A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérje szérumszintjének és genetikai polimorfizmusainak vizsgálata praeeclampsiában Doktori értekezés Dr. Molvarec Attila Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Témavezetők: Dr. Karádi István egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Prohászka Zoltán tudományos főmunkatárs, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Csuka Ildikó egyetemi adjunktus, kandidátus Dr. Siklós Pál osztályvezető főorvos-helyettes, kandidátus Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Paulin Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Csuka Ildikó egyetemi adjunktus, kandidátus Dr. Tóth Károly Sándor egyetemi magántanár, kandidátus Budapest 2007.
Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 1. BEVEZETÉS 1.1. A praeeclampsia definíciója és diagnosztikai kritériumai 1.2. A praeeclampsia epidemiológiája és kockázati tényezői 1.3. Immunológiai folyamatok élettani terhességben 1.4. Immunológiai folyamatok szerepe a praeeclampsia kóreredetében és pathogenesisében 1.5. A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérjék szerkezete és funkciója 1.6. A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérjéket kódoló gének és a génátírás szabályozása 1.7. Az extracellularis Hsp70 eredete, receptorai, jelátvitele és hatásai 2. CÉLKITŰZÉSEK 3. VIZSGÁLATI CSOPORTOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Vizsgálati csoportok 3.1.1. Egészséges terhes és nem terhes nők vizsgálata 3.1.2. Praeeclampsiás terhesek vizsgálata 3.1.3. HELLP-syndromás terhesek vizsgálata 3.1.4. Genetikai asszociációs vizsgálat praeeclampsiában 3.2. Módszerek 3.2.1. A vérminták levétele, előkészítése és tárolása 3.2.2. Szérum Hsp70 koncentráció meghatározása 3.2.3. Szérum C-reaktív protein (CRP) koncentráció meghatározása 3.2.4. Szérum α 2 -macroglobulin és α 2 -HS glycoprotein koncentráció meghatározása 3.2.5. DNS izolálás 3.2.6. Genotipizálás 3.2.6.1. HspA1B (Hsp70-2) 1267A>G polimorfizmus vizsgálata 3.2.6.2. HspA1L (Hsp70-Hom) 2437C>T polimorfizmus vizsgálata 3.2.7. Statisztikai módszerek 4 8 9 11 13 16 23 25 27 31 33 33 33 33 34 35 37 37 37 38 38 38 39 39 40 41 2
4. EREDMÉNYEK 4.1. Egészséges terhes és nem terhes nők szérum Hsp70 koncentrációjának vizsgálata 4.1.1. Az egészséges terhes és nem terhes nők klinikai jellemzői 4.1.2. Az egészséges terhes és nem terhes nők szérum Hsp70 koncentrációja 4.2. Egészséges és praeeclampsiás terhesek szérum Hsp70, C-reaktív protein és α 2 -HS glycoprotein koncentrációjának vizsgálata 4.2.1. Az egészséges és praeeclampsiás terhesek klinikai jellemzői 4.2.2. Az egészséges és praeeclampsiás terhesek szérum Hsp70, C-reaktív protein és α 2 -HS glycoprotein koncentrációja 4.3. Egészséges, súlyos praeeclampsiás (HELLP-syndroma nélkül) és súlyos praeeclampsiás, HELLP-syndromás terhesek szérum Hsp70, C- reaktív protein, α 2 -macroglobulin és α 2 -HS glycoprotein koncentrációjának vizsgálata 4.3.1. Az egészséges, súlyos praeeclampsiás és HELLP-syndromás terhesek klinikai jellemzői 4.3.2. Az egészséges, súlyos praeeclampsiás és HELLP-syndromás terhesek szérum Hsp70, C-reaktív protein, α 2 -macroglobulin és α 2 -HS glycoprotein koncentrációja 4.4. Egészséges és praeeclampsiás terhesek Hsp70-2 1267A>G és Hsp70- Hom 2437C>T genotípusának vizsgálata 4.4.1. A genetikai asszociációs vizsgálatban résztvevő egészséges és praeeclampsiás terhesek klinikai jellemzői 4.4.2. Az egészséges és praeeclampsiás terhesek Hsp70-2 1267A>G és Hsp70- Hom 2437C>T genotípusai 5. MEGBESZÉLÉS 6. KÖVETKEZTETÉSEK 7. ÖSSZEFOGLALÁS 8. SUMMARY 9. IRODALOMJEGYZÉK 10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 43 43 43 43 48 48 48 53 53 53 59 59 59 64 77 80 82 84 110 112 3
Rövidítések jegyzéke A adenozin AHSG α 2 -Heremans Schmid glycoprotein ALT alanin-aminotranszferáz AMG α 2 -macroglobulin ANCOVA kovariancia analízis ANOVA varianciaanalízis AST aszpartát-aminotranszferáz AT1 angiotenzin receptor-1 ATP adenozin-trifoszfát AUC a görbe alatti terület (area under curve) B regressziós együttható β standardizált regressziós együttható BAG-1 Bcl-2-associated athanogene 1 BiP Immunoglobulin heavy chain-binding protein BMI testtömeg index C citidin CCR chemokin receptor CD differenciálódási antigén (cluster of differentiation) CHIP Carboxyl Terminus of Hsc70-Interacting Protein CI megbízhatósági tartomány (konfidencia intervallum) CRP C-reaktív protein CSF-1 kolóniastimuláló faktor 1 Da Dalton DnaJ a 40 kda molekulatömegű hősokkfehérje Escherichia coliban található homológja DnaK a 70 kda molekulatömegű hősokkfehérje Escherichia coliban található homológja DNS dezoxi-ribonukleinsav dntp dezoxi-ribonukleozid-trifoszfát doi digitális objektum-azonosító (digital object identifier) 4
EDTA etilén-diamin-tetraecetsav ELISA enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat (enzyme-linked immunosorbent assay) EM Expectation-Maximization (a várható érték maximalizálásán alapuló módszer) enos endothelialis nitrogén-monoxid szintáz FAS CD95 (apoptosis antigen 1) FcγR Fcγ-receptor (az immunglobulinok Fc-szakaszát felismerő plazmamembrán receptor) G guanozin GM-CSF granulocyta-macrophag kolóniastimuláló faktor Grp glükózregulált fehérje Hdj1, -2 human DnaJ homologue 1, -2 HELLP haemolysis, emelkedett májenzim értékek, alacsony thrombocytaszám Hip Hsc/Hsp 70 interacting protein HLA humán leukocyta antigén HSBP1 heat shock factor binding protein 1 Hsc70 constitutiv 70 kda molekulatömegű hősokkfehérje HSE hősokk elem HSF hősokk transzkripciós faktor Hsp hősokkfehérje Hsp70 fő hő-indukálható 70 kda molekulatömegű hősokkfehérje ICAM-1 intercellularis adhéziós molekula-1 IDO indolamin 2,3-dioxigenáz IF impakt faktor IFN-γ interferon-γ IL interleukin IRAK IL-1 receptor associated kinase IUGR intrauterin növekedési retardatio KIR killer immunglobulinszerű receptor LD linkage (kapcsoltsági) disequilibrium 5
LDH laktát-dehidrogenáz LGL large granular lymphocyte LIF leukémia gátló faktor LOX-1 lectin-like oxidised low-density lipoprotein receptor-1 M mol/l MAPK mitogén-aktivált protein kináz MCP-1 monocyta chemoattractans protein-1 MHC major histocompatibilitasi complex MIP-1α, -1β macrophag inflammatoricus protein-1α, -1β MyD88 myeloid differenciációs protein 88 n esetszám n.a. nem alkalmazható NF-κB nuclearis faktor kappa-b NK-sejt természetes ölősejt NS nem szignifikáns OMIM Online Mendelian Inheritance in Man OR esélyhányados p statisztikai szignifikancia szint PAI-1 plazminogén aktivátor inhibitor-1 PBS foszfáttal pufferelt sóoldat (phosphate-buffered saline) PCR polimeráz láncreakció PIBF progeszteron indukálta blokkoló faktor PlGF placentaris növekedési faktor R Spearman-féle korrelációs együttható RANTES Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted RFLP restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus RNS ribonukleinsav ROC Receiver Operating Characteristic Sec63 Saccharomyces cerevisiae protein 63 sflt1 solubilis fms-like tyrosine kinase-1 Sis1 a Hdj1 élesztőgombában található homológja SNP egypontos nukleotid variáció 6
STAT signal transducer and activator of transcription T timidin Taq Thermus acquaticus TCR T-sejt receptor TGF-β transzformáló növekedési faktor-β Th T helper TNF-α tumor necrosis faktor-α tpa szöveti plazminogén aktivátor TRAIL tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand TRAP1 tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 TUKEB Tudományos és Kutatásetikai Bizottság U nemzetközi egység UV ultraibolya VCAM-1 vascularis sejt adhéziós molekula-1 VEGF vascularis endothelialis növekedési faktor Ydj1 yeast DnaJ homologue 1 7
1. Bevezetés A praeeclampsia napjainkban is világszerte a szülészet jelentős problémája, az anyai és perinatalis morbiditás és mortalitás egyik vezető oka. Kóreredete az intenzív kutatás ellenére máig tisztázatlan. A kórkép csak humán terhességben észlelhető, ami aetiologiájának és pathogenesisének feltárását, kísérletes tudományos vizsgálatát megnehezíti. A praeeclampsia az egész anyai szervezetet érintő megbetegedés és tüneteinek csak egyike az emelkedett vérnyomás. Szövődményei még enyhén emelkedett vérnyomás mellett is életveszélyesek lehetnek. Klinikai megjelenése heterogén, jelentős különbségeket mutat az egyes betegek között, de még egy betegben is akár órák alatt változhat, súlyosbodhat. Kezelése az elmúlt néhány évtizedben alig változott, definitív megoldása a terhesség befejezése. A kórkép előrejelzésére megbízható módszerrel máig nem rendelkezünk és megelőzése sem megoldott. A praeeclampsia anyai szövődményei (abruptio placentae, HELLP-syndroma, disseminált intravascularis coagulatio, tüdőoedema, akut veseelégtelenség, eclampsia, súlyos májkárosodás, stroke) súlyosak, nemritkán az anya és a magzat életét is veszélyeztetik. A fejlődő országokban, ahol a terhesgondozás színvonala nem megfelelő, a megbetegedés által okozott anyai halálozás gyakori, de még a fejlett országokban is az anyai mortalitás 15-20%-áért a praeeclampsia és szövődményei tehetők felelőssé (1). Egyre több epidemiológiai adat támasztja alá, hogy azon nők körében, akik terhességük alatt praeeclampsiában szenvedtek különösen akkor, ha az korai kezdetű volt, vagy egy következő terhességben ismétlődött, évekkelévtizedekkel később a cardiovascularis megbetegedések (hypertonia, koszorúérbetegség, stroke) előfordulása és az általuk okozott halálozás gyakoribb (2-4). Ezt részben a közös rizikófaktorokkal (obesitas, hyperlipidaemia, insulinresistentia) és a hasonló kórélettani mechanizmusokkal (oxidatív stressz, gyulladás, endothelsejt károsodás) magyarázzák (5). A praeeclampsia a perinatalis morbiditást és mortalitást is kedvezőtlenül befolyásolja. A koraszülések 15%-ának hátterében a praeeclampsia és annak szövődményei miatti indukált (elektív) koraszülés áll (5). A koraszülés, különösen a 28. hét előtti éretlen koraszülés okozta mortalitás ugyan a neonatológiai ellátás fejlődésének köszönhetően az utóbbi években jelentősen csökkent, de a koraszülés okozta 8
