!HU00000287T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 287 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 76183 (22) A bejelentés napja: 200. 0. 31. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 200076183 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 170716 A1 200. 12. 1. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 170716 B1 2008. 08. 20. (1) Int. Cl.: A61K 31/19 (2006.01) A61P 3/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0117891 PCT/US 0/019169 (30) Elsõbbségi adatok: 200402193 P 2004. 0. 30. US (72) Feltalálók: O CONNOR, Owen, A., Scarsdale, NY 1083 (US); SIROTNAK, Francis, Hampton Bays, NY 11946 (US) (73) Jogosult: Sloan-Kettering Institute For Cancer Research, New York, New York 10021 (US) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) T-sejtes limfóma kezelése 10-propargil-10-deaza-aminopterin alkalmazásával (7) Kivonat A találmány tárgya 10¹propargil-10-deaza-aminopterin alkalmazása T¹sejtes limfóma terápiájában. A találmány szerinti alkalmazott 10¹propargil-10-deaza-aminopterin 10¹deaza-aminopterintõl lényegében mentes. HU 00 287 T2 A leírás terjedelme 8 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 00 287 T2 2 A jelen bejelentés igényli a 60/21 93 számú ideiglenes amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva: 2004. május 30.) elsõbbségét. A találmány tárgyköre A bejelentés 10¹propargil-10-deaza-aminopterin alkalmazására vonatkozik, T¹sejtes limfóma terápiájában. A 10¹propargil-10-deaza-aminopterin ( PDX vagy 10¹propargil-10-dAM ) vegyületek nagy családjának tagja, amelyet megvizsgálva egyes esetekben tumorok kezelésére alkalmasnak találtak. Ezt a vegyületet, amely az 1. ábrán bemutatott struktúrával rendelkezik, DeGraw és mtsai. írták le [Synthesis and Antitumor Activity of 10¹Propargyl-10-deaza-aminopterin, J. Medical Chem. 36, 2228 2231 (1993)], és kimutatták, hogy gátolja az egér L1210-sejtvonal növekedését, és kisebb mértékben, a dihidrofolát-reduktáz ( DHFR ) enzim inhibitoraként hat. Ezenfelül, a vegyület antitumor-aktivitására utaló, az E0771 elnevezésû egéremlõtumor-modell alkalmazásával kapott eredményeket is közöltek. Ezek az adatok nem voltak egyértelmûek a felhasznált egerek kis száma (dózisonként 3 egér), a standard eltérésre vonatkozó információ hiánya, amely az adatok megbízhatóságát kvantitálta volna, és azon tény miatt, hogy a legmagasabb alkalmazott dózis valójában toxikus volt az egerekre. Mindazonáltal, feltételezve, hogy az adatok valamennyire prediktív értékûek a drog humán tumorok kezelésében várható hatékonyságára, azokból optimális esetben olyan drogra következtethetünk, amely, azonos szintû toleranciaszintek mellett, a metotrexáthoz hasonló vagy akár kissé elõnyösebb tulajdonságokkal bír. A WO 98/02 163 számú nemzetközi közzétételi iratban azt a meglepõ megfigyelést írják le, hogy sokkal nagyobb tisztaságú PDX-készítmények, amikor humán tumorokkal szembeni hatékonyságukat xenograft modellben tesztelték, messze felülmúlták a metotrexátot ( MTX ), és egy újabb klinikai kandidáns szert is, az edatrexátot ( ETX ). Ezenfelül, a 10¹propargil-10-dAM meglepõ tulajdonságot mutatott, amennyiben képes volt úgy kuratív hatást kifejteni tumorokra, hogy tumornövekedés több héttel a terápia befejezését követõen sem volt igazolható. Ennek megfelelõen, a találmány szerint, 10¹propargil-10-dAM¹t tartalmazó nagy tisztaságú készítmény alkalmazható tumorok, ezen belül szolid tumorok és leukémiák kezelésére. A készítményt humán emlõtumorok és humán tüdõrák terápiájában történõ alkalmazásán keresztül