5. gyakorlat: Áramlási citometria, sejtszeparációs technikák

Átírás

1 5. gyakorlat: Áramlási citometria, sejtszeparációs technikák Az immunológia alapjai PTE-KK, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécs, 2016.

2 Áramlási citometria gyakorlat 1. Gyakorlat menete: 1. 1 cső alvadásgátolt vér a rumn laborból. 2. Sejfelszíni direkt fluoreszcens jelölés: Adjatok 50 μl vért a már előkészíteq anmtest-keverékekhez és inkubáljátok 30 percig! 3. Hemolízis: Adjatok 1 ml lízis puffert a mintákhoz, inkubáljátok 10 percig! 4. Mosás: Adjatok a mintához 2 ml PBS-t, majd centrifugáljátok 1000 rpm fordulatszámmal 5 percig! 5. Öntsétek le a felülúszót, a pelletet reszuszpendáljátok 500 μl FACS-Fix oldatban! (FACS-Fix: PBS + 0,5% paraformaldehid, MÉRGEZŐ) 6. Mérés az intézetben található BD FACSCalibur áramlási citométerrel és az eredmények analizálása a BD CellQuest programmal. HÚZZATOK KESZTYŰT!

3 Áramlási citometria gyakorlat 2. Az asztaloknál található anmtest-keverékek: 1. Cső: anm-cd3-fitc + anm-cd4-pe 2. Cső: anm-cd3-fitc + anm-cd8-pe 3. Cső: anm-cd19-fitc + anm-cd5-pe 4. Cső: nincs benne anmtest = autofluoreszcens kontroll 5. Cső: nincs benne anmtest = autofluoreszcens kontroll Használt fluorokrómok (lásd később): FITC: Fluorescein isothiocyanate PE: Phycoerythrin BD FACSCalibur áramlási citométer

4 Az áramlási citometria (flow cytometry) definíciója Mitől citometria? Sejtek paramétereinek vizsgálatára alkalmas módszer. (pl. sejtszám, méret, granularitás, fehérjék jelenléte a felszínen vagy a citoplazmában, DNStartalom, stb., lásd a következő diákon) Mitől áramlási? Folyadékban szuszpendált sejteknek vagy egyéb parmkulumoknak lézerfény és detektorok előp áramoltatásán alapul. (lásd a következő diákon) Mire jó? Egy nagyobb sejtmennyiség gyors, multparaméteres vizsgálatát teszi lehetővé, vagyis amelleq, hogy rövid időn belül sok sejtet vizsgál, egyetlen vizsgált sejtről egyidejűleg több paramétert is megad. (méret, granularitás, jelöléstől függően egyéb, lásd a következő diákon) Egy hemocitométer: Mikroszkóp alaq a vizsgáló megszámol percenként kb sejtet. BD FACSCanto II áramlási citométer: Egy másodperc alaq akár sejtet is képes lemérni. [1.]

5 Az áramlási citometria lényege Fluoreszcens detektorok Lézerforrás Dikroikus tükör Számítógép SSC (oldalsó detektor) Fényszűrő FSC (szemközt detektor) A folyadékban lévő sejtek egyesével elhaladnak a lézer előq. A fényszórásból az FSC és SSC detektorok meghatározzák a sejt méretét és granularitását, illetve a lézer gerjeszt a fluoreszcens molekulákat, amik a rájuk jellemző hullámhosszúságú fényt emiaálják. A kibocsátoq fluoreszcens fényt dikroikus tükrökkel vagy filterekkel terelik a megfelelő detektorhoz. [2.]

6 Hidrodinamikus fókuszálás A folyadékban lévő sejteket a hozzájuk áramoltatoq köpenyfolyadék (angolul sheath fluid, ez általában PBS) sorba rendezi. A sejtek így egymás után, egyesével haladnak egy kapillárisban. A lézerfény erre a kapillárisra fókuszált. Ultrahang is használható a sejtek fókuszálására (akuszmkus fókuszálás): Köpenyfolyadék Sejtszuszpenzió Hidrodinamikus fókuszálás Emiaált fluoreszcens fény Lézerforrás Szórt fény Az akuszmkus fókuszálást használó AQune áramlási citométer fókuszálás nélkül (bal) és fókuszálással (jobb).