morbiditás, a túlélő koraszülöttek megbetegedései még mindig jelentős problémát képeznek. A praeeclampsiás terhesekben a magzati sorvadás (magzati növekedési retardatio-iugr) előfordulása gyakori. Az utóbbi nemcsak az újszülöttkori morbiditást növeli, hanem a cardiovascularis megbetegedések (hypertonia, koszorúér-betegség, stroke) és a nem insulindependens diabetes mellitus fokozott kockázatával jár a felnőttkorban (6). A praeeclampsia súlyos esetben respiratoricus placentaris elégtelenségen keresztül magzati hypoxiát és ritkán a magzat méhen belüli elhalását okozhatja. Mindezek a praeeclampsia kóreredetének és pathogenesisének pontosabb megismerését teszik szükségessé a kórkép megelőzése és eredményesebb kezelése érdekében. 1.1. A praeeclampsia definíciója és diagnosztikai kritériumai A praeeclampsia a terhesség 20. hete után fellépő hypertonia (a szisztolés vérnyomás 140 Hgmm vagy a diasztolés vérnyomás 90 Hgmm, legalább két alkalommal minimum 6 óra, de maximum 7 nap különbséggel mérve, korábban normotensiv terhesben), amit szignifikáns proteinuria ( 300 mg/24 óra) kísér (7,8). A kórkép azonban ritkán a 20. terhességi hét előtt is felléphet a gestatiós trophoblastbetegségek esetében. Korábban azokat az eseteket is ide sorolták, amikor ugyan a szisztolés vérnyomás 140 Hgmm és a diasztolés vérnyomás 90 Hgmm alatt volt, de a nem terhes állapothoz, vagy ha az nem volt ismert, a koraterhességben mért értékhez képest a szisztolés értékben legalább 30 Hgmm vagy a diasztolés értékben legalább 15 Hgmm emelkedés mutatkozott. A legújabb, jelenleg érvényes klasszifikációban (7) ez a meghatározás már nem szerepel, mert ezekben az esetekben a terhesség kimenetele nem volt kedvezőtlen (9). Ilyenkor azonban szoros megfigyelés javasolt praeeclampsia irányában, különösen akkor, ha proteinuria is jelen van (7). A klasszifikáció a diasztolés vérnyomás mérésekor a Korotkoff V. hang használatát javasolja. A proteinuria diagnózisa kimondható akkor is, ha legalább két random vizeletmintában (minimum 6 óra, de maximum 7 nap különbséggel nyerve) húgyúti fertőzés hiányában a fehérjekoncentráció 300 mg/l (vagy 1 + tesztcsíkkal nézve), de megbízhatósága miatt a 24 órás vizeletgyűjtés részesítendő előnyben. 9
A praeeclampsia súlyosnak tekintendő az alábbi tünetek bármelyikének fennállása esetén (10): A szisztolés vérnyomás 160 Hgmm vagy a diasztolés vérnyomás 110 Hgmm, legalább két alkalommal, minimum 6 óra különbséggel mérve Proteinuria 5 g/24 óra vagy 3 + tesztcsíkkal legalább két random vizeletmintában, minimum 6 óra különbséggel nyerve Oliguria (vizeletürítés<500 ml/ 24 óra) Központi idegrendszeri zavarok, látászavar Tüdőoedema vagy cyanosis Epigastrialis vagy jobb bordaív alatti fájdalom Májenzim értékek emelkedése Thrombocytopenia Magzati sorvadás (a magzat születési súlya kisebb, mint a terhességi kornak és a nemnek megfelelő 10 percentilis érték) A magzati sorvadás (IUGR) jelenlétét nem minden besorolás tekinti súlyos praeeclampsiának (8). A rárakódásos praeeclampsia korábban meglevő hypertonia, vesebetegség, illetve egyéb szisztémás betegség talaján kifejlődő praeeclampsiás állapot. Diagnózisa nem könnyű, különösen akkor, ha az alapbetegség miatt hypertonia és proteinuria már a 20. terhességi hét előtt fennáll. Jelentőségét növeli, hogy prognózisa mind az anyára, mind a magzatra nézve kedvezőtlenebb, mint a praeeclampsiáé (7). Az eclampsia a praeeclampsiás betegben jelentkező eszméletvesztéssel járó tonusos-clonusos görcsroham (grand mal roham), ami más okkal (például vérző arteriovenosus malformatio, aneurysma ruptura, epilepsia) nem magyarázható (10). Az esetek egy részében (egy, az Egyesült Királyságban végzett felmérés szerint 38%-ában) hypertonia és proteinuria nem előzi meg a jelentkezését (11). A HELLP (hemolysis, elevated liver enzymes, low platelet count)-syndroma a praeeclampsia egy súlyos formája, ami jelentős anyai és perinatalis morbiditással és halálozással jár. Súlyos szövődménye a subcapsularis májhaematoma, illetve a májruptura. Jellemzői a microangiopathiás haemolysis, az emelkedett májenzim értékek és az alacsony thrombocytaszám, amelyek alapján a kórképet Weinstein nevezte el HELLP-syndromának 1982-ben (12). Diagnosztikai kritériumai nem egységesek. Sibai 10
szerint (13): szérum aszpartát-aminotranszferáz (AST) szint>70 U/l, szérum laktátdehidrogenáz (LDH) szint>600 U/l és thrombocytaszám<100 G/l. A microangiopathiás haemolysist alátámasztja a fragmentocyták jelenléte a perifériás vérkenetben és az alacsony szérum haptoglobin koncentráció. Martin a thrombocytopenia határértékét 150 G/l-nél állapította meg és a legalacsonyabb perinatalis thrombocytaszám alapján a HELLP-syndromát 3 csoportra osztotta (Mississippi-beosztás): súlyos (1. típus: thrombocytaszám 50 G/l), középsúlyos (2. típus: 51-100 G/l) és enyhe (3. típus: 101-150 G/l) thrombocytopeniával járó formára. A beosztás jól korrelált a kórkép súlyosságának laboratóriumi és klinikai mutatóival (14). A kórisme felállítását megnehezíti, hogy a HELLP-syndroma kialakulhat normális vérnyomás mellett és proteinuria hiányában is (15). 1.2. A praeeclampsia epidemiológiája és kockázati tényezői A praeeclampsia incidenciája 2-10%, a széles tartomány jelzi a populációs különbségeket a kórkép gyakoriságában, valamint a nem egységesen használt diagnosztikai kritériumokat (16). Az utóbbi években a praeeclampsia előfordulási gyakoriságában emelkedés mutatkozott, amit az ikerterhességek növekvő számával, valamint azzal magyaráznak, hogy egyre több nő vállal terhességet idősebb életkorban, illetve idült megbetegedés (hypertonia, diabetes, vesebetegség, autoimmun betegség) mellett (5). Az eclampsia incidenciája a szülészeti ellátás fejlődésének köszönhetően a fejlett országokban csökkent, jelenleg 0.05% körüli. Az esetek 38%-a antepartum, 18%- a intrapartum és 44%-a postpartum jelentkezik (11). A praeeclampsia számos kockázati tényezőjét azonosították epidemiológiai vizsgálatokkal (16-18). Ezek a következők: primiparitas, fiatal vagy idős anyai életkor, obesitas és insulinresistentia, többes terhesség, afro-amerikai etnikum, praeeclampsia egy előző terhességben vagy a családi anamnézisben, 10 év vagy hosszabb intervallum egy előző terhesség óta, chronicus hypertonia, gestatiós és praegestatiós diabetes mellitus, vesebetegség, szisztémás autoimmun betegség, antifoszfolipid-syndroma, alacsony anyai születési súly (magzati sorvadás miatt), anyai fertőzések (húgyúti fertőzés, periodontitis, chlamydia, cytomegalovirus okozta fertőzés), malnutritio, thrombophilia (Leiden-mutatio, protein S-hiány), hyperlipidaemia, 11
hyperhomocysteinaemia, hydrops fetalis, chromosomaaberratio (13-trisomia, triploidia), mola hydatidosa. A terhesség alatti dohányzás 30-40%-kal csökkenti a praeeclampsia kockázatát (19), de ez nem ellensúlyozza a dohányzás számos káros hatását terhességben (például koraszülés, IUGR, abruptio placentae gyakoribb előfordulása). A praeeclampsia elsősorban a primiparák betegsége. A megbetegedés kockázatát növeli, ha a fogamzást minimalis spermaexpositio előzi meg a partnerrel (20). Az utóbbi megfigyelés magyarázatul szolgálhat arra, hogy miért gyakoribb a kórkép nagyon fiatal életkorban. Egy kiviselt terhesség ugyanattól a partnertől csökkenti a praeeclampsia kockázatát egy következő terhességben, de ez a kedvező hatás elvész, ha a terhesség új partnertől fogant. Az előbbi megfigyelések vezettek a primipaternitas koncepciójához, amit alátámaszt az is, hogy a praeeclampsia gyakoribb donorinseminatio és embryodonatio esetében (18,21). Az apai faktorok fontosságára utal, hogy a partnercsere egy előző praeeclampsiás terhesség esetében csökkenti a praeeclampsia ismétlődésének kockázatát, valamint, hogy az apa új kapcsolatából fogant terhességben a praeeclampsia előfordulása gyakoribb (18,22). Norvég kutatók a primipaternitas koncepcióját kétségbe vonták azzal, hogy a partnercsere adataik szerint csak a szülések között eltelt hosszabb időintervallumon keresztül növeli a praeeclampsia rizikóját (23). Eredményeik azonban több ponton vitatottak (a használt születési regiszter apaságra vonatkozó adatai nem megbízhatóak, a praeeclampsia diagnózisa 60%-ban megkérdőjelezhető) és ezért nem indokolják a koncepció elvetését (24). A HELLP-syndroma incidenciája 0.17-0.85% (25), a súlyos praeeclampsiás, illetve eclampsiás terhesekben 10-20% (13). Az esetek 70%-a az antepartum, 30%-a a postpartum periódusban jelentkezik (13). A HELLP-syndromára specifikus rizikóprofilt nem azonosítottak (25), de súlyos praeeclampsiás és eclampsiás terheseket vizsgálva, incidenciáját fehér nőkben, illetve multiparákban magasabbnak találták, és a kórképben megbetegedettek átlagéletkora is szignifikánsan magasabb volt (24.8 ± 6.1 év (HELLPsyndromás terhesek) versus 18.9 ± 4.7 év (súlyos praeeclampsiás-eclampsiás terhesek HELLP-syndroma nélkül)) (26). 12
