni populáció a dunántúli állományoktól genetikailag különbözik, de nem teljesen független tőlük. A genetikai kapcsolat lehet természetes eredetű, amennyiben a populációk nem határolódnak el teljesen, és az állatok kismértékű diszperziója tartja fenn a populációk közötti génáramlást, amihez néhány generációnként egy-egy bika bevándorlása már elégséges lehet (Kuehn et al. 2004, Frantz et al. 2008, Pérez- Espona et al. 2008, Fickel et al. 2012, Frantz et al. 2017). A természetes diszperzió mellett emberi áttelepítések hatása is lehet a populációk genetikai határainak elmosódása; ugyanis a faj fontossága miatt évszázados múltja van gímszarvas egyedek élőhelyek közötti mozgatásának (Hartl et al. 2003, Frantz et al. 2006, Apollonio et al. 2010, Haanes et al. 2010, Carden et al. 2012, Stanton et al. 2016, Frantz et al. 2017) MITOKONDRIÁLIS DNS A mitokondriális kontroll régió szekvenciájának vizsgálatát a magyarországi gímszarvas bikák közül két populációból (Gemenc és Zemplén) származó 87 állaton volt lehetőségem elvégezni. A teljes kontroll régió illesztés 916 bp hosszúságú; a magyar szekvenciákban 68 variábilis pozíciót tartalmaz, ezek közül 62 parszimónia informatív karakter, így összesen 39 különböző haplotípust eredményeznek. A 39 DNS haplotípus szekvenciáját a GenBank szekvencia adatbázisba ( feltöltöttem, ahol azok a KX KX azonosítási számokkal szabadon hozzáférhetőek. Az egyedi haplotípusok száma és gyakorisága a 4. mellékletben található. A magyarországi minták haplotípus és nukleotid diverzitása is magasnak mondható (14. táblázat), az összesített adatsorban D = 0,929, illetve π = 0,015. Ez a magas diverzitás hasonló a Krojerová-Prokešová és munkatársai (2015) által Csehországban (D = 0,914), illetve Borowski és 62

65 munkatársai (2016) által Lengyelországban (D = 0,90) leírt mitokondriális haplotípus diverzitásokhoz, és közelít az egész európai állományt jellemző diverzitáshoz, ami Skog és munkatársai (2009) alapján D = 0,96. Egyéb gímszarvas populációkban leírt haplotípus diverzitás 0,252 és 0,836 között változott (Feulner et al. 2004, Pérez-Espona et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Karaiskou et al. 2014). A mitokondriális vizsgálatok is megerősítik, az autoszómás és ivari kromoszómás STR vizsgálatokhoz hasonlóan, hogy a magyarországi gímszarvasok genetikai diverzitása az európai populációkhoz képest kiemelkedően magas. 14. táblázat. Mitokondriális haplotípusok száma (N H), haplotípus diverzitás (D), nukleotid diverzitás (π), nukleotid különbségek átlagos száma (k) és szegregáló pontok száma (S) magyarországi gímszarvasokban populációnként és összesítve. Populáció N N H D π k S Gemenc ,831 0,007 6, Zemplén ,957 0,018 16, Magyarország ,929 0,015 13, A detektált mitokondriális kontroll régió haplotípusok filogenetikai fáján (16. ábra) két elkülönült klád figyelhető meg, ami arra utal, hogy a magyarországi gímszarvasokban két leszármazási vonal van jelen. A genetikai távolság a két klád között 0,6-3,9%, ami megfelel a fajon belüli varianciának (Wada et al. 2010). Csak két haplotípus, Hap1 és Hap3, volt jelen Gemencen és Zemplénben is, a többi haplotípus csak az egyik vagy másik populációban volt jelen (4. melléklet). A haplotípusok földrajzi eredete viszont nem mutat teljes egyezést a filogenetikai kládokkal; a fa mindkét ágán megtalálhatók mind a gemenci mind a zempléni populációból származó állatok. Ez is mutatja, hogy 63

66 ez a két populáció, dacára a köztük lévő földrajzi távolságnak, érintkezik, vagy korábban érintkezett egymással. 16. ábra. Magyarországi gímszarvas mitokondriális kontroll régió haplotípusok törzsfája. Az elágazásoknál látható számok a Bayesi valószínűségeket mutatják, csak 0,8 vagy nagyobb értékek látszanak. Fekete kör a Gemencről származó haplotípusokat, fekete háromszög a Zemplénből származókat, négyzet a mindkét populációban megtalálhatókat jelöli. Az európai szekvenciákkal összevetve a magyar mintákat mind a nyugateurópai A mind a kelet-európai C haplocsoportba tartozó szekvenciák megtalálhatók a Kárpát-medencében, míg a mediterrán B haplocsoportba tartozó mitokondriális haplotípus nem került elő (17. ábra). A gemenci populációban a C haplocsoport, a zempléni populációban az A haplocsoport volt a domináns, bár mindkét régióban találtam minkét haplocsoporthoz 64

67 tartozó szekvenciákat. A három gemenci bikában megtalált Hap7 nevű haplocsoport és az egy bikában jelen lévő Hap13 a nyugat-európai vonalhoz tartozott. Összesen 12 egy-egy zempléni állatban talált haplotípus (Hap22, Hap23, Hap28, Hap29, Hap31, Hap32, Hap34, Hap35, Hap36, Hap37, Hap38, Hap39) a kelet-európai vonalhoz tartozott. 17. ábra. Európai gímszarvas mitokondriális kontroll régió haplotípusok törzsfája, kiegészítve a kárpát-medencei mintákkal. 65

68 18. ábra. Mitokondriális kontroll régió haplocsoportok eloszlása a gemenci és a zempléni gímszarvas populációban; rózsaszín - A haplocsoport, zöld - C haplocsoport. 19. ábra. Európai gímszarvas mitokondriális haplocsoportok feltételezett kolonizációs útvonalai; rózsaszín - A haplocsoport, zöld - C haplocsoport. 66

69 A nyugat-európai vonalhoz tartozó Hap1 és Hap3 haplotípus mindkét populációban jelen volt. Így összesen 15 (41,7%) balkáni leszármazási vonalhoz tartozó egyedet találtam a zempléni populációban és 4 (7,8%) ibériai leszármazási vonalhoz tartozó egyedet Gemencen. Ezek voltak azok a haplotípusok, amelyeknek a filogenetikai pozíciója nem egyezett a földrajzi eredettel. A gemenci 51 bika közül 47 (92,2%) tartozott a balkáni eredetű C haplocsoportba, a zempléni 36 bika közül pedig 21 (58,3%) az ibériai eredetű A haplocsoportba (18. ábra). A mitokondriális kontroll-régió szekvenciák filogenetikai elemzése alapján a Kárpát-medencébe a jégkorszak után két irányból települtek be a gímszarvasok. Egyrészt az eljegesedéseket a Balkánon átvészelő állatok észak felé terjedve, másrészt az Ibériából származó egyedek Közép-Európán keresztül; a két leszármazási vonal képviselői pedig valahol a Duna mentén találkozhattak és természetes úton keveredhettek egymással (19. ábra). A Kárpát-medence két irányból történő meghódítását korábban is feltételezték, de a korábbi vizsgálatok korlátozott mintavétele erről a területről csak a balkáni eredetű C haplocsoport jelenlétét tudta kimutatni (Sommer et al. 2008, Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Krojerová-Prokešová et al. 2015). A két haplocsoport együttes jelenléte lehet a magas haplotípus diverzitást, ami hasonlóan alakult más keveredési zónákban, Csehországban (Krojerová-Prokešová et al. 2015) illetve Lengyelországban (Borowski et al. 2016), talált mitokondriális haplotípus diverzitásokhoz. A talált mintázatot okozhatnák emberi betelepítések is, amennyiben az egyik leszármazási vonalhoz tartozó haplotípusokat hordozó teheneket az emberek hozták be a Kárpát-medencébe. A faj fontossága miatt évszázados múltja van gímszarvas egyedek áttelepítésének (Hartl et al. 2003, Frantz et al. 2006, Apollonio et al. 2010, Haanes et al. 2010, Carden et al. 2012, Stanton et al. 2016, Frantz et al. 2017), de az áttelepítések a nagyléptékű filogenetikai mintázatra nem voltak igazán hatással, legalábbis a mitokondriális vonalak 67

70 esetében (Ludt et al. 2004, Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Meiri et al. 2013, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Borowski et al. 2016). Az Y kromoszómás STR markerekkel kapott haplotípusok filogenetikai fáján is két elkülönült klád figyelhető meg, a 19 magyarországi Y kromoszóma haplotípus közül 15 volt megtalálható a gemenci vagy a zempléni gímszarvas populációban (18. ábra). A mitokondriális haplocsoportokhoz hasonlóan, Y kromoszómásan is két leszármazási vonal van jelen a gemenci és a zempléni gímszarvasokban; de az Y kromoszómás vonalak földrajzi eredete sem mutat teljes egyezést a filogenetikai helyzetével. A mitokondriális haplotípusokkal szemben az Y kromoszómás vonalak közül több, szám szerint 6, az Y_01, Y_02, Y_04, Y_05, Y_10 és Y_16 jelű, volt jelen mindkét régióban, az Y_06, Y_08, Y_09 és Y_14 jelű vonalat csak gemenci, míg az Y_03, Y_07, Y_15, Y_17 és Y_19 jelű vonalat csak zempléni állatokban detektáltam; az Y_11, Y_12, X_13 és Y_18 jelűek egyik populációban sem mutatkoztak, de más magyarországi gímszarvas bikák hordozták ezeket. Az Y kromoszómás vonalakhoz nem áll rendelkezésre földrajzi viszonyítási alap, de a gemenci bikák esetében a két klád gyakoriságának eloszlása nagyon hasonlít a mitokondriális haplocsoportok eloszlásához, 2 bika (3,9%) tartozott az I. kládhoz, 49 (96,1%) pedig a II. kládhoz (18. ábra). A zempléni állatoknál viszont, ha a gemenci eloszlást vesszük alapul, az Y kromoszómás kládok gyakorisága ellentétesen alakul a mitokondriális haplocsoportok eloszlásához, 13 bika (36,1%) tartozott az I. kládhoz, 23 (63,9%) pedig a II. kládhoz (20. ábra). Az eredmények alapján feltételezhető, hogy a mitokondriális haplotípusokhoz hasonlóan az Y kromoszómás vonalak is két irányból érték el a Kárpát-medencét; egyrészt a Balkán felől, másrészt Közép-Európán keresztül. Az Y kromoszómás vonalak mitokondriális haplotípusokhoz képest nagyobb mértékű keveredése mögött a bikák nagyobb mértékű vándorlási hajlama állhat (Szemethy et al. 1999, Catchpole et al. 2004, Frantz et al. 2008, Hoffmann et al. 2016); bár ezt okozhatnák emberi betelepítések is, ha az egyik 68