7 Az FSC és SSC detektorok Beérkező fény Lézerforrás Dikroikus tükör SSC (oldalsó detektor) SSC (oldalra irányuló szórás) FSC (előre irányuló szórás) Fluoreszcens detektorok Számítógép A FSC (forward scaqer) detektor a kibocsátó lézerforrással nagyjából szemben található, a sejt felszíne által okozoq fényszórást méri, ami a sejt méretével arányos. Az SSC (side scaqer) detektor a sejtre érkező lézerfényhez képest oldalt található, a sejt belsejében előforduló membránnal körülveq struktúrák (pl. granulumok, mitokondriumok, stb.) által okozoq s z ó r á s t m é r i, a m i a s e j t granuláltságával arányos. Fényszűrő FSC (szemközt detektor)

8 Dot plot bemutatása FSC és SSC alapján A dot plot (dot = pont, plot = kép) az áramlási citometriás vizsgálatok egy jellegzetes megjelenítési formája. Egy kéaengelyű koordináta-rendszerben helyezi el a sejteket a beállítoq két paraméter függvényében. Minden egyes látoq pont egy sejtnek felel meg. Az azonos sejtcsoportba tartozó sejtek nagyobb halmazokat, sejtpopulációkat alkotnak. Az egyes populációk ezt követően kiválaszthatók ( kapuzás ) és külön-külön vizsgálhatók más paraméterekre. Humán perifériás vér dot ploton: Granulocyták SSC (granularitás) Lymphocytá k FSC (méret) Monocyták Granulocyták Monocyták Lymphocyták

9 Példa a kapuzásra A B C SSC SSC IL-17 FSC CD4 CD4 SzereQék volna a mintában meghatározni a a Th17 sejtek (lásd 2. gyakorlat) arányát. A vért fluoreszcensen jelölték (lásd következő diákon) CD4-re, és IL-17-re, majd a mintát áramlási citométerrel vizsgálták. A: Méret (FSC) és granularitás (SSC) alapján kiválasztoqák a lymphocytákat. (R1 kapu) B: A lymphocytákon belül kiválasztoqák a CD4 pozi{v sejteket. (R2, zöld kapu) C: A lymphocytákon belül vizsgálták az CD4+ és IL-17+ sejtek arányát. (jobb felső kvadráns, 1,24%-a az összes lymphocytának.)

10 Áramlási citometria és a vörösvérsejtek A vörösvérsejtek zavarják a vérminták vizsgálatát, mert: Hasonló méreaartományba esnek, mint a lymphocyták. A lymphocytákhoz képest sokkal több van belőlük, ezért elfedik a lymphocytákból érkező jelet. Baktérium 0,5 µm Fitoplankton 2 µm Vörösvérsejt 6-8 µm Lymphocyta 7-10 µm Granulocyta µm Monocyta µm Kicsi Nagy Módszerek a vörösvérsejtek eliminálására: Hemolízis Ficoll-grádiens centrifugálás (lásd később) Vvt, tct és egy lymphocyta

11 Immunfluoreszcens jelölés Gerjesztea állapot Piros fluorokróm Kék fluorokróm Zöld fluorokróm Abszorpció Emisszió Kék fény (nagy energiájú) Lézerforrás Gerjesztés Dikroikus tükör Alapállapot SSC (oldalsó detektor) Fényszűrő FSC (szemközt detektor) Zöld fény (alacsonyabb energiájú) Fluoreszcens detektorok Számítógép A antgén B antgén C antgén A méret és a granularitás melleq a sejtekből érkező fluoreszcens jel is detektálható. A lézer gerjesztő fényként gerjeszm a jelöléshez használt anmtesthez konjugált fluorokrómot, ami valamilyen rá jellemző hullámhossz tartományban (emissziós spektrum) fényt bocsát ki. A különböző hullámhosszú fluoreszcens fényt dikroikus szűrőkkel vagy tükrökkel el lehet különíteni és a nekik megfelelő detektorokba terelhetők.

