A függetlenül kialakuló rezisztencia vizsgálata 29 rezisztens sejtvonalon

A függetlenül kialakuló rezisztencia vizsgálata 29 rezisztens sejtvonalon Doktori értekezés Dr. Tegze Bálint Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Győrffy Balázs, tudományos főmunkatárs, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Döme Balázs, osztályvezető főorvos, Ph.D. Dr. Langmár Zoltán, egyetemi tanársegéd, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Losonczy György, egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Masszi András, egyetemi tanársegéd, Ph.D. Dr. Réz Gábor, egyetemi docens, az MTA doktora Budapest 2012

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék... 1 Rövidítések jegyzéke... 3 1 Irodalmi háttér... 5 1.1 Az emlőrák... 5 1.1.1 Az emlőtumorról általában... 5 1.1.2 Az emlőrák szisztémás terápiája... 5 1.1.3 Alkalmazott gyógyszerek... 14 1.2 Biomarkerek... 18 1.2.1 Prognosztikai és prediktív markerek... 18 1.2.2 Biomarkerek emlőrákban... 19 1.3 Modell-rendszerek... 23 1.3.1 Sejkultúrás modellek... 23 2 Módszerek... 26 2.1 Sejtvonalak... 26 2.2 Gyógyszerek... 26 2.3 Sejtkultúra... 26 2.4 Sejtproliferáció mérése... 27 2.5 Sejtszám meghatározás... 28 2.6 Rezisztens sejtvonalak kialakítása... 28 2.7 Nukleinsav izolálás... 29 2.8 Minőségellenőrzés... 30 2.9 RT-PCR... 31 2.10 RT-PCR statisztikai kiértékelése... 32 2.11 Citogenetika... 32 2.12 Áramlási citometria... 32 3 Eredmények... 34 3.1 Sejtvonal fejlesztés... 34 3.2 RT-PCR... 35 3.3 Citogenetika... 39 3.4 Áramlási citometria... 43 1

4 Megbeszélés... 45 5 Következtetések... 48 6 Összefoglalás... 50 7 Summary... 52 8 Irodalomjegyzék... 54 9 Publikációk jegyzéke... 85 9.1 Disszertációhoz kapcsolódó publikációk jegyzéke... 85 9.2 Disszertációtól független publikációk jegyzéke... 86 10 Köszönetnyilvánítás... 87 2

Rövidítések jegyzéke HER2: humán epidermális növekedési faktor jelfogó 2 CMF: ciklofoszfamid, metotrexát, 5-fluorouracil FAC: 5-fluorouracil, doxorubicin, ciklofoszfamid FEC: 5-fluorouracil, epirubicin, ciklofoszfamid AC: doxorubicin, ciklofoszfamid CMFP: ciklofoszfamid, metotrexát, 5-fluorouracil, prednizolon TAC: docetaxel, doxorubicin, ciklofoszfamid MDR : multidrog rezisztencia Pgp: P-glikoprotein MRP1: multidrog rezisztencia fehérje 1 (multidrog resistance protein) BCRP: emlőrák rezisztencia fehérje (breast cancer resistance protein) ABC transzporter: ATP-binding cassette traszporter MXR: multixenobiotikum rezisztencia fehérje (multixenobiotic resistance protein) CYP450: citokróm P450 SXR: szteroid és xenobiotikum jelfogó (steroid and xenobiotic receptor) EGFR: epidermális növekedési faktor jelfogó FDA: Food and Drug Administration IC 50 : fél maximális gátlás koncentráció MEK: Mitogén-aktivált Erk aktiváló kináz (mitogen-activated Erk activating kinase) MET: hepatocita növekedési faktor jelfogó TGFα : transzformáló növekedés faktor α PBS: foszfáttal pufferelt sóoldat (phosphate buffered saline) MTT: 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólium bromid DMSO: dimetil szulfoxid HSP: hősokk fehérje 3

CIN : kromoszómális instabilitás MVP: tüdő rezisztencia fehérje (lung resistance protein, major vault protein) MAP4: mikrotubulus asszociált fehérje 4 4

1 Irodalmi háttér 1.1 Az emlőrák 1.1.1 Az emlőtumorról általában Világszerte évente több mint 1,000,000 új emlőrákos beteget diagnosztizálnak és 370 000-en halnak meg emlőrák következtében. Nők esetén az emlőrák a leggyakoribb rosszindulatú daganat az USA-ban, és a második leggyakoribb oka a női daganatos halálozásnak, valamint a leggyakoribb oka a 40 és 59 éves kor közötti daganatos halálozásnak [1]. Hazánkban a női emlőrák mortalitása és előfordulása 100,000 főre viszonyítva 34,5 és 81,5. Évente több, mint 2300 nő hal meg emlőrákban Magyarországon [2]. Az emelkedő gyakoriság ellenére a betegségre specifikus halálozás a legtöbb fejlett országban csökkent [3], a javulás a szisztémás kezelés fejlődésének és az emlőrák szűrésnek köszönhető. A legfontosabb rizikótényezők a kor, a szülési anamnézis, hormonális faktorok és a családi kórelőzmény. Bár a családi érintettség gyakori az emlőrákos betegek körében, a betegek kevesebb, mint 10%-a hordoz csírasejtes mutációt. Kezelésében a sebészeti, radioterápia, kemoterápia, endokrin és célzott terápia is szerepet kap [4]. 1.1.2 Az emlőrák szisztémás terápiája Az emlőrák heterogén betegségcsoport, amely több alcsoportból áll, melyeket különböző genetikai változások jellemeznek, más a prognózisuk és az egyes kezelési protokollokra adott válaszuk [5]. Az emlőrákot klinikai szempontból ösztrogén receptor pozitív, HER2 pozitív és a tripla negatív fő alcsoportokra tudjuk osztani. Az emlődaganatok utóbbi csoportja is több alcsoportból áll, melyek különböző expressziós profillal és eltérő prognózissal bírnak [6]. Endokrin kezelés Az emlőrákok körülbelül 70%-a fejezi ki az ösztrogén receptor α-át, melynek fontos szerepe van a daganat túlélésében, növekedésében, progressziójában, ezáltal kiváló daganatellenes terápiás célpont is egyben. Több terápiás lehetőség is 5