1.3. Immunológiai folyamatok élettani terhességben A magzat az anyai szervezet számára 50%-ban idegen (apai eredetű) antigénstruktúrát hordoz, ezért immunológiailag semi-allograftnak tekinthető. Ennek ellenére az anyai immunrendszer toleráns az embryo/magzat szöveteivel szemben. Számos mechanizmussal magyarázzák ezt az immunológiai paradoxont, de az élettani terhességben szerepet játszó immunológiai folyamatok teljes részleteikben még nem ismertek. Terhesség alatt a T helper 1 (Th1)/ T helper 2 (Th2) cytokintermelés egyensúlya Th2 irányba tolódik el. Ezáltal a terhességre káros cellularis (cytotoxicus) immunválasz gátolt, a humoralis immunválasz-készség fokozódik (27). A perifériás keringésben a természetes ölősejtek (natural killer (NK-) sejtek) száma és aktivitása csökken (28). Ezekkel a változásokkal magyarázzák a terhesek fogékonyságát intracellularis pathogének által okozott fertőzésekre és egyes primaer tumorok gyakoribb előfordulását terhességben (27,28). Az anyai immunrendszer felismeri a magzati antigéneket, de az apai alloantigénekre specifikus (adaptív) immunválasz gátolt, amiben szerepet játszhat az apai antigénekre specifikus T- és B-lymphocyták anergiája és klonális deléciója is (29,30). Egyre több adat támasztja alá a regulatoricus T-sejtek szerepét a terhesség alatti immuntoleranciában. Terhességben a regulatoricus T-sejtek (CD4 + CD25 bright T-sejtek) száma emelkedik és kimutatták aktiválódásukat is (31,32). A természetes (veleszületett) immunrendszer terhesekben aktivált állapotban van, ami az általános immunológiai védekezésben részben ellensúlyozza a csökkent sejtközvetített immunválasz-készséget (28). A természetes immunrendszer aktiválódása a perifériás keringésben a monocyták és granulocyták számának emelkedésében és aktiválódásukban, akut fázis fehérjék, alvadási fehérjék fokozott szintézisében és a komplementrendszer aktiválódásában nyilvánul meg (33). Feltételezik, hogy a természetes immunrendszer aktiválásában a méhlepényből származó trophoblast törmelék (syntitiotrophoblast microfragmentumok, cytokeratin, magzati DNS és RNS) játszik szerepet, ami a magzatbolyhok syntitialis felszínének folyamatos megújulása során kerül az anyai keringésbe (33). Az anya és a magzat legfontosabb érintkezési határfelszíne a méhlepényben található. A decidualis fehérvérsejtek többsége a terhesség első felében NK-sejt (más néven large granular lymphocyte, LGL), amelyek azonban fenotípusukban különböznek 13
a perifériás keringésben található NK-sejtektől. Az uterinalis NK-sejtek CD56 bright fenotípusúak, fokozott cytokin termelést és alacsony cytotoxicus aktivitást mutatnak (34). Felszínükön aktiváló és gátló funkciójú receptorokat hordoznak. A méhlepény magzati oldalán a syntitiotrophoblastok és a villosus cytotrophoblastok felszínén MHC (major histocompatibilitasi complex) antigének nem fejeződnek ki. Ezzel szemben az extravillosus cytotrophoblastok felszínén HLA (humán leukocyta antigén)-c, -E és HLA-G antigének találhatók (28). A legújabb adatok szerint HLA-F is kifejeződik felszínükön, de ennek receptora és funkciója terhességben még nem ismert (35). A nagyfokú polimorfizmust mutató HLA-A, -B és HLA-D antigéneket azonban ezek a sejtek sem hordozzák felszínükön, ezáltal az anyai T-lymphocyták nem ismerik fel idegennek őket és elkerülik a cytotoxicus T-lymphocyták támadását (28). Az uterinalis NK-sejtek cytotoxicus hatását, killer funkcióját elsősorban a trophoblaston jelenlevő HLA-E gátolja, az NK-sejtek C-lektinszerű CD94/NKG2A receptorához kötődve. A HLA-G az immunglobulinszerű KIR2DL4 receptoron keresztül stimulálja az uterinalis NK-sejtek cytokin és angiogeneticus faktor (vascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF), placentaris növekedési faktor (PlGF), angiopoietin-2) szekrécióját, amelyek a beágyazódásban, placentatióban és a méhlepény vascularis érésében fontos szerepet játszanak (34). Bár Th1 típusú cytokinek termelése is fokozódik, amelyek közül az interferon-γ (IFN-γ) a legfontosabb a vascularis remodelling folyamatában (36), a cytokintermelés egyensúlya a méhlepényben is Th2 irányba tolódik el (37). Az NKsejtek és a deciduasejtek által termelt leukémia gátló faktor (leukemia inhibitory factor, LIF) a beágyazódás folyamatában és a Th2-es immunfenotípus kialakításában vesz részt (28,34). A HLA-G és solubilis formája (shla-g) fontos szerepet játszik a cytotoxicus T-sejtek és dendriticus sejtek működésének gátlásában, mind a méhlepényben, mind a perifériás keringésben (38,39). A dimorf HLA-C az uterinalis NK-sejtek KIR2D receptoraival lép kölcsönhatásba és ezen keresztül kontrollálja cytokin termelésüket. A trophoblaston levő HLA-C haplotípustól és az aktiváló vagy gátló killer immunglobulinszerű receptorok (KIR) jelenlététől függően ez a hatás lehet az NKsejtek aktiválása (HLA-C1 a trophoblaston és KIRB a decidualis NK-sejteken), ami elősegíti a trophoblast invasiot, vagy gátlása (HLA-C2 és KIRA), ami korlátozza azt (40). Mind a villosus, mind az extravillosus trophoblast sejtek felszínükön apoptosisindukáló ligandokat (CD95L (Fas ligand), tumor necrosis factor (TNF)-related 14
apoptosis-inducing ligand (TRAIL)) expresszálnak, amin keresztül képesek előidézni az aktivált immunsejtek apoptosisát (28). A méhlepényben található indolamin 2,3- dioxigenáz (IDO) a triptofán lebontása révén triptofán hiányhoz vezet, ami lokálisan gátolja az anyai T-sejt működést (34). Terhességben a γ/δ T-sejtek száma mind a perifériás keringésben, mind a deciduában megemelkedik és ezek a sejtek aktivált állapotban vannak. Feltételezik, hogy az aktiválódásuk a méhlepényben, magzati eredetű antigének hatására történik és csak ezt követően jelennek meg a perifériás keringésben (41). A deciduában a γ/δ T- sejtek és az NK-sejtek között jelentős az átfedés (CD56 + /γ/δ TCR + NKT-sejtek) (42). Élettani terhességben mind a perifériás vérben, mind a deciduában a γ/δ T-sejtek Vγ1Vδ1 szubpopulációja dominál (41). A Vγ1Vδ1 T-sejtek magzati antigén hatására amiről feltételezik, hogy egy filogenetikailag konzervált fehérje emlősökben, és itt a 60 kda molekulatömegű hősokkfehérje szerepe is felmerült (43) aktiválódnak és progeszteron receptorokat expresszálnak (42). Progeszteron jelenlétében ezek a sejtek egy 34 kda molekulatömegű fehérjét, progeszteron indukálta blokkoló faktort (PIBF) termelnek, ami a cytokintermelés egyensúlyát Th2 irányba tolja el, gátolja az NK-sejtek cytolyticus hatását és indukálja a szuppresszor funkciójú sejtek aktivitását (42). A potenciálisan cytotoxicus Vγ9Vδ2 T-sejtek aránya terhességben csökken, Th1 aktivitásukat (TNF-α és IFN-γ termelés) pedig a felszínükön expresszálódó CD94/NKG2A receptoron keresztül a trophoblaston jelenlevő HLA-E gátolja (41). A dendriticus sejtek az ismert leghatásosabb antigén-prezentáló sejtek. Képesek aktiválni a T-, B- és NK-sejteket és fontos szerepet töltenek be a centrális és perifériás immuntolerancia szabályozásában (44). Tolerogén hatásukhoz bizonyos fokú érési folyamaton keresztül kell menniük, de amennyiben veszély jelek (Th1 cytokinek, bakterialis és viralis termékek) aktiválják őket, igen kifejezetten immunogénné válnak (45). Az utóbbi egy-két év eredményei alapján mind a perifériás keringésben, mind a méhlepényben (decidualis dendriticus sejtek) fontos szerepet játszanak a terhesség alatti immuntolerancia kialakításában (46,47). 15
1.4. Immunológiai folyamatok szerepe a praeeclampsia kóreredetében és pathogenesisében Számos megfigyelés utal immunológiai folyamatok szerepére a praeeclampsia kóreredetében és pathogenesisében. A kórkép gyakoribb primiparákban és autoimmun betegségben szenvedők körében (16). Gyakoribb előfordulása többes- és molaterhességben arra utal, hogy a trophoblast volumennek és a magzati antigén terhelés mértékének szerepe lehet a kórkép kialakulásában (48). A praeeclampsia ritkább azokban a terhesekben, akik korábban vért kaptak, viszont gyakoribb korábban barrier módszert használók körében és a fogamzást megelőző védekezés nélküli házasélet tartama fordított összefüggést mutat a megbetegedés incidenciájával (48-50). Mindezek az idegen, illetve apai antigénnel szembeni immunisatio védő szerepét jelzik. A multiparák védettsége azonban elvész, ha a terhesség új partnertől fogant. A primipaternitas (új apai antigén) koncepcióját alátámasztja az is, hogy a praeeclampsia gyakoribb donor-inseminatio és embryodonatio esetében (18,21). Praeeclampsiában az immunrendszer számos mind cellularis, mind humoralis elemének aktiválódását figyelték meg (48). Praeeclampsiás terhesekben a chorionbolyhokban és a vese glomerulusaiban immunkomplex és komplement depositumok láthatók (51). A decidualis spiralis artériákban megfigyelhető akut atherosis szövettanilag nagyon hasonlít az allograft rejectio esetében látott elváltozásokhoz (52). A fenti epidemiológiai adatok arra utalnak, hogy az anyai-magzati (apai) immunológiai maladaptatio fontos szerepet játszik a praeeclampsia kialakulásában. Az ondó az anyai genitalis tractusba kerülve az ondóhólyagból származó transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β) révén egy klasszikus gyulladásos reakciót vált ki az apai antigének processzálásával. Az apai antigénekre adott Th2 immunválasz révén az ondóban található TGF-β egy partner-specifikus mucosalis immuntoleranciát hoz létre, ami terhességben meggátolhatja a semiallogen magzat apai antigénjei ellen irányuló Th1 immunválasz kialakulását (53). A fogamzást megelőző tartós spermaexpositio protectiv, tolerogén hatásában az antigént a spermium biztosítja (54). A praeeclampsia kialakulása egy kétlépcsős folyamat. Az első lépcső a hibás placentatio, amit az anyai tünetegyüttes kialakulása (második lépcső) követ (55). A két 16
folyamat térben és időben is elkülönül egymástól. A praeeclampsia kialakulásának feltételezett folyamatát az 1. ábrán mutatom be. Anyai-magzati (apai) immunológiai maladaptatio 1. Hibás placentatio Placentaris ischaemia, oxidatív stressz Th1 cytokinek, lipidperoxidációs termékek, trophoblast törmelék, egyéb faktorok Anyai szisztémás gyulladásos válaszreakció 2. Anyai tünetegyüttes (hypertonia, oedema, proteinuria, alvadási zavar, HELLP-syndroma, eclampsia) 1. ábra A praeeclampsia kialakulásának két lépcsője Th: T helper; HELLP: haemolysis, emelkedett májenzim értékek, alacsony thrombocytaszám 17