12 A fluoreszcens spektrum 488 nm lézer FL1 (530/30) FL2 (585/42) FL3 (>670) FITC PerCP PE A BD FACSCalibur lézerei: [3.] 488 nm argon lézer 635 nm vörös dióda lézer hullámhossz FL4 (661/16) A BD FACSCalibur detektorai: FL1: nm (530/30) FL2: nm (585/42) FL3: >670 nm FL4: nm (661/16) 635 nm lézer APC hullámhossz A lézerekkel ellentétben, amik egy fix hullámhosszúságú fénynyalábot bocsátanak ki, a fluorokrómok egy rájuk jellemző emissziós spektrummal rendelkeznek, amik sokszor jelentősen ásednek egymással.

13 Fluorokrómok Fluorokróm Színe Gerjesztési hullámhossz max. (nm) Gerjesztő lézer (nm) Emissziós hullámhossz max. (nm) Ugyanabban a mintában ugyanazon lézer által gerjeszteq és azonos színű fluorokrómok használata kerülendő, mert nem lesznek elkülöníthetőek a vizsgált anmgének. (Gyakran használt kombináció: FITC + PE + APC)

14 Fluoreszcencia megjelenítése dot ploton Fluoreszcencia intenzitás 10 4 APC pozi{v 10 3 APC Nega{v FITC Fluoreszcencia intenzitás FITC+APC keqős pozi{v FITC pozi{v A vizsgálat kvanttauv, a mért fluoreszcencia intenzitások számban kifejezhetőek. (=A pozitvitás mértéke is meghatározható.)

15 Példák egyéb megjelenítési formákra Sejtszám Nega{v Pozi{v Fluoreszcencia intenzitás Hagyományos hisztogram: A vízszintes tengelyen az adoq detektorban mért fluoreszcencia intenzitás (=jelerősség), a függőleges tengelyen pedig a sejtek száma látható. A megadoq példában elkülöníthető egy alacsony fluoreszcenciájú nega{v és egy magasabb fluoreszcenciát adó pozi{v sejtpopuláció.

16 A CD markerek {pusai Sejtvonal markerek: Kizárólag egy sejtvonalra jellemzőek, az adoq vonal összes sejtjén jelen vannak, de más sejteken nem találhatók meg. Pl.: CD3 minden T-sejten CD19 minden B-sejten Érési markerek: A sejtérés eltérő fázisaiban különbözik az immunfeno{pus, egyes molekulák csak a sejtérés bizonyos fázisaiban vannak jelen, később eltűnnek, más molekulák csak az éreq sejteken találhatók meg, stb. Pl.: CD20 (B-sejt marker is egyben, más sejteken nem fordul elő) [1.] CLP Pro-B-sejt Pre-B-sejt Éretlen B-sejt ÉreQ B-sejt Plazmasejt CD20 negauv CD20 negauv CD20 poziuv CD20 poziuv CD20 poziuv CD20 negauv AkTvációs markerek: Nyugvó sejteken nincsenek, vagy csak nagyon kis mennyiségben vannak jelen, de a sejtakmváció hatására megjelennek, pl.: CD25 (az interleukin-2 receptorának az alfa lánca, IL-2Rα, lásd később) CD80 és CD86 (B7-1 és B7-2, az anmgén prezentáló sejteken található ún. kosmmulációs molekulák, lásd később)

17 Normál humán vér lymphocyta alcsoportjai NK [4,5.] Tc Th NK NKT CD8 B+NK Th CD4 CD56 B T B+NK Tc CD3 CD3 CD3 Tc B B CD8 B+NK Th CD19 NK T CD19 T NK CD4 CD3 CD56 Emlékeztető: CD3 T-sejt, CD4 Th sejt, CD8 Tc sejt, CD19 B-sejt, CD56 NK-sejt

18 CD45 humán perifériás vérben Monocyták Lymphocyták Granulocyták A CD45 molekula minden fehérvérsejten megtalálható, ún. pan-leukocyta marker.

19 CD45RA és RO izoformák kimutatása humán vérben Naiv T-sejtek Memória T-sejtek CD45RA FITC CD45RO CyC CD3 PE CD3 PE CD45 funkciója: Sejtmembránba ágyazoq foszfatáz, számos izoformája ismert, a CD45RA a naiv T-sejtekre, a CD45RO a memória T-sejtekre jellemző. [6.] (részletesen lásd előadáson)

20 CD25 expresszió humán vér T-sejtjeiben AkMvált T-sejtek CD25 PE CD3 FITC CD25: Az interleukin-2 receptorának alfa lánca (IL-2Rα), mely akmvált lymphocytákon jelenik meg. [7.] (részletesen lásd előadáson)

21 Humán CD5+ B-sejtek Egészséges egyén perifériás vére: T-sejtek B-sejtes chronicus lymphocytás leukaemia (B-CLL): T-sejtek CD5+ B-sejtek CD5- B-sejtek CD5+ B-sejtek CD5- B-sejtek

22 Az áramlási citometria jelentősége 1. Meghatározható a mintában található sejtek immunpheno{pusa (immunphenotpizálás): Malignus hematológiai betegségek diagnoszmkája és differenciáldiagnoszmkája [8, 9.] Immunhiányos állapotok diagnoszmkája és differenciáldiagnoszmkája [10.] Autoimmun betegségek követése Transzplantáció előp és utáni állapotok követése [11.] HLA haploupus meghatározása [12.] (lásd később) Fertőző betegségek diagnoszmkája és követése KvanTtauv mérési lehetőségek: A vizsgált anmgént hordozó sejtek arányának mérése Az antgén expressziójának meghatározása a vizsgált sejtpopulációban DNS és RNS tartalom mérése: [13.] Apoptózis vizsgálata Sejtciklus vizsgálata ReMculocyták számának meghatározása Aneuploidia kimutatása

23 Az áramlási citometria jelentősége 2. Funkcionális tesztek: Phagocytaló képesség vizsgálata [14.] Intracelluláris kalcium szint mérése [15.] Intracelluláris ph meghatározása Enzim mennyiség és akmvitás meghatározása Chemotaxis vizsgálata Reak{v oxigén szabadgyökök termelésének meghatározása Proliferációs index mérése Citokin szint mérés [16.] (CBA, lásd később a szerológiai teszteknél) Sejtszeparálás [17.] (Sejt szortolás, lásd később) Hematológiai automaták vérkép (fluoreszcens jelölés nélkül) A következőkben láthaqok pár szemléltető diát az áramlási citometria felhasználási területeiről. Az azokon szereplő anyagot természetesen nem kérjük számon, azonban a főbb felhasználási területeit ismerni kell és tudnotok kell dot plotot elemezni!

24 Példa immunphenompizálásra 1. A betegnél vérvétel során kórosan emelkedeq lymphocytaszámot (lymphocytosis) találtak. SSC SSC Áramlási citometria FSC CD19-PE Kérdés: Milyen sejtek ezek? CD5-PE CD5-PE Normál vérkenet CD23-APC FMC7-FITC KapoQ immunpheno{pus: CD5+/CD23+/CD19+/FMC7- A beteg kenete Diagnózis: B-sejtes chronicus lymphocytás leukaemia (B-CLL, B-cell chronic lymphocymc leukemia)

25 Példa immunphenompizálásra 2. Lymphocytosis és nyirokcsomó-megnagyobbodás (lymphadenomegalia) miaq vizsgálták a beteget. Kérdés: Milyen sejtek ezek? KapoQ immunpheno{pus: CD5+ CD19+ CD20+ CD45+ CD79b+ FMC7+ Lambda+ CD10- CD23- Diagnózis: Köpenysejtes lymphoma (MCL, Mantle cell lymphoma), leukaemiás vérképpel KiszélesedeQ köpenyzóna (mantle zone) egy nyiroktüsző körül MCL-ben. (fehér nyilakkal jelölve, H&E festés)

26 Példa immunhiány követésére CD4/CD8 arány egy egészséges egyén perifériás vérében: Kóros CD4/CD8 arány HIV fertőzöq betegben: Helper T-sejtek CD4 CD8 CD3 CD8 CD4 Cytotoxicus T-sejtek CD3 CD3 CD3

27 Példa phagocytosis vizsgálatára A: Kezeletlen macrophagok FITCel jelölt latex gyöngyök nélkül B: Kezeletlen macrophagok FITC-el jelölt latex gyöngyökkel inkubálva A kezelések hatására fokozódik a macrophagok phagocytaló képessége. C: Növényi poliszachariddal kezelt macrophagok FITC-el jelölt latex gyöngyökkel inkubálva D: LPS-el kezelt macrophagok FITCel jelölt latex gyöngyökkel inkubálva

28 DNS tartalom vizsgálata tumorokban DNS-t festő fluorokrómokkal kezelik a sejteket, majd megmérik a fluoreszcencia intenzitást. Normális állapot: Májbiopszia hepatocellularis carcinomából: [18.] G0+G1 diploid sejtek Haploid csirke vvt (kontroll) Diploid sejtek (G0+G1) Sejtszám Sejtszám Aneuploid sejtek (G0 +G1) S fázis G2+M fázisú sejtek Aneuploid sejtek (G2+M) Fluoreszcencia intenzitás Fluoreszcencia intenzitás Aneuploidia: Abnormális kromoszómaszám (pl. 60 a 46 helyeq G0 fázisú sejtekben)

29 Példa sejt életképesség Propidium-jodid: DNS-t kötő fluoreszcens molekula, mely azonban az élő sejtek membránján nem jut át. Annexin V: Az apoptomkus sejtek membránjában előforduló foszfamdilszerinhez kötődik. SSC SSC vizsgálatára P1 88,4% Propidium-jodid FSC Annexin V-FITC Jurkat-sejtek + camptothecin (kemoterápia) P1 53,1% Jurkat-sejtek Propidium-jodid Élő 85,4% Élő 62,3% Elhalt 11,3% ApoptoTkus 3,2% Elhalt 9,3% ApoptoTkus 28,3% FSC Annexin V-FITC

30 Mononukleáris sejtek izolálása Fizikai paramétereken alapuló módszerek: [19.] Filtráció (vérsejtek mérete alapján) Grádiens centrifugálás (pl. Ficoll-grádiens centrifugálás, a vér alakos elemeinek sűrűsége alapján) Vörösvérsejt Ficoll (1,077) Sejtszám Neutrophil Lymphocyta Monocyta Basophil Eosinophil Sűrűség (g/ml) Adhéziós tulajdonságokon alapuló eljárások: Nylon vaqa: monocyták és a B-sejtek kitapadnak Műanyag/üvegfelszín: monocyták kitapadnak, lymphocyták eltávolíthatók

31 Ficoll-grádiens centrifugálás 1. Közönséges centrifugálás: Alakos elemek Vérplazma (térfogat kb. 55 százaléka) Buffy coat (fvs+tct) < 1% Ebben mindenféle fehérvérsejt megtalálható Vérvétel Centrifugálás Erytrhocyták (térfogat kb. 45 százaléka) Ficoll-grádiens centrifugálás: Higítoa vér rárétegezése a Ficollra Vérplazma Lymphocyták + monocyták (PBMC) Ficoll Vérvétel Ficoll Centrifugálás Erythrociták + neutrophilek és eosinophilek

32 Ficoll-grádiens centrifugálás 2. Perifériás vér mononukleáris sejtjei (PBMC, Peripheral blood mononuclear cells = nemszegmentált magvú fehérvérsejtek): Lymphocyták, monocyták (és kis arányban basophil granulocyták) [20.]

33 Szortolás Szortolás: áramlási citometrián alapuló sejtelválasztó technika FACS: Fluoreszcencia-akMvált sejt szortolás (Fluorescence acmvated cell sormng) 1. A sejtek egyesével egy-egy folyadékcseppbe kerülnek. 2. A fluoreszcensen jelölt sejt elhalad a lézer előq, a szórt és az emiqált fényt a detektorok mérik. 3. A cseppek a beállítoq paraméterektől függően elektromos töltést kapnak. 4. A cseppeket eltérímk a pozi{v és nega{v töltéssel bíró lemezek. 5. A sejteket tartalmazó eltéríteq cseppek külön csövekbe kerülnek. Lézer Kevert sejtszuszpenzió Töltés Detektor Töltöa lemezek Elkülönítea sejtek Az elkülöníteq sejtek életképesek és felhasználhatók

34 Szortolás egér thymusból DN (Double negatve) CD4/CD8 DP (Double positve) CD4-PE Kiindulási minta (thymocyták) CD4-PE CD8-CyC CD4 SP (Single positve) CD4-PE CD8-CyC CD4-PE CD8-CyC Az elért Tsztaság >90% CD4-PE CD8-CyC CD8 SP (Single positve) CD8-CyC

35 Immunomágneses sejtszeparálás (MACS) 1. AnTtest keverék 2. Mágneses gyöngy 5. Felülúszó leöntése 3. Inkubáció 4. Mágneses szeparáció Poziuv szelekció: Csőhöz tapadt jelölt sejtek Negauv szelekció: Felülúszóban lévő jelöletlen sejtek Mágneses gyöngy SEJT AnTtest komplex A Stemcell Technologies EasySep mágnese.

36 Hivatkozások BD Biosciences: BD FACSCanto II (hqps:// 2. McCoy JP Jr 1 : Basic principles of flow cytometry. Hematol Oncol Clin North Am Apr;16(2): BD Biosciences: BD FACSCalibur (hqps:// 4. Addison EG 1, North J, Bakhsh I, Marden C, Haq S, Al-Sarraj S, Malayeri R, Wickremasinghe RG, Davies JK, Lowdell MW: LigaTon of CD8alpha on human natural killer cells prevents actvaton-induced apoptosis and enhances cytolytc actvity. Immunology Nov;116(3): Campbell JP 1, Guy K, Cosgrove C, Florida-James GD, Simpson RJ: Total lymphocyte CD8 expression is not a reliable marker of cytotoxic T-cell populatons in human peripheral blood following an acute bout of high-intensity exercise. Brain Behav Immun Mar;22(3): Epub 2007 Oct AlMn JG 1, Sloan EK: The role of CD45 and CD45-associated molecules in T cell actvaton. Immunol Cell Biol Oct;75(5): Létourneau S 1, Krieg C, Pantaleo G, Boyman O: IL-2- and CD25-dependent immunoregulatory mechanisms in the homeostasis of T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol Apr;123(4): doi: /j.jaci Craig FE 1, Foon KA: Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood Apr 15;111(8): doi: /blood Epub 2008 Jan Virgo PF 1, Gibbs GJ: Flow cytometry in clinical pathology. Ann Clin Biochem Jan;49(Pt 1): doi: /acb Epub 2011 Oct O'Gorman MR 1, ZolleQ J, Bensen N: Flow cytometry assays in primary immunodeficiency diseases. Methods Mol Biol. 2011;699: doi: / _15.

37 Hivatkozások Maguire O 1, Tario JD Jr, Shanahan TC, Wallace PK, Minderman H: Flow cytometry and solid organ transplantaton: a perfect match. Immunol Invest. 2014;43(8): doi: / Bray RA 1, Tarsitani C, Gebel HM, Lee JH: Clinical cytometry and progress in HLA antbody detecton. Methods Cell Biol. 2011;103: doi: /B Darzynkiewicz Z 1, Halicka HD, Zhao H: Analysis of cellular DNA content by flow and laser scanning cytometry. Adv Exp Med Biol. 2010;676: Lehmann AK 1, Sornes S, Halstensen A: Phagocytosis: measurement by flow cytometry. J Immunol Methods Sep 21;243(1-2): June CH 1, Abe R, Rabinovitch PS: Measurement of intracellular calcium ions by flow cytometry. Curr Protoc Cytom May;Chapter 9:Unit 9.8. doi: / cy0908s Morgan E 1, et al.: Cytometric bead array: a multplexed assay plasorm with applicatons in various areas of biology. Clin Immunol Mar;110(3): Tomlinson MJ 1, Tomlinson S, Yang XB, Kirkham J: Cell separaton: Terminology and practcal consideratons. J Tissue Eng. 2013;4: doi: / Epub 2012 Dec Ashraf Tabll 1 and Hisham Ismail 2, 3 : The Use of Flow Cytometric DNA Ploidy Analysis of Liver Biopsies in Liver Cirrhosis and Hepatocellular Carcinoma (hqp:// 19. Fuss IJ 1, Kanof ME, Smith PD, Zola H: IsolaTon of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol Apr;Chapter 7:Unit7.1. doi: / im0701s Mitre E 1, Taylor RT, Kubofcik J, Nutman TB: Parasite antgen-driven basophils are a major source of IL-4 in human filarial infectons. J Immunol Feb 15;172(4):