szemléltetik. Újabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a PDX egyaránt alkalmazható önmagában és más terápiás szerekkel együtt kombinációkban. Például, Sirotnak és mtsai. [Clinical Cancer Reserach 6, 370 3712 (2000)] leírják, hogy PDX és probenicid, egy cmoat/mrpszerû plazmamembrán ATPáz inhibitor együttes adagolása nagymértékben fokozza a PDX hatékonyságát in vivo, humán szolid tumorok ellen. PDX és PDX kombinációja platinaalapú kemoterápiás szerekkel hatékonynak bizonyult mezotelioma (a mellhártya rosszindulatú daganata) ellen [Khokar és mtsai.: Clin Cancer Res. 7, 3199 320 (2001)]. 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 Limfómák kifejezésen különbözõ kóros állapotokat értünk, például nem Hodgkin-limfómát (NHL), diffúz nagy B¹sejtes limfómát (DLBCL), follikuláris limfómát (FL), Hodgkin-kórt, Burkitt-limfómát, kután T¹sejtes limfómát, primer központi idegrendszeri limfómát és limfomatózus áttéteket. Az esetek többségében, a limfómát rákos B¹sejtek jelenléte jellemzi. T¹sejtes limfómákban azonban a betegség állapotot rákos T¹limfociták jelenléte jellemzi. A találmány összefoglalása A jelen találmánnyal összhangban, T¹sejtes nem Hodgkin-limfómát kezelnek PDX alkalmazásával. A találmány egy szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi alkalmazás T¹sejtes nem Hodgkin-limfóma kezelésére, amely tartalmazza PDX terápiásan hatékony mennyiségének beadását limfómában szenvedõ betegnek. Elõzetes klinikai eredmények humán egyéneken azt mutatták, hogy ez a kezelés különösen hatékony, még más terápiás szerekkel szemben refrakternek bizonyult limfómák vonatkozásában is. Az ábrák rövid leírása Az 1. ábra PDX és metotrexát struktúráját mutatja. A 2. ábra a technika korábbi állása szerint elõállított, nem tiszta 10¹propargil-10-dAM készítmény HPLC-analízisét mutatja. A 3. ábra a találmány szerinti, nagy tisztaságú 10¹propargil-10-dAM készítmény HPLCanalízisét mutatja. A 4. ábra szintézis menetét mutatja, amely a találmány szerint alkalmas a vegyület elõállítására. A találmány részletes ismertetése A bejelentés tárgyát 10¹propargil-10-deaza-aminopterin alkalmazása képezi T¹sejtes nem Hodgkinlimfóma kezelésére. T¹sejtes nem Hodgkin-limfómák olyan limfómák, amelyekben a beteg T¹sejtjei rákosnak bizonyultak. T¹sejtes limfómák különbözõ állapotokat foglalnak magukban, például, de a korlátozás szándéka nélkül: (a) limfoblasztos limfómákat, amelyekben a malignitás a csecsemõmirigybõl (thymusból) származó primitív limfoid progenitorokban jön létre; (b) érett vagy perifériás T¹sejtes neoplazmák, ezen belül T¹sejtes prolimfocitás leukémia, T¹sejtes granuláris limfocitás leukémia, agresszív NK¹sejtes leukémia, kután T¹sejtes limfóma (Mycosis fungoides/sezary-szindróma), anaplasztikus nagysejtes limfóma, T¹sejt típusos, enteropatia típusú T¹sejtes limfóma, felnõttkori T¹sejtes leukémia/limfóma, például HTLV-1-asszociált és angioimmunoblasztos T¹sejtes limfóma, valamint szubkután pannikulitiszszerû T¹sejtes limfóma; és (c) perifériás T¹sejtes limfómák, amelyek kezdetben nyirokcsomó parakortexét érintik, és soha nem válnak valódi follikuláris mintázatúvá. A találmány egy megvalósítási módja szerint, a készítmény nagy tisztaságú PDX ¹et tartalmaz. A leírás- 2