A kórkép pathogenesisében a méhlepény központi szerepet játszik, amit több megfigyelés is alátámaszt. A praeeclampsia kialakulásához sem a magzat, sem a méh részvétele nem szükséges, mivel a megbetegedést megfigyelték mola hydatidosa és hasűri terhesség mellett is (56,57). Továbbá a kórkép csak a szüléssel, illetve a terhesség befejezésével oldódik meg, amikor a méhlepény távozik, illetve eltávolításra kerül. A méhlepény, illetve lepényrészek visszamaradása esetén a praeeclampsia nem szűnik meg azok eltávolításáig (57). Élettani placentatio esetén a terhesség 6. hetétől kezdve az extravillosus cytotrophoblast sejtek behatolnak a deciduába, majd a myometriumba. A spiralis artériákkal kapcsolatba lépve belépnek azok lumenébe, ahol intraluminalis dugókat képeznek. Ez utóbbiak az anyai véráramlás útjába eső szelepként viselkedve fontos szerepet játszanak az intervillosus véráramlás szabályozásában és a fejlődő embryo védelmében. A 9. hét után ezek az erek rekanalizálódnak a méhlepény perifériájáról indulva és ez a folyamat a 12. terhességi hétre válik teljessé (58). Színkódolt Dopplerultrahangvizsgálatok eredményei szerint folyamatos intervillosus áramlás észlelése az első trimeszterben gyakrabban járt együtt a terhesség kedvezőtlen kimenetelével (spontán vetéléssel) és normális terhességben az intervillosus űrben valódi, folyamatos áramlás csak a 12. hét után figyelhető meg (59). Ekkor az intraplacentaris oxigéntenzió jelentősen emelkedik és átmenetileg egy mérsékelt placentaris oxidatív stressz figyelhető meg élettani terhességben is (60). Az oxigéntenzió emelkedése és az oxidatív stressz hatására az addig elsődlegesen proliferatív viselkedésű extravillosus cytotrophoblast invasivvá válik és sejtfelszíni adhéziós molekulái az epithelialis sejtekre jellemzőről endothelialisra változnak ( integrin switching ) (61,62). Az utóbbi folyamatot pseudovasculogenesisnek nevezzük. Ettől kezdve az endovascularis trophoblast sejtek elfoglalják a spiralis artériák endothelsejtjeinek a helyét és behatolnak a mediába, elpusztítva a media elasticus, muscularis és neuralis szöveteit ( remodelling ). A folyamat eredményeként a spiralis artériák, amelyek az uteroplacentaris keringés végartériái, alacsony resistentiájú, nagy kapacitású uteroplacentaris erekké alakulnak és felszabadulnak az anyai vasomotor kontroll alól. A spiralis artériák átalakulása a 20. terhességi hétre válik teljessé és érinti a spiralis artériák decidualis szakaszát, valamint myometrialis szakaszának belső harmadát (63). Praeeclampsiában (és a magzati sorvadás eseteinek egy részében) a folyamat 18
tökéletlenül zajlik le, a placentaris ágy spiralis artériáinak 30-50%-a nem megy keresztül a fenti átalakuláson, a fennmaradó részükben pedig csak a decidualis szegmentum alakul át (51,63,64). A kórképben megfigyelték a pseudovasculogenesis zavarát (61) és feltételezik, hogy a hibás placentatióban szerepet játszhat az anyai antioxidáns kapacitás elégtelensége és a következményes élettanit meghaladó mértékű placentaris oxidatív stressz (60). Az interstitialis és endovascularis trophoblast invasio kontrolljában és a placentaris ágy vascularis átalakulásában az uterinalis NK-sejtek és az extravillosus cytotrophoblast kommunikációja kulcsfontosságú. Az extravillosus cytotrophoblast aktiváló hatására a decidualis NK-sejtek az előbbi folyamatokat szabályozó cytokineket (például IFN-γ, granulocyta-macrophag kolóniastimuláló faktor (GM-CSF), macrophag inflammatoricus protein (MIP)-1α, kolóniastimuláló faktor 1 (CSF-1), LIF) és angiogeneticus faktorokat (VEGF, PlGF, angiopoietin-2) szekretálnak (65). Az IFN-γ fontos szerepet játszik a spiralis artériák átalakulásában és vascularis hatását az α 2 - macroglobulinon keresztül, annak átírását fokozva fejti ki (36). Az anyai aktiváló és gátló killer immunglobulinszerű receptorok (KIR) és a magzati cytotrophoblast interakciójában a partner-specifikus jelet a dimorf HLA-C közvetíti. A praeeclampsia rizikója szignifikánsan nagyobb volt a gátló KIR A haplotípust homozigóta formában hordozó terhesekben, ha egyidejűleg a magzat a HLA-C2 haplotípusra nézve homozigóta vagy heterozigóta volt. Az összefüggés akkor is fennállt, ha az anya HLA- C2 haplotípust hordozott, ami azt jelzi, hogy sem a nem saját, sem a hiányzó saját megkülönböztetés nem játszik szerepet az interakcióban (66). Ezek az eredmények alátámasztják az anyai-magzati (apai) immunológiai maladaptatio (az extravillosus cytotrophoblast és a decidualis NK-sejtek együttműködési zavarának) szerepét a hibás placentatio és a következményes praeeclampsia kialakulásában. A kórfolyamatban azonban más faktorok is részt vesznek, mert a magzati C2-anyai AA genotípus kombinációt hordozó terhességeknek csak egy részében alakul ki praeeclampsia és nem minden praeeclampsiás terhességben van jelen a fenti genotípus kombináció. A praeeclampsia kialakulásának második lépcsőjében a hibás placentatio következtében az uteroplacentaris keringés elégtelensége miatt a méhlepényben ischaemia, és intermittáló reperfusio (ischaemia-reperfusio) révén oxidatív stressz alakul ki (67). A kórfolyamat későbbi fázisában akut atherosis és a spiralis artériákban 19
kialakuló thrombosis is hozzájárulhat a placentaris ischaemiához (64,67). Ezek hatására a méhlepényből proinflammatoricus (Th1) cytokinek (interleukin (IL)-1, IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-γ), lipidperoxidációs termékek és trophoblast törmelék (syntitiotrophoblast microfragmentumok, cytokeratin, magzati DNS és RNS, akár sejtes elemek) kerül az anyai keringésbe, amelyek egy szisztémás gyulladásos válaszreakciót hoznak létre (17,68-70). Syntitiotrophoblast törmelék korlátozott mennyiségben élettani terhességben is bekerül az anya keringésébe apoptosis eredményeként, egy enyhe (subclinicus) szisztémás gyulladást okozva, ami maximumát a harmadik trimeszterben éri el (33). Praeeclampsiában a placentaris hypoxia, illetve oxidatív stressz miatt a syntitiotrophoblast apoptosis fokozódik, valamint necrosis is hozzájárul ahhoz, hogy az élettanit jelentősen meghaladó mennyiségű, gyakran oxidált lipideket és fehérjéket tartalmazó trophoblast törmelék jut az anyai keringésbe (67). Ez a törmelék proinflammatoricus tulajdonságú és képes direkt módon károsítani az endotheliumot (67,71). Eltakarítása során a természetes immunrendszer humoralis és sejtes elemei (monocyták, granulocyták) aktiválódnak (33). Az utóbbiak az ischaemiás méhlepény intervillosus keringésén történő áthaladás során is aktiválódhatnak (72). Praeeclampsiában megfigyelték az adaptív immunrendszer aktiválódását is (73). Az anyai tünetegyüttesért felelős szisztémás gyulladásos válaszreakció magába foglalja a leukocyták (monocyták, granulocyták) számának emelkedését és aktiválódásukat proteázok, proinflammatoricus cytokinek termelésével, következményes Th1 cytokin túlsúllyal, az endothelsejtek, az alvadási rendszer, a komplementrendszer és a thrombocyták aktiválódását, valamint az akut fázis fehérjék fokozott szintézisét (69). A méhlepényből származó lipidperoxidációs termékek mellett az aktivált leukocyták által kibocsátott szabad gyökök is hozzájárulnak a szisztémás gyulladásos válaszreakcióval együttjáró szisztémás oxidatív stressz kialakulásához (69). A kórfolyamatban központi szerepet játszó szisztémás endothelsejt aktiváció, illetve dysfunctio része a praeeclampsia anyai tünetegyüttesét létrehozó generalizált intravascularis gyulladásos reakciónak (68). A következmény generalizált vasoconstrictio hypertoniával, a vascularis permeabilitas fokozódása oedemák kialakulásával, a vesében glomerularis endotheliosis proteinuriával, az erekben a thrombocyták és az alvadási rendszer aktiválódása microthrombusok képződésével (74). A vasoconstrictio, microthrombusok és csökkent plazmavolumen miatt a szervek 20
(elsősorban a méhlepény, vese, máj, agy) perfusioja csökken, az így létrejövő szervi ischaemia okozta ördögi kör (oxidatív stressz, szisztémás gyulladásos reakció fokozódása) felel a legsúlyosabb klinikai megjelenési formákért (75). A hypoxiás placentából származó solubilis fms-like tyrosine kinase-1 (sflt1), ami megköti és antagonizálja a keringésben levő angiogeneticus VEGF-t és PlGF-t, valamint a neurokinin B hozzájárul a szisztémás endothelsejt dysfunctio kialakulásához (76,77). Praeeclampsiában más, az endothelsejtek dysfunctiójáért felelős faktorokat is azonosítottak. Praeeclampsiás terhesekben megfigyelték az endothelialis nitrogénmonoxid szintáz (enos) endogén inhibitora, az aszimmetrikus dimetilarginin plazma koncentrációjának emelkedését, angiotenzin receptor-1 (AT1)-bradikinin B2 receptor heterodimerek kialakulását és keringő angiotenzin receptor-1 (AT1) elleni autoantitestek megjelenését (78-80). A hibás placentatio és következményes placentaris ischaemia azonban nem minden esetben vezet a praeeclampsia kialakulásához. A placentaris vascularis remodelling zavara felelős a magzati sorvadás és spontán koraszülés eseteinek egy részéért is (63,81). A praeeclampsiás terheseknek csak harmadában figyelhető meg magzati sorvadás és a magzati sorvadás praeeclampsia tünetei nélkül is kialakulhat (82). A hibás placentatio nem oka a praeeclampsiának, hanem egy hajlamosító faktora (68). Az anyai tünetegyüttes kialakulása azon múlik, hogy a placentatio zavara milyen mértékű gyulladásos stimulust okoz (magzati-apai faktorok szerepe), illetve, hogy az anyai szervezet hogyan reagál ezekre a stimulusokra (anyai faktorok szerepe) (68). Praeeclampsia kialakulhat azonban a placentatio zavara nélkül is a microvascularis rendszert érintő anyai betegségek (például chronicus hypertonia, diabetes, vesebetegségek) esetén (70). Ness és Roberts vezette be a méhlepényi (placentaris) és anyai (maternalis) praeeclampsia fogalmát. Az előbbi esetben a placentaris perfusio zavara, az utóbbiban az anya már korábban jelenlevő betegsége vezet a kórkép kialakulásához (83). A határ azonban nem ilyen éles, a klinikumban számos kevert formával találkozunk (70). Ahogy korábban már említettem, a placentaris perfusio zavara gyakran csak anyai faktorokkal együtt vezet a kórkép kialakulásához, illetve a chronicus microvascularis megbetegedés is okozhatja a placentaris perfusio zavarát (5). Redman és Sargent szerint az anyai praeeclampsia esetében az anyai hajlamosító megbetegedést (például chronicus hypertonia, diabetes, obesitas, autoimmun betegség) 21