rendelkezésre áll az ösztrogén receptor mediálta útvonal gátlására. Lehetőség van a receptor közvetlen blokkolására, például tamoxifen révén, a ligand mennyiségének csökkentése menopauza előtt petefészek eltávolítással, sugárterápiával, vagy GHRH agonista alkalmazásával, menopauza után aromatáz gátlókkal lehetséges. Ezen utóbbiak hatékonyak, kedvező mellékhatásprofillal rendelkeznek, emiatt az ösztrogén receptor pozitív emlőrák esetén széles körben használják korai, áttétes és kiújuló emlőrák esetén őket [7]. A válaszadási arány 30 és 75% között változik [8]. A sebészi petefészek eltávolítás nem előnyösebb, mint a tamoxifen kezelés a kezdeti endokrin terápia esetén, ugyanakkor tamoxifen kezelés hatástalansága esetén a petefészek eltávolítása után még terápiás válasz várható [9]. A GHRH analógok használatával a sebészi kezeléssel elérhető teljes túléléstől szignifikánsan nem különböző teljes túlélés érhető el [10]. Előrehaladott emlőrákban szenvedő premenopauzában levő betegek esetén a tamoxifen kezelés és a petefészek gátlás kombinációja bizonyult jobbnak a tamoxifen monoterápiával, illetve a petefészek gátlással szemben válaszadás, progressziómentes túlélés és teljes túlélés tekintetében [11, 12]. Ez alapján a kombinált endokrin kezelés ajánlható a monoterápiával szemben. A szelektív ösztrogén receptor modulátorok a receptor és a ligand közötti kölcsönhatást gátolják. A tamoxifen antagonistaként hat az emlő esetén, ugyanakkor a májban, csontban és a méhben agonista hatásai vannak. A válaszadási arány az ösztrogén és progeszteron receptor pozitív daganatok esetében 65%, az ösztrogén vagy progeszteron receptor pozitív esetekben 30%, a receptor negatív esetekben 5% alatti [9]. A fulvesztrant egy tisztán ösztrogén antagonista tulajdonságokkal bíró gyógyszer. Az ösztrogén receptorhoz nagyobb az affinitása, mint a tamoxifennek, az ösztrogén receptor által szabályozott gének transzkripcióját teljes mértékben gátolja. Mivel nincs ösztrogénszerű hatása, mint a tamoxifennek, nem nő a tromboembóliás szövődmények kockázata, és a méhtestrák kockázata sem [13]. Áttétes emlőrákos betegek esetén másodvonalbeli kezelésként hatásossága nem különbözik az anasztrazolétól [14, 15]. Aromatáz gátló anasztrazol kezelés után is hatásos lehet [16]. Az androgének aromatizációja révén keletkező ösztradiol az ösztrogénhatás fő mediátora a menopauzát követően. Az aromatáz enzim a zsírszövetben, a mellékvesében, az izmokban, a májban, az agyban és az emlőben van jelen [9]. A harmadik generációs aromatáz gátlók szelektívek, és az aromatáz okozta perifériás 6

szteroid átalakulást képesek 90%-ban gátolni. A harmadik generációs aromatáz inhibitorok közül az anasztrazol használata túlélési előnnyel jár tamoxifennel szemben menopauza utáni kezelés esetén áttétes, ösztrogén receptor pozitív emlőrákban [17-19]. A letrozolt tamoxifennel összehasonlító fázis III vizsgálat igazolta, hogy a letrozol kezelésben részesülők esetén a válaszadási arány 32% volt szemben a másik csoportban tapasztalt 21%-kal. A progressziómentes túlélés szignifikánsan hosszabbnak (9,4 szemben 6 hónappal) bizonyult. A teljes túlélés tekintetében szintén szignifikáns különbség mutatkozott 24 hónapot követően [20]. Célzott terápia Az emlőrák jól definiált altípusainak azonosítása, illetve a daganat kialakulásában és progressziójában jelentős genetikai változások azonosítása lehetővé tette a célzott terápiás szerek sikeres alkalmazását. 1987 óta ismert, hogy a humán epidermális növekedési faktor receptor 2 (HER2) amplifikációja és megnövekedett expressziója összefügg a gyakoribb relapszussal, a rosszabb túléléssel, az apoptózis iránti rezisztenciával és megnövekedett áttétképző képességgel [21-23]. Az emlőrákok ~30 %-ában mutatható ki a HER2 amplifikáció és/vagy expressziónövekedés. A HER2 kiváló támadáspont, gátlószerei közül jelenleg kettő van klinikai használatban (trastuzumab, lapatinib) [24]. A trasztuzumab egy humanizált HER2 elleni IgG1 monoklonális antitest. A trasztuzumabot citotoxikus kemoterápiával kombinálva 2006- óta használják korai, HER2 pozitív emlőrák esetén [25, 26]. A lapatinib egy kis molekulasúlyú tirozin kináz gátlószer, a HER1-et és a HER2-t gátolja. Hatékony szer olyan betegek esetén, akik daganata HER2 pozitív és trasztuzumab kezelés ellenére progresszió jelentkezik [27]. A két jelenleg engedélyezett célzott terápiás gyógyszer érdemi változást hozott a HER2 pozitív emlőrákos betegek korábban igen rossz prognózisában [28, 29]. Számos további célzott terápiás gyógyszer mutatott figyelemre méltó eredményeket a preklinikai és a klinikai vizsgálatokban, ezek a szerek további javulást eredményezhetnek a HER2 pozitív emlőrákos betegek túlélésében. Ezen gyógyszerek közé tartozik a pertuzumab, ami egy humanizált monoklonális antitest, ami a HER2 kettes dimerizációs doménjéhez kötődik. Preklinikai vizsgálatokban a HER2 kombinált gátlása trasztuzumabbal és pertuzumabbal szinergista hatást mutatott [30]. Jelenleg a 7

trasztuzumabbal való kombinált kezelés hatékonyságát fázis III vizsgálatban próbálják igazolni, a fázis II vizsgálatok sikere után [31, 32]. A T-DM1 egy trasztuzumab maytanazin konjugátum. A trasztuzumab a konjugátumot a HER2 pozitív sejtekhez irányítja, a receptorhoz való kötődés hatására internalizálódik, proteolitikus degradáció révén felszabadul a mikrotubulusokat gátló maytanazin [33]. A gyógyszerrel végzett fázis II vizsgálat során trasztuzumab kezelésre progrediáló HER2 pozitív betegcsoporton 25,9% volt az objektív válaszadási ráta, a progressziómentes túlélés mediánja 4,6 hónap volt [34]. Kemoterápia A célzott terápiás gyógyszerek és az endokrin terápia alkalmazásának előretörése ellenére a kemoterápia alkalmazása továbbra is indikált lehet neoadjuváns, adjuváns vagy önálló kezelési módként, az előző gyógyszercsoportokkal kombinálva vagy önállóan. A kemoterápia alkalmazása során a betegség anatómiai kiterjedtségét, a progresszió fokát, az ösztrogén receptor és humán epidermális növekedési faktor receptor 2 (HER2) státuszt, illetve beteg állapotát (esetleges komorbiditást, általános egészségi állapotot) figyelembe kell venni. A korábbi kemoterápiás kezelés során észlelt választ, illetve a korábbi kezelések során előforduló mellékhatásokat szintén figyelembe kell venni [35]. A kemoterápia alkalmazása során figyelembe kell venni, hogy: 1. A kezelés túlélésbeli és tumor válaszbeli előnyének egyensúlyban kell lennie az életminőséggel, és a tolerálhatósággal. 2. A kemoterápia lehet monoterápia és kombinált terápia. Jelentős túlélési előny nélkül a monoterápia választandó, ugyanis ebben az esetben a toxicitás kisebb mértékű, ami jobb életminőséggel jár. A kombinációs kezelés elsővonalbeli kezelésként akkor választandó, ha gyors progressziót mutat a betegség, ugyanis nagyobb az objektív válaszadás valószínűsége [35]. Bár nincs világosan meghatározott optimális alkalmazási mód, általában elmondható, hogy a különösen agresszív, tünetekkel járó betegség esetén lehet magasabb válaszadási arányra számítani kemoterápia hatására. A válaszadási arány 8