1 HU 00 287 T2 2 ban és igénypontokban használt értelemben, nagy tisztaságú készítmény más fólsavszármazéktól, közelebbrõl 10¹deaza-aminopterintõl, amely interferálhat a PDX tumorellenes hatásával, lényegében mentes PDX ¹et értünk. A találmány szerinti készítmény tartalmazhat hordozó- vagy vivõanyagokat annak érdekében, hogy a PDX terápiás alkalmazásra megfelelõ egységdózis formában legyen kiszerelve, valamint további nem folát terápiás szereket. PDX szintetizálható a fenti DeGraw közleményben leírt eljárás szerint, vagy az 34 71 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 7. példájában ismertetettek szerint. Az ezzel az eljárással elõállított termék HPLC-analízise jelentõs mennyiségû (körülbelül 4,6%) szennyezõdés jelenlétét mutatta (2. ábra), amelynek retenciós ideje megfelelt a 10¹deaza-aminopterinnek. Amennyiben tehát ezt a szintézis megközelítési módot alkalmazzuk, DeGraw és mtsai. közleményében leírtakon felül további tisztításra van szükség. Ilyen tisztítás végezhetõ további HPLC vagy kristályosítási lépéssel, hogy a 10¹deaza-aminopterint és esetlegesen jelen levõ egyéb fólsavszármazékokat eltávolítsuk. A 3. ábra a találmány szerinti, lényegében 10¹propargil-10dAM-bõl álló nagy tisztaságú készítmény HPLC-analízisét mutatja, amely az 1. példában ismertetett eljárással lett elõállítva. Ebben az esetben, a PDX mennyisége (a HPLC csúcs alatti terület alapján meghatározva) megközelíti a 98%¹ot, és a 10¹deazaaminopterinnek megfelelõ csúcs az adatfeldolgozó szoftverrel nem detektálható, bár egy minimális hullám megfigyelhetõ ezen a területen. PDX¹et alkalmaztak I/II¹es fázisú vizsgálatban, amelybe agresszív limfómában szenvedõ betegeket vontak be, ezen belül három gyógyszerrezisztens T¹sejtes limfómában szenvedõ beteget Az alábbi esetleírás összefoglalókat kaptuk. Mindegyik beteg fólsav (napi 1 mg/m 2, a PDX-kezelés elõtt 1 héttel elkezdve) és B12 (1 mg/m 2 havonta) kiegészítõ kezelésben részesült. 1. beteg Diagnózis: Perifériás T¹sejtes limfóma, IV¹es stádium Demográfiai adatok: 48 éves férfi Korábbi terápia: CHOP 4 ciklus (2002. július 2002. november) refrakter; ICE x 2 ciklus (2002. december) refrakter; Compath (2003. március 2003. június) kevert válasz Kezelést megelõzõ stádiumbeosztás: Kiterjedt betegség, kután betegség A vizsgálatban alkalmazott kezelés: PDX 13 mg/m 2 1 dózis Toxicitás: 3¹as fokú sztomatitisz (szájnyálkahártya-gyulladás); 3¹as fokú neutropenia, szepszis Válasz: Lényegében teljes remisszió PETscan alapján 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 Megjegyzés: 2. beteg Diagnózis: Ez a beteg végül meghalt, miután nyílt bõrsérülésbõl származó, Gram-pozitív baktériumok okozta bakteriémia és szepszis lépett fel nála. Limfoblasztos limfóma, prekurzor T¹sejtes, IV¹es stádium Demográfiai adatok: 6 éves nõ Korábbi terápia: L20 komplex kombinált kemoterápia 2002. májusa óta, két éven át Kezelést megelõzõ stádiumbeosztás: Kiterjedt, generalizált, relapszus A vizsgálatban alkalmazott kezelés: PDX 30 mg/m 2 3 hét, 4 hetente. Eddig 4 ciklus fejezõdött be Toxicitás: Nem volt Válasz: Teljes remisszió PET- és CT¹scan vizsgálatok alapján Megjegyzés: Lényegében metotrexát-rezisztens kórformában szenvedõ beteg, kiterjedt, szinuszból kiinduló betegséggel, akinél egyetlen dózis PDX¹et követõen javulás kezdõdött. 3. beteg Diagnózis: HTLV-asszociált T¹sejtes limfóma Demográfiai adatok: 38 éves férfi Korábbi terápia: EPOCH-infúziós, kombinált kemoterápia, 2003. októberétõl 2004. februárig Kezelést megelõzõ stádiumbeosztás: bal oldali, axilláris betegség A vizsgálatban alkalmazott kezelés: PDX 30 mg/m 2 hetente 3,4 hetente, 2 ciklus Toxicitás: Nem volt Válasz: Teljes remisszió Megjegyzés: Az elsõ ciklus végére a klinikailag nyilvánvaló betegség teljes eltûnése, kitûnõ tolerancia, toxicitás nélkül. 4. beteg Diagnózis: Pannikulitisz-szerû T¹sejtes limfóma Demográfiai adatok: 2 éves férfi Korábbi terápia: Ontak (refrakter), 9/02 11/02; Targretin és IFN¹ 1/03 10/03 (tartós részleges remisszió); CHOP 4/04 6/04; ICE 6/04, CyPen 7/04 8/04, Targretin/MTX 9/04 2/0 A vizsgálatban alkalmazott kezelés: PDX 30 mg/m 2 hetente 4 3