kísérő chronicus szisztémás gyulladás miatt az intact méhlepényből származó gyulladásos stimulus is elég a szisztémás gyulladásos válaszreakció és a praeeclampsia tüneteinek kialakulásához (69). Feltehetőleg ugyanezért fokozzák a kórkép kockázatát az anyai fertőzések (például húgyúti fertőzés, malária) is (68). A praeeclampsia kialakulását befolyásoló anyai rizikófaktorok részben genetikai, részben környezeti tényezők, ami a kórkép multifaktoriális kóreredetére utal (75). A praeeclampsia kockázati tényezői jelentős átfedést mutatnak a cardiovascularis megbetegedések (koszorúér-betegség, stroke) kockázati tényezőivel (például obesitas, hyperlipidaemia, insulinresistentia, diabetes, hypertonia) (5). A családi anamnézisben szereplő szív-érrendszeri betegség hajlamosít praeeclampsiára (84). A praeeclampsia hajlamosít évekkel-évtizedekkel később cardiovascularis megbetegedések (hypertonia, koszorúér-betegség, stroke) kialakulására (4). Ebben a vonatkozásban a terhesség egy metabolicus és vascularis stressz tesztnek is tekinthető (70). Számos jelölt gén (a haemodynamicai változásokban, oxidatív stresszben szerepet játszó gének, thrombophiliáért felelős gének) polimorfizmusának, illetve mutációjának szerepét vizsgálták asszociációs vizsgálatokkal a praeeclampsia rizikójában, de az eredmények ellentmondásosak (85). A Leiden-mutatio és a praeeclampsia között többen találtak összefüggést, mások ezt nem tudták megerősíteni (86-88). Az immunológiai tényezők közül vizsgálták például a TNF-α, TGF-β, IL-1, IL-6, IL-10, IFN-γ gén polimorfizmusokat (89-92). Bár más munkacsoportok közöltek asszociációt a praeeclampsia és a TNF-α polimorfizmusai között, mi azt találtuk, hogy a TNF-α gén promoter régiójában, a -308-as pozícióban található egypontos nukleotid variáció praeeclampsia kialakulására nem, de praeeclampsiás terhesekben IUGR kialakulására hajlamosít (nem közölt eredmények). Hazai kutatócsoportok az apolipoprotein E, valamint a VEGF, mi a leptin receptor, valamint az ösztrogén receptor-α gén polimorfizmusai és a praeeclampsia között találtunk összefüggést (93-96). Teljes genomra kiterjedő vizsgálattal több locust azonosítottak, ami a praeeclampsiával kapcsoltságot mutatott, de ezek populációnként különböztek (97). A praeeclampsia kialakulásában epigenetikai tényezők, a genetikai imprinting is szerepet játszik (98). 22
1.5. A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérjék szerkezete és funkciója A hősokkfehérjék ubiquiter molekulák, amelyek megtalálhatók mind a prokaryotákban, mind az eukaryotákban, az eubacteriumoktól az emberig. Szerkezetük nagymértékben konzerválódott az élővilágban. Mindezek funkcionális jelentőségükre utalnak. Élettani körülmények között, constitutiv módon is kifejeződnek a sejtekben, ilyenkor a sejtek fehérjetartalmának 5%-át alkotják. A hősokkfehérjék expresszióját számos élettani, pathologiás és környezeti tényező indukálhatja, és ennek hatására mennyiségük a sejtek fehérjetartalmának 15%-át is elérheti (99). A hősokkfehérjék élettani körülmények között a sejtosztódási ciklus, a sejtek differenciálódása és a szövetfejlődés során indukálódhatnak, illetve növekedési faktorok és hormonok szabályozhatják termelésüket. Kóros körülmények között a vírusok, baktériumok és paraziták okozta fertőzések, a láz, gyulladás, ischaemia, oxidatív stressz, hypertrophia, malignitas, autoimmunitas és a toxinok (például bacterialis lipopoliszacharid) fokozhatják génátírásukat a cellularis stresszválasz részeként. A környezeti tényezők közül a hőmérsékletváltozás (hő-, vagy hidegsokk), nehézfémek, etanol, antibiotikumok és a sugárzás képes indukálni a hősokkfehérjék expresszióját (100). A hősokkfehérjéket hagyományosan molekulatömegük alapján csoportosítják. Az ún. major hősokkfehérjék (Hsp-k) csoportja magába foglalja a 60, 70, 90 és 110 kda molekulatömegű hősokkfehérjéket. Ezek 37 C-on, hősokk hiányában is kifejeződnek a sejtekben. Az ún. minor hősokkfehérjék glükózmegvonás hatására indukálódnak (glükózregulált fehérjék (Grp-k): Grp 34, 47, 56, 75, 78, 94 és 174 kda). A harmadik csoport az ún. kis molekulatömegű hősokkfehérjék csoportja, amelyek molekulatömege 20 kda körüli (101). A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérjék az evolúció során nagymértékben konzerválódtak, aminosavsorrendjük eukaryotákban 60-78%-ban azonos, míg a humán Hsp70 és Escherichia coliban található megfelelője, a DnaK aminosavsorrendje között 47%-os az azonosság (102). A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérjék családjába sorolják a cytosolban és sejtmagban kimutatható constitutiv Hsp70 (Hsc70; 73 kda) és indukálható Hsp70 (Hsp70; 72 kda) mellett a mitochondrialis Hsp70-et (Hsp75 (Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1, TRAP1); 75 kda) és az endoplasmaticus 23
reticulumban található Hsp70-et (Grp78 (Immunoglobulin heavy chain-binding protein, BiP); 78kDa) is (101). A családba tartozó összes fehérje ATP-t köt és azt működése során hidrolizálja. Szerkezetükben három domain különböztethető meg: egy N-terminalis ATP-kötő domain, egy szubsztrátkötő domain és egy, az evolúció során kevésbé konzerválódott C-terminalis domain (2. ábra). Az utóbbi funkciója még nagyrészt ismeretlen, feltételezik, hogy a szubsztrátkötő domain lefedésében és co-chaperonok kötésében lehet szerepe. A Hsc70 és Hsp70 egy 44 kda molekulatömegű N-terminalis ATP-kötő domainből, egy 18 kda-os peptidkötő domainből és egy C-terminalis 10 kda-os szakaszból áll. A két fehérje elsősorban a C-terminalis fragmentumban különbözik egymástól, a másik két domain aminosavsorrendjében a különbség minimalis közöttük. A Hsc70 646 aminosavból, míg a Hsp70 641 aminosavból áll (101,103). 2. ábra A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérje szubsztrátkötő (bal oldalon és középen (90 -kal elforgatva), a szubsztrát feltüntetésével) és ATP-kötő (jobb oldalon, az ATP feltüntetésével) domainjének szalagdiagramja (Forrás: http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg16z/hsplec.html) A Hsp70-család constitutiv tagjai (Hsc70, Hsp75, Grp78) dajkafehérjeként (molecularis chaperon) elősegítik az újonnan szintetizált fehérjék natív (végleges) szerkezetének kialakulását (részben direkt módon, részben a Hsp60-család tagjaihoz szállítva azokat), irányítják a fehérjék transzportját subcellularis compartmentekbe (sejtmagba, lysosomába, mitochondriumba, endoplasmaticus reticulumba), részt vesznek oligomer fehérje struktúrák szétbontásában, instabil fehérjék proteolyticus lebontásában és más fehérjék, köztük transzkripciós faktorok, szteroid receptorok 24
(például ösztrogén, progeszteron, prolaktin, glükokortikoid receptor) biológiai aktivitásának szabályozásában (103). A sejtet ért stressz indukálja a Hsp70 expresszióját (sokkal nagyobb mértékben, mint a Hsp60 vagy a Hsp90 expresszióját). A Hsp70 a cellularis stresszválasz részeként fontos szerepet játszik a sejtek védelmében (mind a necrosis, mind az apoptosis ellen): megakadályozza a fehérjék aggregációját, elősegíti az aggregálódott fehérjék szerkezetének és funkciójának helyreállítását és az irreverzibilisen károsodott fehérjék transzportját a proteosomákba, valamint protein kinázok és transzkripciós faktorok működését gátolva befolyásolja a jelátviteli és enzimatikus folyamatokat (101,104,105). Működésük során a Hsp70-család tagjai a szubsztrát polipeptid rövid hidrofób szegmentumához kapcsolódnak nem kovalens kötéssel (hidrogénhíd kötéssel, hidrofób kölcsönhatással) és co-chaperonok segítségét is igénybe veszik (Hsp40-család: Ydj1, Sis1, Sec63, auxilin, zuotin, Hdj1, Hdj2) (106). A Hip, CHIP, BAG-1 fehérjék a szubsztrát-hsp70 kapcsolódást szabályozzák (107). 1.6. A 70 kda molekulatömegű hősokkfehérjéket kódoló gének és a génátírás szabályozása A tágabb értelemben vett Hsp70-család tagjait emberben az Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM ) adatbázis (John Hopkins University, Baltimore, MD, USA) alapján 15 gén kódolja. A humán Hsp70 multigén család tagjai szerkezetileg azonos, vagy nagyon hasonló fehérjéket kódolnak, a különbség a fehérjék cellularis és szöveti lokalizációjában, az expresszió típusában (constitutiv, indukálható) és a génátírást indukáló faktorokban van. A 646 aminosavat tartalmazó, constitutivan kifejeződő Hsc70-et kódoló gén (HspA8) a 11-es kromoszóma hosszú karján, a 11q23.3-q25 régióban található. A fő hőindukálható Hsp70-et (Hsp70, 72kDa) a 6-os kromoszóma rövid karján (6p21.3), az MHC III régióban található két gén kódolja (Hsp70-1 (HspA1A), Hsp70-2 (HspA1B)). A két gén fehérjeterméke teljesen azonos, 641 aminosavból áll. A hősokk mindkét gén átírását indukálja, de a Hsp70-1 constitutivan is kifejeződik a sejtekben. Feltételezik, hogy a két gén eltérő módon válaszol a hősokktól különböző stressz faktorokra. A Hsp70 aminosav szekvenciája 82%-ban azonos a Hsc70 aminosav szekvenciájával. Az MHC III régióban egy harmadik gén is található, ami a Hsp70-családba tartozó fehérjét 25
kódol. A Hsp70-Hom (HspA1L) gén terméke 641 aminosavat tartalmaz és aminosavsorrendje 90%-ban azonos a Hsp70 aminosavsorrendjével. A különbség a C- terminalis domainben a legnagyobb mértékű. A Hsp70-Hom gén constitutiven fejeződik ki a sejtekben, átírását hősokk nem indukálja. Szöveti expressziója a herében, a spermatidákban a legkifejezettebb (108). A Grp78 (BiP) génje (HspA5) a 9. kromoszóma hosszú karján, a Hsp75 (TRAP1) génje pedig a 16. kromoszómán található. Az előbbieken túl még 9, más-más kromoszómán található gén kódol a tágabb értelemben vett Hsp70-családba tartozó fehérjéket (HspA2, HspA3, HspA4, HspA6, HspA7, HspA9B, HspA12A, HspA12B, HspA14). Értekezésemben Hsp70 alatt a HspA1A és HspA1B gének által kódolt fő hő-indukálható Hsp70-et (Hsp70, 72kDa) értem. A hősokkfehérjék átírását a hősokk transzkripciós faktorok (HSF) indukálják a hősokkfehérjéket kódoló gének promoter régiójában található hősokk elemekhez (HSE) kötődve. A sejtek stresszmentes állapotában a hősokk faktorok a cytoplasmában a hősokkfehérjékhez kötődnek. A sejtet ért stressz hatására a hősokk faktorok leválnak a hősokkfehérjékről, szerin/treonin kinázok (például protein kináz C) által foszforilálódnak, majd homotrimereket képeznek a cytoplasmában. Ezek bejutnak a sejtmagba, a Hsp gének (és más target gének) promoter régiójában található hősokk elemekhez kötődnek, majd HSF kinázok révén tovább foszforilálódnak. Ennek hatására a génátírás megindul, amit a cytoplasmában a hősokkfehérjék szintézise követ. Az újonnan szintetizálódó hősokkfehérjék megkötik a hősokk faktorokat, meggátolva a további génátírást (negatív feedback) (101). A Hsp70 az aktív HSF1 transzaktivációs domainjéhez kötődve képes közvetlenül is gátolni a génátírást (109). A negatív regulációban a heat shock factor binding protein 1 (HSBP1) is részt vesz (110). Gerincesekben 4 hősokk faktort azonosítottak (111). A HSF1 és HSF3 a stresszindukálta Hsp génexpressziót mediálja. A HSF3-t eddig csak madarakban írták le, hősokk küszöbe magasabb, mint a HSF1-é. A HSF2 és HSF4 stresszmentes sejtekben szabályozza a hősokkfehérjék génátírását. A HSF2 az embryonalis fejlődés és a sejtek differenciálódása során indukálja a hősokkfehérjéket, a HSF2α felnőtt szövetekben, míg a HSF2β embryonalis szövetekben expresszálódik. A HSF4-nek is két izoformája van, a HSF4α represszorként, a HSF4β transzaktivátorként működik a hősokkfehérjék génátírásában. A sejtek stresszmentes állapotában, normális növekedési körülményei 26
között más faktorok is részt vesznek a Hsp-k génátírásának szabályozásában, köztük a cytokinek (például IFN-γ, IL-6) által aktivált STAT1, STAT3 és NF-IL6 is képes indukálni a Hsp70 és Hsp90 expresszióját (112-114). 1.7. Az extracellularis Hsp70 eredete, receptorai, jelátvitele és hatásai A hősokkfehérjék elsősorban intracellularis fehérjeként ismertek és a sejten belül dajkafehérje (molecularis chaperon) és cytoprotectiv funkciót látnak el. A hősokkfehérjék azonban kifejeződhetnek a sejtek felszínén, amit a sejtet ért stresszhatások fokoznak (115-118). Számos élő (nem necroticus) emlős sejtről írták le, hogy sejttenyészetben (in vitro) képes kibocsátani hősokkfehérjéket az extracellularis térbe, például patkány embryosejtek, emberi szigetsejtek, patkány gliasejtek és egy humán neuroblastoma sejtvonal, valamint oxidatív stressznek kitett vascularis simaizomsejtek (119-122). A Hsp60 és a Hsp70 jelen van egészséges emberek perifériás keringésében (szérumában és vérplazmájában) is, de a keringésben található hősokkfehérjék szöveti forrása még nem ismert (123-125). Az intracellularis hősokkfehérjék extracellularis térbe történő kijutásának mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. A hősokkfehérjék kiszabadulhatnak passzív módon a széteső, necroticus sejtekből a plazmamembrán destrukcióját követően (126). Egyre több a bizonyíték arra, hogy a sejtek aktív módon is képesek kibocsátani a hősokkfehérjéket a környezetükbe, részben constitutiv módon, részben különböző stimulusok hatására. A hősokkfehérjék kijuthatnak az extracellularis térbe exosomák belsejében és ez a transzport cytokinekkel (például a Hsp70 kibocsátása IFN-γ-val) stimulálható (127,128). Az exosomák a hősokkfehérjék mellett MHC I-es és II-es osztályba tartozó, valamint costimulatoros molekulákat (például CD86) és a hősokkfehérjékhez kötve peptideket (antigéneket) is tartalmaznak (128). A hősokkfehérjéket a sejtek kisebb részben szabadon (nem exosomákban) is kibocsáthatják az extracellularis térbe egy nem-klasszikus (endoplasmaticus reticulum Golgi-apparátustól független) fehérje transzport mechanizmussal, a plazmamembrán detergens-rezisztens microdomainjein, a lipid raftokon keresztül (129). Bár a Hsp70 a sejten belül anti-inflammatoricus tulajdonsággal rendelkezik, az extracellularis Hsp70 a sejtek közötti ősi veszély jelként (a sejtet ért stresszhatást, illetve 27
a sejtkárosodást, sejtszétesést jelezve) képes aktiválni a természetes és az adaptív immunrendszert (130,131). A Hsp70 egyrészt adjuváns-szerű hatásával (antigéntől függetlenül) képes stimulálni az antigén-prezentáló sejteket, másrészt intrinsic dajkafehérje (chaperon) képességénél fogva peptideket (antigéneket) szállít és elősegíti azok prezentálását az adaptív immunrendszer sejtes elemei felé. A Hsp70 és az MHC I- es osztályba tartozó molekulák peptidkötő domainjének szerkezete nagyon hasonló (101). Az extracellularis Hsp70 tehát képes cytokinként és dajkafehérjeként is működni, amit Asea chaperokine aktivitásnak nevezett el (132,133). Az extracellularis Hsp70 az antigén-prezentáló sejteken található receptorokhoz kötődve stimulálja azok proinflammatoricus (Th1-típusú) cytokin (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12), GM-CSF, nitrogén-monoxid és chemokin (MIP-1α, MIP-1β, monocyta chemoattractans protein-1 (MCP-1), RANTES) termelését, illetve felszínükön MHC I- es és II-es osztályú hisztokompatibilitási antigének, costimulatoros molekulák (CD40, CD80, CD86) és maturációs markerek (CD83, chemokin receptor 7 (CCR7)) expresszióját (131,133,134-137). Az extracellularis Hsp70 elősegíti a dendriticus sejtek érését, migrációját és veszély jelként képes aktiválni azokat. A dendriticus sejtek mindezek hatására tolerogénből kifejezetten immunogénné válnak (126,133,137,138). Az extracellularis Hsp70 közvetlenül képes stimulálni az NK-sejtek migrációját és cytolyticus aktivitását, valamint a γ/δ T-sejteket is (139,140). A γ/δ T-sejtek elpusztítják azokat a tumorsejteket, amelyek felszínén a Hsp70 kifejeződik (141). Kutatócsoportunk mutatta ki, hogy a Hsp70 antitesttől függetlenül aktiválja a humán komplementrendszer klasszikus útját (142). Az extracellularis Hsp70 a természetes immunrendszer sejtes elemein az előbbiekben részletezett hatásait úgy fejti ki, hogy nagy affinitással kötődik a felszínükön található különböző receptorokhoz (CD14, CD36, CD40, CD91, lectin-like oxidised low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1), Toll-like receptor 2 és 4) (133). A humán Hsp70 a TNF receptor családba tartozó CD40-hez kötődve stimulálja a p38 mitogén-aktivált protein kinázt (MAPK), ami a nuclearis faktor-κb transzkripciós faktor aktiválásával előidézi a target (például proinflammatoricus cytokin) gének átírását (143). A CD14 transzmembrán domaint nem tartalmaz, ezért a Hsp70 jelátvitelében együttműködik a Toll-like receptor 2-vel (a Gram-pozitív baktériumok receptora) és a Toll-like receptor 4-gyel (a Gram-negatív baktériumok receptora). A Hsp70 a CD14-hez 28
kötődve kálcium-függő módon aktiválja a myeloid differenciációs protein 88 (MyD88)/IL-1 receptor associated kinase (IRAK)/NF-κB jelátviteli útvonalat (136). A Hsp70 CD14-től függetlenül, de kálcium-függő módon is képes aktiválni az NF-κB-t (134). Az α 2 -macroglobulin receptora, a CD91, valamint a scavenger receptor LOX-1 elsősorban a Hsp70 által kiváltott antigén keresztprezentációban vesz részt (144,145). Jelenleg nem ismert, hogy az utóbbi két receptor képes-e közvetíteni a Hsp70 aktiváló hatását az antigén-prezentáló sejteken. A Hsp70 hatását az NK-sejteken az azok felszínén kifejeződő CD94 mediálja (146). Az extracellularis Hsp70 kötődését leírták endothelialis és epithelialis sejtekhez is, de felszínükön a Hsp70 receptorát még nem azonosították és a Hsp70 hatása sem ismert még ezeken a sejteken (147). Az extracellularis Hsp70 képes antigéneket (peptideket) szállítani és a Hsp70- peptid complex receptor-mediált endocytosis útján az antigén-prezentáló sejtekbe történő internalisatiojával elősegíti azok MHC I (endogén) és MHC II (exogén) úton történő prezentációját a cytotoxicus és helper T-sejtek felé (148). A Hsp70 az exogén antigének endogén úton történő prezentációját, az antigén keresztprezentációt is képes kiváltani (145). Egyidejű nem specifikus (Th1-polarizáló, chemokin termelést stimuláló) hatásaival endogén adjuvánsként is hat (137). A Hsp70 adjuváns hatása mind a szisztémás, mind a mucosalis immunisatióban érvényesül (149). Mint minden rekombináns technológiával előállított fehérjével, a rekombináns Hsp70-nel végzett vizsgálatoknál is figyelembe kell venni az endotoxinnal (lipopoliszachariddal) való kontamináció lehetőségét és azt, hogy a megfigyelt hatást nem a Hsp70, hanem a lipopoliszacharid váltotta ki. Megfelelő preparálással (például polymyxin B oszlopon történő tisztítással vagy polymyxin B mosással) azonban a lipopoliszacharid szennyeződés 95-99%-ban eltávolítható, illetve funkcionális tesztekkel (például hődenaturációval, proteináz K előkezeléssel) a Hsp70 és a lipopoliszacharid hatása elkülöníthető, és a Hsp70 chaperokine aktivitása demonstrálható (133). Az extracellularis Hsp70 tehát veszély jelként egy proinflammatoricus (Th1- típusú) immunválaszt hoz létre a természetes és az adaptív immunrendszer aktiválásával, ami fontos szerepet játszik a szervezet pathogen microorganismusok és tumorsejtek elleni védelmében (131). 29
A hősokkfehérjék, mint immunodomináns molekulák azonban célpontjai is lehetnek az immunválasznak. A pathogen microorganismusok elleni immunválasz részben a microbialis hősokkfehérjék ellen irányul. Fertőzések esetén a microbialis hősokkfehérjék elleni immunválasz molekuláris mimikri révén keresztreakciót adhat az endogén (humán) hősokkfehérjékkel, egy potenciális kapcsolatot létrehozva a fertőzések és az autoimmunitás között (150). Bár az endogén (humán) hősokkfehérjék ellen reguláló, védő immunválasz van jelen (regulatoricus T-sejtek, természetes autoantitestek révén), ez az immunválasz sérülékeny és zavara autoimmun betegségek, például arthritis, sclerosis multiplex, diabetes mellitus és cardiovascularis megbetegedések kialakulásához vezethet. A szabályozásban egyensúlyzavar keletkezhet azáltal, hogy a sejtet ért stressz hatására a hősokkfehérjék expressziója fokozódik és/vagy a saját hősokkfehérjéket védő immunreakció hatásfoka nem megfelelő. Autoimmun betegségek kialakulásához vezethet az is, ha a szervezet a saját hősokkfehérjékre védő helyett destruktív immunválasszal reagál (100). A saját hősokkfehérjékre, mint kiemelten védett saját antigénekre tehát az immunrendszer reguláló, védő immunválaszt ad, ennek zavara esetén azonban a hősokkfehérjék potenciálisan ártalmas autoantigénként viselkedve elősegíthetik autoimmun megbetegedések kialakulását (100,131). Az extracellularis Hsp70 az immunrendszerre gyakorolt hatásai mellett cytoprotectiv hatással is bír, aminek a sejtet ért károsodás esetén a szomszédos sejtek védelmében lehet szerepe. A gliasejtek képesek Hsp70-et kibocsátani és a sejtkultúrához adott Hsp70 fokozta a neuronalis sejtek stressz-toleranciáját (151). Az exogén Hsp70 megnövelte a stressznek kitett aorta-, illetve arterialis simaizomsejtek túlélését in vitro, az utóbbi esetében a Hsp70 a sejtfelszínhez kötődött, de nem internalizálódott (152-153). 30