71 leszármazási vonalhoz tartozó állatokat az emberek telepítették a Kárpátmedencébe. A faj fontossága miatt évszázados múltja van gímszarvas egyedek áttelepítésének (Haanes et al. 2010, Carden et al. 2012, Stanton et al. 2016, Frantz et al. 2017), ami kifejezetten érintette a bikákat (Apollonio et al. 2010), de ennek az Y kromoszómás vonalakra gyakorolt hatásáról ezidáig nem áll rendelkezésre vizsgálat. 20. ábra. Y kromoszóma kládok eloszlása a gemenci és a zempléni gímszarvas populációban; rózsaszín - klád I, zöld - klád II. 69

72 7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK Az értekezés témájának általános biológiai, populációgenetikai, illetve evolúcióbiológiai alapkutatási szinten túl, alkalmazott vadbiológiai illetve vadgazdálkodási vonatkozásai is vannak, mivel a kapott eredmények gyakorlati felhasználása egy kiemelten fontos nagyvadfaj életmódjának megértését, és ezáltal a vadon élő, illetve zárttéri körülmények között tartott állományok hosszú távú fenntartását segíthetik. Mikroszatellita markerek fejlesztése Új ivari kromoszómás mikroszatellita markerek fejlesztéséhez gímszarvas genomszekvenálásból származó szekvencia adatokat használtam fel, a Seq- Assembly-SSR vagyis szekvencia-illesztés-marker megközelítéssel. Azaz a nyers szekvenciákat először genom illesztéshez használtuk, ami hosszabb egybefüggő szekvencia darabokat eredményez, és ezeken a szekvenciákon futtattam a mikroszatellita keresést. Gímszarvas STR markerek fejlesztése korábban leginkább más fajokból származó markerek adaptálásával történt (Zsolnai et al. 2009, Szabolcsi et al. 2014), ami hosszadalmas labormunkával járt. Ehhez képest a bioinformatikai markerszűrések eredményeként több mint mikroszatellita motívum, valamint primer tervezésre alkalmas genomi lókusz lett azonosítva a gímszarvas genomban. A szarvasmarha referencia ivari kromoszómára térképeződés alapján a gímszarvas X kromoszómán , az Y kromoszómán pedig 714 STR található. Ez a bioinformatikai protokoll jelentősen egyszerűsítette új STR markerek fejlesztését, és nagy mennyiségű markerjelöltet eredményezett (Zane et al. 2002, Thiel et al. 2003, Yu et al. 2011, Castoe et al. 2012). A kapott STR illetve primer adatbázist a markerek rokon fajok közötti kereszt-amplifikáció miatt (Goodman et al. 1999, Mukesh et al. 2013, Szabolcsi et al. 2014, Willems et al. 2016) sok szarvas faj esetében lehet új markerek kereséséhez használni. 70

73 Ezáltal nagy gyakorlati jelentősége lehet a jövőben populációk eredetének, kapcsolatának és a közöttük lévő génáramlás tanulmányozásában. Megjegyzendő még, hogy a bemutatott bioinformatikai protokoll más fajokban is hasonlóan egyszerűen használható jó minőségű mikroszatellita markerek fejlesztésére genomszekvenálási adatokból. Ivari kromoszómás STR markerek és vonalak Az ivari kromoszómára térképeződő markerek közül 18 primer párt választottam ki a genetikai vizsgálatokhoz. Ezek közül 3 nem adott értékelhető PCR terméket, így a fejlesztett markerek több mint 83%-a megfelelő genetikai vizsgálathoz történő felhasználásra. Ez a bioinformatikai markerfejlesztési protokoll alkalmas akár kromoszóma specifikus markerek fejlesztésére is, ahogy az ivari kromoszómák esetén demonstráltam is; így akár QTL térképezéshez, genetikai térkép alapú klónozáshoz, fizikai és genetikai kromoszóma térképek integrációjához vagy marker alapú szelekcióhoz használható jó minőségű markerek válogatására is alkalmas a módszer. A választott markerek közül 13 mutatott az eddig levizsgált gímszarvas mintákon polimorfizmust, azaz legalább két eltérő nagyságú allélt. Az átlagos allélszám 3,3 és az átlagos géndiverzitás 0,27 volt; ezek az STR-ek közepesen informatív markernek számítanak. Az ivari kromoszómás lókuszokon az egyes allélek viszont nem véletlenszerű kombinációban határoznak meg egy DNSprofilt, hanem kapcsoltan öröklődnek (Spurdle & Jenkins 1992, Jobling et al. 1997), így ezek a közepesen informatív markerek is alkalmasak populációgenetikai felhasználásra. A fejlesztett ivari kromoszómás markerekkel kárpát-medencei gímszarvas bikákban 19 Y kromoszómás vonalat találtam. Az Y kromoszómás vonalak közül két vonal nagyon gyakori volt a magyarországi bikákban, az Y_01 nevű vonalat 43, az Y_04 vonalat 50 egyed hordozta; ez a két domináns vonal mindegyik vizsgált vadon élő gímszarvas populációban kimutatható volt. A 71

74 különböző vizsgált földrajzi régiókban élő gímszarvas populációkban jelentősen eltért az egyes Y kromoszómás vonalak gyakorisága, amit leginkább az unikális haplotípusok okoztak. Az Y kromoszómás vonalak diverzitása a Zempléni-hegységben volt a legmagasabb (0,830), a Dunántúlon alacsonyabb, de ezekben a populációkban közel azonos értéket mutatott (0,652-0,695). Az Y kromoszómás vonalak esetében a teljes genetikai variabilitás nagy része az egyedek között található, csak 13%-át okozza a populációk közötti variabilitás, a populációk apai vonalai pedig szignifikánsan különböznek egymástól (Φst = 0,131, p < 0,001). A különböző populációk páronkénti összehasonlítása alapján minden vadon élő populáció különbözik a többitől (minden p 0,04). A fejlesztett ivari kromoszómás markerek polimorfizmusa lehetőséget teremt leszármazási vonalak felmérésére, valamint populációk genetikai struktúrájának és genetikai kapcsolatainak vizsgálatára (Roewer et al. 1996, de Knijjf et al. 1997); a különböző populációk eredete eltérő lehet, de a földrajzi távolság ellenére közöttük, legalábbis a bikák esetében, genetikai keveredés figyelhető meg. Ezt a keveredést a bikák vándorlása is okozhatta (Szemethy et al. 1999, Catchpole et al. 2004, Frantz et al. 2008, Hoffmann et al. 2016), bár az emberi áttelepítések hatása sem zárható ki, aminek évszázados múltja van gímszarvas esetében (Haanes et al. 2010, Carden et al. 2012, Stanton et al. 2016, Frantz et al. 2017). Ugyanakkor az áttelepítések Y kromoszómás vonalakra gyakorolt hatásáról ezidáig nem áll rendelkezésre vizsgálat, de ezek pontos feltérképezése vadgazdálkodási illetve igazságügyi szempontból is fontos lehet. Ezek segítségével a jövőben az illegális áttelepítések könnyebben kimutathatóak lehetnek. Ennek érdekében a magyarországi, valamint az európai gímszarvas állományok kiterjedtebb genotipizálása lenne szükséges az Y kromoszómás markerekkel. 72

75 Autoszómás STR markerek A Szabolcsi és munkatársai (2014) által fejlesztett autoszómás STR markerekkel magas genetikai diverzitást mértem, az egy lókuszon található allélek száma 6 és 18 között változott, az átlagos allélszám 13,8 volt. Ez a magas alléldiverzitás megfelel a közép-európai gímszarvasokban leírtaknak, és kifejezetten előnyös populációgenetikai vizsgálatokhoz (Zsolnai et al. 2009, Szabolcsi et al. 2014, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Hoffmann et al. 2016, Zachos et al. 2016). A heterozigozitás is magas volt, az átlagos várt heterozigozitás 0,833, az átlagos megfigyelt heterozigozitás értéke pedig 0,759. Ezek az értékek megfelelnek a markerekkel korábban genotipizált magyarországi gímszarvasok heterozigozitásának (Szabolcsi et al. 2014), és nem különböznek más gímszarvas populációk heterozigozitásától (Radko et al. 2014, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Hoffmann et al. 2016, Willems et al. 2016, Zachos et al. 2016). A további diverzitás indexek közül a PIC lókuszonkénti értéke 0,456 és 0,904 között változott, a markerekre összesített értéke 0,815; a Shannon-Weaver index értékei lókuszonként 1,004 és 2,552 között, az összes marker átlagában pedig 2,131 volt. Az alkalmazott markerek a PIC alapján nagyon informatívnak (Silos Moraes de Castro e Souza et al. 2012), a Shannon-Weaver index alapján pedig nagyon diverznek számítanak (Hennink & Zeven 1991), azaz kifejezetten alkalmasak populációgenetikai vizsgálatokhoz. Ez nem is meglepő, mivel ezek a markerek igazságügyi egyedazonosítási célból lettek fejlesztve, így akár rokonsági viszonyok feltárását is segíthetik, alkalmazásuk igazságügyi egyedazonosításra (Szabolcsi et al. 2014), illetve az állattenyésztési, vadgazdálkodási gyakorlatban apasági/anyasági vizsgálatokhoz (Zsolnai et al. 2009) javasolt. A genetikai diverzitás, valamint a genetikai struktúra vizsgálatára erőteljesebb mintavétel lenne ajánlatos a Kárpát-medencéből, amely minták egyedi genotipizálása és az eredmények értékelése szükséges. 73