doxorubicin esetében magasabb, ha elsőként alkalmazzuk áttétes emlőrák esetén. Ebben az esetben 41% a válaszadási arány, paklitaxel után alkalmazva 30%. [36, 37]. Az antraciklin/taxán kombinációknak (doxorubicin + paklitaxel és doxorubicin + docetaxel) magasabb a teljes válaszadási arányuk, és a progressziómentes túlélés aránya is magasabb összehasonlítva a taxánokat nem tartalmazó antraciklin kombinációkkal, ugyanakkor a toxicitásuk is nagyobb [38]. A teljes túlélést a kezelések sorrendje nem befolyásolja szignifikánsan. Adjuváns kemoterápia Az adjuváns szisztémás terápiát eredetileg a reziduális mikrometasztázisok eradikálására alkalmazták a sebészi ellátást követően, azért, hogy a daganat kiújulását megakadályozzák és a túlélést növeljék. A korai emlőrák esetén a daganat vagy az emlőre korlátozódik vagy nyirokcsomó pozitivitás esetén minden érintett nyirokcsomó eltávolítható. Csak ezekben az esetekben alkalmazható adjuváns kemoterápia. Adjuváns kezelés nélkül a nyirokcsomó negatív esetek 10-30%-ában, a nyirokcsomó pozitív betegek 35-90%-ában sebészi kezelést követően relapszus következik be az okkult mikrometasztázisok miatt [39]. Randomizált klinikai vizsgálatok megerősítették az adjuváns kezelés túlélést meghosszabbító hatását. Kezeléstől függően a halálozás éves kockázatcsökkenése 8 és 28% között van. Ezek az előnyök a szűrőprogramokkal karöltve járultak hozzá az emlőrák mortalitásának 1975 és 2000 között bekövetkezett csökkenéséhez [40]. Az 1960-as évek végén végeztek először klinikai vizsgálatokat adjuváns terápiával nyirokcsomó pozitív betegek bevonásával [41]. Többféle kemoterápiás kezelési sémát is kipróbáltak [42]. Az eredmények igazolták az adjuváns kemoterápia sikerességét [43, 44]. A ciklofoszfamidot, metotrexátot és 5-fluorouracilt (CMF) tartalmazó kezelési séma hatékonynak mutatkozott nyirokcsomó pozitív betegek kezelése során [45]. CMF-hez hasonló kezelési sémák képesek voltak a kiújulás és a halálozás esélyét 24%-kal, illetve 14%-kal csökkenteni [41, 46]. Antraciklint tartalmazó kombinációkat az 1970-es évek végétől vizsgálták adjuváns kezelésként. A FAC (5-fluorouracil, doxorubicin, ciklofoszfamid), FEC (5- fluorouracil, epirubicin, ciklofoszfamid) és AC (doxorubicin, ciklofoszfamid) kezelési 9

sémák a kiújulás kockázatát 11,2%-kal, a halálozás kockázatát 16%-kal csökkentették CMF kezelési sémához viszonyítva [47]. Az antraciklint tartalmazó kezelési sémákat a CMF-fel közvetlenül is összehasonlították. Négy ciklus AC betegségmentes túlélés és teljes túlélés tekintetében ekvivalens 6 ciklus CMF-fel [48]. Több randomizált vizsgálat és metaanalízis is megerősítette, hogy 6 ciklus antraciklint tartalmazó kombináció (FAC, FEC, ciklofoszfamid+ doxorubicin + 5-fluorouracil és ciklofoszfamid + epirubicin + 5-fluorouracil (CEF)) hatékonyabb, mint 6 ciklus CMF f[46, 47, 49]. Kimutatták, hogy 6 ciklus FEC hatékonyabb, mint 3 ciklus [50]. Ezen adatok alapján alakult ki az 1990-es évekre az adjuváns kezelés tekintetében konszenzus, ami szerint a 6 ciklusból álló, antraciklint tartalmazó hármas kombináció az ideális kezelés a nyirokcsomó pozitív emlőrákos betegek számára. A taxánokat az 1990-es évek óta használják emlőrákos betegek kezelésében. A taxánok hatásosságát vizsgáló egyik klinikai metaanalízisben [51] kilenc vizsgálat eredményét összegezték. A taxánok az addigi standard kemoterápiával szemben szignifikánsan jobbnak bizonyultak betegségmentes túlélés tekintetében a teljes populációban (relatív kockázat=0,86, p< 0,00001), és a nyirokcsomó pozitív populációban (relatív kockázat=0,84, p< 0,0001), illetve teljes túlélés tekintetében mindkét populációban (relatív kockázat=0,87, p< 0,0001 és relatív kockázat=0,84; p< 0,0001). Egy másik metaanalízis során 12 vizsgálat eredményeit értékelték ki, az esetszám meghaladta a 18000-et, az utánkövetés medián értéke 60,4 hónap volt. A kockázati arány 0,81 (p<0,00001) volt a betegségmentes túlélés és a teljes túlélés tekintetében. Az eddigi legnagyobb metaanalízis 22903 beteg adatait összegezte, melyek 13 különböző vizsgálatból származnak [52]. A teljes túlélés tekintetében a kockázati arány 0,83 (p<0,00001) volt. A kockázatcsökkenést nem befolyásolta a taxán típusa (paklitaxel esetén a kockázati arány 0,83 volt, p<0,0004, docetaxel esetén a kockázati arány 0,87 volt, p<0,003), az ösztrogén receptor státusz (ösztrogén receptor pozitív csoportban a kockázati arány 0,83 volt, p<0,00001, ösztrogén receptor negatív esetben a kockázati arány 0,79 volt, p<0,0001), az axilláris nyirokcsomó áttétek száma (1-3 metasztázis esetén a kockázati arány 0,71 volt, p<0,0001, négynél több metasztázis esetén a kockázati arány 0,75 volt, p<0,0001). A taxán kezelés az 5 éves betegségmentes túlélést 5%-kal, a teljes túlélést 3%-kal növelte meg. Ezen eredmények alapján a taxánok az adjuváns kezelés arany standardjává váltak [41]. 10

Neoadjuváns kemoterápia A neoadjuváns szisztémás kemoterápia a sebészi kezelés előtt végzett kezelés, amelyet korai emlőrák inoperábilis eseteiben vezettek be, azért, hogy a daganat operálhatóvá váljon [53]. Azonban egyre nagyobb mértékben használják operálható emlőrákos betegek esetén is. A neoadjuváns kezelés lehetővé teszi az emlőmegtartó műtétek nagyobb arányát, és a klinikai válasz in vivo monitorozását. A kezelést követően a tumor méretváltozása összefüggött a betegség kimenetével, így prognosztikus markerként is használható. A patológiai komplett remisszió, a betegségmentes túlélés, és a teljes túlélés közötti összefüggést több klinikai vizsgálat is igazolta. Az összefüggés független volt a tumor altípustól, és a betegség kezdeti stádiumától [54, 55]. Emiatt a patológiailag teljes remissziót a hosszú távú prognózis megbízható markerének tekintik, és a neoadjuváns vizsgálatok végpontjaként használják. A túlélési mutatók, adjuváns és neoadjuváns kezelés esetén megegyeznek [55]. A betegek 70-90%-ánál figyelhető meg klinikai válasz, amely a kezelési sémától és a kezelési ciklusok számától függ [56]. Metasztatikus emlőrák kemoterápiás kezelése Az áttétes emlőrák általában gyógyíthatatlan, azonban rendszerint jól reagál kemoterápiára, így alkalmazása meghosszabbítja a túlélést, és daganat okozta tünetek esetén palliatív terápiaként jön szóba alkalmazása. Az antraciklinek hatékony szerek kemoterápiában még nem részesült betegek esetén, illetve ha az adjuváns kezelés keretében több mint 12 hónapja történt a kezelés. A válaszadási arány 30-40% metasztatikus emlőrák esetében [37, 57]. Áttétes emlőrák kezelése esetén mellékhatásai gátolják az alkalmazását. Harminc vizsgálat metaanalízise kimutatta, hogy az antraciklint tartalmazó kezelési sémák válaszadási aránya jobb a többihez viszonyítva, azonban nem társult jobb túlélés az antraciklin alapú kezelésekhez. A gyomor-bélrendszeri, a kardiális mellékhatások, illetve az alopécia gyakoribbnak bizonyult [58]. A vizsgálatok azonban heterogének voltak a megelőző kezelés és a betegcsoportok tekintetében. Egy másik vizsgálat kimutatta, hogy az antraciklin alapú kezelések meghosszabbították a teljes túlélést [59]. 11