2. Célkitűzések 1. A hősokkfehérjék elsősorban intracellularis fehérjeként ismertek, de a sejtek felszínén is kifejeződnek és a sejtekből aktív és passzív módon kijuthatnak az extracellularis térbe. A Hsp60 és Hsp70 jelen van egészséges emberek perifériás keringésében, de kevés adat áll rendelkezésre a keringésben található 70 kda molekulatömegű hősokkfehérjéről terhességben. Ezért vizsgáltuk, hogy egészséges terhesek szérumában jelen van-e a Hsp70, illetve, hogy milyen tényezők befolyásolják a Hsp70 szérumszintjét terhességben (anyai életkor, testtömeg index (BMI), dohányzás, szisztolés, diasztolés vérnyomás, terhességi kor). 2. Bár a hősokkfehérjék a sejten belül dajkafehérje, cytoprotectiv és antiinflammatoricus tulajdonsággal rendelkeznek, az extracellularis Hsp70 a természetes és az adaptív immunrendszer aktiválásával képes egy proinflammatoricus (Th1-típusú) immunválaszt létrehozni, ami terhességben kedvezőtlenül befolyásolhatja azokat a mechanizmusokat, amelyek a semiallogen ébrénnyel/magzattal szembeni immuntolerancia fenntartását szolgálják. Ezért tanulmányoztuk azt is, hogy az extracellularis tér egyik compartmentjében, a szérumban van-e különbség a Hsp70 koncentrációjában egészséges terhes és nem terhes nők között. 3. A praeeclampsia kóreredete és pathogenesise még nem teljesen tisztázott. A placentaris ischaemia és oxidatív stressz, valamint az anyai szisztémás gyulladásos válaszreakció szisztémás oxidatív stresszel szerepet játszik a kórkép kialakulásában. Súlyos esetekben egyes szervek (elsősorban a vese, máj, agy) ischaemiája is megfigyelhető praeeclampsiában. Az ischaemia, az oxidatív stressz és a gyulladás, valamint a haemodynamicus stressz (akut magas vérnyomás) képes indukálni a Hsp70 expresszióját. A Hsp70 a stressznek kitett, illetve károsodott, széteső sejtekből kijuthat az extracellularis térbe. Ezért vizsgáltuk, hogy praeeclampsiában, illetve annak egy súlyos formájában, HELLP-syndromában megbetegedett és egészséges terhesek között mérhető-e különbség a Hsp70 szérumszintjében. Praeeclampsiás terhesekben elemeztük, hogy a kórkép súlyossága, korai vagy késői kezdete, illetve a magzati sorvadás jelenléte befolyásolja-e a Hsp70 szérum koncentrációját. 31
4. Egyre több a bizonyíték arra, hogy az anyai szisztémás gyulladásos válaszreakció (a leukocyták számának emelkedésével és aktiválódásukkal, Th1 cytokin túlsúllyal, az endothelsejtek, alvadási rendszer, komplementrendszer és a thrombocyták aktiválódásával, valamint akut fázis fehérjék fokozott szintézisével), amit jelen ismereteink szerint az ischaemiás és oxidatív stressznek kitett méhlepényből az anyai keringésbe kerülő Th1 cytokinek, lipidperoxidációs termékek és trophoblast törmelék vált ki, központi szerepet játszik a praeeclampsia kialakulásában. Ezért meghatároztuk két pozitív (C-reaktív protein, α 2 -macroglobulin) és egy negatív (α 2 - Heremans Schmid (α 2 -HS) glycoprotein) akut fázis fehérje szérumszintjét egészséges, praeeclampsiás és HELLP-syndromás terhesekben és vizsgáltuk, hogy szérumszintjük mutat-e összefüggést a Hsp70 szérum koncentrációjával. 5. A praeeclampsia egy multifaktoriális kóreredetű megbetegedés, kialakulását részben genetikai, részben környezeti tényezők befolyásolják. A Hsp70-2 (HspA1B) gén kódoló régiójában, az 1267-es pozícióban található egypontos nukleotid variáció (single nucleotide polymorphism (SNP)) bár aminosavcserét nem eredményez, de befolyásolja a fő hő-indukálható Hsp70 messenger RNS expressziójának mértékét (154). A Hsp70-Hom (HspA1L) gén kódoló régiójában, a 2437-es pozícióban található báziscsere (SNP) egy aminosavcserével jár a kódolt fehérje peptidkötő domainjében és feltételezik, hogy módosítja annak peptidkötő specificitását (155). Tanulmányunkban meghatároztuk egészséges és praeeclampsiás terhesek genotípusát az előbb említett két polimorfizmusra és elemeztük, hogy a két polimorfizmus mutat-e kapcsolatot a praeeclampsia kialakulásának kockázatával, illetve a Hsp70 szérumszintjével vizsgálati csoportjainkban. 32
3. Vizsgálati csoportok és módszerek 3.1. Vizsgálati csoportok 3.1.1. Egészséges terhes és nem terhes nők vizsgálata 176 egészséges terhes nőt szövődménymentes terhességgel (életkoruk 17 és 44 év között, terhességi koruk 20 és 41 hét között volt) és 81 egészséges, nem terhes nőt (életkoruk 22 és 40 év között volt) vontunk be ebbe a vizsgálatba. A terheseket a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömb Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályán és az I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikán gondozták. A nem terhes nők a Semmelweis Egyetem III. Sz. Belgyógyászati Klinikán szűrővizsgálatokon vettek részt. A terheseket konszekutív módon soroltuk be vizsgálatunkba a terhesség során rutinszerűen végzett vérvételek alkalmával. Terhességük alatt mindvégig normotensivek maradtak és semmilyen kóros terhességi állapot nem alakult ki náluk. Az egészséges, nem terhes nőket életkoruk alapján illesztettük az egészséges terhes nők csoportjához és e célból egy 323 egészséges, nem terhes nőt magába foglaló csoportból (életkor: 22-79 év) válogattuk le őket. A vérvétel minden esetben éhgyomor mellett történt. A terhes nők egyikénél sem indult meg a szülés és nem történt idő előtti burokrepedés sem. A vizsgálatba bevont összes nő kaukázusi származású volt. A vizsgálat kizárási kritériuma volt a többes terhesség, magzati fertőzés vagy congenitalis anomalia jelenléte. 3.1.2. Praeeclampsiás terhesek vizsgálata Ebben az eset-kontroll vizsgálatunkban 93, a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömb Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályán, illetve az I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikán gondozott praeeclampsiás terhes vett részt. Kontroll csoportként a 3.1.1. pontban tárgyalt egészséges terhesek csoportjába konszekutív módon besorolt első 127 normotensiv (szisztolés vérnyomás<140 Hgmm és diasztolés vérnyomás<90 Hgmm), egészséges terhes szolgált. A vérvételt minden esetben éhgyomor mellett végeztük. Az egészséges és praeeclampsiás terhes nők egyikénél sem indult meg a szülés és idő előtti burokrepedés sem történt. A vizsgálat összes 33
résztvevője kaukázusi származású volt. Kizárási kritériumok a következők voltak: többes terhesség, chronicus hypertonia, diabetes mellitus, autoimmun megbetegedés, érbetegség, vesebetegség, anyai vagy magzati fertőzés és magzati congenitalis anomalia. A praeeclampsiát a jelenleg érvényes klasszifikáció (7) alapján a következőképpen definiáltuk: a terhesség 20. hete után fellépő hypertonia (a szisztolés vérnyomás 140 Hgmm vagy a diasztolés vérnyomás 90 Hgmm, legalább két alkalommal minimum 6 óra, de maximum 7 nap különbséggel mérve, korábban normotensiv terhesben), amit szignifikáns proteinuria ( 300 mg/24 óra) kísér. Amennyiben 24 órás vizeletgyűjtés nem történt, a proteinuria diagnózisát a következők alapján mondtuk ki: legalább két random vizeletmintában (minimum 6 óra, de maximum 7 nap különbséggel nyerve) húgyúti fertőzés hiányában a fehérjekoncentráció 300 mg/l (vagy 1 + tesztcsíkkal nézve). A praeeclampsiás terhesek vérnyomása a szülést követő 12. hétig minden esetben rendeződött. Chronicus hypertoniás, átmeneti terhességi hypertoniás és rárakódásos praeeclampsiás terhesek vizsgálata nem képezi tárgyát az értekezésnek. A praeeclampsiát súlyosnak tekintettük, ha a következő feltételek bármelyike teljesült: a szisztolés vérnyomás 160 Hgmm vagy a diasztolés vérnyomás 110 Hgmm, legalább két alkalommal, minimum 6 óra különbséggel mérve; proteinuria 5 g/24 óra vagy 3 + tesztcsíkkal legalább két random vizeletmintában, minimum 6 óra különbséggel nyerve; illetve, ha magzati sorvadás állt fenn (10). A súlyos praeeclampsiás terhesek csoportjába két eclampsiás terhest is besoroltunk. A 93 praeeclampsiás terhes csoportjában HELLPsyndromás terhesek nem voltak, a HELLP-syndromás terheseket külön vizsgáltuk (lásd a 3.1.3. pont alatt). A praeeclampsiát korai kezdetűnek tekintettük, ha a betöltött 34. terhességi hét előtt jelentkezett (156). Magzati sorvadást akkor állapítottunk meg, ha a magzat születési súlya kisebb volt, mint a terhességi kornak és a nemnek megfelelő 10 percentilis érték (157). 3.1.3. HELLP-syndromás terhesek vizsgálata 10 súlyos praeeclampsiás, HELLP-syndromás, 20 súlyos praeeclampsiás (HELLP-syndroma nélkül) és 20 normotensiv, egészséges terhest szövődménymentes 34
terhességgel vontunk be ebbe az eset-kontroll vizsgálatba a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömb Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályán és az I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikán. A HELLP-syndromás terheseket konszekutív módon soroltuk be a vizsgálatunkba. A súlyos praeeclampsiás (HELLP-syndroma nélkül) és normotensiv, egészséges terheseket a HELLP-syndromás terhesek csoportjához illesztettük az anyai életkor, vérvételkori terhességi kor és a terhesség előtti testtömeg index (BMI) alapján, a 3.1.2. pontban tárgyalt 93 praeeclampsiás és 127 normotensiv, egészséges terhesből álló csoportokból leválogatva őket. A vérvételt a HELLPsyndromás terheseknél is éhgyomor mellett végeztük és egyiküknél sem indult meg a szülés vagy történt idő előtti burokrepedés. A 10 súlyos praeeclampsiás, HELLPsyndromás terhes is kaukázusi származású volt. A kizárási kritériumok megegyeztek a 3.1.2. pontban felsoroltakkal. A HELLP-syndroma diagnosztikai kritériumai a következők voltak: szérum aszpartát-aminotranszferáz (AST) szint>70 U/l, szérum laktát-dehidrogenáz (LDH) szint>600 U/l és thrombocytaszám<150 G/l. A microangiopathiás haemolysist alátámasztotta a fragmentocyták jelenléte a perifériás vérkenetben. A Mississippibeosztás alapján a HELLP-syndroma formája három terhesben 1. típusú, négy terhesben 2. típusú és három terhesben 3. típusú volt (14). Mind a 10 HELLP-syndromás terhes teljesítette a súlyos praeeclampsia 3.1.2. pontban tárgyalt feltételeit is. Vérnyomásuk a szülést követő 12. hétig rendeződött. 3.1.4. Genetikai asszociációs vizsgálat praeeclampsiában Genetikai asszociációs vizsgálatunkban 93 praeeclampsiás és 125 normotensiv, egészséges terhes vett részt. A 3.1.1. pontban ismertetett egészséges terhes nők csoportjából 125 terhesnek, míg a 3.1.2. pontban tárgyalt praeeclampsiás csoportból 81 terhesnek állt rendelkezésre a DNS-mintája. Genetikai vizsgálatunkba bevontunk 12 korábban praeeclampsiás nőt is, akiktől a szülést követő 1 éven belül vettünk vért. Az utóbbiaknak azonban csak a Hsp70-2 1267A>G és Hsp70-Hom 2437C>T genotípusát határoztuk meg, Hsp70 szérumszintjüket nem vizsgáltuk. A HELLP-syndromás terhesek alacsony száma (a 10 HELLP-syndromás terhesből csak 8-nak volt meg a 35
DNS-mintája) a HELLP-syndromás csoporttal genetikai asszociációs vizsgálat végzését nem tette lehetővé. A vizsgálat minden résztvevője kaukázusi származású volt és a középmagyarországi régióban lakott. A diagnosztikai és kizárási kritériumok megegyeztek a 3.1.2. pontban ismertetettekkel. A praeeclampsiás terhesek vérnyomása legkésőbb a szülést követő 12. hétig rendeződött. Vizsgálatainkat a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága engedélyezte (TUKEB: 177/1999). Tudományos vizsgálatunk minden résztvevője a vizsgálatról írásban és szóban tájékoztatást kapott és annak elvégzéséhez írásos beleegyezését adta. 36
3.2. Módszerek 3.2.1. A vérminták levétele, előkészítése és tárolása A vérmintákat alkari vénapunkcióval vettük le natív és EDTA-t tartalmazó Vacutainer csövekbe, majd szobahőmérsékleten 10 percig 3000 g-vel centrifugáltuk azokat. A natív mintákból nyert szérumot -80 C-on, míg az EDTA-val alvadásgátolt vérmintákból származó buffy coat-ot -20 C-on tároltuk a vizsgálatok elvégzéséig. 3.2.2. Szérum Hsp70 koncentráció meghatározása A szérum solubilis Hsp70 (fő hő-indukálható Hsp70) tartalmát szendvics ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) technikával határoztuk meg. A méréshez az R&D Systems ELISA kitjét (Minneapolis, Minnesota, USA, Cat. No. DYC1663E) használtuk. A teszt során az egér anti-humán Hsp70 monoklonális capture antitesttel érzékenyített (100 μl/lyuk; 2 μg/ml; bikarbonát pufferben (ph 9.5) egy éjszakán át 4 Con) 96 lyukú ELISA lemezt háromszori mosás (PBS (foszfáttal pufferelt sóoldat), 0.1% Tween 20) és a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása (200 μl PBS, 0.5% zselatin, 0.1% Tween 20, 1 órán át, szobahőn) után hígítatlan vizsgálati szérummintával inkubáltuk (100 μl/lyuk; 2 órán át, szobahőn). Újabb mosási ciklust követően biotinnal jelzett nyúl anti-humán Hsp70 monoklonális antitesttel (100 μl/lyuk; 0.5 μg/ml; PBS-zselatinban, 1.5 órán át, szobahőn) és streptavidin-torma peroxidáz komplexszel (mosás után; 1:200; PBS-zselatinban, 20 percig, szobahőn) detektáltuk a lemezhez kötődött Hsp70 fehérje mennyiségét. Standardként rekombináns humán Hsp70 hígítási sorát használtuk (0-10 ng/ml). A lemezeket mosást követően 100 μl o-phenylene-diamine (OPD, Sigma, St. Louis, Missouri, USA) szubsztráttal hívtuk elő, az optikai denzitást 490 nm-en (referencia 620 nm) mértük. A detekciós küszöb 0.05 ng/ml volt, az intra/inter-assay variabilitás értéke <10/<16%-nak mutatkozott. 37
3.2.3. Szérum C-reaktív protein (CRP) koncentráció meghatározása A szérum CRP koncentrációját ultraszenzitív, latex szemcsékkel érzékenyített immunoturbidimetriás eljárással mértük Cobas Integra 800 automatán a gyártó által forgalmazott kittel (Roche, Mannheim, Germany, Cat. No. 20764930). A humán CRP agglutinált a monoklonális anti-crp antitestekkel fedett latex szemcsékkel. A precipitáció turbidimetriás méréssel, 552 nm-en került meghatározásra. A mérési küszöb 0.07 mg/l, az intra/inter-assay variabilitás pedig 6.2 és 142 mg/l átlagérték mellett 1.8/2.9%, illetve 1.5/2.7% volt. 3.2.4. Szérum α 2 -macroglobulin és α 2 -HS glycoprotein koncentráció meghatározása A szérum α 2 -macroglobulin és α 2 -HS glycoprotein koncentrációját radiális immundiffúzióval határoztuk meg, poliklonális nyúl anti-humán α 2 -macroglobulin antitest (Dako, Glostrup, Denmark, Cat. No. A0033), illetve kecske anti-humán α 2 -HS glycoprotein IgG frakció (DiaSorin Inc., Stillwater, Minnesota, USA, Cat. No. 81931) alkalmazásával. A standard koncentrációk meghatározására az α 2 -macroglobulin esetében Human Serum Protein Calibratort (Dako, Glostrup, Denmark, Cat. No. X0908), míg az α 2 -HS glycoproteinnél egészséges véradók kevert plazmáját használtuk. Az intra/inter-assay variabilitás az α 2 -macroglobulin mérésekor 3.8/6.5%, míg az α 2 -HS glycoprotein esetében 3.6/6.2% volt. 3.2.5. DNS izolálás A genomialis DNS-t a buffy coat-ból a Miller és munkatársai által 1988-ban leírt kisózásos módszerrel izoláltuk (158). A vörösvérsejtek feloldása után a fehérvérsejteket tisztára mostuk, majd nátrium-dodecil-szulfáttal és proteináz K-val pufferolt közegben 30 percig 56 C-os vízfürdőben emésztettük. A sejtlizátumban lévő fehérjéket tömény (6 M) konyhasóoldattal csaptuk ki ( kisóztuk ). A csapadékot centrifugálással eltávolítottuk és a felülúszóhoz izopropanolt adva a DNS-t precipitáltuk. Ezt követően 38
az extrahált DNS-t tiszta csőbe átraktuk, 70%-os etanolban mosva tisztítottuk és 200 μl desztillált vízben feloldottuk. 3.2.6. Genotipizálás A terhesek genotípusát a HspA1B (Hsp70-2) 1267A>G és HspA1L (Hsp70- Hom) 2437C>T egypontos nukleotid variációkra (SNP) a polimeráz láncreakciórestrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus (PCR-RFLP) módszerrel határoztuk meg. 3.2.6.1. HspA1B (Hsp70-2) 1267A>G polimorfizmus vizsgálata Polimeráz láncreakcióval egy 1117 bázispár hosszúságú, a polimorf lókuszt tartalmazó fragmentumot amplifikáltunk egy 5`-CATCGACTTCTACACGTCCA-3` (szenz) és egy 5`-CAAAGTCCTTGAGTCCCAAC-3` (antiszenz) primerrel. A 10 μl térfogatú PCR reakcióelegy 1 μl 2 mm dntp-t, 1 μl 10x PCR reakció puffert, 2.9 μl desztillált vizet, 1-1 μl 10 μm primert, 1 μl 25 mm MgCl 2 -t, 0.1 μl 5 U/μl HotStar Taq DNS polimerázt (QIAGEN Diagnostics GmbH, Hamburg, Germany) és 2 μl (200 ng) genomialis DNS-t tartalmazott. A PCR program a következő volt: kezdő denaturálás 95 C-on 15 percig, amit 35 ciklus denaturálás (94 C-on 30 másodpercig), annealing (58 C-on 30 másodpercig) és kiterjesztés (extenzió, 72 C-on 1 percig) követett, majd a programot egy végső extenziós fázis zárta le (72 C-on 7 percig). A polimeráz láncreakcióhoz AB 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) PCR készüléket használtunk. A restrikciós emésztés során 10 μl PCR termékhez 10 U PstI restrikciós endonukleázt (Fermentas International Inc., Burlington, Ontario, Canada) és 1 μl 10x puffert adtunk. Az emésztés 37 C-on, 12 órán át zajlott. A hasítási termékeket 1 μg/ml etidium-bromidot tartalmazó 2%-os agaróz gélen futattuk meg. Az értékelés ultraibolya (UV) fénnyel való megvilágítással történt. A kapott fragmentumok hossza 1117 bázispár (A allél), illetve 936 és 181 bázispár (G allél) volt (3. ábra). 39
500 bp 1031 bp AG AG GG AG AG AA AA GG marker 3. ábra Hsp70-2 1267A>G polimorfizmus vizsgálata: PstI restrikciós endonukleázzal emésztett PCR termékek gélelektroforetikus futtatás utáni negatív képe AA: 1117 bázispár (bp); AG: 1117, 936 és 181 bp; GG: 936 és 181 bp; marker: Gene Ruler 50 bp Ladder; (A 181 bp fragmentum a képen nincs rajta.) 3.2.6.2. HspA1L (Hsp70-Hom) 2437C>T polimorfizmus vizsgálata Ebben az esetben PCR módszerrel egy 878 bázispár hosszúságú DNS szakaszt sokszorosítottunk meg egy 5`-GGACAAGTCTGAGAAGGTACAG-3` szenz és egy 5`- GTAACTTAGATTCAGGTCTGG-3` antiszenz primerrel. A PCR reakcióelegy 1 μl 2 mm dntp-t, 1 μl 10x PCR reakció puffert, 5 μl desztillált vizet, 0.4 μl 20 μm szenz és antiszenz primert, 0.6 μl 25 mm MgCl 2 -t, 0.04 μl 5 U/μl Promega Taq DNS polimerázt (Promega, Madison, Wisconsin, USA) és 2 μl (200 ng) genomialis DNS-t tartalmazott. A polimeráz láncreakció kondíciói a következők voltak: kezdő denaturálás 95 C-on 3 perc 30 másodpercig, 33 ciklus denaturálás (95 C-on 15 másodpercig), annealing (52 C-on 15 másodpercig) és kiterjesztés (72 C-on 30 másodpercig), majd egy végső extenzió 72 C-on 4 percig. Az amplifikált PCR terméket NcoI restrikciós endonukleázzal (Fermentas International Inc., Burlington, Ontario, Canada) 37 C-on, 12 órán keresztül emésztettük 10 μl PCR termékhez 10 U restrikciós enzimet és 1 μl 10x puffert adva. A hasítási termékeket a 3.2.6.1. pontban leírtak szerint futattuk és UV fény alatt detektáltuk. A kapott fragmentumok 878 bázispár (T allél), illetve 551 és 327 bázispár (C allél) hosszúságúak voltak (4. ábra). 40
100 bp 200 bp 300 bp 500 bp 900 bp CC CT TT CC CT CC TT CC marker 4. ábra Hsp70-Hom 2437C>T polimorfizmus vizsgálata: NcoI restrikciós endonukleázzal emésztett PCR termékek gélelektroforetikus futtatás utáni negatív képe CC: 551 és 327 bázispár (bp); CT: 878, 551 és 327 bp; TT: 878 bp; marker: Gene Ruler 50 bp Ladder 3.2.7. Statisztikai módszerek A folytonos változók normalitását a Shapiro-Wilk-féle W-teszttel ellenőriztük. Tekintettel arra, hogy a folytonos változók nem mutattak normális eloszlást, eredményeink értékelésekor nemparaméteres statisztikai eljárásokat használtunk. A folytonos változókat két csoport között a Mann-Whitney U-teszttel, míg több csoport esetében a Kruskal-Wallis-féle ANOVA (analysis of variance) teszttel hasonlítottuk össze. Post-hoc tesztként a Mann-Whitney U-tesztet alkalmaztuk. A diszkrét (kategoriális) változók csoportjaink közötti összehasonlítására a Fisher egzakt tesztet és a Pearson-féle χ 2 -próbát használtuk. A korrelációs együtthatókat a Spearman-féle rangkorrelációs eljárással, míg a regressziós együtthatókat kétváltozós lineáris regresszióval számítottuk ki. Többszörös (többváltozós) lineáris regresszióval a standardizált regressziós együtthatókat határoztuk meg. Analízisünk során a zavaró (confounding) változók hatását dichotom függő változó esetén többszörös (többváltozós) logisztikus regresszióval, míg, ha a függő változó folytonos volt, kovariancia analízissel (analysis of covariance (ANCOVA)) korrigáltuk (adjusztáltuk). 41