1 HU 00 287 T2 2 Válasz: Klinikailag teljes remisszió PET szerint Toxicitás: Nem volt Megjegyzés: Szubkután elváltozások gyógyulása, számuk túl nagy a megszámláláshoz, nagy fekélyes (ulceratív), granulálódó alapú elváltozások. Eddig, mindössze négy beteg részesült T¹sejtes limfóma miatt PDX-kezelésben, és mind a négy megfelelt a teljes remisszió kritériumainak, még a nagy érzékenységû PET leképezõ eljárások szerint is. Érdekes módon, a 13 mg/m 2 dózissal kezelt beteg csupán egyetlen adagot kapott, és kiválóan válaszolt a terápiára, míg a többiek kisebb, mérsékelt dózisokat kaptak hetente ütemezve. A találmány szerinti alkalmazásra, a PDX¹et elõnyösen gyógyászati készítmény részeként szereljük ki. A közelebbi adagolási forma függ a beadás módjától, de lehet tabletta, kapszula, szájon át adagolható folyadék, és injektálható oldat intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális beadásra. Egy alkalmas adagolás rend szerint, adható 10 mg/m 2 kéthetente. Alacsonyabb szintek alkalmazását indokolhatja a beteg egyéni toleranciája vagy az alkalmazás nagyobb gyakorisága. Például, testfelszínre vonatkoztatva napi 40 120 mg/m 2 nagyságrendbe esõ szintek megfelelõek. Alkalmazható például heti 30 mg/m 2 három hétig, egy hét szünettel, heti 30 mg/m 2 hat hétig, egy hét szünettel, vagy hetente fokozatosan emelkedõ PDX-dózisok, 6 hetes ütemezéssel. Magasabb szintek alkalmazhatók, amennyiben kisebb gyakorisággal történik az adagolás. Általánosságban tehát, 30 27 mg/m 2 nagyságrendbe esõ dózisok alkalmazhatók különbözõ adagolási rendek szerint, például 13 27 mg/m 2 dózis kéthetente, vagy 30 10 mg/m 2 dózis hetente. A megfelelõ dózisok megállapítása a 6 323 20 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetettekhez hasonlóan, a technika állása szerint ismert eljárásokkal történhet. A PDX alkalmazható más citotoxikus és tumorellenes vegyületekkel kombinálva, ilyenek például a következõk: vinkaalkaloidák, például vinbalsztin, navelbin és vindesin; probenicid, nukleotidanalógok, például gemcitabin, ¹fluoro-uracil, és citarabin; alkilálóágensek, például ciklofoszfamid vagy ifoszfamid; ciszplatin vagy karboplatin; leukovorin; taxánok, például paclitaxel vagy docetaxel; anti-cd20 monoklonális ellenanyagok radioizotópokkal vagy azok nélkül, és antibiotikumok, például doxorubicin és mitomicin. PDX kombinációja az említett tumorellenes szerek közül néhánnyal vagy növekedési faktor inhibitorokkal és antiangiogén szerekkel ugyancsak alkalmazható. PDX és más hatóanyagok adagolhatók egyidejûleg vagy alkalmazhatók kombinációban közös kezelési rend részeként, ahol a PDX és egyéb szer(ek) beadására különbözõ idõpontokban kerül sor. Például, a másik szer beadható a PDX beadása elõtt, vagy azt követõen azonnal vagy adott (például 24 órás) idõperiódus után. A bejelentésben használt értelemben tehát, hacsak kifejezetten másképp nem kötjük ki, az adagolás 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 kifejezés általánosságban vonatkozik a hatóanyagok egyidejû adagolására vagy szekvenciális adagolására, bármilyen sorrendben egy párhuzamos kezelési rendben, a drogok beadása közt idõperiódusok kihagyásával vagy anélkül. A PDX¹et elõnyösen fólsavval és B12-vitaminnal kiegészítve alkalmazzák a kezelés mellékhatásainak mérséklésére. Például, a betegek kezelhetõk fólsavval (1 mg/m 2 naponta, egy héttel a PDX-kezelés elõtt elkezdve) és B12-vel (1 mg/m 2 havonta). 