Áramlási citométer Az áramlási citometria alkalmazási területei Hogyan működik? I.Lamináris áramlás, - hidrodinamikus fókuszálás - akusztikus fókuszálás (>2MHz UH) II.Optika (fényforrás, szűrők, tükrök, detektorok) III.Elektronika II/1. Lézer emisszió az UV/látható spektrumban Wavelength nm 700 650 600 550 500 450 400 300 II/2. Fényszórás detektálása A lézer előtt elhaladó sejtekről a fény kis és nagy szögben szóródik, melyet megfelelően elhelyezett detektorok érzékelnek: - kis szögben v. előre szórt fény: sejt mérettel arányos (forward scatter - FSC) - nagy szögben v. oldalra szórt fény: sejt granularitásával vagy lobuláltságával arányos (side scatter - SSC) RED ORANGE YELLOW GREEN BLUE VIOLET ULTRAVIOLET He Ne Lasers 633-635 nm Yellow Dye Lasers 588nM Ar-ion 488 nm Violet Lasers 405 nm UV Lasers He/ Cd 325 nm 355 nm II/3. Fluoreszcens jelek detektálása Direkt immunfluoreszcencia Fluoreszcens jel Fluoreszcens festékeket a lézer gerjeszti (elektronok magasabb energiájú pályákra kerülnek) λ exc = 488 nm A fluorochrom a gerjesztési hullámhossznál nagyobb hullámhosszú fényt emittál (λ em > λ exc, Stokes shift) George Gabriel Stokes, 1852 hő A monoklonális antitestet fluoreszcens festékkel jelöljük. Leggyakrabban használt fluoreszcens festékek: 1. FITC (fluoreszcein izotiocianát) 2. PE (phycoerythrin) 3. PerCP (peridin chlorofil-a protein) 4. APC (allophycocyanin) E 1 > E 3 λ 1 < λ 3
Tandem festékek Intensity 120 100 80 60 40 FITC PE 120 525 580 100 80 60 40 Intensity PE-TxR PE-Cy5 PE-Cy7 APC-Cy7 transfer 20 0 380 480 580 680 nm 20 0 390 490 590 690 790 nm excitation transfer emission excitation A B emission 405nM Fluoreszcens festékek 488nM 588nM 647 nm DNS, RNS és élő sejtek detektálására használt festékek Alexa Fluor 405 Alexa Fluor 430 Cascade Blue (Cascade Yellow)* Pacific Blue Pacific Orange Krom Orange FITC Alexa Fluor 488 R-PE PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 PerCP PerCP-Cy5.5 PE Cy7 Rhodamine Texas Red Cascade yellow Cy5.5-APC (APC)* (APC-Cy7)* APC Alexa Fluor 647 Alexa Fluor 750 APC-Cy7 APC-H7 UV Hoescht 33342 (DNA) DAPI (DNA) 488 nm Acridine Orange (DNA) Acridine Orange (RNA) Propidium Iodide (DNA) 7-AAD (DNA) Syto16 588nM Ethidium monoazide Pyronin Y *Festékek, melyek széles hullámhossz tartományban gerjeszthetők. Hogyan detektálható az emisszió? Hogyan detektálható az emisszió? 1. filterek 2. Dikroikus tükrök Adott hullámhossz felett /alatt 90 -ban megtöri a fényt, a többit átengedi Az emittált fényt a detektorra irányítja Long Pass Short Pass Band Pass Dichroic
Spektrális átfedés Külön detektorok (photomultiplier, PMT) szolgálnak a FITC, PE, PerCP, APC festékek által emittált fény érzékelésére. A PMT-k nem fluorokróm, hanem hullámhossz érzékenyek! A spektrális átfedések kiküszöbölésére szolgál az ún. kompenzálás. Pacific Blue Pacific Orange FITC PE PerCP- Cy5.5 PE- Cy7 APC APC-H7 Kalibráció Kompenzáció FL1 detektor (zöld tartomány) 530±30 nm FL2 detektor (narancs tartomány): 585±40 nm FL3 detektor (vörös tartomány): >670 nm FL4: 660±20 nm Navios (BC) - 3 lézer (10 szín) - Walk away 32 cső / karuzel - Egyenként vortexeli a csövet felszívás előtt - Bárkód olvasó - Munkalista - 25 000 event / sec FACSCalibur (BD) 2 lézer: 488-nm, 633-nm (4 szín) FACSCanto II (BD) 3 lézer: 488-nm, 633-nm, és 407-nm (8 szín) 10 000 event / sec III. A detektorok jelének továbbítása és adattárolás 1 sejtről n+2 adatot tárol a műszer (FS, SS, n = FL detektorok száma) ún. list mode file-okban. Az adatokat (digitális vs.analóg-digitális konverzió) a computer hisztogramok vagy felhőképek formájában jeleníti meg a sejtekhez tartozó számszerű értékekkel.