Az 1990-es években végzett vizsgálatok derítették fel, hogy a paklitaxel jelentős hatékonysággal bír áttétes emlőrákban, az objektív válaszadási arány 50% volt [60]. Azok a betegek, akik az adjuváns kezelés részeként antraciklin kezelést kaptak, illetve akik esetében progresszió alakult ki metasztatikus emlőrák esetén, antraciklin kezelés mellett taxán kezelést kaptak. Több randomizált kontrollált vizsgálat támasztja alá a taxán kezelés létjogosultságát. Naboltz és munkatársai a docetaxel monoterápiát hasonlították össze mytomicint és vinblasztint magába foglaló kombinált terápiával. A teljes túlélés a docetaxel kezelés esetén szignifikánsan jobbnak bizonyult (11,4 vs 8,7 hónap, p=0,0097). A válaszadási arány (30 és 12%) és a progresszióig eltelt idő (4,4 és 2,5 hónap) is szignifikánsan jobb volt a docetaxellel kezelt csoportban. Egy másik vizsgálatban docetaxel kezelést hasonlítottak össze metotrexát, 5-fluorouracil kombinált terápiával. A válaszadási arány 42% volt a docetaxellel kezelt csoportban és 21% a kombinált kezelés esetén. A progresszióig eltelt idő 6,3 hónap és 3 hónap volt. Nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a teljes túlélésben [61]. Több klinikai vizsgálat is összehasonlította az antraciklin kezelésben még nem részesült betegek esetén a taxán kezelés hatékonyságát az antraciklin kezelés hatékonyságával. Chan és munkatársai 326 beteg bevonásával hasonlították össze a docetaxel kezelést a doxorubicin kezeléssel [57]. Az objektív válaszadási arány 48% volt a docetaxel karon és 33% a doxorubicin karon. A progresszióig eltelt idő 26 hét és 21 hét volt a docetaxel kar javára, azonban ez a különbség nem volt szignifikáns. Egy másik vizsgálatban paklitaxel kezelés kevésbé bizonyult hatékonynak doxorubicin kezeléssel szemben [37]. A válaszadási arány 25% és 41% (P=0,003), a progressziómentes túlélés 3,9 és 7,5 hónap volt a doxorubicin kar javára. Ezek mellett a teljes túlélés 15,6 és 18,3 hónap volt, ez a különbség nem volt szignifikáns. Protokollok Az emlőrák szisztémás kezelésében számos kezelési sémát alkalmaznak, ezeket vagy önállóan elsődlegesen (például tripla negatív emlőrák távoli áttéttel) vagy egyéb kezelési módokkal kombinálva alkalmazzák. Az 1. táblázat a protokollok legfontosabb tulajdonságait foglalja össze. 12

1. táblázat: Az táblázat a jelenleg emlőrákban használt kezelési sémákat, illetve főbb tulajdonságaikat összegzi. Forrás: NCCN emlőrákra vonatkozó útmutatója (verzió: 2.2011, http://www.nccn.org/). Kezelési séma Gyógyszerek Trasztuzumab Neoadjuváns Preferált és adjuváns /egyéb TAC docetaxel, doxorubicin, ciklofoszfamid - Adjuváns Preferált AC (nagy doxorubicin, dózisú) ciklofoszfamid - Adjuváns Preferált AC+T doxorubicin, ciklofoszfamid, paklitaxel - Adjuváns Preferált TC docetaxel, ciklofoszfamid - Adjuváns Preferált AC doxorubicin, ciklofoszfamid - Adjuváns Preferált FAC/CAF fluorouracil, doxorubicin, ciklofoszfamid - Adjuváns Egyéb FEC/CEF ciklofoszfamid, epirubicin, fluorouracil - Adjuváns Egyéb CMF ciklofoszfamid, metotrexát, fluorouracil - Adjuváns Egyéb AC+T doxorubicin, ciklofoszfamid, docetaxel - Adjuváns Egyéb EC epirubicin, ciklofoszfamid - Adjuváns Egyéb A+T+C doxorubicin, paklitaxel, ciklofoszfamid - Adjuváns Egyéb FEC+T fluorouracil, epirubicin, ciklofoszfamid, docetaxel - Adjuváns Egyéb FEC+T fluorouracil, epirubicin, ciklofoszfamid, paklitaxel - Adjuváns Egyéb 13

Kezelési séma Gyógyszerek Doxorubicin, AC+T+ ciklofpszfamid, trastuzumab paklitaxel, trasztuzumab docetaxel, karboplatin, TCH trasztuzumab T+ docetaxel, trasztuzumab, trasztuzumab fluorouracil, epirubicin, +FEC ciklofoszfamid doxorubicin, AC+T+ ciklofoszfamid, trastuzumab docetaxelm trasztuzumab T+ paklitaxel+ trasztuzumab trasztuzumab után ciklifoszfamid, után epirubicin, 5-fluorouracil, CEF+ trasztuzumab trasztuzumab Trasztuzumab Neoadjuváns Preferált és adjuváns /egyéb + Adjuváns Preferált + Adjuváns Preferált + Adjuváns Egyéb + Adjuváns Egyéb + Neoadjuváns Preferált 1.1.3 Alkalmazott gyógyszerek Doxorubicin A doxorubicin egy antraciklin szerkezetű antibiotikum, melyet számos rosszindulatú daganat kezelésére használnak. Központi szerepet játszik az emlőrák [62], a húgyhólyagrák [63], a gyomorrák [64], a tüdőrák [65-67], a petefészekrák [68], a pajzsmirigyrák [69], a lágyrész szarkóma [70], a myeloma multiplex [71], a leukémiák és a limfómák [72, 73] kezelésében. A leggyakrbban használt doxorubicint tartalmazó kezelési sémákat a 2. táblázat foglalja össze. 14

2. táblázat: A leggyakoribb doxorubicint tartalmazó kezelési sémák Kezelési séma Gyógyszerek AC TAC ABVD BEACOPP CHOP FAC doxorubicin, ciklofoszfamid docetaxel, doxorubicin, ciklofoszfamid doxorubicin, bleomicin, vinblasztin, dakarbazin blelomicin, etopozid, doxorubicin, ciklofoszfamid, prokarbazin, prednizolon ciklofoszfamid, doxorubicin, vinblasztin, prednizolon 5-fluorouracil, doxorubicin, ciklofoszfamid Daganatellenes hatását több mechanizmus biztosítja. A DNS-sel való interkalációja az elsődleges hatásmechanizmus, a DNS-hez kötődött doxorubicin kapcsolódik a topoizomeráz II enzimhez, aminek hatására az enzim nem képes a kettős DNS törések egyesítésére [74]. Ezen hatások mellet a doxorubicin reaktív oxigéngyökök keletkezéséhez vezethet, ami szintén hozzájárul citotoxikus hatásához [75]. A reaktív oxigéngyökök a DNS közvetlen károsításával, illetve lipid peroxidációval képesek károsítani a sejteket [76]. Antioxidáns enzimek (kataláz, glutation-peroxidáz, szuperoxid-dizmutáz), illetve antioxidáns anyagok (glutation, vitaminok) képesek ártalmatlanítani a reaktív oxigén gyököket, mielőtt sejtkárosító hatásukat kifejthetnék. A reaktív gyökök daganatellenes hatását a keletkezett reaktív gyökök mennyisége és az antioxidáns védelem határozza meg. A sejtkárosodás hatására a p53 fehérje indukálódik, a sejtosztódás leáll, apoptózis következhet be [77, 78]. Gyakoribb mellékhatásai közé tartozik a kardiotoxicitás [79], csontvelő szuppresszió [80] és a reverzibilis hajhullás [81]. Paklitaxel A taxánok 1992-ben történő bevezetése óta széles körben elterjedtek, a kemoterápiás szerek között jelenleg az egyik leghatékonyabb gyógyszercsoportot alkotják [82]. Emlőrák, prosztatarák, petefészekrák, nem kissejtes tüdőrák, Kaposi szarkóma és ismeretlen eredetű primer daganat esetén használják a taxánokat, melyek 15