76 Mitokondriális DNS vizsgálata A teljes mitokondriális kontroll régió szekvenciájának meghatározás először történt meg kárpát-medencei gímszarvasokban. A teljes szekvencia illesztés 916 bp hosszúságú, a magyarországi szekvenciákban 68 variábilis pozíciót tartalmaz, ezek közül 62 parszimónia informatív karakter, így összesen 39 különböző mitokondriális haplotípust eredményeznek. A magyarországi minták haplotípus és nukleotid diverzitása is magasnak mondható (D = 0,929, π = 0,015), hasonlóan magas a Csehországban (Krojerová-Prokešová et al. 2015) és Lengyelországban (Borowski et al. 2016) leírt mitokondriális haplotípus diverzitásokhoz, és közelít az egész európai állományt jellemző diverzitáshoz (Skog et al. 2009). Az egyéb európai helyi gímszarvas populációkban haplotípus diverzitása ennél jelentősen alacsonyabb is lehet (Feulner et al. 2004, Pérez-Espona et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Karaiskou et al. 2014). A mitokondriális vizsgálatok is megerősítik, az autoszómás és ivari kromoszómás STR vizsgálatokhoz hasonlóan, hogy a magyarországi gímszarvasok genetikai diverzitása az európai populációkhoz képest kiemelkedően magas. A mitokondriális kontroll régió haplotípusok filogenetikai fáján két elkülönült klád figyelhető meg. Két haplotípus (Hap1 és Hap3) a gemenci és zempléni állatokban is jelen volt, a többi csak az egyik vagy másik populációban volt jellemző, a haplotípusok földrajzi eredete viszont nem mutat teljes egyezést a filogenetikai elhelyezkedésükkel. Az európai szekvenciákkal összevetve a magyar mintákat mind a nyugat-európai A, mind a kelet-európai C haplocsoportba tartozó szekvenciák megtalálhatók a Kárpát-medencében, míg a mediterrán B haplocsoportba tartozó haplotípus nem került detektálásra. A gemenci populációban a C, a zempléni populációban az A haplocsoport volt a domináns, bár mindkét régióban előfordult minkét haplocsoporthoz tartozó szekvencia. Ezek alapján a Kárpát-medencébe két irányból települtek be gímszarvasok a jégkorszak után; az eljegesedéseket a Balkánon átvészelő 74

77 állatok észak felé terjedve, másrészt az Ibériából származó egyedek Közép- Európán keresztül. A Kárpát-medence két irányból történő meghódítását mások is feltételezték, de a korábbi vizsgálatok korlátozott mintavétele erről a területről csak a balkáni eredetű C haplocsoport jelenlétét tudta kimutatni (Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Krojerová-Prokešová et al. 2015). A talált mintázatot okozhatnák emberi betelepítések is, amennyiben az egyik leszármazási vonalhoz tartozó haplotípusokat hordozó teheneket az emberek hozták be a Kárpát-medencébe. A faj fontossága miatt évszázados múltja van gímszarvas egyedek áttelepítésének (Hartl et al. 2003, Frantz et al. 2006, Apollonio et al. 2010, Haanes et al. 2010, Carden et al. 2012, Stanton et al. 2016, Frantz et al. 2017), de az áttelepítések a nagyléptékű filogenetikai mintázatra nem voltak hatással, legalábbis a mitokondriális vonalak esetében (Skog et al. 2009, Niedziałkowska et al. 2011, Meiri et al. 2013, Krojerová- Prokešová et al. 2015, Borowski et al. 2016), ezért a természetes vándorlással történő terjedés tűnik elfogadhatóbbnak a talált mintázat magyarázatára. Gímszarvas populációk genetikai struktúrája A gímszarvas populációk strukturáltsága és a közöttük lévő kapcsolat mind autoszómás mind Y kromoszómás STR markerekkel, valamint mtdns segítségével is kimutatható volt, ami megerősíti a korábbi vizsgálatokat, amelyek finoman strukturált genetikai mintázatot, vagyis nem véletlen térbeli elrendeződést találtak a faj populációiban (Frantz et al. 2006, Pérez-Espona et al. 2009, Krojerová-Prokešová et al. 2015, Zachos et al. 2016). A magyarországi populációk esetében csekély genetikai strukturáltságot találtam, ami az AMOVA, PCA és Structure elemzésekben is megmutatkozott, és a populációk elkülönítését is nehezítette. Következésképpen ezek az állományok genetikailag kapcsolódnak egymáshoz, az a priori definiált populációk között bizonyos fokú génáramlás létezik. Figyelemre méltó, hogy a genetikai differenciáció nem minden marker típus esetében mutat 75

78 összefüggést a populációk közötti földrajzi távolsággal, bár itt megjegyzendő, hogy bizonyos területekről származó alacsony mintaszámok torzíthatják az eredményeket, illetve a populációk földrajzi eredete nem feltétlenül esik egybe a populációk tényleges elkülönülésével. Ezen okok miatt további genetikai vizsgálatok lennének szükségesek a dél-dunántúli gímszarvas populációk genetikai struktúrájának vizsgálatára; a genetikai diverzitás fenntartását pedig fontos lenne természetvédelmi illetve vadgazdálkodási célul kitűzni. A genetikai struktúra megléte fontos vadgazdálkodási kérdés, mivel a genetikai diverzitás közvetlen összefüggést mutat az állomány egészségügyi állapotával (Zachos et al. 2007). Azaz a beltenyésztettség növekedése közvetlen egészségügyi problémák megjelenésével jár, ezáltal az állomány életképességét illetve egyéb minőségi jellemzőinek romlását okozza (Walling et al. 2011, Mukesh et al. 2013). Tehát a diverzitás csökkenésének közvetlen hatása van az állományok hasznosítására, hasznosíthatóságára. A populációk közötti génáramlás, amit az állományok között vándorló állatok okoznak, segít a genetikai diverzitás fenntartásában (Kuehn et al. 2004, Pérez-Espona et al. 2008, Fickel et al. 2012). Közismert, hogy az emberi tevékenységek, illetve az ember környezet-átalakító hatása erőteljes hatással van a populációk közötti kapcsolatok alakulására sok állatfaj esetében, ezáltal a közöttük lévő génáramlást is akadályozhatja (Dixon et al. 2007, Long et al. 2010, Lancaster et al. 2011, Fickel et al 2012). A populációk közötti genetikai kapcsolatok feltérképezése ilyen módon segít fenntartani a genetikai diverzitást, és elkerülni a beltenyésztettség kialakulását. Azaz az eredmények közvetlenül hasznosíthatóak lennének a vadgazdálkodásban. Így ajánlatos lenne a vadgazdálkodási szempontból fontos populációk és környezetük genetikai felmérése és nyomon követése, az egyes populációk közötti átjárhatóság biztosítása az állatok részére. 76

79 8. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK A kutatás során az alábbi fontosabb új tudományos eredmények születtek: 1. A munkám egy gímszarvas genom projekten alapul, illetve ahhoz szorosan kapcsolódik, amelynek eredményeként meghatároztuk az első gímszarvas referencia genomot (CerEla1.0), amely az NCBI Assembly adatbázisában az MKHE hozzáférési számon elérhető. A genomszekvenálásból származó szekvencia adatokat felhasználására egy bioinformatikai protokollt használtam mikroszatellita markerek fejlesztéséhez gímszarvas esetében, és ilyen módon több százezer ismétlődő motívumból, valamint több tízezer mikroszatellitára tervezett primerből álló adatbázist hoztam létre. 2. A tervezett primer párok közül ivari kromoszómára térképeződő markereket válogattam, a választott markereket teszteltem és PCR protokollt optimalizáltam gímszarvas egyedek genotipizálásához. Ilyen módon leírtam 15 primer párt, amelyek közül 13 mutatott gímszarvas mintákon polimorfizmust, azaz legalább két eltérő nagyságú allélt. Így kialakítottam két 8 primer párt tartalmazó multiplex rendszert, a primerek szekvenciájának, fluoreszcens jelölésének, kromoszóma lokalizációjának és a PCR termékek mérettartományának leírásával. 3. A fejlesztett markerek segítségével elvégeztem Kárpát-medence gímszarvas populációiból származó egyedek genotipizálását, ezáltal elsőként mértem fel magyarországi gímszarvasok Y kromoszómás genetikai diverzitását, valamint elsőként térképeztem fel ezen populációk apai leszármazási vonalait. Így kimutattam a populációk 77

80 apai vonalainak strukturáltságát, de a populációk közötti genetikai kapcsolatot is, amit feltehetően a génáramlás tart fenn. 4. Az Y kromoszómás markerekkel kapott diverzitásmutatókat összevetettem autoszómás mikroszatellita diverzitás értékekkel. Így kimutattam, hogy a Kárpát-medencében élő gímszarvas populációk európai szinten kiemelkedően diverznek számítanak. Továbbá ezek az eredmények is megerősítették a populációk közötti gyenge genetikai strukturáltságot, és a közöttük lévő génáramlást. 5. A Kárpát-medencéből származó gímszarvasokból elsőként határoztam meg a teljes mitokondriális kontroll régió szekvenciáját. Ezen szekvenciák segítségével feltérképeztem a populációk filogenetikai leszármazását, így megerősítettem azt a feltételezést, hogy a Kárpátmedencét a jégkorszak után két irányból népesítették be a gímszarvasok; feltételezhető, hogy ez a betelepülés természetes módon ment végbe, és emberi áttelepítése csak kis mértékben érintette a filogenetikai mintázatot. Az Y kromoszómás vonalak filogenetikai mintázata szintén valószínűsíti a két irányból történő betelepülést, bár ebben az esetben nem állnak rendelkezésre európai adatok a filogenetikai kapcsolatok összevetéséhez. 78

81 9. ÖSSZEFOGLALÁS A gímszarvas (Cervus elaphus) az egyik legelterjedtebb és legismertebb szarvasféle, egyike a legkeresettebb és legértékesebb európai trófeás vadaknak. A genetika más területeihez hasonlóan a populációgenetikában is nagy jelentősége volt a mikroszatellita markerek felfedezésének és elterjedésének, viszont új fajok vizsgálatához új markerek fejlesztése szükséges; gímszarvas genetikai kutatásokhoz eddig leginkább más szarvasfélékben fejlesztett mikroszatellita markereket adaptáltak. A vizsgálatunk célja ezért egy egyedi gímszarvas DNS-profil felállítására alkalmas genetikai marker készlet felállítása és gyakorlati felhasználásra történő adaptációja volt. Új ivari kromoszómás mikroszatellita markerek fejlesztéséhez gímszarvas genomszekvenálásból származó szekvencia adatokat használtam fel, a Seq-Assembly-SSR vagyis szekvencia-illesztésmarker megközelítéssel; a nyers szekvenciákat először genom illesztéshez használtuk, és az így kapott hosszabb egybefüggő szekvencia darabokon futtattam a mikroszatellita keresést és primer tervezést. A feltérképezett markerek közül ivari kromoszómás markerek válogattam, melyeket PCR alapú genotipizálási eljáráshoz optimalizáltam. A populációgenetikai vizsgálatokhoz legálisan szervezett vadászatok során terítékre került gímszarvas bikákból gyűjtött szövetmintákat dolgoztam fel, melyek a Kárpát-medence 5 területéről származtak. Teljes genomi DNS-t vontam ki összesen 130 bikából, amelyeket aztán genotipizáltam a 15 új ivari kromoszómás, valamint 10 autoszómás mikroszatellita marker segítségével. A minták közül 87 állaton volt lehetőségem elvégezni a mitokondriális kontroll régió szekvenciájának vizsgálatát is. Az ivari kromoszómás markerek közül 18 primer párt választottam ki a genetikai vizsgálatokhoz, ezek közül 3 nem adott értékelhető PCR terméket, és 13 mutatott polimorfizmust. A populációgenetikai vizsgálathoz használt 79

82 mintákban az átlagos allélszám 3,3 és az átlagos géndiverzitás 0,27 volt. Az ivari kromoszómás lókuszokon az egyes allélek viszont nem véletlenszerű kombinációban határoznak meg egy DNS-profilt, hanem kapcsoltan öröklődnek, így ezek a közepesen informatív markerek is alkalmasak populációgenetikai felhasználásra. A fejlesztett ivari kromoszómás markerekkel 19 Y kromoszómás vonalat találtam a kárpát-medencei gímszarvasokban; ezek közül két apai vonal nagyon gyakori volt. Ez a két apai vonal mindegyik vizsgált vadon élő gímszarvas populációban kimutatható volt, és a bikák közül összesen 93 egyed (71%) hordozta a két domináns vonal valamelyikét. A különböző vizsgált földrajzi régiókban élő gímszarvas populációkban jelentősen eltért az egyes Y kromoszómás vonalak gyakorisága, amit leginkább az unikális haplotípusok okoztak. Az Y kromoszómás vonalak diverzitása a Zempléni-hegységben volt a legmagasabb, a dunántúli populációkban alacsonyabb, de közel azonos értékeket kaptam. A populációk apai vonalai szignifikánsan különböznek egymástól, a populációk páronkénti összehasonlítása alapján minden vadon élő populáció különbözik a többitől. Az autoszómás STR markerekkel magas genetikai diverzitást mértem, az egy lókuszon található allélek száma 6 és 18 között változott, az átlagos allélszám 13,8 volt; az átlagos várt heterozigozitás 0,833, az átlagos megfigyelt heterozigozitás értéke pedig 0,759. A további diverzitás indexek közül a PIC lókuszonkénti értéke 0,456 és 0,904 között változott, a markerekre összesített értéke 0,815; a Shannon-Weaver index értékei lókuszonként 1,004 és 2,552 között, az összes marker átlagában pedig 2,131 volt. Az alkalmazott markerek nagyon informatívnak és nagyon diverznek számítanak, a kárpát-medencei gímszarvas populációk pedig európai szinten is kiemelkedő genetikai diverzitást hordoznak. A mitokondriális kontroll régió teljes szekvencia illesztés 916 bp hosszúságú, a magyarországi szekvenciákban 68 variábilis pozíciót tartalmaz, ezek közül 80

83 62 parszimónia informatív karakter, így összesen 39 különböző mitokondriális haplotípust eredményeznek. A magyarországi minták haplotípus és nukleotid diverzitása is magasnak mondható (D = 0,929, π = 0,015). A mitokondriális vizsgálatok is megerősítik, az autoszómás és ivari kromoszómás STR vizsgálatokhoz hasonlóan, hogy a magyarországi gímszarvasok genetikai diverzitása az európai populációkhoz képest kiemelkedően magas. A mitokondriális kontroll régió haplotípusok filogenetikai fáján két elkülönült klád figyelhető meg. Két haplotípus (Hap1 és Hap3) a gemenci és zempléni állatokban is jelen volt, a többi haplocsoport csak az egyik vagy másik populációban volt jellemző, a haplotípusok földrajzi eredete viszont nem mutat teljes egyezést a filogenetikai elhelyezkedésükkel. Az európai szekvenciákkal összevetve a magyar mintákat mind a nyugat-európai A, mind a kelet-európai C haplocsoportba tartozó szekvenciák megtalálhatók a Kárpát-medencében, míg a mediterrán B haplocsoportba tartozó haplotípus nem került elő. Ezek alapján feltételezhető, hogy a Kárpát-medencébe két irányból települtek be gímszarvasok a jégkorszak után; az eljegesedéseket a Balkánon átvészelő állatok észak felé terjedve, másrészt az Ibériából származó egyedek Közép- Európán keresztül. A gímszarvas populációk strukturáltsága és a közöttük lévő kapcsolat mind autoszómás mind Y kromoszómás STR markerekkel, továbbá mtdns segítségével is kimutatható volt, ami megerősíti a korábbi vizsgálatokat, amelyek finoman strukturált genetikai mintázatot találtak a faj populációiban. A magyarországi populációk esetében csekély genetikai strukturáltságot találtam, ami a populációk elkülönítését is nehezítette, azaz ezek az állományok genetikailag kapcsolódnak egymáshoz, közöttük bizonyos fokú génáramlás létezik. Így az egészséges állományok fenntartása céljából ajánlatos lenne a populációk és környezetük genetikai felmérése és nyomon követése, az egyes populációk közötti átjárhatóság biztosítása az állatok részére. 81

84 10. SUMMARY The red deer (Cervus elaphus) is one of the most abundant and best known cervid species, which provides one of the most desirable and highly prized trophies in Europe. Similarly to other fields of genetics, the discovery of microsatellite markers had a significant importance in population genetics. However, to study new species the development of new markers is required. So far, genetic studies of red deer have been relied mostly on adapted STR markers originally developed in other deer species. Thus, the goal of this study was to develop a set of genetic markers for red deer DNA/genetic profiling and individual identification. For the development of new sex chromosome linked microsatellite markers sequencing data of the red deer genome were used with the so called Seq-Assembly-SSR approach. Illumina reads were first assembled into a draft genome, and this assembly of longer contiguous sequences was used in microsatellite discovery and primer design. Sex chromosome linked markers were selected and optimized for PCRbased genotyping. For population genetics studies, tissue samples were collected from wild red deer, in five regions of the Carpathian Basin. Total genomic DNA was isolated from 130 stags, and they were genotyped with 15 new sex chromosome linked and 10 autosome linked microsatellite markers. Examination of the mitochondrial control region (D-loop) was performed in 87 animals. From the sex chromosome linked markers, 18 primer pairs were selected for further genetic study. Three of these did not amplified detectable products, while 13 showed polymorphisms. The average number of alleles per locus was 3.3 and the average allelic diversity was This moderate diversity is due to that alleles on sex chromosome loci are fully linked and do not define DNA/genetic profiles in random combination. Thus, these moderate informative markers can be involved in population genetics studies. 82

85 The developed sex chromosome markers defined 19 Y chromosome lines in red deer samples collected from the Carpathian Basin; two of these paternal lines were very frequent. These two paternal lines were detected in all wild populations, and in total 93 of 130 stags (71%) carried one of the two lines. The frequencies of different Y chromosome lines were significantly different in populations of different geographic regions, mostly caused by unique haplotypes. The Y chromosome haplotype diversity was the highest in the Zemplén Mountains, and somewhat lower in the examined Transdanubian populations. Based on pairwise comparisons, the paternal lines of all wild populations of this study were significantly different. Autosomal STR markers showed a high genetic diversity, the number of alleles per locus varied between 6 and 18, with an average number of 13.8 alleles per locus. The mean expected and observed heterozygosities were and 0.759, respectively. Of other diversity indices, PIC per locus was between and with an average value of and Shannon-Weaver Index values per locus were between and with an average value of The markers were highly informative and showed high diversity, indicating that red deer in the Carpathian Basin have an outstanding genetic diversity in Europe. The complete assembly of the red deer mitochondrial control region was 916 bp long. Within the Hungarian sequences, 68 positions were variable and 62 were parsimony-informative, thus resulting in 39 different haplotypes. Both the haplotype and nucleotide diversities of Hungarian samples were high (D = 0.929, π = 0.015). Mitochondrial analyses confirmed, similarly to the Y chromosome and autosomal STR surveys, that genetic diversity of Hungarian red deer populations is high compared with other European populations. The phylogenetic tree of the mitochondrial haplotypes divided in two distinct clades. Only two haplotypes (Hap1 and Hap3) were shared between the Gemenc and Zemplén populations; other haplotypes were present only in one 83

86 of them, and there was some discrepancy between the geographic origin of haplotypes and their phylogenetic placement. The extended data set of European red deer haplotypes confirmed the presence of both the Western European haplogroup A and Eastern European haplogroup C in the Carpathian Basin, but no haplotypes belonging to the Mediterranean B haplogroup were found. These results are in good agreement with the concept of postglacial expansion of the range of the eastern red deer lineages from the Balkans northwards into Eastern Europe, and, parallel to this, the recolonization of Central Europe by red deer lineages originated from the Iberian refuge. The genetic structure of red deer populations and the connection between them were identified using autosomal and Y chromosome STR markers and mtdna sequences. These results confirm previous findings, which found a fine-scale genetic pattern in other populations of the species. Since the examined Hungarian populations are genetically connected, i.e. there is gene flow between them, the discrimination of the populations is difficult. Thus, in order to maintain healthy stocks, both the genetic survey and monitoring of the populations would be important and required, and assuring available passages for animals between populations is recommended. 84

87 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném megköszönni a segítséget témavezetőimnek, Dr. Horn Péter akadémikus úrnak és Dr. Orosz László akadémikus úrnak a disszertáció elkészítése során nyújtott értékes tanácsait és türelmét. Külön köszönettel tartozom Dr. Stéger Viktornak a NAIK MBK Alkalmazott Vad és Haszonállat Genomikai Csoport vezetőjének, hogy lehetővé tette számomra a szükséges laboratóriumi munkák elvégzését, és a sok hasznos tanácsáért, tapasztalatáért, amiket megosztott velem. Hálával tartozom továbbá a kutatócsoport minden tagjának az elmúlt években tőlük kapott segítségért is. Köszönöm Nagy Jánosnak a Kaposvári Egyetem Vadgazdálkodási Tájközpont vezetőjének, hogy lehetővé tette az állatokból történő mintavételt. Szeretném megköszönni a mintavételhez nyújtott segítséget Dr. Sugár Lászlónak és Dr. Bleier Norbertnek, továbbá az összes helyi vadásznak, akik részt vettek a minták begyűjtésében. Hálás köszönettel tartozom szüleimnek, Frank Antalnak és Frankné Fábián Györgyinek, a tőlük kapott szeretetteli biztatásért és tanulmányaim türelmes támogatásáért. 85