1. példa A 4. ábra szintézis vázlatát mutatja, amely alkalmas 10¹propargil-10-dAM találmány szerinti elõállítására. Olajban diszpergált 60% NaH (1,06 g, 26, mmol) és 18 ml szûrve szárított THF elegyét 0 C¹ra hûtöttük. A hideg elegyet homotereftálsav dimetil-észter (,0 g, 24 mmol; lásd 4. ábra, 1 vegyület) oldatával kezeltük száraz THF-ben (7 ml), és az elegyet 1 órán át 0 C¹on kevertük. Az elegyhez propargil-bromidot adtunk (26,4 mmol), és az elegyet további egy órán át 0 C¹on, majd szobahõmérsékleten 16 órán át kevertük. Az így kapott elegyet 2,4 ml 0%¹os ecetsavval kezeltük, majd hozzáöntöttük 240 ml vízhez. Az elegyet éterrel extraháltuk (2 10 ml). Az éteres kivonatokat összevontuk, Na 2 SO 4 fölött szárítottuk, majd narancssárga olajjá koncentráltuk. Szilikagélen (600 ml, 230 400¹as háló) végzett kromatográfia ciklohexán-etoac (8:1) eluálással az ¹propargil-homotereftálsav-dimetilészter terméket (2¹es vegyület) adta fehér, szilárd anyagként (4,66), amely vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) (ciklohexán-etoac, 3:1) homogénnek tûnt. A termék tömegspektroszkópiás vizsgálatának adatai azonban azt mutatták, hogy az a kívánt 2¹es termék és a dipropargilezett vegyület elegye. Az 1¹es kiindulási anyagot nem detektáltuk. HPLC-vizsgálatok azt mutatták, hogy a mono- és dipropargilezett termékek aránya körülbelül három az egyhez. Mivel a dipropargilezett termék, szemben az 1¹es vegyülettel, a reakció következõ lépésében nem képes nem kívánt melléktermék létrehozására, ez az anyag alkalmas volt a 3¹as vegyületté történõ konvertálás céljára. Az 1¹es kiindulási vegyület hiánya a szintézis folytatására alkalmazott termékben nagyon fontos, hogy a következõkben a végtermékhez vezetõ átalakulások során elkerüljük 10¹dAM képzõdését, mivel a 10¹dAM teljes eltávolítása 10¹propargil-1-dAM reakcióelegybõl rendkívül nehéz. Olajban diszpergált 60% NaH (0,36 g, 9 mmol) és 10 ml száraz DMF elegyét állítottuk elõ és hûtöttük le 0 C¹ra. A hideg elegyet cseppenként kezeltük az elsõ reakció termékével (2¹es vegyület, 2,94 g, 12 mmol) 10 ml száraz DMF-ben, majd 0 C¹on 30 percen át kevertük. Miután az elegyet 2 C¹ra hûtöttük, 2,4-diamino-6-(bróm-metil)-pteridin-hidrobromid-0,2-2- propanolt (1,00 g, 2,9 mmol) tartalmazó száraz DMF¹et adtunk cseppenként az elegyhez, a hõmérsékletet közelítõleg 2 C¹on tartva. Hagytuk, hogy a keverés alatt tartott elegy hõmérséklete 2 óra alatt 10 C¹ra emelkedjen. A hõmérsékletet további 2 órán át 10 C¹on tartottuk, majd hagytuk 20 C¹ra emelkedni; 4
1 HU 00 287 T2 2 10 1 20 2 30 3 40 4 a szobahõmérsékleten történõ keverést további 2 órán át folytattuk. A reakcióelegy ph¹ját ezt követõen 7¹re állítottuk, szilárd CO 2 (szárazjég) hozzáadásával. Miután az elegyet az oldószer eltávolítása céljából vákuum alatt koncentráltuk, a maradékot dietil-éterrel kevertük, és az éterben nem oldható anyagot összegyûjtöttük, vízzel mostuk, majd vákuum alatt szárítottuk, hogy 1,49 g nyersterméket kapjunk. Ezt a nyersterméket CHCl3:MeOH (10:1) oldószerben oldottuk, hogy szilikagél oszlopra vihessük. A fentivel azonos oldószerrendszerrel eluálva, 10¹propargil-10-karbo-metoxi-4-dezoxi- 4-amino-10-deazapteroesav-metil-észtert (3¹as vegyület; a pteroesav kifejezés a pteroic acid kifejezés megfelelõje) kaptunk, amely TLC szerint homogénnek bizonyult, a kinyerési hatásfoka 40% (48 mg) volt. A 2¹metoxi-etanolban ( ml) felvett 3¹as vegyület (400 mg, 0,9 mmol) keverés alatt álló oldatát vízzel ( ml), majd 10%¹os nátrium-hidroxid-oldattal (3,9 ml) kezeltük. Az