gyakran egyéb daganatellenes gyógyszerekre rezisztens daganatok esetén is hatékonyak [83-91]. A mikrotubulusok számos sejtfunkció ellátásában vesznek részt, mint például a sejt mozgásában, sejtalak meghatározásában, mitózisban és a sejten belüli transzportban. A paklitaxel a mikrotubulusok egyik alkotóeleméhez, a β-tubulinhoz kötődik reverzibilisen, és elősegíti a mikrotubulus további polimerizációját [92-94]. A paklitaxel a β-tubulin T konformációjához képes kötődni, melynek hatására a kapcsolat a szomszédos α-tubulinnal stabilizálódik [95-97]. A mikrotubulusok GTP kötődés hatására képesek polimerizálódni, míg a hidrolízis révén kialakult GDP-tubulin instabil, a mikrotubulus depolimerizációjához vezet. Ha paklitaxel kötődik a β-tubulinhoz a GDP-t kötő tubulinok közti kapcsolat stabil marad, a depolimerizáció nem megy végbe, ugyanakkor GTP hiányában is végbe tud menni polimerizáció [98, 99], melynek hatására a sejtciklus továbbhaladása gátolt és apoptózis következik be [100, 101]. Multidrog rezisztencia Régóta ismert a daganatoknak azon képessége, hogy egyidejűleg több gyógyszerrel szemben rezisztensekké válhatnak, ami a kemoterápiás kezelés hatékonyságát nagymértékben csökkenti. A daganatok ezen képessége multidrog rezisztencia (MDR) néven ismert. A multidrog rezisztencia létrejöttében több mechanizmus is szerepet játszik: oka lehet a gyógyszer tumorhoz történő csökkent szállítása, a rossz felszívódás, a megnövekedett metabolizmus vagy a megnövekedett kiválasztás. A tumor rossz érellátása is csökkent terápiás koncentráció elérését eredményezi. A csökkent biológiai hozzáférhetőség mellett a tumor genetikai és epigenetikai változásai, az extracelluláris mátrix és a tumor geometria is fontos tényezőt jelenthetnek a MDR kialakulásában. A megnövekedett kiáramlás, a lecsökkent beáramlás, a DNS hibajavítás aktiválódása, a méregtelenítő enzimek aktiválódása és a blokkolt apoptózis szintén MDR kialakulását eredményezheti. Egyes betegekben ezen mechanizmusok közül egyidejűleg több is jelen lehet, egymást kölcsönösen erősítve és keresztrezisztenciát eredményezve [102]. A hidrofób szerekkel szemben efflux mechanizmussal létrejövő MDR-t nevezik klasszikus MDR-nek, amely széles szubsztrátspecificitású ATP-függő pumpák működése révén valósul meg. A legtöbb pumpa a 7 alcsaládot magába foglaló ABC 16

transzporterek közé tartozik, melyek génjei közül eddig 48-at azonosítottak [103]. A legtöbbet vizsgált transzporterek a Pgp, az MRP1, és a BCRP. A többi transzporter MDR-ban játszott szerepe ellenére kevéssé jellemzett. A vinka alkaloidok (vinblastin, vincristin), az antraciclinek (doxorubicin, daunorubicin), az actinomycin-d, a paklitaxel egyaránt szubsztrátjai lehetnek az ABC transzportereknek [104]. Az ABC transzporterek széles szubsztrátspecificitással jellemezhetők. A molekula megköti a szállítandó neutrális vagy pozitívan töltött molekulát, és ATP hidrolízisből származó energia terhére kipumpálja az extracelluláris térbe [105]. A multidrog rezisztencia protein 1 (MRP1) semleges, anionos, hidrofób anyagokat, konjugátumokat szállít [106]. A emlőrák rezisztencia protein (breast cancer resistance protein) mitoxanthron rezisztenciát okozhat. A transzporter génjének létezik olyan pontmutációja, amely segítségével szubsztrátspecificitása megnő. Az ABCB11 élettani működése során egyes epekomponenseket szállít. A paklitaxel szintén szubsztrátja, alacsony mértékű rezisztenciát képes létrehozni paklitaxellel szemben [107]. Az MDR3 fiziológiás körülmények között foszfolipideket szállít az epébe, azonban a paklitaxelt és a vinblastint is szubsztrátja [107, 108]. Az ABCA2 egyes rezisztens tumorokban estramustin rezisztenciát okoz [109]. Az LRP (lung resistance protein) nem az ABC transzporter család tagja, de az ABC transzporterekhez hasonló stratégiával okoz rezisztenciát [110]. ABC transzporterek humán tumorokban A humán tumorokban az ABC transzporter család egyes tagjainak expressziónövekedése a rezisztencia egyik fontos tényezője. Megnövekedett Pgp expressziót számos daganattípus esetén leírtak, például colon, vese, mellékvese és máj daganatokban [111]. A Pgp expresszió és a klinikai kimenetel között azonban nem sikerült összefüggést kimutatni. A tüdő daganataiban a MDR1 expresszió növekedését figyelték meg, míg szarkómák esetén a Pgp expresszió korrelál a túléléssel [112, 113]. Leukémia esetén találták a legszorosabb korrelációt a Pgp expresszió és a klinikai kimenetel között. Daunorubicin és AraC kezelés esetén a Pgp megnövekedett expressziója összefüggött a rosszabb prognózissal [114]. Emlőrákban szenvedő betegeknél a Pgp expresszió növekedése valószínűsítheti a kezelés hatástalanságát. 17

Ugyancsak összefüggés figyelhető meg a MRP1 expresszió és a visszaesésmentes túlélés között is [115]. Egyéb szolid tumorokban nehéz korrelációt találni a klinikai kimenetel és egyes MDR-ben szerepet játszó ABC transzporterek expressziója között, ami a transzporterek lokalizációjának nagyfokú variabilitására vezethető vissza [102]. A transzportmechanizmusokon kívül számos egyéb rezisztencia-mechanizmus is ismert. A csökkent felvétellel kialakuló rezisztencia a vízoldékony vegyületekre jellemző, melyek vagy transzporter segítségével vagy endocitózis útján jutnak be a sejtbe, ilyen mechanizmussal kialakuló rezisztenciát metotrexát, 5-fluorouracil, 8- azaguanin, ciszplatin esetében írtak le [116, 117]. A méregtelenítő enzimek koordinált aktiválódása is okozhat MDR-t. A DNS támadásponttal rendelkező gyógyszerek elleni rezisztenciában a DNS javítómechanizmusok aktiválódása meghatározó lehet. Ugyancsak meghatározó lehet a CYP450 enzimek aktiválódása, ugyanis egyes gyógyszerek lebontásában fontos szerepet játszanak. Megfigyelték egyes tumorokban a Pgp és a CYP450 A3 koordinált indukcióját is, ami támogatja azt az elképzelést, hogy a MDR egyszerre több párhuzamos mechanizmus segítségével alakul ki [118]. A MDR-hoz kapcsolódó jelátvitel vizsgálatakor több ismeretlen ligandú (orphan) magi jelfogót azonosítottak, például az SXR-t melynek szerepe lehet a MDR kialakulásában, ezért a hozzá tartozó jelátviteli elemek felderítése teljesebbé teheti a MDR-ról eddig kialakult képet. Egyes kemoterápiás szerek hatásukat a programozott sejthalál aktiválása révén érik el, ha az apoptotikus utak nem működnek megfelelően, akkor az adott szertől terápiás haszon nem vagy csökkent mértékben várható. Hibásak lehetnek az apoptotikus utak, ha a sejt ceramid szintje megváltozik, ha a sejtciklus szabályozásában szereplő fehérjék nem működnek megfelelően (pl. P53) [119, 120]. 1.2 Biomarkerek 1.2.1 Prognosztikai és prediktív markerek A biomarkerek jellemző biológiai ismertetőjelek, melyeket objektíven meg lehet határozni, és valamilyen fiziológiai vagy patológiai folyamatra utalnak. A biomarkereket diagnosztikus, prediktív és prognosztikus alcsoportokra tudjuk osztani. 18

Daganatos megbetegedések esetén számos diagnosztikus, prognosztikai és prediktív biomarker van használatban a klinikai gyakorlatban. A prognoszikus biomarkerek a daganatos betegség kimenetelét, míg a prediktív biomarkerek egy adott kezelésre adott választ hivatottak előre jelezni. Az utóbbiak segítségével személyre szabott kezelés valósítható meg [121]. 1.2.2 Biomarkerek emlőrákban Monogénes markerek Jelenleg a klinikai és patológiai gyakorlatban három egygénes prediktív biomarkert használnak: az ösztrogén receptort, a HER2-t és a progeszteron receptort [122]. A magi ösztrogén és a progeszteron receptor jelenléte és mennyisége alapján az endokrin kezelés hatékonyságát lehet előre jelezni. A receptor státusz meghatározását a gyakorlatban immunhisztokémiai módszerrel végzik, melyet paraffinba ágyazott blokkokból készítenek. Az ösztrogén és progeszteron receptor pozitív esetek 75%-ában lehet számítani a kezelésre adott válasszal, míg az ösztrogén receptor negatív, progeszteron receptor pozitív, illetve az ösztrogén receptor pozitív, progeszteron receptor negatív betegpopulációban ettől az értéktől szerényebb terápiás válasz várható, míg a receptor negatív daganatok esetében a hormonterápia hatástalan [122, 123]. A trasztuzumab egy monoklonális antitest, amely a humán epidermális növekedési faktor receptor 2-höz kötődik. A lapatinib egy kis molekulasúlyú tirozin kináz gátló, ami a HER2 és az EGFR tirozin kináz doménjét gátolja. Emlőrák esetén a HER2 emelkedett expresszója, vagy a gén sokszorózódása esetén használják a fenti két gyógyszert, így a HER2 státusz a trasztuzumab és lapatinib kezelés prediktív biomarkerének tekinthető [124]. A HER2 felülexpresszió és/vagy amplifikáció a daganatok körülbelül 25-30 %-ában következik be. A 3+ eredmény egyértelműen pozitívnak számít, míg a 2+ eredmény esetén fluoreszcens in situ hibridizáció végzendő az esetleges amplifikáció kimutatásának céljából. A prediktív biomarker használatával és a két célzott terápiás gyógyszer alkalmazásával, a HER2 pozitív emlőrákok 19

kedvezőtlen prognózisán szignifikánsan javítani lehetett [125]. A HER2 meghatározása nem csak a HER2 elleni kezelés hatékonyságát jelezheti előre. Genari és munkatársai demonstrálták, hogy a HER2 amplifikált és/vagy felülexpresszált daganatokban az antraciklint tartalmazó kemoterápiás protokollok szignifikánsan jobbnak bizonyultak betegségmentes és teljes túlélés tekintetében. A HER2 negatív betegpopulációban nem volt szignifikáns különbség megfigyelhető az antraciklint tartalmazó és antraciklint nem tartalmazó kezelési sémák között. Ezek alapján kijelenthető, hogy a HER2 státusz nem csak a HER2 elleni kezelések prediktív biomarkere, hanem az antraciklin kezelésé is [126]. A Ki-67 egy magi fehérje, melyet proliferációs markerként használnak. Feltehetőleg fontos szerepet tölt be a sejtciklus szabályozásában, ugyanis neutralizáló antitesttel történő blokkolása, illetve defoszforilációjának gátlása a sejtciklusból történő kilépéshez vezet [127, 128]. A sejtciklus G0 fázisában nem mutatható ki, azonban a G1, S, G2 és M fázisban megjelenik, ami miatt ideális proliferációs biomarkernek tekinthető [129]. Ugyanakkor mások kiemelik, hogy G1 és korai S fázisban az expresszió minimális lehet, ami a kimutathatóságot megnehezítheti, ezzel csökkentve a Ki-67 marker hatékonyságát [130-132]. Prognosztikus jelentősége abban van, hogy képes a távoli áttétmentes túlélés előrejelzésére is több daganattípus esetén [122, 133-135]. Emlőrák esetén gyakran kiegészítő markerként használják [136]. A P-glikoprotein egy széles szubsztrátspecificitással jellemezhető ABC transzporter (részletes leírás a kemorezisztencia mechanizmusai részben található). Számos vizsgálatot végeztek, kimutatták jelentőségét mind a doxorubicin, mind a paklitaxel kezelés hatékonyságának előrejelzésében. Metchetner és munkatársai 359 emlőrákban szenvedő betegből származó mintákon demonstrálták, hogy a P- glikoprotein expresszió a kezeletlen emlőrákos betegek 11%-ában volt emelkedett, míg a kemoterápiában részesülő csoportban 30%-nak bizonyult ez az arány. A Pgp expressziót nem mutató tumorokhoz képest szignifikáns mértékű rezisztencia mutatható ki a Pgp-t kifejező tumorokban, ami a megelőző kezeléstől független [137]. Penson és munkatársai hasonló eredményeket publikáltak petefészekrák esetén, ahol a Pgp kifejeződés fordított korrelációt mutatott a túléléssel a paklitaxellel kezelt betegeknél [138]. Paklitaxellel kezelt nem kissejtes tüdőrák esetén a kezelésre reagáló betegek 100%-a esetén Pgp expresszó nem volt kimutatható, ugyanakkor a kezelésre nem 20

reagáló esetek 68%-ában volt megfigyelhető emelkedett expresszió [139]. Más vizsgálatok vagy nem találtak Pgp expressziót emlőrák esetében, illetve a korábbiakkal ellentétben nem találtak összefüggést a fehérje kifejeződése és a teljes túlélés között ovárium daganatok esetén [140, 141]. Ezek az ellentmondó adatok miatt a Pgp, mint prediktív biomarker nem került be a klinikai gyakorlatban is használt biomarkerek körébe. További vizsgálatok tisztázhatják a Pgp prediktív hatékonyságát doxorubicin és paklitaxel kezelés esetén. A topoizomeráz II a DNS mindkét szálát elhasítja, ennek következtében a DNS képes a feltekeredett állapotát megváltoztatni, így transzkripcionálisan és replikáció tekintetében aktívvá tud válni. A doxorubicin-dns komplexhez kötődve nem képes a DNS lánc egyesítésére. A lánctörések hatására apoptózis indukálódik. Preklinikai vizsgálatok során kimutatták, hogy a topoizomeráz II expressziója és aktivitása jelentősen befolyásolja a doxorubicin hatékonyságát, és emiatt potenciális prediktív biomarkernek tekinthető [82, 142-148]. A proteaszóma a sérült illetve feleslegessé vált fehérjék lebontását végző multikatalitikus proteináz komplex [149]. A PSMB7 gén a proteaszóma β alegységének egyik fehérjéjét kódolja. Vizsgálatunkban a PSMB7-ről bebizonyítottuk, hogy in vitro modellen oki szerepet játszhat a doxorubicin rezisztencia kialakulásában. Eredményeinket 1592 emlőrákban szenvedő beteg adatainak in silico vizsgálata során igazoltuk [150]. Ezen eredmények alapján felvetődött, hogy a PSMB7 alkalmas prediktív biomarker lehet, azonban további klinikai vizsgálatok szükségesek klinikai prognosztikus erejének meghatározására. Számos egyéb egygénes prediktív biomarkert írtak le emlőrák esetén, mint a ciklin D1 [151], a c-myc [152], metalloproteinázok [153-155], az urokináz típusú plazminogén aktivátor és a pazminogén aktivátor inhibitor-1 [156-159], a metallotionein [160] és a tau [161-163]. Ezek a biomarkerek nem kerültek gyakorlati felhasználásra a klinikai vizsgálatok hiánya vagy ellentmondásos eredmények miatt [122]. 21

Multigénes markerek Számos többgénes prediktív és prognosztikus tesztet fejlesztettek ki emlőrákos betegek számára, melyek közül több klinikai használatban van jelenleg is. A tesztek közül a BNL-t (Breast Lymph Node assay) és a MammaPrintet fogadta el a FDA (Food and Drug Administration) az USA-ban. Az Oncotype DX-et ugyan nem fogadta el, azonban szakmai útmutatókban már szerepel. A jóváhagyott multigénes biomarkerek közül a Breast Lymph Node assay a 0,2 milliméternél nagyobb áttét kimutatására alkalmas az őrszemnyirokcsomóból. A kimutatás alapja az emlőspecifikus mammaglobin mrns expressziójának, illetve az epiteliális markerként ismert citokeratin-19 meghatározása [164, 165]. A MammaPrint a nyirokcsomó negatív betegek esetén használható, a teszt a betegek prognózisát 70 gén mrns expressziójának meghatározásával képes megbecsülni [166-172]. A fenti két teszt esetén az ösztrogén receptor státusztól függetlenül használható [122]. Az Oncotype DX nyirokcsomó-negatív, ösztrogén receptor pozitív emlőrák esetén jelzi előre a távoli kiújulás esélyét, illetve segít annak eldöntésében, hogy szükséges-e az adott betegnél a kemoterápiás kezelés. A teszt 21 gén (16 tumorasszociált és 5 háztartási) mrns expresszióját határozza meg, melyek segítségével a kiújulás valószínűségét jellemző recurrence score-t számol, mely korrelál a kemoterápia iránti érzékenységgel, a 10 éven belüli kiújulás esélyével, illetve a mortalitással. Számos korábbi, illetve jelenlegi vizsgálat hivatott a teszt független validálására [173-176]. A 16 gén között megtalálható az ösztrogén receptor, a progeszteron receptor, a HER2 a Ki-67, melyek meghatározása ugyan más módszerrel, de korábban is használatban voltak. Ezeknek nagy a súlyuk a recurrence score számításánál, a többi gén azokban az esetekben befolyásolhatja jelentősen a végeredményt, ha a kulcsgének segítségével nem lehet pontos előrejelzést adni [122]. Számos FDA által el nem ismert, kezelési útmutatókban sem szereplő multigénes prediktív és prognosztikus teszt létezik emlőrákos betegek részére. A Theros H/I teszt ösztrogén receptor pozitív, nyirokcsomó-negatív betegek esetén a HOXB13 és az IL17BR génexpresszió aránya alapján jelzi előre a kiújulás esélyét. A betegeket alacsony és magas rizikójú csoportba sorolja kiújulás szempontjából, valamint az endokrin kezelésre adott válaszkészséget meghatározza. A THEROS MGI teszt grade meghatározást végez 5 gén expressziója alapján, melynek prediktív értékét számos 22

vizsgálat igazolta [177-183]. A MapQuant DX 97 gén mrns expressziójának meghatározásával a primer ösztrogén receptor pozitív, nyirokcsomó-negatív, grade II tumorokat osztja alacsony és magas rizikójú csoportokba [184, 185]. Számos további multigénes tesztet fejlesztenek, mint az ARUP Breast Bioclassifier [172, 175, 186], a Metastatic score [187-189], az Invasive Gene Signature [190-193], a Wound Response Indicator [194-196], a Mammotrat [197, 198], az exagenbc [199]. Ezek alapján a jövőben feltételezhető, hogy további multigénes tesztek kerülnek az ajánlásokba, illetve a klinikai gyakorlatba [122]. 1.3 Modell-rendszerek 1.3.1 Sejkultúrás modellek A sejtvonalak, mint modell rendszerek alkalmazása a daganatos megbetegedések vizsgálatára 1951-ben vált lehetővé, mikor a John Hopkins kórházban Dr. George O. Gey laboratóriumában sikerült először daganatos sejteket hosszú ideig tenyészteni [200]. Ezt követően számos daganattípus esetén rendkívül sok sejtvonalat hoztak létre, ezáltal lehetővé vált a technikailag könnyen kivitelezhető kontrollált vizsgálatok véghezvitele, ami jelentősen elősegítette a daganatok kialakulásának genetikai és epigenetikai hátterének feltárását [201, 202]. Lehetővé vált a daganatellenes kezelések hatékonyságának in vitro meghatározása, az elsődleges [203] és a szerzett rezisztencia [204] vizsgálata, prognosztikus és prediktív biomarker jelöltek azonosítása [205]. Az extracelluláris mátrix, a strómasejtek, a daganat érellátása, oxigénellátása mind olyan paraméterek, melyek képesek befolyásolni a daganatos sejtek működését, azonban a sejtvonalak in vitro tenyésztése esetén ezek a körülmények nincsenek jelen, vagy nem abban a formában, ahogy in vivo jelen lennének, így a sejtvonalak vizsgálatával nyert eredmények mindig a modell korlátainak figyelembe vételével értelmezhetőek. Számos vizsgálat kimutatta, hogy az extracelluláris mátrix képes befolyásolni a daganatellenes szerek iránti érzékenységet [206-214], ugyanakkor az in vitro modellek nagy része ezt nem veszi figyelembe. A daganat fibroblasztokat, hemopoetikus eredetű sejteket, endotél sejteket tartalmaz, melyek fontos szerepet játszanak számos tumor-biológiai esemény létrejöttében, mint a daganat kialakulása, 23

progressziója, növekedése, és a rezisztencia [215, 216]. Ezeket a tényezőket szintén nem lehet figyelembe venni a sejtvonalak in vitro tenyésztése esetén. Egy adott daganatellenes szer hatékonyságát, illetve az elsődleges és a másodlagos rezisztencia jelenlétét, kialakulását szintén hatékonyan lehet in vitro modellek segítségével vizsgálni. A modell a preklinikai vizsgálatok egyik alappillére lett. Voskoglou-Nomikos és munkatársai bebizonyították, hogy az in vitro és xenograft vizsgálatokat megfelelően végezve az eredmények alkalmasak a fázis II vizsgálatok eredményének előrejelzésére [217]. Győrffy és munkatársai demonstrálták, hogy az in vitro modell alkalmas prediktív biomarkerek azonosítására. Vizsgálatukban 30 sejtvonal IC 50 értékét határozták meg 11 daganatellenes szer esetében. A sejtvonalakat rezisztencia indexük alapján érzékeny és rezisztens csoportra osztották, majd olyan géneket azonosítottak, melyek eltérnek a két csoportban. Az így kapott gének egy részét TaqMan segítségével is igazolták. A leírt genetikai különbségek alkalmasak lehetnek a klinikai gyakorlatban a kezelésre adott reakció előrejelzésére, amennyiben további klinikai vizsgálatok igazolják az in vitro eredményeket [203]. A rezisztencia hátterében rejlő mechanizmusok azonosítása is egy fontos alkalmazási területe a sejtkultúra alapú vizsgálatoknak. Számos vizsgálat igazolta, hogy sejtvonalak segítségével azonosíthatók primer és szerzett rezisztenciához vezető mechanizmusok, és biomarkerek, melyek segítségével a rezisztenciát előre lehet jelezni [218-228]. Az egy sejtvonalból származó több rezisztens sejtvonal modell esetén a többféle rezisztencia-mechanizmus is kialakulhat [229-231], melynek hátterében a daganat heterogenitás játszhat fontos szerepet. A humán daganatok esetében daganaton belüli heterogenitás figyelhető meg génexpresszió, sejtmorfológia, anyagcsere, motilitás, proliferatív, érképző, immunogén és áttétképző képesség tekintetében [232-236]. A daganat növekedésekor a sejtek osztódása során törvényszerűen keletkeznek genetikai hibák, illetve az egyes daganatokban megfigyelhető genetikai instabilitás is hozzájárul a daganatok genetikai heterogenitásához. A heterogén sejtpopuláció a kezelés során szelekción megy keresztül, mely során kiszelektálódnak a rezisztens sejtpopulációk. Mivel több mechanizmussal is létrejöhet a rezisztencia, a különböző rezisztenciamechanizmusokkal jellemezhető sejtpopulációk száma fogja meghatározni a 24

rezisztenciáért felelős eltérések számát az adott daganatban. A daganaton belül eltérő rezisztencia-mechanizmusokkal jellemezhető területek alakulhatnak ki, így egy minta nem feltétlenül reprezentálhatja a heterogén daganat prediktív biomarker és rezisztencia-mechanizmus mintázatát [236]. Kérdésfelvetés Vizsgálataim során arra a kérdésre kerestem választ, hogy egy sejtvonalból több rezisztens sejtvonal létrehozása megfelelőbb modell-e egy daganatellenes szerrel szembeni szerzett rezisztencia modellezésére, mint egy rezisztens és az eredeti sejtvonal összehasonlítása. Eközben ennek a modellnek a segítségével a multidrog rezisztencia jelenségét is vizsgáltam. Kísérleteimmel a következő kérdéseket akartam/szerettem volna megválaszolni: 1 Több, egy sejtvonalból származó rezisztens sejtvonal vizsgálatával lehetséges-e a doxorubicinnal szembeni szerzett rezisztenciában szereplő géneket azonosítani? 2 Több, egy sejtvonalból származó rezisztens sejtvonal vizsgálatával lehetséges-e a paklitaxellel szembeni szerzett rezisztenciában szereplő géneket azonosítani? 3 Több, egy sejtvonalból létrehozott rezisztens sejtvonal esetén a rezisztencia az egyes sejtvonalakban azonos módon alakul ki doxorubicin kezelés hatására? 4 Több, egy sejtvonalból létrehozott rezisztens sejtvonal esetén a rezisztencia az egyes sejtvonalakban azonos módon alakul ki paklitaxel kezelés hatására? 5 Egy kemoterápiás szerrel történő hosszú távú kezelés során kialakul-e multidrog rezisztencia? 25

2 Módszerek 2.1 Sejtvonalak Vizsgálatom során két humán emlőrák sejtvonalat, az MCF-7-et és az MDA-MB-231-et használtam. A sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től szereztem be, tulajdonságaikat a 3. táblázat foglalja össze. 3. táblázat: A vizsgálat során használt sejtvonalak jellemzői MDA-MB-231 MCF-7 Elsődleges daganat emlő emlő Szövettan adenokarcinóma adenokarcinóma Származási hely pleurális effúzió pleurális effúzió Sejttípus epitheliális epitheliális Növekedési jellemző letapadó letapadó Beteg életkora (év) 51 69 Beteg neme nő nő Ösztrogén receptor státusz Negatív Pozitív 2.2 Gyógyszerek Vizsgálataim során két gyógyszert, doxorubicint (EBEWE Pharma, Unterach, Ausztria) és paklitaxelt (Sigma-Aldrich, Steinheim, Németország, katalógusszám: T7402) használtam. A koncentrációsor a klinikai dózis 0,0001-szeresétől az 1000- szereséig terjedt. A klinikai dózist a gyógyszer egyszeri dózisa alapján számoltam, feltételezve, hogy egyenlően oszlik el a szervezetben. Az egyszeres klinikai dózis doxorubicin esetén 0,02 µg/ml, paklitaxel esetén pedig 0,1 µg/ml volt. 2.3 Sejtkultúra A sejtek Leibovitz-15 médiumban (PAA, katalógusszám: E15-821) nőttek, amit foetális borjúszérummal (végső koncentráció: 10%, PAA, katalógusszám: A15-105), transzferrinnel (végső koncentráció: 2,5 mg/l, Sigma-Aldrich, katalógusszám: T8158), 26

fetuinnal (végső koncentráció: 500 mg/l, Sigma-Aldrich katalógusszám: F6131), nátrium-bikarbonáttal (végső koncentráció: 1,1 g/l, PAA, katalógusszám: S11-002), MEM vitaminnal (végső arány: 1%, GIBCO katalógusszám: 11120), Amphotericin B- vel (végső koncentráció: 2,5 mg/l, GIBCO katalógusszám:15070-063), Penicillin- Streptomycin oldattal (penicillin végső koncentrációja: 50 000 U/l, streptomycinnel végső koncentráció: 50 mg/l, Sigma-Aldrich katalógusszám: P0781) egészítettem ki. A sejtek 5% CO 2 -t tartalmazó, 37 C-os hőmérsékletet biztosító inkubátorban nőttek. 2.4 Sejtproliferáció mérése A sejtvitalitást MTT sejtproliferációs próba (Roche, katalógusszám: 11 465 007) segítségével határoztam meg. Lyukanként 2000 sejtet pipettáztam 80 µl végtérfogatban a 96 lyukú lemezre. 24 órával később 20 µl doxorubicint vagy paklitaxelt tartalmazó PBS-t pipettáztam a kezelendő sejteket tartalmazó lyukakba. A gyógyszerek végkoncentrációja a klinikai dózis 0,0001-szeresétől 1000-szereséig terjedt. A klinikai dózis doxorubicin esetén 0,02 µg/ml, paklitaxel esetén 0,1 µg/ml volt. A kontrollnak, illetve a prekontrollnak megfelelő lyukakba 20 µl PBS-t pipettáztam. A prekontroll lyukakhoz azonnal, a kontroll és a kezelt lyukakhoz 72 óra elteltével 10 µl MTT festéket (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólium bromid) adtam, melyet az élő sejtek formazánná alakítanak. 4 órával később 100 µl szolubilizáló oldatot adtam. A keletkező formazán termék mennyiségét 24 órával később Multiscan FC spektrofotométerrel mértem le 595 nm-es (formazán abszorpciós maxumima) és 690 nm-es (háttér) hullámhosszon. Minden koncentráció esetén háromszoros ismétléssel végeztem a méréseket. A további számításokat a három mérés átlagával végeztem. A sejtnövekményt a (kezelt-prekontroll)/(kontroll-prekontroll) képlet alapján számoltam ki. Adott sejtvonal koncentrációértékeihez tartozó értékekre görbét illesztettem, és meghatároztam az IC 50 értéket GraphPad Prism szoftver segítségével. A rezisztens sejtvonalak keresztrezisztenciáját is meghatároztam doxorubicin, paklitaxel, 5-fluorouracil és ciszplatin kezelés esetén is. A fentiekhez azonos módon végeztem az IC 50 érték meghatározását. 5-fluorouracil esetén a klinikai koncentráció (1x es kezelési koncentráció) 64,65 µg/ml ciszplatin esetében 14,3 µg/ml volt. 27