Fehérvérsejtek vizsgálata Immunfenotípus vizsgálatok: leukémiás sejtek jellemző markereinek analízise, leukémia típusának megállapítása Minimális Reziduális Betegség (MRD) vizsgálata Tumoros sejtek DNS tartalmának meghatározása és sejtciklus analízis Leukémiás sejtek citosztatikum érzékenységének kimutatása Őssejtek (CD34+ sejtek) abszolút számának meghatározása transzplantáció kapcsán AL screen (ALL, AML) B-CLL/NHL, CLLprog, T/NK limfóma, T/NK aktiváció Ly alosztály, MM, Waldenström, MDS MRD 300.000 sejt Neuroblastoma, idegensejt infiltráció Sejtciklus analízis és DNS index, MDR funkcionális teszt CD34+ sejtszám Turn Around Time 2 óra Immunfenotípus vizsgálatok elve CD (cluster of differentiation) fogalma és jellemzői 1. Sejtvonal és leukémia altípusának azonosítása: sejtfelszíni ill. intracelluláris fehérjék, melyek jellemzőek a sejtvonalra és a sejt differenciáltsági fokára. lymphoid és myeloid sejtek markerei általában különböznek (CD13, CD33 myeloid, CD19 lymphoid) CD34/CD19 koexpresszió: lymphoblast CD34/CD13, CD33 koexpresszió: myeloblast éretlen és érett sejteken eltérő markerek találhatók (CD10 éretlen a B sejten, CD20 érett B sejten) egyes markerek a sejt érése során végig detektálhatók (CD19 a B sejteken) Az immunfenotípus vizsgálatok gyakorlati aspektusai 1. Minta EDTA-val vagy heparinnal alvadásgátolt friss perifériás vér/csontvelő vagy leukaferetizált sejtszuszpenzió, likvor, ascites, mellkasi folyadék, BAL, nyirokcsomó (tárolás szobahőn, magvas sejtek és élő sejtek detektálása pl. syto festékek) 2. Mintaelőkészítés - sejtszuszpenzió és az antitest inkubálása 15 percig - vvt-k lízise lizáló oldattal - mosás 1 ml PBS-ben - fixálás 1%-os paraformaldehidben - mérés 24 órán belül, tárolás 4 C-on - citoplazmatikus markerek esetén a permeabilizálás megelőzi a felszíni Ag jelölést 2. Abnormális koexpressziók detektálása 3. Izotípus kontroll vagy autofluoreszcencia IK: fluoreszcens festékkel jelölt, de egyik CD markerre sem specifikus antitest, ehhez viszonyítjuk a többi marker pozitivitását. Négynél több szín esetén már nehezen kivitelezhető. AF: a sejtek saját fluoreszcens jele, antitestet nem adunk hozzá, ehhez viszonyítjuk a többi marker pozitivitását. 5. Fluoreszcens jelek detektálása FL-2 detektor (PE) 4. Sejtek begyűjtése és adattárolás diagnosztikus mintában: 100 000 sejt adatai reziduális leukémiás sejtek kimutatására: 300 000 500 000 sejt adatai kutatásban, ritka események detektálása (pl. keringő endothel sejt vagy leukémiás őssejt: 500 000 1 millió sejt) Különböző FC más-más kiterjesztésű adatfájlokat képez (BC -.LMD, BD -.FCS) FL-1 detektor (FITC) CD4 (FITC) - CD8 (PE)
6. Analízis Kapuzás FSC-SSC alapján Analízis Kapuzás CD45-SSC alapján Normál Normál perifériás vér Leukémiás minta blastokkal Analizáló szoftverek 7. Eredményközlés: A. kutatásban a. pozitív sejtek %-os aránya a dot plot képek alapján a. A gyártó saját terméke, csak az adott FC család adatait képes kezelni (CellQuest, FACSDiva, Navios) b. Univerzális, képes különböző FC-en mért adatfile-ok beolvasására (FloJo, Kaluza, Infinicyt) b. fluoreszcencia intenzitás hisztogram analízis alapján 7. Eredményközlés: B. klinikai FC laborban - Egyes markerek expressziójának %-át nem kell megadni. - A mintában az élő sejtek aránya és a különböző sejtalkoltók aránya fontos, kóros sejtek %-os aránya megadandó. - A kóros populáció karakterizálása. - Szöveges, interpretatív lelet adása. - Lelethez csatolható grafikus dokumentum. - Elektronikus rendszeren (MedSolution vagy e-mail) kívánatos a kezelőorvoshoz juttatni, fax nem ideális. Legfontosabb myeloid CD markerek Granulocyták cympo, CD13, CD33, C15, CD11b, CD16 Monocyták Megakaryocyták CD14, HLA-DR, CD4, CD13, CD33, cyfxiii CD41, CD61, CD42a, cyfxiii, CD33, CD13 Erythroidok Glycophorin A, CD71, CD45-! Pan-leukocyta marker CD45 Stem cell marker CD34, CD117, CD133 Legfontosabb lymphoid CD markerek T sejtek CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD8 B sejtek CD19, CD20, CD22, HLA-DR, cycd79a (cytdt, CD10) NK sejtek CD16, CD56,
myeloid stem cell CD34,CD117, HLA-DR, MPO pluripotens stem cell CD34, HLA-DR Normál hemopoiesis CFU-GM CD13, CD33, HLA-DR, MPO CFU-Meg CD41,42a,61 BFU-E GpA, CD71 monoblast myeloblast megakaryoblast normoblastok T lymphoblast monocyta CD14, CD13, CD33, MPO neutrophil CD13, CD15 MPO, HLA-DR thrombocyta CD41, CD42a CD61 erythrocyta GPA, CD71 T sejt CD2,CD3,CD5, CD7, CD4, CD8 Myeloblast MPO- CD117+ CD16- Myeloid érés Promyelocyta MPO+, SSC CD117+ CD16- Myelocyta MPO+, SSC CD117- CD16- Metamyelocyta MPO+ CD117- CD16+ Granulocyta MPO+ CD117- CD16++ lymphoid stem cell CD34,HLA-DR,TdT B lymphoblast B sejt CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD23 plazmasejt CD38, CD138 AML Éretlenség jelei: CD45dim/CD11b-/HLA-DR+ Éretlenség jelei: CD34+/CD117+/CD15-/CD16- Aberráns vonás: CD71- Panelek Akut leukémiák Screen CD15 CD7 CD33 CD19 CD34 CD117 syto40 CD45 B sejtvonal: Syto CD66c CD34 CD19 CD10 CD38 CD20 CD45 CD58 CD123 CD33 CD19 CD10 CD81 Syto40 CD45 ntdt cyigm CD34 CD19 - CD10 CD24 CD21 CD45 cyfxiii-a CD10 CD45 CD19 T sejtvonal: CD99 CD7 CD5 CD56 CD3 - Syto40 - CD45 ntdt CD7 CD3 CD2 - cycd3 CD8 CD4 CD45 Myeloid CD14 CD11b HLA-DR CD13 CD300e CD64 CD4 CD45 CD15 CD123 CD34 CD13 CD10 CD16 HLADR CD45 CD71 CD7 CD33 CD56 CD34 CD117 HLADR CD45 cyfxiii-a cympo CD33 CD2 CD34 CD117 HLADR CD45 Panelek - Krónikus leukémiák B-CLL/NHL: CD23 CD22 CD5 CD19 CD38 CD81 - CD20 CD45 kappa lambda CD5 CD19 CD10 CD43 FMC7 CD45 CD11c CD103 CD25 CD19 CD79b HLADR Syto40 CD45 B-CLL prognosztika: CD20 CD38 CD5 CD19 cyzap70 CD19 CD3+CD56 T/NK lymphoma: α+β γ+δ CD5 CD2 CD3 CD8 CD4 CD45 CD30 CD7 HLADR CD56 CD3 CD8 CD4 CD45 Myeloma: CD38 CD56 CD27 CD19 CD117 CD81 CD138 CD45 cykappa cylambda CD28 CD19 CD38 CD20 CD138 CD45 Waldenström: CD23 IgM CD5 CD19 CD38 CD81 - CD20 CD45 kappa lambda CD5 CD19 CD10 CD43 FMC7 CD45
488nm blue 647 nmm red 405nm violet Mire használható Myeloma Multiplex esetén? 518 nm FITC 575 nm PE 695 nm PerCP- Cy5.5 785 nm PE-Cy7 660 nm APC 785 nm APC-H7 452 nm PB 551 nm PO Myeloma sejtek aránya a csontvelőben 100 Myeloma sejt Normál plazmasejt 1. CD23 CD22 CD5 CD19 CD38 CD81 CD20 CD45 90 80 70 2. 3. kappa lambda CD5 CD19 CD10 CD43 CD11c CD103 CD25 CD19 CD79b HLADR FMC7 Syto40 CD45 CD45 60 50 40 30 20 10 0 MM / totalpc: 99,6% CLL panel 8 szín n = 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 4 szín (%) 7 szín (%) csontvelő morfológia (%) A CD138+ plazmasejtek többsége CD19- myeloma sejt (44,28%, piros), melyek jól elkülöníthetők a CD19+ normál plazmasejtektől (0,17%, zöld). Myeloma sejt Kappa/lambda: 5.0 Egyéb sejtek analízise Normál plazmasejt CD45-/CD81+/CD56+/CD117+ MM / total PC: 10% 1. Autofluoreszcencia 2. CD81 CD117 CD56 CD45 Kappa/lambda: 2.1 Jóllehet a myeloma sejt arány a csontvelőben mindössze 0,028% és a totál plazmasejt arány is csak 0,286%, de a kisszámú myeloma immunfenotípusú sejt monoklonalitást mutat. Neuroblastoma Áramlási citometria laboratórium 1.Tárgyi feltétel: műszerek, antitestek, szoftverek, szgépek 2.Személyi feltétel: Asszisztens, analitikus, interpretatív leletet adó szakorvos 3. Minőségirányítási rendszer: - Módszer leírások: SOP (antitest klónok, fluorokrómok, panelek, jelölés menete, karbantartások, tisztítások, mosások, stb) - TAT: 2 óra: screen, CD34# 2 nap: többi - QC belső: bead kalibrálás - külső: pl. UK-NEQAS Külső QC kiadások Kromatográfia 344 060; 11% Kémia 275 600; 9% Tumor marker 36 684; 1% Immunkémia 155 745; 5% Hemosztázis 858 700; 27% Áramlási citometria 530 375; 17% CD34# sejtszám, IF, MRD Hematológia 251 460; 8% Endokrin 307 492; 10% Elektroforézis 36 664; 1% TDM 357 552; 11% Total (HUF): 3 154 332
Hemato-onkológiai diagnosztikai szolgáltatás Hasznos linkek www.kbmpi.hu pathologyoutlines.com Áramlási citometria immunfenotipizálás CSV aspiráció cytogenetika Beteg mintái HODS Integrált lelet (heti eredménykiadás) vérkép Mol. Gen. hisztológia www.labtestsonline.hu