88 12. IRODALOMJEGYZÉK Abernethy K. (1994) The establishment of a hybrid zone between red and sika deer (genus Cervus). Molecular Ecology 3(6): Agnarsson I., May-Collado L.J. (2008) The phylogeny of Cetartiodactyla: The importance of dense taxon sampling, missing data, and the remarkable promise of cytochrome b to provide reliable species-level phylogenies. Molecular Phylogenetics and Evolution 48(4): Altschul S., Gish W., Miller W., Myers E., Lipman D. (1990) Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215(3): Apollonio M., Andersen R., Putman R. (szerk.) (2010) European ungulates and their management in the 21st century. Cambridge University Press, Cambridge, UK, 600 pp. Ba H., Jia B., Wang G., Yang Y., Kedem G., Li C. (2017) Genome-wide SNP discovery and analysis of genetic diversity in farmed sika deer (Cervus nippon) in Northeast China using double-digest restriction siteassociated DNA sequencing. G3: Genes, Genomes, Genetics 7(9): Ba H., Wang D., Li C. (2016) MicroRNA profiling of antler stem cells in potentiated and dormant states and their potential roles in antler regeneration. Molecular Genetics and Genomics 291(2): Bergmann F. (1976) Beiträge zur Kenntnis der Infrastrukturen beim Rotwild. II. Erste Versuche zur Klärung der genetischen Struktur von Rotwildpopulationen an Hand von Serumprotein-Polymorphismen. Zeitschrift der Jagdwissenschaft 22: Borowski Z., Świsłocka M., Matosiuk M., Mirski P., Krysiuk K., Czajkowska M., Borkowska A., Ratkiewicz M. (2016) Purifying selection, density blocking and unnoticed mitochondrial DNA diversity in the red deer, Cervus elaphus. PLoS ONE 11(9): e

89 Borsy A., Podani J., Stéger V., Balla B., Horváth A., Kósa J., Gyurján I., Molnár A., Szabolcsi Z., Szabó L., Jakó E., Zomborszky Z., Nagy J., Semsey Sz., Vellai T., Lakatos P., Orosz L. (2009) Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis. Molecular Genetics and Genomics 281(3): Broom J.E., Tate M.L., Dodds K.G. (1996) Linkage maping in sheep and deer identifies a conserved ruminant linkage group orthologous to two regions of HSA16 and a portion of HSA7Q. Genomics 33(3): Burbaitė L., Csányi S. (2010) Red deer population and harvest changes in Europe. Acta Zoologica Lituanica 20(4): Bureš D., Bartoň L., Kotrba R., Hakl J. (2015) Quality attributes and composition of meat from red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama) and Aberdeen Angus and Holstein cattle (Bos taurus). Journal of the Science of Food and Agriculture 95(11): Cai G., Leadbetter C.W., Muehlbauer M.F., Molnar T.J., Hillman B.I. (2013) Genome-wide microsatellite identification in the fungus Anisogramma anomala using Illumina sequencing and genome assembly. PloS ONE 8(11): e Caniglia R., Fabbri E., Greco C., Galaverni M., Randi E. (2010) Forensic DNA against wildlife poaching: Identification of a serial wolf killing in Italy. Forensic Science International: Genetics 4(5): Carden R.F., McDevitt A.D., Zachos F.E., Woodman P.C., O Toole P., Rose H., Monaghan N.T., Campana M.G., Bradley D.G., Edwards C.J. (2012) Phylogeographic, ancient DNA, fossil and morphometric analyses reveal ancient and modern introductions of a large mammal: the complex case of red deer (Cervus elaphus) in Ireland. Quaternary Science Reviews 42: Castelo A.T., Martins W., Gao G.R. (2002) TROLL-tandem repeat occurrence locator. Bioinformatics 18(4):

90 Castoe T.A., Poole A.W., de Koning A.P.J., Jones K.L., Tomback D.F., Oyler- McCance S.J., Fike J.A., Lance S.L., Streicher J.W., Smith E.N., Pollock D.D. (2012) Rapid microsatellite identification from Illumina paired-end genomic sequencing in two birds and a snake. PLoS ONE 7(2): e Catchpole E.A., Fan Y., Morgan B.J.T., Clutton-Brock T.H., Coulson T. (2004) Sexual dimorphism, survival and dispersal in red deer. Journal of Agricultural, Biological, and Environmental Statistics 9(1): Csányi S., Kovács I., Csókás A., Putz K., Schally G. (szerk.) (2015) Vadgazdálkodási Adattár 2014/2015. vadászati év. Országos Vadgazdálkodási Adattár, Gödöllő, 36 pp. Csányi S., Kovács I., Csókás A., Putz K., Schally G. (szerk.) (2016) Vadgazdálkodási Adattár 2015/2016. vadászati év. Országos Vadgazdálkodási Adattár, Gödöllő, 48 pp. Csányi S., Tóth P. (2000) Populáció-rekonstrukció alkalmazása a hazai gímszarvas állomány létszámának meghatározására. Vadbiológia 7: Csányi S., Tóth K., Kovács I., Schally G. (szerk.) (2014a) Vadgazdálkodási Adattár 2013/2014. vadászati év. Országos Vadgazdálkodási Adattár, Gödöllő, 48 pp. Csányi S., Tóth K., Kovács I., Szemethy L. (2014b) Adatok a lőtt gímszarvasok testtömegének ivar és kor szerinti jellemzőiről a vadgazdálkodási statisztikák alapján. Vadbiológia 16: Csányi S., Tóth K., Schally G. (szerk.) (2013) Vadgazdálkodási Adattár 2012/2013. vadászati év. Országos Vadgazdálkodási Adattár, Gödöllő, 52 pp. de Knijff P., Kayser M., Caglià A., Corach D., Fretwell N., Gehrig C., Graziosi G., Heidorn F., Herrmann S., Herzog B., Hidding M., Honda K., Jobling M., Krawczak M., Leim K., Meuser S., Meyer E., Oesterreich W., Pandya A., Parson W., Penacino G., Perez-Lezaun A., Piccinini A., 88

91 Prinz M., Schmitt C., Schneider P.M., Szibor R., Teifel-Greding J., Weichhold G., Roewer L. (1997) Chromosome Y microsatellites: population genetic and evolutionary aspects. International Journal of Legal Medicine 110(3): Di Stefano G., Petronio C. (2002) Systematics and evolution of the Eurasian Plio-Pleistocene tribe Cervini (Artiodactyla, Mammalia). Geologica Romana 36: Dixon J.D., Oli M.K., Wooten M.C., Eason T.H., McCown J.W., Cunningham M.W. (2007) Genetic consequences of habitat fragmentation and loss: the case of the Florida black bear (Ursus americanus floridanus). Conservation Genetics 8(2): Drummond A.J., Suchard M.A., Xie D., Rambaut A. (2012) Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7. Molecular Biology and Evolution 29(8): Earl D.A., vonholdt B.M. (2012) STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resources 4(2): Edwards A., Civitello A., Hammond H.A., Caskey C.T. (1991) DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American Journal of Human Genetics 49: Evanno G., Regnaut S., Goudet J. (2005) Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14(8): Faircloth B.C. (2008) MSATCOMMANDER: detection of microsatellite repeat arrays and automated, locus-specific primer design. Molecular Ecology Resources 8(1): Fajardo V., González I., López-Calleja I., Martín I., Rojas M., Hernández P.E., García T., Martín R. (2007) Identification of meats from red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), and roe deer (Capreolus 89

92 capreolus) using polymerase chain reaction targeting specific sequences from the mitochondrial 12S rrna gene. Meat Science 76: Fernandez-Silva I., Whitney J., Wainwright B., Andrews K.R., Ylitalo-Ward H., Bowen B.W., Toonen R.J., Goetze E., Karl S.S (2013) Microsatellites for next-generation ecologists: A post-sequencing bioinformatics pipeline. PLoS ONE 8(2): e Fernández-Silva P., Enriquez J.A., Montoya J. (2003) Replication and transcription of mammalian mitochondrial DNA. Experimental Physiology 88(1): Feulner P.G.D., Bielfeldt W., Zachos F., Bradvarovic J., Eckert I., Hartl G.B. (2004) Mitochondrial DNA and microsatellite analyses of the genetic status of the presumed subspecies Cervus elaphus montanus (Carpathian red deer). Heredity 93: Fickel J., Bubliy O.A., Stache A., Noventa A., Jirsa A., Heurich M. (2012) Crossing the border? Structure of the red deer (Cervus elaphus) population from the Bavarian-Bohemian forest ecosystem. Mammalian Biology 77(3): Frantz A.C., Hamann J.-L., Klein F. (2008) Fine-scale genetic structure of red deer (Cervus elaphus) in a French temperate forest. European Journal of Wildlife Research 54: Frantz A.C., Tigel Pourtois J., Heuertz M., Schley L., Flamand M.C., Krier A., Bertouille S., Chaumont F., Burke T. (2006) Genetic structure and assignmenttests demonstrate illegal translocation of red deer (Cervus elaphus) into a continuous population. Molecular Ecology 15(11): Frohlich J., Kubickova S., Musilova P., Cernohorska H., Muskova H., Vodicka R., Rubes J. (2017) Karyotype relationships among selected deer 90

93 species and cattle revealed by bovine FISH probes. PLoS ONE 12(11): e Gallagher D.S., Womack J.E. (1992) Chromosome conservation in the Bovidae. Journal of Heredity 83(4): Gentry A.W. (1994) The Miocene differentiation of old world Pecora (Mammalia). Historical Biology 7(2): Gilbert C., Ropiquet A., Hassanin A. (2006) Mitochondrial and nuclear phylogenies of Cervidae (Mammalia, Ruminantia): systematics, morphology, and biogeography. Molecular Phylogenetics and Evolution 40(1): Goodman S.J., Barton N.H., Swanson G., Abernethy K., Pemberton J.M. (1999) Introgression through rare hybridization: a genetic study of a hybrid zone between red and sika deer (genus Cervus) in Argyll, Scotland. Genetics 152(1): Goosen G.J., Dodds K.G., Tate M.L., Fennessy P.F. (1999) QTL for live weight traits in Père David s x red deer interspecies hybrids. Journal of Heredity 90(6): Goosen G.J., Dodds K.G., Tate M.L., Fennessy P.F. (2000) QTL for pubertal and seasonality traits in male Père David s x red deer interspecies hybrids. Journal of Heredity 91(5): Groves C.P., Grubb P. (1987) Relationships of living deer. In: Wemmer C. (szerk.) Biology and Management of the Cervidae. Smithsonian Institute Press, Washington, pp Gustavsson I., Sundt C.O. (1968) Karyotypes in five species of deer (Alces alces L., Capreolus capreolus L., Cervus elaphus L., Cervus nippon Temm. and Dama dama L.). Hereditas 60(1-2): Gyurján I., Molnár A., Borsy A., Stéger V., Hackler L., Zomborszky Z., Papp P., Duda E., Deák F., Lakatos P., Puskás L.G., Orosz L. (2007) Gene expression dynamics in deer antler: mesenchymal differentiation 91

94 toward chondrogenesis. Molecular Genetics and Genomics 277(3): Haanes H., Røed K.H., Mysterud A., Langvatn R., Rosef O. (2010) Consequences for genetic diversity and population performance of introducing continental red deer into the northern distribution range. Conservation Genetics 11(5): Hammer Ø., Harper D.A.T., Ryan P.D. (2001) PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia Electronica 4(1): 9. Hartl G.B., Nadlinger K., Apollonio M., Markov G., Klein F., Lang G., Findo S., Markowski J. (1995) Extensive mitochondrial-dna differentiation among European Red deer (Cervus elaphus) populations: implications for conservation and management. Zeitschrift für Säugetierkunde 60 (1): Hartl G.B., Willing R., Lang G., Klein F., Köller J. (1990) Genetic variability and differentiation in red deer (Cervus elaphus L.) of Central Europe. Genetics Selection Evolution 22: Hartl G.B., Zachos F.E., Nadlinger K. (2003) Genetic diversity in European red deer (Cervus elaphus L.): anthropogenic influences on natural populations. Comptes Rendus Biologies 326(S1): S37-S42. Hassanin A., Douzery E.J.P. (2003) Molecular and morphological phylogenies of Ruminantia and the alternative position of the Moschidae. Systematic Biology 52(2): Haynes G.D., Latch E.K. (2012) Identification of novel single nucleotide polymorphisms (SNPs) in deer (Odocoileus spp.) using the BovineSNP50 BeadChip. PLoS ONE 6(1): e Hennink S., Zeven A.C. (1991) The interpretation of Nei and Shannon-Weaver within population variation indices. Euphytica 51(3):

95 Herzog S. (1987) The karyotype of red deer (Cervus elaphus L.). Caryologia 40(4): Hewitt G.M. (1999) Post-glacial recolonization of European biota. Biological Journal of the Linnean Society 68(1-2): Hewitt G.M. (2004) Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary. Philosophical Transactions of the Royal Society B 359: Hoffmann G.S., Johannesen J., Griebeler E.M. (2016) Population dynamics of a natural red deer population over 200 years detected via substantial changes of genetic variation. Ecology and Evolution 6(10): Horn P. (2004) A gímszarvastenyésztés mint új állattenyésztési ágazat - Az első háziasított nagytestű emlős faj ötezer év óta. Magyar Tudomány 110(4): Huang L., Chi J., Nie W., Wang J., Yang F. (2006) Phylogenomics of several deer species revealed by comparative chromosome painting with Chinese muntjac paints. Genetica 127(1-3): Huisman J., Kruuk L.E.B., Ellis P.A., Clutton-Brock T., Pemberton J.M. (2016) Inbreeding depression across the lifespan in a wild mammal population. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 113(13): Jia B.Y., Ba H.X., Wang G.W., Yang Y., Cui X.Z., Peng Y.H., Zheng J.J., Xing X.M., Yang F.H. (2016) Transcriptome analysis of sika deer in China. Molecular Genetics and Genomics 291(5): Jobling M.A., Pandya A., Tyler-Smith C. (1997) The Y chromosome in forensic analysis and paternity testing. International Journal of Legal Medicine 110(3): Johnston S.E., Huisman J., Ellis P.A., Pemberton J.M. (2017) A high-density linkage map reveals sexual dimorphism in recombination landscapes in 93

96 red deer (Cervus elaphus). G3: Genes, Genomes, Genetics 7(8): Kalia K., Rai M.K., Kalia S., Singh R., Dhawan A.K. (2011) Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants. Euphytica 177: Kalinowski S.T., Taper M.L., Marshall T.C. (2007) Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology 16(5): Karagyozov L., Kalcheva I.D., Chapman V.M. (1993) Construction of random small-insert genomic libraries highly enriched for simple sequence repeats. Nucleic Acids Research 21(16): Karaiskou N., Tsakogiannis A., Gkagkavouzis K., Papika S., Latsoudis P., Kavakiotis I., Pantis J., Abatzopoulos T.J., Triantaphyllidis C., Triantafyllidis A. (2014) Greece: a Balkan subrefuge for a remnant red deer (Cervus elaphus) population. Journal of Heredity 105(3): Katona K., Kiss M., Bleier N., Székely J., Nyeste M., Kovács V., Terhes A., Fodor Á., Olajos T., Rasztovits E., Szemethy L. (2013) Ungulate browsing shapes climate change impacts on forest biodiversity in Hungary. Biodiversity and Conservation 22(5): Kayser M., Caglià A., Corach D., Fretwell N., Gehrig C., Graziosi G., Heidorn F., Herrmann S., Herzog B., Hidding M., Honda K., Jobling M., Krawczak M., Leim K., Meuser S., Meyer E., Oesterreich W., Pandya A., Parson W., Penacino G., Perez-Lezaun A., Piccinini A., Prinz M., Schmitt C., Schneider P.M., Szibor R., Teifel-Greding J., Weichhold G., de Knijff P., Roewer L. (1997) Evaluation of Y-chromosomal STRs: a multicenter study. International Journal of Legal Medicine 110(3):

97 Kharzinova V.R., Sermyagin A.A., Gladyr E.A., Okhlopkov I.M., Brem G., Zinovieva N.A. (2015) A study of applicability of SNP chips developed for Bovine and Ovine species to whole-genome analysis of reindeer Rangifer tarandus. Journal of Heredity 106(6): Koepfli K.P., Paten B., the Genome 10K Community of Scientists, O Brien S.J. (2015) The Genome 10K Project: A way forward. Annual Review of Animal Biosciences 3: Kofler R., Schlotterer C., Lelley T. (2007) SciRoKo: a new tool for whole genome microsatellite search and investigation. Bioinformatics 23(13): Köller J., Kabai P., Demeter A. (1988) Untersuchungen zur regionalen Differenzierung ungarischer Rotwildpopulationen anhand morphologischer Geweihmerkmale.. Zeitschrift der Jagdwissenschaft 34: Krojerová-Prokešová J., Barančeková M., Šustr P., Heurich M. (2010) Feeding patterns of red deer Cervus elaphus along an altitudinal gradient in the Bohemian Forest: effect of habitat and season. Wildlife Biology 16(2): Krojerová-Prokešová J., Barančeková M., Koubek P. (2015) Admixture of eastern and western European red deer lineages as a result of postglacial recolonization of the Czech Republic (Central Europe). Journal of Heredity 106(4): Kuehn R., Haller H., Schroeder W., Rottmann O. (2004) Genetic roots of the red deer (Cervus elaphus) population in Eastern Switzerland. Journal of Heredity 95(2): Kuehn R., Schroeder W., Pirchner F., Rottmann O. (2003) Genetic diversity, gene flow and drift in Bavarian red deer populations (Cervus elaphus). Conservation Genetics 4:

98 Kumar V.P., Thakur M., Rajpoot A., Joshi B.D., Nigam P., Ahmad K., Kumar D., Goyal S.P. (2017) Resolving the phylogenetic status and taxonomic relationships of the Hangul (Cervus elaphus hanglu) in the family Cervidae. Mitochondrial DNA Part A 28(6): Kuska B. (1998) Beer, Bethesda, and biology: How genomics came into being. Journal of the National Cancer Institute 90(2): 93. Kuznetsova M.V., Danilkin A.A., Kholodova M.V. (2012) Phylogeography of red deer (Cervus elaphus): Analysis of mtdna cytochrome b polymorphism. Biology Bulletin 39(4): Kyselý R., Pecinovská M. (2018) Red deer (Cervus elaphus) skeleton from the Early Bronze Age pit at Brandýs (Czech Republic). Archaeological and Anthropological Sciences 10(1): Lancaster M.L., Taylor A.C., Cooper S.B., Carthew S.M. (2011) Limited ecological connectivity of an arboreal marsupial across a forest/plantation landscape despite apparent resilience to fragmentation. Molecular Ecology 20(11): Li M., Tamate H.B., Wei F-W., Wang X-M., Masuda R., Sheng H-L., Ohtaishi N. (2003) Phylogenetic relationships among deer in China derived from mitochondrial DNA cytochrome b sequences. Acta Theriologica 48(2): Librado P., Rozas J. (2009) DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 25(11): Lister A.M. (1990) Critical appraisal of the middle Pleistocene deer species Cervus elaphoides Kahlke. Quaternary 3-4: Litt M., Luty J.A. (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics 44(3):

99 Long E.S., Diefenbach D.R., Wallingford B.D., Rosenberry C.S. (2010) Influence of roads, rivers, and mountains on natal dispersal of whitetailed deer. Journal of Wildlife Management 74(6): Lorenzini R., Cabras P., Fanelli R., Carboni G.L. (2011) Wildlife molecular forensics: Identification of the Sardinian mouflon using STR profiling and the Bayesian assignment test. Forensic Science International: Genetics 5(4): Ludt C.J., Schroeder W., Rottmann O., Kuehn R. (2004) Mitochondrial DNA phylogeography of red deer (Cervus elaphus). Molecular Phylogenetics and Evolution 31(3): Lunt D.H., Hutchinson W.F., Carvalho G.R. (1999) An efficient method for PCR-based identification of microsatellite arrays (PIMA). Molecular Ecology 8(5): Mahmut H., Massuda R., Onuma M., Takahashi M., Nagata J., Suzuki M., Ohtaishi N. (2002) Molecular phylogeography of the red deer (Cervus elaphus) populations in Xianjiang of China: comparison with other Asian, European and North American populations. Zoological Science 19(4): Maqbool N.J., Tate M.L., Dodds K.G., Anderson R.M., McEwan K.M., Mathias H.C., McEwan J.C., Hall R.J. (2007) A QTL study of growth and body shape in the inter-species hybrid of Père David s deer (Elaphurus davidianus) and red deer (Cervus elaphus). Animal Genetics 38(3): Markov G.G., Kuznetsova M.V., Danilkin A.A., Kholodova M.V., Sugár L., Heltai M. (2015) Genetic diversity of the red deer (Cervus elaphus L.) in Hungary revealed by Cytochrome b gene. Acta Zoologica Bulgarica 67(1): Mátrai K., Szemethy L. (2000) A gímszarvas szezonális táplálékának jellegzetességei Magyarország különböző élőhelyein.. Vadbiológia 7:

100 Mattioli S., Meneguz P.G., Brugnoli A., Nicoloso S. (2001) Red deer in Italy: Recent changes in range and numbers. Hystrix 12(1): Meglécz E., Costedoat C., Dubut V., Gilles A., Malausa T., Pech N., Martin J- F. (2010) QDD: a user-friendly program to select microsatellite markers and design primers from large sequencing projects. Bioinformatics 26(3): Meiri M., Lister A.M., Higham T.F.G., Stewart J.R., Straus L.G., Obermaier H., González Morales M.R., Marín-Arroyo A.B., Barns I. (2013) Lateglacial recolonization and phylogeography of European red deer (Cervus elaphus L.). Molecular Ecology 22(18): Milner J.M., Bonenfant C., Mysterud A., Gaillard J.M., Csányi S., Stenseth N.C. (2006) Temporal and spatial development of red deer harvesting in Europe: biological and cultural factors. Journal of Applied Ecology 43(4): Molnár A., Gyurján I., Korpos É., Borsy A., Stéger V., Buzás Zs., Kiss I., Zomborszky Z., Papp P., Deák F., Orosz L. (2007) Identification of differentially expressed genes in the developing antler of red deer Cervus elaphus. Molecular Genetics and Genomics 277(3): Molnár J., Nagy T., Stéger V., Tóth G., Marincs F., Barta E. (2014) Genome sequencing and analysis of Mangalica, a fatty local pig of Hungary. BMC Genomics 15: 761. Mukesh, Sharma L.K., Kumar V.P., Charoo S.A., Mohan N., Goyal S.P. (2013) Loss of genetic diversity and inbreeding in Kashmir red deer (Cervus elaphus hanglu) of Dachigam National Park, Jammu & Kashmir, India. BMC Research Notes 6: 326. Murphy W.J., Sun S., Chen Z-Q., Pecon-Slattery J., O Brien S.J. (1999) Extensive conservation of sex chromosome organization between cat and human revealed by parallel radiation hybrid mapping. Genome Research 9(12):

101 Nei M., Tajima F. (1981) DNA polymorphism detectable by restriction endonucleases. Genetics 89(3): Nichols R.V., Spong G. (2017) An edna-based SNP assay for ungulate species and sex identification. Diversity 9(3): 33. Niedziałkowska M., Jędrzejewska B., Honnen A-C., Otto T., Sidorovics V.E., Perzanowski K., Skog A., Hartl G.B., Borowik T., Bunevich A.N., Lang J., Zachos F.E. (2011) Molecular biogeography of red deer Cervus elaphus from eastern Europe: insights from mitochondrial DNA sequences. Acta Theriologica 56(1): Novembre J., Stephens M. (2008) Interpreting principal component analyses of spatial population genetic variation. Nature Genetics 40(5): Ohta T., Kimura M. (1973) The model of mutation appropriate to estimate the number of electrophoretically detectable alleles in a genetic population. Genetics Research 22(2): Olivieri C., Marota I., Rizzi E., Ermini L., Fusco L., Pietrelli A., De Bellis G., Rollo F., Luciani S. (2014) Positioning the red deer (Cervus elaphus) hunted by the Tyrolean iceman into a mitochondrial DNA phylogeny. PLoS ONE 9(7): e Ostrander E.A., Jong P.M., Rine J., Duyk G. (1992) Construction of smallinsert genomic DNA libraries highly enriched for microsatellite repeat sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 89(8): Pérez-Espona S., Pérez-Barbería F.J., Goodall-Copestake W.P., Jiggins C.D., Gordon I.J., Pemberton J.M. (2009) Genetic diversity and population structure of Scottish Highland red deer (Cervus elaphus) populations: a mitochondrial survey. Heredity 102(2): Pérez-Espona S., Pérez-Barbería F.J., McLeod J.E., Jiggins C.D., Gordon I.J., Pemberton J.M. (2008) Landscape features affect gene flow of Scottish 99

102 Highland red deer (Cervus elaphus). Molecular Ecology 17(4): Peakall R., Smouse P.E. (2012) GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update. Bioinformatics 28(19): Pfeiffer T. (2002) The first complete skeleton of Megaloceros verticornis (Dawkins, 1868) Cervidae, Mammalia, from Bilshausen (Lower Saxony, Germany): description and phylogenetic implications. Mitteilungen aus dem Museum für Naturkunde in Berlin Geowissenschaftliche Reihe 5(1): Pitra C., Fickel J., Meijaard E., Groves P.C. (2004) Evolution and phylogeny of old world deer. Molecular Phylogenetics and Evolution 33(3): Polziehn R.O., Strobeck C. (1998) Phylogeny of wapiti, red deer, sika deer, and other North American cervids determined from mitochondrial DNA. Molecular Phylogenetics and Evolution 10(2): Polziehn R.O., Strobeck C. (2002) A phylogenetic comparison of red deer and wapiti. Molecular Phylogenetics and Evolution 22(3): Radko A., Zalewski D., Rubiś D., Szumiec A. (2014) Genetic differentiation among 6 populations of red deer (Cervus elaphus L.) in Poland based on microsatellite DNA polymorphism. Acta Biologica Hungarica 65(4): Ramanzin M., Amici A., Casoli C., Esposito L., Lupi P., Marsico G., Mattiello S., Olivieri O., Ponzetta M.P., Russo C., Marinucci M.T. (2010) Meat from wild ungulates: ensuring quality and hygiene of an increasing resource. Italian Journal of Animal Science 9: e61. Rassmann K., Schlotterer C., Tautz D. (1991) Isolation of simple sequence loci for use in polymerase chain reaction based DNA fingerprinting. Electrophoresis 12(2-3):

103 Roewer L., Kayser M., Dieltjes P., Nagy M., Bakker E., Krawczak M., de Knijff P. (1996) Analysis of molecular variance (AMOVA) of Y- chromosome-specific microsatellites in two closely related human populations. Human Molecular Genetics 5(7): Rozen S., Skaletsky H.J. (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S., Misener S. (szerk.) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, pp Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74(12): Seabury C.M., Bhattarai E.K., Taylor J.F., Viswanathan G.G., Cooper S.M., Davis D.S., Dowd S.E., Lockwood M.L., Seabury P.M. (2011) Genome-wide polymorphism and comparative analyses in the whitetailed deer (Odocoileus virginianus): a model for conservation genomics. PLoS ONE 6(1): e Senan S., Kizhakayil D., Sasikumar B., Sheeja T.E. (2014) Methods for development of microsatellite markers: An overview. Notulae Scientia Biologicae 6(1): Sharma P.C., Grover A., Kahl G. (2007) Mining microsatellites in eukaryotic genomes. Trends in Biotechnology 25(11): Silos Moraes de Castro e Souza A., Miño C.I., Del Lama S.N. (2012) Polymorphic heterologous microsatellite loci for population genetics studies of the white-faced ibis Plegadis chihi (Vieillot, 1817) (Pelecaniformes, Threskiornithidae). Genetics and Molecular Biology 35(1): Skog A., Zachos F.E., Rueness E.K., Feulner P.G.D., Mysterud A., Langvatn R., Hmwe S.S., Lehocky I., Hartl G.B., Stenseth N.C., Jakobsen K.S. 101

104 (2009) Phylogeography of red deer (Cervus elaphus) in Europe. Journal of Biogeography 36(1): Slate J., Van Stijn T.C., Anderson R.M., McEwan K.M., Maqbool N.J., Mathias H.C., Bixley M.J., Stevens D.R., Molenaar A.J., Beever J.E., Galloway S.M., Tate M.L. (2002a) A deer (subfamily Cervinae) genetic linkage map and the evolution of ruminant genomes. Genetics 160(4): Slate J., Visscher P.M., MacGregor S., Stevens D., Tate M.L., Pemberton J.M. (2002b) A genome scan for quantitative trait loci in a wild population of red deer (Cervus elaphus). Genetics 162(4): Sommer R.S., Zachos F.E., Street M., Jöris O., Skog A., Benecke N. (2008) Late Quaternary distribution dynamics and phylogeography of the red deer (Cervus elaphus) in Europe. Quaternary Science Reviews 27(7-8): Sommer R.S., Zachos F.E. (2009) Fossil evidence and phylogeography of temperate species: glacial refugia and post-glacial recolonization. Journal of Biogeography 36(11): Sonkoly K., Bleier N., Heltai M., Katona K., Szemethy L., Szabó L., Beregi A., Csányi S. (2013) Big game meat production in Hungary: A special product of a niche market. Hungarian Agricultural Research 22(2): Speir M.L., Zweig A.S., Rosenbloom K.R., Raney B.J., Paten B., Nejad P., Lee B.T., Learned K., Karolchik D., Hinrichs A.S., Heitner S., Harte R.A., Haeussler M., Guruvadoo L., Fujita P.A., Eisenhart C., Diekhans M., Clawson H., Casper J., Barber G.P., Haussler D., Kuhn R.M., Kent W.J. (2016) The UCSC genome browser database: 2016 update. Nucleic Acids Research 44(D1): D717-D

105 Spurdle A.B., Jenkins T. (1992) The Y-chromosome as a tool for studying human evolution. Current Opinion in Genetics and Development 2: Stanton D.W.G., Mulville J.A., Bruford M.W. (2016) Colonization of the Scottish islands via long-distance Neolithic transport of red deer (Cervus elaphus). Proceedings of the Royal Society B 283: Stéger V., Molnár A., Borsy A., Gyurján I., Szabolcsi Z., Dancs G., Molnár J., Papp P., Nagy J., Puskás L., Barta E., Zomborszky Z., Horn P., Podani J., Semsey Sz., Lakatos P., Orosz L. (2010) Antler development and coupled osteoporosis in the skeleton of red deer Cervus elaphus: expression dynamics for regulatory and effector genes. Molecular Genetics and Genomics 284(4): Sugár L., Barna R. (2008) Quantitative and qualitative analysis of red deer in Somogy county between 1970 and 2006 using an age group population dynamic model. Acta Agraria Kaposváriensis 12(2): Szabolcsi Z., Egyed B., Zenke P., Pádár Zs., Borsy A., Stéger V., Pásztor E., Csányi S., Buzás Zs., Orosz L. (2014) Constructing STR multiplexes for individual identification of Hungarian red deer. Journal of Forensic Sciences 59(4): Széchenyi Zs. (1979) Szarvasok nyomában. Gondolat Kiadó, Budapest, 262 pp. Szemethy L., Pető Z., Bíró Zs., Heltai M. (1999) A gímszarvas területhűsége egy alföldi élőhelyen. Vadbiológia 6: Taberlet P., Fumagalli L., Wust-Saucy A.G., Cosson J.F. (1998) Comparative phylogeography and postglacial colonization routes in Europe. Molecular Ecology 7(4): Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30(12):

106 Tang J., Baldwin S.J., Jacobs J.M.E., van der Linden C.G., Voorrips R.E., Leunissen J.A.M., Van E.H., Vosman B. (2008) Large-scale identification of polymorphic microsatellites using an in silico approach. BMC Bioinformatics 9: 374. Tate M.L., Anderson R.M., McEwan K.M., Goosen G.J., Pearse A.J. (1998) Genetic analysis of farmed deer hybrids. Acta Veterinaria Hungarica 46: Tate M.L., Mathias H.C., Fennessy P.F., Dodds K.G., Penty J.M., Hill D.F. (1995) A new gene mapping resource: interspecies hybrids between Père David s deer (Elaphurus davidianus) and red deer (Cervus elaphus). Genetics 139(3): Thiel T., Michalek W., Varhney R.K., Graner A. (2003) Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley (Hordeum vulgare L.). Theoretical and Applied Genetics 106(3): Valdes A.M., Slatkin M., Freimer N.B. (1993) Allele frequencies at microsatellite loci: the stepwise mutation model revisited. Genetics 133: Van Oosterhout C., William F., Hutchinson D.P., Wills M., Shipley P. (2004) Microchecker: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes 4(3): Vislobokova I., Changkang H., Su B. (1989) On the systematic position of the Lagomerycinae. Vertebrata Palasiatica 27: Vrba E.S., Schaller G.B. (szerk.) (2000) Antelopes, deer, and relatives: Fossil record, behavioral ecology, systematics, and conservation. Yale University Press, New Haven, 354 pp. Wada K., Okumura K., Nishibori M., Kikkawa Y., Yokohama M. (2010) The complete mitochondrial genome of the domestic red deer (Cervus 104

107 elaphus) of New Zealand and its phylogenic position within the family Cervidae. Animal Science Journal 81(5): Walling C.A., Nussey D.H., Morris A., Clutton-Brock T.H., Kruuk L.E.B., Pemberton J.M. (2011) Inbreeding depression in red deer calves. BMC Evolutionary Biology 11: 318. Wang D.G., Fan J.B., Siao C.J., Berno A., Young P., Sapolsky R., Ghandour G., Perkins N., Winchester E., Spencer J., Kruglyak L., Stein L., Hsie L., Topaloglou T., Hubbel E., Robinson E., Mittmann M., Morris M.S., Shen N., Kilburn D., Rioux J., Nusbaum C., Rozen S., Hudson T.J., Lipshutz R. Chee M., Lander E.S. (1998) Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 280: Willems H., Welte J., Hecht W., Reiner G. (2016) Temporal variation of the genetic diversity of a German red deer population between 1960 and European Journal of Wildlife Research 62(3): Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18(22): Yu J-N., Won C., Jun J., Kwak M. (2011) Fast and cost-effective mining of microsatellite markers using NGS technology: An example of the Korean water deer Hypodropotes inermis argyropus. PLoS ONE 6(11): e Yao B., Zhao Y., Zhang H., Zhang M., Liu M., Liu H., Li J. (2012) Sequencing and de novo analysis of the Chinese Sika deer antler-tip transcriptome during the ossification stage using Illumina RNA-Seq technology. Biotechnology Letters 34: Zachos F.E., Althoff C., von Steynitz Y., Eckert I., Hartl G.B. (2007) Genetic analysis of an isolated red deer (Cervus elaphus) population showing 105

108 signs of inbreeding depression. European Journal of Wildlife Research 53(1): Zachos F.E., Frantz A.C., Kuehn R., Bertouille S., Colyn M., Niedziałkowska M., Pérez-González J., Skog A., Sprĕm N., Flamand M.C. (2016) Genetic structure and effective population sizes in European red deer (Cervus elaphus) at a continental scale: insights from microsatellite DNA. Journal of Heredity 107(4): Zachos F.E., Hartl G.B., Apollonio M., Reutershan T. (2003) On the phylogeographic origin of the Corsican red deer (Cervus elaphus corsicanus): evidence from microsatellites and mitochondrial DNA. Mammalian Biology 68(5): Zane L., Bargelloni L., Patarnello T. (2002) Strategies for microsatellite isolation: A review. Molecular Ecology 11(1): Zhang W-Q., Zhang M-H. (2012) Phylogeny and evolution of Cervidae based on complete mitochondrial genomes. Genetics and Molecular Research 11: Zsolnai A., Lehoczky I., Gyurmán A., Nagy J., Sugár L., Anton I., Horn P., Magyary I. (2009) Development of eight-plex microsatellite PCR for parentage control in deer. Archiv Tierzucht 52(2):

109 13. A DISSZERTÁCIÓ TÉMAKÖRÉBŐL MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK Lektorált folyóiratban megjelent idegen nyelvű publikáció Frank K., Barta E., Bana Á.N., Nagy J., Horn P., Orosz L., Stéger V. (2016) Complete mitochondrial genome sequence of a Hungarian red deer (Cervus elaphus hippelaphus) from high-throughput sequencing data and its phylogenetic position within the family Cervidae. Acta Biologica Hungarica 67(2): doi: / Frank K., Bleier N., Tóth B., Sugár L., Horn P., Barta E., Orosz L., Stéger V. (2017) The presence of Balkan and Iberian red deer (Cervus elaphus) mitochondrial DNA lineages in the Carpathian Basin. Mammalian Biology 86: doi: /j.mambio Bana Á.N., Nyíri A., Nagy J., Frank K., Nagy T., Stéger V., Schiller M., Lakatos P., Sugár L., Horn P., Barta E., Orosz L. (2018) The red deer Cervus elaphus genome CerEla1.0: sequencing, annotation, genes, chromosomes. Molecular Genetics and Genomics Online First. doi: /s

110 Konferencia kiadványban teljes terjedelemben magyar nyelven megjelent Frank K., Stéger V., Bana Á.N., Nagy T., Nagy J., Wilhelm J., Kálmán Zs., Barta E., Horn P., Orosz L. (2015) Gímszarvas mikroszatellita marker fejlesztés újgenerációs szekvenálási adatok segítségével. XXI. Ifjúsági Tudományos Fórum, Pannon Egyetem, Keszthely, május 21. ISBN

111 14. A DISSZERTÁCIÓ TÉMAKÖRÉN KÍVÜLI PUBLIKÁCIÓK Lektorált folyóiratban megjelent idegen nyelvű publikáció Frank K., Majer J., Dudás Gy. (2012) Capture-recapture data of Large Whip Snakes Dolichophis caspius (GMELIN, 1789), in southern Transdanubia, Hungary. Herpetozoa 25(1/2): Kurucz K., Batáry P., Frank K., Purger J.J. (2015) Effects of daily nest monitoring on predation rate - an artificial nest experiment. North- Western Journal of Zoology 11(2): Frank K., Miró K., Nagy T., Marincs F. (2017): Development of a PCR-based DNA marker for Glu-1By alleles in the old Hungarian Bánkúti wheat. Molecular Breeding 37(10): 120. doi: /s Fábián R., Kovács A., Stéger V., Frank K., Egerszegi I., Oláh J., Bodó Sz. (2017) X- and Y-chromosome specific variants of the amelogenin gene allow non-invasive sex diagnosis for detection of pseudohermaphrodite goats. Acta Veterinaria Hungarica 65(4): Frank K., Dudás Gy. (2018) Body size and seasonal condition of Caspian Whip Snakes, Dolichophis caspius (GMELIN, 1789), in southwestern Hungary. Herpetozoa 30(3/4):

112 Lektorált folyóiratban megjelent magyar nyelvű publikáció Fábián R., Kanizsai B., Frank K., Bordán J., Kovács A., Egerszegi I., Oláh J., Stéger V., Bodó Sz. (2016) Szarvatlan gidák ivarának meghatározása PCR segítségével. Állattenyésztés és Takarmányozás 65(1): Konferencia kiadványban teljes terjedelemben idegen nyelven megjelent Németh A., Frank K., Bana Á. N., Molnár J., Tóth G., Nagy T., Barta E., Marincs F., Bodó Sz., Stéger V. (2014) Development of Mangalica breed-specific DNA marker. 20th Youth Scientific Forum, Pannon Egyetem, Keszthely, május , pp ISBN Konferencia kiadványban teljes terjedelemben magyar nyelven megjelent Szepesi K., Frank K., Heltai B., Satoshi M., Taller J., Barta E., Kolics B., Stéger V. (2016) Krajnai méh (Apis mellifera carnica) szekvenciák genomikai feldolgozása mikroszatellit marker fejlesztés céljából. XXII. Ifjúsági Tudományos Fórum, Pannon Egyetem, Keszthely, május 26. ISBN

113 15. RÖVID SZAKMAI ÉLETRAJZ február 4-én születtem Pécsen. Középiskolai tanulmányaimat a Ciszterci Rend Pécsi Nagy Lajos Gimnáziumában végeztem, ahol 2001-ben sikeres érettségi vizsgát tettem. Az érettségi megszerzése után a Pécsi Tudományegyetem Egészségügyi Főiskolai Kar Gyógytornász szakán kezdtem felsőfokú tanulmányaimat, és 2005-ben gyógytornász oklevelet szereztem. Majd 2006-ban felvételt nyertem a Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Karra, Biológia BSc majd Biológus MSc szakra is, itt szereztem biológus mesterszakos diplomát 2011-ben. Az egyetemi tanulmányaim befejezése után felvételt nyertem a Kaposvári Egyetem Állattenyésztési-tudományok Doktori Iskolájába, melynek nappali tagozatos hallgatója voltam. Doktoranduszként a kutatómunkámat a Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézetében végeztem, ahol azóta is dolgozom. 111

114 16. MELLÉKLETEK 1. melléklet. Y kromoszóma haplotípusok előfordulása és gyakorisága egyes gímszarvas populációkban. Haplotípus Bőszénfa Lábod Vajszló Gemenc Zemplén Y_01 6 (0,857) 8 (0,381) 5 (0,333) 11 (0,216) 13 (0,361) Y_02 1 (0,019) 1 (0,028) Y_03 1 (0,028) Y_04 10 (0,476) 7 (0,467) 28 (0,549) 5 (0,139) Y_05 1 (0,019) 1 (0,028) Y_06 5 (0,098) Y_07 1 (0,028) Y_08 1 (0,019) Y_09 1 (0,019) Y_10 1 (0,019) 1 (0,028) Y_11 1 (0,048) Y_12 1 (0,048) Y_13 1 (0,143) 1 (0,048) Y_14 1 (0,019) Y_15 3 (0,083) Y_16 1 (0,067) 1 (0,019) 4 (0,111) Y_17 1 (0,028) Y_18 2 (0,133) Y_19 5 (0,139) 112

115 2. melléklet. Y kromoszóma haplotípusok gyakorisága egyes gímszarvas populációkban. 113