elegyet 4 órán át szobahõmérsékleten kevertük, amely idõ alatt feloldódott. Az oldat ph¹értékét ecetsavval 8¹ra állítottuk, majd erõs vákuum alatt koncentráltuk. Az így kapott maradékot 1 ml vízben oldottuk és ph=,,8 értékig savanyítottuk, ami precipitátum képzõdését eredményezte. A precipitátumot összegyûjtöttük, vízzel mostuk, és vákuum alatt szárítottuk, hogy 340 mg 4¹es vegyületet kapjunk (91%¹os kinyerési hatásfok). HPLC-vizsgálat szerint a termék tisztasága 90% volt. A 4¹es vegyületet (330 mg) dekarboxileztük azáltal, hogy 1 ml DMSO-ban 10 percen át, 11 120 C¹on hõkezeltük. Tíz perc elteltével végzett HPLC-vizsgálat megerõsítette, hogy az átalakulás lényegében teljes volt. A DMSO¹t vákuum alatt végzett desztillálással távolítottuk el (40 C¹os vízfürdõben). A visszamaradt anyagot 0, N NaOH-oldattal kevertük, amíg tiszta oldatot adott. Az 1 N HCl-oldattal ph=,0 értékre történõ savanyítás 10¹propargil-4-dezoxi-4-amino-10-deazapteroesavat (¹ös vegyület) eredményezett sárga, szilárd anyagként, 70%¹os kinyerési hatásfokkal. Ebben a fázisban, HPLC-vizsgálat szerint a termék 90%¹os tisztaságú volt. Az ¹ös vegyületet (22 mg, 0,6 mmol) dimetil-lglutamát-hidrokloriddal (137 mg, 0,6 mmol) kapcsoltuk, trietil-amint (148 mg, 1,46 mmol) tartalmazó DMSO-ban (10 ml) felvett BOP-reagens [benzo-triazol- 1-il-oxi-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluorofoszfát (287 mg, 0,6 mmol, Aldrich Chemical Co.)] alkalmazásával. Az elegyet 3 órán át 20 2 C¹on kevertük, majd száradásig evaporáltuk. A maradékot vízzel kevertük, a vízben nem oldódó nyersterméket összegyûjtöttük, és vákuum alatt szárítottuk. A nyersterméket (30 mg) szilikagélkromatográfiával tisztítottuk, az eluáláshoz trietanol-amint (térfogat szerint 0,2%¹ot) tartalmazó CHCl 3 :MeOH (10:1) oldatot alkalmaztunk, hogy 16 mg 10¹propargil-10-deaza-aminopterin-dimetil-észtert kapjunk (6¹os vegyület, 0%¹os kinyerési hatásfok), ami TLC szerint (CHCl 3 :MeOH :1) homogénnek bizonyult. A 6¹os vegyületet (16 mg, 0,326 mmol) keverés mellett 10 ml MeOH-oldatban szuszpendáltuk, amelyhez 0,72 ml (0,72 milliekvivalens) 1 N NaOH¹ot adtunk. Az elegyet szobahõmérsékleten addig kevertük, amíg néhány óra múlva feloldódott. Az oldatot 8 órán át 20 2 C¹on tartottuk, majd 10 ml vízzel hígítottuk. Csökkentett nyomáson végzett párologtatással a metanolt eltávolítottuk, és a koncentrált vizes oldatot további 24 órán át 20 2 C¹on tartottuk. Az ezt követõen végzett HPLC-vizsgálat azt mutatta, hogy az észterhidrolízis teljessé vált. A tiszta vizes oldat ph¹ját ecetsavval 4,0¹es értékre állítottuk, hogy halványsárga, szilárd 10¹propargil-10-deaza-aminopterin precipitátumot kapjunk. Az összegyûjtött, vízzel mosott és vákuum alatt szárított termék tömege 122 mg volt (79%¹os kinyerési hatásfok). Elemi analízis, proton NMR- és tömegspektroszkópiás vizsgálatok teljesen megfeleltek a feltételezett szerkezetnek. HPLC-vizsgálat 98%¹os tisztaságra utalt, továbbá arra, hogy a termék 10¹deaza-aminopterintõl mentes. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. 10¹Propargil-10-deaza-aminopterin alkalmazása T¹sejtes limfóma kezelésére alkalmas gyógyszer formulázására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a 10¹propargil-10-deaza-aminopterin 10¹deaza-aminopterintõl lényegében mentes. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a 10¹propargil-10-deaza-aminopterin adagolására dózisonként 30 27 mg/m 2 mennyiségben van formulázva.
HU 00 287 T2 Int. Cl.: A61K 31/19 6
HU 00 287 T2 Int. Cl.: A61K 31/19 7
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest