Az asztma (és atópiás ekcéma/dermatitis szindróma) genomikai vizsgálatai; különös tekintettel a hisztamin immunmodulációjára Doktori értekezés Kozma Tibor Gergely Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu, 19. sz. program Programvezeto: Prof. Falus András Témavezeto: Dr. Szalai Csaba Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet Budapest, 2004. 73
Tartalomjegyzék 1 Bevezetés... 4 1.1 Célkituzések... 6 2 Irodalmi áttekintés... 9 2.1 Az Ig-mediált allergiás betegségek kialakulásában fontos tényezok... 9 2.2 Az asthma bronchiale állatkísérletes modellezése... 15 2.3 Th1-Th2 immunpolarizációs egyensúly eltolódása... 18 2.4 Az allergiás betegségek patomechanizmusa... 21 2.4.1 Az AEDS patomechanizmusa...21 2.4.2 Az allergiás asztma patomechanizmusa...22 2.5 Az asztma és (AEDS) szabályozásában szerepet játszó fontosabb citokinek és kemokinek... 32 2.5.1 Citokinek...32 2.5.2 Kemokinek...39 2.6 A hisztamin immunmoduláló hatásai... 45 3 Kísérleti módszerek... 51 3.1 Az allergia populációgenetikai vizsgálatainak módszerei... 51 3.1.1 A vizsgálatba bevont személyek...51 3.1.2 Laboratóriumi paraméterek meghatározása...52 3.1.3 DNS izolálás...53 3.1.4 Mutációk azonosítása...53 3.1.5 Statisztikai módszerek...55 3.2 Az asztma állatkísérletes modellezésénél alkalmazott módszerek... 57 3.2.1 A kísérleti állatok...57 3.2.2 Kísérleti protokoll...57 3.2.3 Az AHR mérése...58 3.2.4 Tüdo szövettan...62 3.2.5 A BAL morfológiai vizsgálata...62 3.2.6 A BAL limfocitáinak FACS (Flow Citometria) vizsgálata...62 3.2.7 Szérum IgE mennyiségének mérése...63 3.2.8 Citokinek, kemokinek génexpressziójának meghatározása tüdoszövetbol...67 3.2.9 Az INF-? és IL-4 fehérje mennyiségének meghatározása tüdoszövetbol...70 3.2.10 Statisztikai módszerek...71 2
4 Eredmények... 73 4.1 Az allergia populációgenetikai vizsgálatai... 73 4.1.1 Nincs kapcsoltság az asztma/allergia és a RANTES -28G, -403A (74), valamint a CCR5? 32 polimorfizmusok között (83)...73 4.1.2 Az MCP-1 promoterének -2518G mutációja kapcsoltan öröklodik az asztmával (74)...76 4.1.3 Az MCP-1-2518G allél csak az asztmával mutat kapcsoltságot, az atópiával nem (74)...78 4.1.4 Az MCP-1-2518G allél kapcsolatban áll a vér eozinofil granulocita aránnyal/számmal és az asztma súlyosságával (74)...78 4.1.5 Sem a RANTES, sem az MCP-1 promoterének polimorfizmusai nem öröklodnek kapcsoltan az AEDS-sel (73)...82 4.2 Az asztma állatkísérletes modellezése... 84 4.2.1 Csökkent marad az AHR a HDC KO egerekben szenzitizálás után...84 4.2.2 Csak kis mértéku gyulladás alakul ki allergizálás után a HDC KO egerek tüdejében...85 4.2.3 A gyulladásos sejtek aránya lényegesen kisebb a HDC KO állatok BAL-jában, mint WT társaikéban szenzitizálás után...87 4.2.4 A limfociták közül elsosorban a CD3+ T sejtek arányát emeli a kezelés...89 4.2.5 A KO állatok szignifikánsan kevesebb allergén specifikus IgE-t termelnek az allergizálás után, mint WT társaik...90 4.2.6 A KO állatok citokin és kemokin génexpressziós profilja jelentosen eltér a WT állatokétól...91 4.2.7 A KO állatok tüdejébol szignifikánsan kevesebb INF-? és IL-4 mutatható ki allergizálás után, mint WT társaikból...97 5 Diszkusszió... 99 5.1 Populációgenetikai vizsgálatok... 99 5.1.1 Az asztma populációgenetikai vizsgálatai...99 5.1.2 Az AEDS populációgenetikai vizsgálatai...103 5.2 Az asztma állatkísérletes modellezése...104 6 Összefoglalás... 113 7 Summary... 114 8 Rövidítések jegyzéke... 115 9 Megjelent publikációk... 116 8 Bibliográfia... 117 9 Köszönetnyilvánítás... 146 3
1 Bevezetés A címben említett asztma és atópiás ekcéma/dermatitis szindróma (AEDS), olyan allergiás betegségek közé tartoznak, amelyeket manapság sokan az "atópiás" jelzovel illetnek (1). Az "atópia" kifejezést amely az "atopos" szóból származik, és jelentése: nem megfelelo az 1920-as években Coca és Cooke használta eloször (2) az allergiás rhinitis-re és a bronhialis asztmára, hogy elkülönítse az allergiától. Az "allergia" eredetileg az atópiánál tágabb kifejezés volt. Jelentése: eltérés az eredeti állapottól. Eloször von Pirquet vezette be 1906-ban minden olyan túlérzékenységi reakcióra, amelyben antigén (foleg fehérje) játszik szerepet (3). 1968-ban Gell és Coombs az allergiát 4-féle túlérzékenységi reakcióra osztotta (4), az elsobe azokat a túlérzékenységi reakciókat sorolva, melyet IgE (immunoglibulin E) mediál. Ugyanebben az évben a WHO hivatalosan is elismerte, hogy a korábban az atópiáért felelossé tett ho labilis testek" szintén az IgE molekulák (5). Ezért az atópia eredeti jelentése elveszett, és gyakran az allergia kifejezéssel szinonimaként használták. 2001-ben az EAACI (European Academy of Allergology and Clinical Immunology) újradefiniálta az allergia és atópia kifejezéseket (1). Az EAACI szerint az atópia" betegségek leírására nem használható. Definíció szerint az atópia: egyéni, vagy családi hajlam IgE izotípusú antitestek termelésre kisdózisú allergénekkel (általában fehérjékkel) szemben; és olyan betegségek kialakulására, mint az asztma, a rhinoconjunctivis, vagy az ekcéma/dermatitis. Az új nomenklatúra szerint az olyan túlérzékenységi reakciókat hívjuk allergiának, melynek kialakulási mechanizmusait többé-kevésbé ismerjük. Allergia kialakulása mögött gyakran áll atópia, azonban számos betegség (pl. AEDS, fetalis erithroblastosis) IgE-tol független mechanizmusok útján alakul ki. Az EAACI új nomenklatúrát javasolt a különféle allergiás betegségekre is: Az immunológiai mechanizmusok által mediált asztmát allergiás asztmának, míg a régebben intrinsic asztmának nevezett betegséget nem allergiás asztmának definiálta. Az eddig atópiás dermatitisként, ill. atópiás ekcémaként nevezett allergiás betegségeket AEDS-nek hívja. Az allergiás megbetegedések gyakorisága az utóbbi évtizedekben jelentosen emelkedett, különösen a fejlett országokban (6, 7). A gyermekkorban jelentkezo krónikus betegségek közül az asztma, vezeto szerepet tölt be (8). Svédországban például durván 12 évente megduplázódott az allergiás rhinitisben, asztmában vagy ekcémában szenvedo gyermekek száma (9); az Egyesült Államokban az asztma gyógyítása 6 4
milliárd $-t emészt fel évente (10). A respiratorikus mucosa krónikus gyulladása mely alapveto szerepet játszik az asztma patogenezisében az iparvidékékben gazdag országokban élok 10%-át érinto betegség (11). Az asztma a légutak krónikus gyulladásos betegsége, amely reverzibilis légúti obstrukcióval, és légúti túlérzékenységgel (AHR) jár (12). Az antigén a légutakban igen sokféle gyulladásos sejt közremuködésével fejti ki hatását: eozinofil granulociták, B sejtek, hízósejtek, aktivált T sejtek (CD4+) által (13-16). Bár a pontos mechanizmus még mindig ismeretlen, a sejtek közötti komplex kölcsönhatások vezetnek az asztma patogenezisében fontos citokinek, és egyéb gyulladásos mediátorok termeléséhez (17). Az AEDS klinikai képe ugyan eltér az asztmáétól, hiszen a diagnózis alapjául is szolgáló legfobb tünete az ekcémás léziók megjelenése; patomechanizmusa mégis több lényeges ponton átfed vele (18, 19): a magas allergén specifikus IgE szint, és a gyulladás helyére bevándorolt eozinofil granulociták nagy száma közös jelenség. Továbbá mindkét betegség kialakulásának fo irányítójaként egyre inkább a T sejteket teszik felelossé (20-27). A betegségek kialakulásánál elsosorban a Th2 sejtek a nélkülözhetetlenek (22, 23), majd a késobbi, krónikussá alakuló stádiumban az infiltrálódó Th1 sejtek a tünetek súlyosbodásához vezetnek (24-27). Az allergiát, az immunrendszer irányítását végzo megszámlálhatatlan gén összehangolt muködésében bekövetkezo zavar váltja ki, melyet a többi gén, illetve a környezet kiszámíthatatlanul formál át. Az allergia ugyanis multifaktoriális betegség, melynek kialakulásában mind genetikai, mind környezeti tényezok szerepet játszanak (28-31). A genetikai tényezok lehetnek az immunválaszt és az IgE termelést (azaz atópiát) és/vagy hatást szabályozó gének polimorfizmusai, míg a környezeti tényezok a különféle allergénekkel való találkozás. Az utóbbi években igen nagy erofeszítéssel, sok kutatócsoport dolgozik az allergiás betegségek kialakulásában fontos genetikai tényezok feltárásán, azonban gyakorlatilag nem lehet olyan eredményrol beszámolni (a legfrissebbektol eltekintve), amit ne cáfoltak volna meg. Ennek legfobb okai, hogy a rendkívül összetett patomechanizmus mellett már a fenotípus definiálása és a mintagyujtés is komoly nehézségekbe ütközik, és eltéro földrajzi helyeken élo emberekre eltéro környezeti tényezok hatnak. Az is elképzelheto például, hogyha ugyanaz a polimorfizmus az élet különbözo idoszakában jut érvényre (eltéro környezeti tényezok miatt), más-más allergiás betegség kialakításában vesz részt. Ugyanakkor az 5
egészséges szervezet, öröklodo, kóros hajlam nélkül is válaszolhat nagymennyiségu IgE termeléssel bizonyos körülmények között. Nagydózisú allergén (gyakran adjuvánssal együtt) önmaga is kiválthat (1) allergiás kórképeket. Erre példaként lehet felhozni a szakmai ártalmak következtében fellépo allergiát (32), és ezen az elven alapulnak a kísérleti állatokon eloidézett allergiás modellrendszerek is, amelyek tekintet nélkül az atópiás hajlamra kialakulnak az adott élolényben. A nagyhatékonyságú molekuláris genetikai módszerek napjainkban ugrásszeru fejlodésen mennek át, és a számítástechnikával együtt alkalmazva megteremtik a genom léptéku molekuláris genetikát: a genomikát. "A humán genomika azt vizsgálja, hogy az ember genetikai állománya hogyan határozza meg az ember fenotípusát." (28) A genomika egyik elsodleges feladata a betegséggel kapcsolatba hozható génváltozatok (allélek) megtalálása, amelyek késobb felhasználhatók lesznek diagnózisra is. Mivel ezek a polimorfizmusok nem minden környezeti feltétel mellett, és nem is minden etnikumban járulnak hozzá egyformán a betegség manifesztációjához, elengedhetetlen, hogy hazánk is részt vegyen ezekben a kutatásokban. A genomika másik igen fontos feladata annak vizsgálata, hogy egy fenotípus (betegség) kialakulását milyen gének megszólalása alakítja ki, és ezeket milyen tényezok módosítják. PhD munkám során az allergia genomikájának mindkét kutatási ágába bekapcsolódtam. Mivel ezek az allergia kutatásának két különálló részét képezik, a kettosség az egész dolgozat során jelen van. 1.1 Célkituzések A PhD munkám elso felében ismertetett kísérleteink során olyan polimorfizmusokat kerestünk magyar gyermekek körében, amelyek kapcsolatban lehetnek az atópia, az asztma, és/vagy az AEDS betegségekkel. Mivel kutatócsoportunk nem veheti fel a versenyt a világ nagy, sok pénzt felemészto kutatásaival, elsosorban a már mások által (gyakran más betegségekben) leírt polimorfizmusok Magyarországon betöltött szerepeinek vizsgálataival foglalkoztunk. Budapesti gyermekek körében azt vizsgáltuk, hogy a TNF-? (tumor necrosis factor-? ), a RANTES (regulated on activation normal T cell expressed and secreted), vagy az MCP-1 (monocyte chemoattractant protein) promoterében már leírt polimorfizmusok, amelyek ezeknek a kemokineknek a szintjét befolyásolják a szervezetben, kapcsolatba hozhatók-e az allergiával, vagy az asztmával, az AEDS-sel, illetve a betegek valamely vizsgált 6
klinikai/biológiai jellemzojével. (A TNF-? polimorfizmusainak elofordulását az AEDSben nem vizsgáltuk.) Hasonló jellegu kutatásokat végeztünk továbbá az Fc?RI (nagy affinitású IgE receptor), valamint a CCR5 (kemokin receptor 5) kódoló szakaszában leírt polimorfizmusok kapcsán is. Az elobbi egy aminosav cserét idéz elo a molekula? láncában, az utóbbi pedig egy 32 bázispárnyi delécióval jár. Mivel sem a TNF-?, sem a Fc?RI említett polimorfizmusai sem hozhatók összefüggésbe a vizsgálat betegségekkel, továbbá eredményeinket nem is publikáltuk, ezekrol csupán érintolegesen ejtek szót dolgozatomban. A PhD munkám második felében azokról a kísérletekrol írok, melyekben a hisztamin késoi asztmás fázisban betöltött hatásait vizsgáltuk. A hisztamin az allergiás válasz egyik fo effektor molekulája. Részt vesz a légúti simaizomzat kontrahálásában, a microvasculáris permeabilitás növekedésében (33, 34). Az asztmásoknak magasabb a szérum hisztamin koncentrációja, mint a nem asztmás, kontroll egyéneknek (35). A provokálás utáni emelkedett plazma hisztamin szint pedig együtt jár a bronhiális obstrukcióval (36). Érdekes azonban, hogy az antihisztaminok mégsem elég hatékonyak az asztma kezelésében (37). In vitro kísérletek szerint számos alapveto, az immunrendszer muködésének egészére ható szerepe van a hisztaminnak: pl. hatással van a dendritikus sejtek és makrofágok érésére (38-40). Azonban még mindig nem ismert, hogy immunregulációja in vivo hogyan befolyásolja az asztma kialakulásának patomechanizmusát; mivel az in vitro rendszerekben kapott eredmények a kísérleti körülmények, és az alkalmazott sejtek függvényében meglehetosen ellentmondásosak. Pedig az asztma késoi fázisában megnyilvánuló hatásai valószínuleg inkább az immunrendszert szabályozó, mintsem az effektor funkciói révén jutnak érvényre. A hisztamin receptorok átfedo, de sokszor ellentétes funkciói miatt, a receptorok blokkolásával nem lehet teljesen, az összes hisztamin hatást megszüntetni. Bár a hisztamin szintézisét blokkoló? -fluorometil hisztidin jelentosen csökkenti a hisztamin szintet számos élolényben, még annak használatával is nehézségekbe ütközik a hisztamin hosszú távú in vivo eliminálása. Korábbi kísérletek, amelyeket hízósejt hiányos egereken végeztek, egyenesen azt sugallják, hogy a késoi asztmás fázisban a hisztaminnak nincs is komoly szerepe: a hisztamin legfobb forrásainak számító hízósejtek nélkül is kifejlodött a légúti gyulladás és késoi AHR (41). Kísérleteink során elsoként vizsgáltuk a hisztamin allergiával/asztmával kapcsolatos abszolút hatásait in 7
vivo körülmények között, állatkísérletes asztma-modell rendszerben. A genetikailag módosított egerek létrehozatala különösen nagy lehetoséget rejt magában az egyes mediátorok allergiás reakcióban betöltött szerepeinek megértésében, mivel olyan állatokon lehet vizsgálatokat végezni, melyekben egy adott géntermék hiányzik, vagy túlexpresszált. Kísérleteinket mi is ilyen állatokon (HDC KO egerek) végeztük (42): olyan egereken, melyek képtelenek muködoképes hisztidin-dekarboxiláz (HDC) expresszióra. Mivel ez az enzim (jelenlegi tudásunk alapján) az egyedüli, amely képes a hisztamin eloállítására, ezekben az állatokban hiányzik az endogén hisztamin. Az exogén hisztamin bevitelét hisztamin-mentes táppal akadályoztuk meg. Kísérleteink során ezeknek a KO egereknek az allergizálás utáni (asztmára jellemzo) fenotípusát, és az asztmában valószínuleg szerepet játszó citokin és kemokin expressziós profilját hasonlítottuk össze az allergizált vad típusú állatokéval, illetve a kontroll csoportokkal, a hisztamin asztmában betöltött szerepeinek pontosabb megértéséhez. 8
2 Irodalmi áttekintés 2.1 Az Ig-mediált allergiás betegségek kialakulásában fontos tényezok Az allergia kialakulásáért a gazdaszervezet és a környezeti tényezok közötti kölcsönhatások a felelosek (28-31). Az asztma kialakulásában résztvevo legfontosabb rizikótényezoket 1995-ben a GINA (Global Initiative on Asthma) a WHO-val (World Heath Organization) közösen foglalta össze (43), de ezek közül egyesek valószínuleg nem valós okok, hanem inkább következmények. Általánosságban elmondható, hogy az allergia poligénes-multifaktoriális betegségeket foglal magába. Ez azt jelenti, hogy kölcsönhatás van a specifikus immunválaszt és IgE termelést befolyásoló gének között, amelyet erosen befolyásolnak a különbözo, nem genetikai tényezok, különösképpen a számos környezeti allergén szintje, és a velük való találkozás gyakorisága. Az allergiára hajlamosító, vagy ellene védo tényezok egy jelentos csoportját azok alkotják, amelyek az immunpolarizációs viszonyok (lsd. 2.3 fejezet) megváltozására hatnak. Epidemiológiai kutatások is alátámasztják az atópiával szembeni védelemben azoknak a gyermekkori fertozéseknek a fontos szerepét, amelyek a szervezetben Th1 irányú eltolódást hoznak létre (44). Ebben a bélflóra baktérium összetételének is igen fontos szerepet tulajdonítanak (45). Más környezeti tényezok kifejezetten a Th2 immunpolarizációnak kedveznek, így fokozzák az atópia kialakulásának valószínuségét (1. ábra): ilyenek például a diéta, a pollenszezonban való születés (46, 47). De fontos, allergiára hajlamosító tényezonek tartják az élet elso pár hónapjában az állatok közelségét (48), a vírusinfekciót (49), a levegoszennyezést (50) és az anya dohányzását (51) is. A legtöbb allergén olyan fehérje, amely természetes körülmények között enzimként funkcionál, vagy pedig egyszeruen csak nagy szemcseméretu. Az enzimaktivitású allergének növelhetik a mucosa permeabilitását (proteolízis), az utóbbiak pedig, irritálhatják a légutakat (44). Számos allergén (ún. szuperantigének) az adjuvánsokhoz hasonlóan poliklonális IgE termelést is beindíthat. Ilyen pl.: a Staphylococcus aureus, amely a poliklonális IgE válasz mellett képes még eozinofil granulociták által mediált gyulladást is kiváltani AEDS-ben. A fejlett (nyugati) 9
országokban eloforduló leggyakoribb allergének: a házipor atka (Der p 1 és Der p 2), a macskából származó allergének (pl. Fel d 1), a különféle fák (pl. Bet v 1: nyír) és fufélék allergénjei (parlagfu: Amb a 1-6), de egyre fontosabbak az amerikai mogyoró allergénjei (Ara h 1-3) is (44). Genetikai tényezok Specifikus HLA allélek jelenléte Különféle gének polimorfizmusai Környezeti tényezok Allergén szenzitizálás Testvérek Túlzott higénia Az élet elso 2 évében kapott antibiotikumok, oltások, betegségek Atópia Betegség a célszervben Bronhiális epitélium Bor Bél Kiváltó tényezok Vírus infekció Allergénnel való találkozás Dohányfüst "Indoor és outdoor" szennyezok 1. ábra Az atópia és a Th2 sejtek által mediált allergiás gyulladás kialakulásra ható tényezok (44) Th2-mediált allergiás gyulladás Már az 1960-as években végzett kutatások alapján feltételezték, hogy az allergia öröklodo jelleg. Mikor még populációs gyakorisága 20% körül mozgott, a betegek 46-68%-nál lehetett kimutatni családi hátteret (52). Annak érdekében, hogy a genetikai tényezok allergiában betöltött szerepeit vizsgálni lehessen, azonosítani kell a rokonsági kapcsolatokat, szét kell választani a környezeti, a kulturális és a genetikai tényezoket (53). Ezekhez a családkorrelációs vizsgálatok (54); az egy, illetve kétpetéju ikrek összehasonlító vizsgálatai (55) és a szegregációs analízisek jelentenek segítséget. A családkorrelációs vizs gálatok szerint míg az asztma populációs gyakorisága 4%; 20-25%-os valószínuséggel lesz valaki asztmás, ha valamely elsofokú rokona beteg (54). Az AEDS konkordanciája (együttes elofordulása) 77% egypetéju ikreknél, míg kétpetéjueknél 15%, ami szintén jelzi a betegség genetikai hátterét (56). Szegregációs analízisekkel megállapították, hogy az allergiás betegségek iránti hajlamban szerepet játszó sokféle gén között vannak kiemelkedoen fontos, úgynevezett "major" (meghatározó, dönto) gének, azonban ezek öröklésmenete még mindig nem teljesen egyértelmu (57). 10
Egy betegség genetikai kutatásának elso lépése a beteg fenotípus egyértelmu, objektív elkülönítése az egészségestol, mivel a rossz diagnózis a genetikai analízis statisztikáját rontja. Az allergiában már ennek a feltételnek a teljesítése nehézségekbe ütközik. Például nincs olyan fiziológiai mérés, amellyel abszolút módon diagnosztizálni lehetne az allergiás rhinitist, vagy az AEDS-t. Talán leginkább az asztma diagnózisában vannak olyan objektíven mérheto jellegek, amelyeket az asztma pont (58) és az asztma algoritmus (59) módszerekkel feldolgozva, viszonylag éles különbség teheto az egészséges és a beteg fenotípus között. A diagnózist tovább nehezíti, hogy egy egyénnek sokszor több allergiás betegsége is van, ami maga után vonhatja, hogy a betegség "specifitását" adó géneket még nehezebb megtalálni. Becslések szerint az AEDS-es újszülöttek 40%-ában 3-4 éves korára asztma alakul ki (60), más tanulmány szerint az asztmás betegek 35%-ának van AEDS-e (61), megint mások szerint az allergiás rhinitis-esek 20-38%-ának van asztmája (62). Jelenleg az allergia kialakulásában szerepet játszó gének és azok mutációinak azonosítása még az elején tart. Az 1. táblázatban (lsd. 14. oldal), 5 kutatócsoport által publikált teljes genom szurés eredményeibol, valamint több száz genetikai kapcsoltsági és asszociációs tanulmány eredményeibol azokat a kromoszóma területeket emeltük ki, melyek több tanulmányban is konzekvensen szerepeltek, és jelenlegi tudásunk alapján jelentoségteljesnek tunnek. A fejezet további részében azokkal a kromoszóma területekkel foglakozunk részletesebben, amelyek az általunk is vizsgált génterületeket tartalmazzák. 6p21.3 A 6p21.3 kromoszóma régió és az atópia/asztma között már viszonylag régóta ismeretes szoros összefüggés (63-65). Az itt lokalizált gének foleg az MHC (fo hisztokompatibilitási gén komplex) osztályba tartoznak. Közülük mi az MHC III osztályba tartozó TNF-? vizsgálataival foglalkoztunk. A TNF-? promoterének -308A polimorfizmusát (a szám a starthelytol való távolságot jelzi downstream irányban), amely emelkedett TNF-? szintet idéz elo, több tanulmány is összefüggésbe hozta már az asztmával (66, 67), viszont az atópiával nem. Mivel az asztma kóros gyulladásos immunválasz következtében kialakuló betegség, elméleti megfontolások alapján is lehetséges, hogy ez a gyulladásos citokin fontos funkciót lát el az asztma patomechanizmusában. Mivel gyulladás IgE-tol függetlenül is kialakulhat, értelmezheto az is, hogy pusztán az atópiával miért nem mutat kapcsoltságot. Saját kísérleteink, 11
melyeket budapesti asztmás gyermekek vérmintáiból végeztünk, nem támasztották alá, hogy ez a polimorfizmus befolyásolná az asztma kialakulását (nem publikált eredmények). 11q13 Több tanulmány megerosítette a kapcsolatot a 11q13 kromoszómarégió és az atópia között (68, 69). Az elsodleges jelölt gén ezen a területen az Fc?RI? - alegységének génje volt. Az Fc?RI 4 alegységbol épül fel: egy-egy? és?, valamint két? láncokból. Az IgE molekula megkötéséért az? lánc felelos. A? lánc a receptor keresztkötése révén keletkezo szignál amplifikálásában vesz részt. Az atópiával kapcsolatba hozott polimorfizmus a? lánc fehérjéjének 181. aminosavában okoz egy Ile/Leu szubsztitúciót (70). A mutáció a hízósejtekben és bazofilekben a korábbi feltételezések szerint emelkedett hisztamin szintézist is kivált. Azonban számos, más kutatócsoport által végzett tanulmány, képtelen volt a kapcsoltságot kimutatni (71) a 181 Leu szubsztitúció és az allergiás betegségek között, sot a molekula kóros, hisztamin szintet emelo tulajdonságát sem tudták igazolni (72). Ezeket az eredményeket erosítették meg az általunk végzett kísérletek is (nem publikált eredmény): ez a polimorfizmus nem fordul elo sem nagyobb, sem kisebb gyakorisággal a Budapesten élo asztmás gyermekekben, mint az egészségesekben. 17p11.1-17q11.2 Több etnikumban is találtak összefüggést a 17-es kromoszóma és az asztma között (64). Ezen a kromoszómán nagyszámú jelölt gén található, de közülük kiemelkedo fontosságúak a 17q11.2 pozícióban található kemokin géncsaládba tartozók, melyek közül mi a RANTES, és az MCP-1 promoter régióinak polimorfizmusait vizsgáltuk (73, 74). A RANTES az egyik leginkább tanulmányozott kemokin. Három különbözo afrikai és amerikai etnikai csoporton végzett teljes genom szurés eredménye szerint van kapcsoltság az asztma és az említett 17q11.2 kromoszóma régió között (63-65). Fontos azonban megjegyezni, hogy fehérboru csoportokban nem sikerült kimutatni a kapcsoltságot. A RANTES promoterében két olyan polimorfizmust írtak le, amely sejtvonalakban befolyásolják a transzkripcióját (75, 76): a -28-as pozícióban egy C/G, és a -403-asban egy G/A szubsztitúciót. Mindkét polimorfizmus (-28G és -403A) növelte a RANTES promoter erosségét, így feltételezhetoen a molekula szöveti szintjét is. Német gyermekeknél ki is mutatták, hogy a -403A allél kapcsoltságot mutat az 12
AEDS-sel (75). Azonban a Budapesten élo asztmás és AEDS-es gyermekekben nem sikerült a kimutatnunk a kapcsoltságot egyik vizsgált lókuszra sem (73, 74). A kemokinek a leukocitákon speciális sejtfelszíni receptorokon keresztül fejtik ki a hatásukat, melyek a G proteinhez kapcsolt receptorok szupercsaládjába tartoznak (74-79). Bár teljes genom szuréssel nem mutattak ki kapcsoltságot a kemokin receptorokat tartalmazó kromoszóma területek és az allergiás betegségek között, mégis a patomechanizmus ismeretében feltételezheto fontos szerepük (jelölt gén klónozás). A RANTES egyik receptora az utóbbi idoben a HIV-1 fertozéssel kapcsolatos szerepe miatt sokat vizsgált CCR5. A kaukázusi populációban egy rendkívül elterjedt 32 bp deléciót találtak a CCR5 génben (CCR5? 32) (80). A mutáns gén terméke nem jelenik meg a sejtfelszínen, így, mint receptor, nem képes muködni. A mutációnak védo szerepe van a HIV-1 fertozéssel szemben, és hasonló szerepe lehet az allergiában is. Errol azonban ellentmondásos eredményeket láttak napvilágot: Hall és mtsai. szerint, akik skót gyermekek vizsgáltak, kapcsoltság van a CCR5? 32 allél és az asztma kialakulásának csökkent kockázata között (81), míg Mitchell és mtsai. nem találtak szignifikáns kapcsolatot az atópia és az asztma között nyugat-ausztráliai és dél-angliai családokban (82). A magyar gyermekeken végzett vizsgálataink Mitchell és mtsai.-val vannak összhangban. Ezek szerint tehát szintén nem tulajdonítható védo szerep az asztmával szemben ennek a deléciónak (83). Az MCP-1 a RANTES mellett az asztma/allergia szempontjából egy másik igen fontosnak vélt kemokin a 17q11.2 génterületen. Az MCP-1 transzkripcióját, úgy tunik, két különálló génterület szabályozza az 5`-flanking régióban (84). A disztális regulációs terület a transzkripciós starthelytol 1,8-2,7 kb.-ra helyezkedik el upstream irányban, és két NF?B köto motívumot tartalmaz, amelyek esszenciális szerepeket töltenek be az MCP-1 transzkripciójának iniciálásában. Ezen a területen, -2518-as pozicióban, leírtak egy olyan biallélikus A/G polimorfizmust (85), amely a monocitákban GG homozigóta formában emelte ennek a kemokinnek az IL-1? (interleukin) indukált expresszióját az AA genotípushoz képest. Úgy tunik a G allél hatása dózisfüggo: a GG homozigóta allélpárt tartalmazó sejtek több MCP-1-et termeltek, mint a GA heterozigóták. Kísérleti eredményeink szerint az MCP-1-2518G polimorfizmus valószínuleg kapcsoltságban van az asztmával a budapesti populációban (74), azonban az AEDS-sel nincs (73). 13
Krom. régió Jelölt gének Feltételezett funkció Fenotípus 2q IL-1 géncsalád Gyulladási válasz Asztma befolyásolása 5q31-q33 IL-4, IL-13, GM-CSF B sejtek átkapcsolása IgE termelésre, Th2 válasz kiváltása 6p21.3 IL-5 Eozinofil felszabadítása a csontvelobol, eotaxin (eozinofil kemoattraktáns) termelés fokozása 7q31 CFTR Tüdoben transzmembrán kloridion csatorna 11q13 12q14.3-q24.31 Emelkedett IgE szint, asztma Asztma, AHR IL-9 asztma, AHR, hízósejt hiperplázia CD14 Bakteriális LPS köto Emelkedett IgE receptor szint HLA-D Antigén bemutatás Specifikus IgE, vagy IgG antitestek TNF-a Gyulladási válasz Asztma közvetítése Allergiás bronhopulmonalis aspergillosis FceRI-ß CC16 INF-? SCF STAT6 NFY-ß NNOS Basophil, dendritikus és hízósejteken IgE receptor Légúti gyulladás szabályozása IL-4 aktivitás gátlása IL-4 termelés Esszenciális citokinregulált transzkripciós faktor IL-4 és a HLA-D gének transzkripcióját növeli Az NO vasodilatator, és légúti gyulladási regulátor 14q11.2-q13 T sejt receptor a és d Kölcsönhatásba lép az MHC-peptid komplexekkel 16p21 IL-4R IL-4-nek (és az a alegység az IL-13-nak is) receptora Atópia, asztma, anyai öröklodés Asztma Asztma, atópia, össz IgE Asztma Specifikus IgE antitestek Atópia, asztma 17p11.1- RANTES, MCP-1 Leukociták gyulladáshoz Asztma, AEDS 17q11.2 eotaxin vonzása (kemokinek) 1. Táblázat Az allergiás megbetegedésekkel kapcsoltságot mutató jelölt gének kromoszóma lokalizációja és feltételezett funkciója 14
2.2 Az asthma bronchiale állatkísérletes modellezése Az állatkísérletes modellek kituno lehetoségeket kínálnak a komplex betegségek vizsgálataira, és az asztma modellezésére is gyakran alkalmazzák, foleg egereken. Ezekben a kísérletekben az egereken az emberi asztmához hasonló tünetek figyelhetok meg: allergén specifikus IgE-t termelnek, tüdejükbe eozinofil granulociták és hízósejtek infiltrálódnak, Th2 irányba polarizált citokintermelést folytatnak, és nem specifikus bronhokonstriktorokra (pl. metakolin) légúti túlérzékenységet mutatnak (86). Az állatokon kiváltott asztma tanulmányozásának különös jelentosége a humán asztmához képest, hogy a szövetek invazív vizsgálatai is megoldhatók, valamint a rendelkezésre álló különféle genotípusú egerek segítséget nyújtanak az asztma genetikai tényezoinek feltárásához is. Ugyanakkor az állatkísérletek kapcsán új nehézségekkel is számolni kell, melyeket két csoportba sorolhatunk: Az elsobe azok tartoznak, amelyek az állatok emberekhez képesti eltéro allergiás válasza miatt megkérdojelezik az állatmodellek relevanciáját. Talán a legfontosabb, ilyen jellegu problémák, hogy az egéren lejátszódó asztma lényegesen rövidebb lefolyású az emberinél (87); és az eozinofil granulociták az emberiektol eltéroen a gyulladás helyén valószínuleg nem degranulálódnak (88). A második csoportba az allergizálás kimenetelét befolyásoló, nagyszámú paraméter miatt felmerülo nehézségek sorolhatók, melyek részben az eltéro kísérleti protokollból, részben az állatok eltéro genotípusából származnak. Ezek ugyanakkor elonyt is jelentenek az asztmakutatásban: az eltéro kísérleti protokollokkal a különféle környezet, az eltéro genotípussal pedig a genetikai tényezok modellezhetoek. Az elobbit elsosorban szenzitizáláshoz felhasznált allergénnel (89), és adjuvánssal (90-91) lehet befolyásolni. Ez a következoképpen illusztrálható: egy fehérje-ag szubkután injekciója fötális borjú albuminnal (CFA) eros Th1 immunválaszt vált ki; ugyanakkor ovalbumin (OVA) szubkután injekciója adjuváns nélkül, vagy orálisan adott OVA kolera toxin adjuvánssal, illetve intraperitoneálisan (i.p.) adott OVA alumínium-hidroxid adjuvánssal Th2 reakciót vált ki (89, 92). A különféle genetikai hátteru egértörzsekben még azonos kísérleti körülmények közt is más mértékben fejezodik ki az AHR, különbözo mennyiségu allergén specifikus IgE termelodik, és eltéro összetételu gyulladásos sejt és citokin (93-95) mérheto. Az általunk is alkalmazott BALB/c egerek pl. viszonylag eros AHR-t mutatnak (93), és a gyakorta alkalmazott C57BL/6 egerekhez képest magas IgE, gyulladásos sejt és citokin szintjük van (96) a szenzitizálás és provokáció után. A nehézségek ellenére, az állatmodellek révén az 15
allergiás gyulladásról és a légúti túlérzékenységrol szerzett ismereteink nagyrészt felhasználhatóak a humán asztma patomechanizmusának megismerésére, azonban nem helyettesíthetik, csupán megalapozhatják a humán asztma vizsgálatát. Szenzitizáló reagens Szenzitizáló adjuváns Szisztémás szenzitizálás OVA 3 egyhetes per kután szenzitizálás 2 hetes idoközönként OVA Antigén inhaláció 10 napig naponta OVA Al(OH) 3 Al(OH) 3, OVA szuszpenzió kezelés i. p. a 0. és 14. nap "T sejt" Hovel elölt B. pertusis -szal, OVA -val és Al(OH) 3 -dal szenzitizált állat T sejtjeinek átoltása i. p. a szenzitizált egérbe Lokális szenzitizálás, provokáció Porlasztott OVA inhaláció 2. táblázat Az asztmás tünetek eloidézésére szolgáló néhány protokoll összehasonlítása. Kísérleteinkben a dolt betus protokollt alkalmaztuk. Kiváltott fenotípus asztma A szenzitizálási asztma protokollba foglalva A 28., 29., 30. napon asztma 1%-os OVA inhaláció, a 32. napon 5%-os porlasztott OVA késoi asztmás inhaláció reakció Az allergiás tünetek kiváltására sokféle protokoll terjedt el (2. táblázat). Ezekben a kísérletekben közös, hogy a többszöri szenzitizálás során az állat immunrendszere megismerkedik" egy adott allergénnel, amelyre a következo alkalommal (provokáció) kórosan túlreagál. A szenzitizálást leggyakrabban szisztémásan (i.p.), majd lokálisan (inhaláció) végzik. A lokális/inhalációs szenzitizálás után átlagosan 4-8 órával emelkedik meg a csontveloi eozinofilek száma, majd ezek a sejtek a tüdobe vándorolnak (97). Itt 48 órával a szenzitizálás után érik el maximális számukat, de már 8 óra elteltével is kimutathatók. 24 óra múlva a tüdomosó folyadékban (BAL) is megjelennek, ahol számuk a 2-3. napon tetoz (98). A T sejtek valamivel az elsoként megjeleno eozinofilek után vándorolnak az állatok tüdejébe. Ezeken a sejteken kívül neutrofil granulociták is elég nagy számban kimutathatók a BAL-ban, de az elobbi sejtféleségekhez képest kevéssé ismert az AHR-ben betöltött funkciójuk. Egyszeri inhalációs szenzitizálás után az AHR kb. 24 órával jelentkezik (97). Ha a szisztémás szenzitizálást több allergén inhaláció is követ mint ahogy az általunk alkalmazott protokollban is (87), az AHR két csúcsban mutatkozik: A kora fázisra jellemzo AHR az inhaláció után 5-30 perccel jelentkezik, amit a 3-12 óra múlva kialakuló késoi fázisra jellemzo AHR kísér (maximumát kb. 6 órával az inhaláció után éri el). Az utolsó szenzitizálás/provokáció után 5-6 héttel már nem mutatható ki eozinofil granulocita a BAL-ból, és az AHR is megszunik. 16
2. ábra Az AHR kialakulásának 3 feltételezett mechanizmusa eltéro egértörzsekben (86) Az asztma modellezésében talán leginkább vizsgált paraméter az AHR. Ha az állatokat csak lokálisan szenzitizálják, szisztémásan nem: az AHR szöveti gyulladás nélkül is kialakul (99) bennük. Nem minden esetben igaz tehát az, hogy az allergiás, eozinofil gyulladás szükséges feltétele az AHR kialakulásának (100). Az asztmával kapcsolatos állatkísérletekbol az AHR kialakulásának háromféle mechanizmusát írták le (86) (2. ábra), amelyek magyarázatot adhatnak arra, hogy az eozinofil gyulladás és AHR között miért nincs mindig egyértelmu korreláció. Az elso út IL-4-tol és hízósejtektol függo: az IL-4 hatására IgE izotípusú antitestek termelodnek, amelyek az allergénnel való találkozás után aktiválják a hízósejteket, ezáltal hisztamin és egyéb, az AHR kiváltásáért felelos mediátor (pl. leukotriének) szabadul föl. Ez az asztmás egyénekben lejátszódó korai asztmatikus reakció analógja. A második folyamatban a T sejtek irányításával termelt IL-5 az eozinofil granulociták révén vezet szövetkárosodáshoz és AHR-hez. Ez tekintheto a humán késoi típusú asztmatikus reakció analógjának. Az asztma kialakulásának harmadik útját az IL-13 mediálja, az IL- 4-tol és IL-5-tol is függetlenül. Ezzel a mechanizmussal játszódik le az asztma az IL-5 hiányos állatokban. A különbözo egértörzsekben (lsd. ábra jobb oldala) a különféle utak másképpen jutnak érvényre. Közös bennük azonban, hogy a légúti gyulladást végso soron a T limfociták irányítják, és ezek a sejtek felelosek az AHR kialakulásáért is. Az eozinofil granulociták, a hízósejtek, vagy az IL-13 csupán csak közvetíto szerepet látnak el. Mindazon által feltételezhetoen az eozinofilek az AHR egyik legfontosabb sejtes mediátorai (86). 17
2.3 Th1-Th2 immunpolarizációs egyensúly eltolódása Az asztma minden típusában a frissen diagnosztizált, enyhétol kezdve egészen a súlyos asztmáig gyakori jelenség a bronhiális mucosa-ban megjeleno nagyszámú limfocita, melyek jelentos részét a T sejtek alkotják (13, 14). A környezet allergénjeire adott adaptív immunválaszt a T limfociták koordinálják és közvetítik. A T limfocitákat effektor funkcióik és sejtfelszíni markereik alapján két csoportba lehet osztani. Azok a T sejtek, amelyek CD4-et expresszálnak "helper" T sejteknek (Th) hívjuk; amelyek pdig CD8-at fejeznek ki felszínukön citotoxikus/szuppresszor T sejteknek nevezzük (Tc/s). Ez utóbbi sejtek irányítják a sejtközvetített immunválaszt az endogén úton feldolgozott, MHC I molekulával perzentált antigének ellen. Ezzel szemben a CD4+, limfociták, az MHC II-vel asszociált, szervezettol idegen antigénekkel reagálnak. A Th sejtek csoportja két további szubpopulációra osztható: A még el nem kötelezett Th0 sejtekbol IL-12, IL-1 és IL-18 hatására IFN-?-t, TNF-?-t, IL-18-at és IL-2-t expresszáló sejtekre, amelyeket Th1 sejteknek hívnak; valamint Th2 sejtekre, amelyek a Th0 sejtekbol IL-4 hatására differenciálódnak, és IL-4-et, IL-5-öt, IL-6-ot, IL-9-et és IL-13- at termelnek (101-103). A Th1 sejtek a bakteriális és virális fertozésekkel szembeni védekezésben vesznek részt a sejtes immunválasz révén; a Th2 sejteknek normál muködésük közepette a terhesség fenntartásában, a szervezet féregfertozések elleni védelmében, továbbá a Th1 sejtekhez hasonlóan a bakteriális/virális fertozések által kiváltott különféle gyulladások kialakításában és fenntartásában (1) lehet szerepük. (A fertozések attól függoen alakítanak ki Th1, vagy Th2 választ, hogy konkrétan milyen baktérium, vagy vírus okozza oket.) A Th1-Th2 szabályozásában bekövetkezo hiba a legkülönfélébb immunopatológiai eltérések kialakulását idézheti elo (104, 105). Általában a nem atópiás emberek az allergénekkel szemben kisfokú immunválaszt tanusítanak, amely IgG1 és IgG4 izotípusú ellenanyag megjelenésével (106), valamint T-sejtjeik (Th1 sejtek) in vitro mérsékelt proliferációjával és INF-? (interferon-?) termelésével jellemezheto (107). Az atópiás emberek ezzel szemben jelentos mennyiségu IgE és allergén specifikus IgE termeléssel válaszolnak az illeto allergénre, és pozitív borpróbát adnak aeroallergénekbol készült kivonat borbe juttatására (18-19). T-sejtjeik in vitro elsosorban Th2 típusú citokin termeléssel (IL-4, IL-5, IL-13) válaszolnak (17). Sot, a betegség egyik igazi immunopatológiai bizonyítékának a Th2 sejtek szöveti infiltrációja (22, 23) tekintheto. A Th1 sejtek, amelyek INF-?-t 18
szecernálnak, ezzel szemben a legelfogadottabb elméletek szerint az allergiás betegségek ellen védelmet nyújtanak a Th2 effektor sejtek gátlása révén (108). Így azokban az egyénekben, akik immunrendszere Th1 irányban el van tolódva, kisebb valószínuséggel alakulnak ki allergiás megbetegedések (109, 110). Erre utal az is, hogy az allergia konvencionális terápiájában (szteroid kezelés) azzal együtt, hogy csökken az IL-4 termelo Th2 sejtek száma, az INF-?-t termelo Th1 sejtek száma és a Th1 citokinek szintje no (111, 112). Állatokon végzett kísérletek szerint az IL12/IL-18 kezelés képes megakadályozni a Th2 sejtek kialakulását, az AHR-t, és az eozinofil gyulladást az asztmát modellezo rendszerben (113). Ezekhez hasonló megfigyelések vezettek a Th1-Th2 paradigma kialakulásához: mely szerint a Th1 és Th2 sejtek ellensúlyozzák egymást. A Th1 sejtek védenek, vagy megakadályozzák a Th2-mediált allergiás választ, a Th2 sejtek kialakulását (103), valamint számos esetben gátolják az IgE termelést (114) is. Más esetekben azonban a Th2 sejtek is antagonizálhatják a Th1 sejteket (101). Az magzatok immunrendszere a placentán átjutó közönséges környezeti allergének miatt Th2 irányban van eltolódva, ezért az újszülöttekben is ez a túlsúly dominál (115). Az egészséges gyermekek immunpolarizációjában ezután valószínuleg a különféle fertozések által egy Th1 irányú eltolódás alakul ki. Atópiás gyermekekben ez a Th1 irányú repolarizáció nem jön létre (116). A gyermekkori fertozések fontos szerepére utal az is, hogy az allergia civilizációs betegség. Feltehetoen a fejlett országokban túlságosan "steril" körülmények között nevelkednek a gyermekek, mivel a környezet relatíve tiszta, és a legcsekélyebb mikrobiális fertozések ellen is antibiotikumokat használnak. Pedig a mikrobiális antigének kulcsfontosságúak lehetnek a Th1 sejtek stimulálásában (117). Korábban például a kevésbé fejlett NDK-ban a betegség elofordulási gyakorisága messze alulmaradt a fejtett országokban tapasztaltakhoz képest, de az egyesülés után fokozatosan elérte a németországi értéket (118). A Th1 repolarizációban kiemelkedo szerepet kapnak például a dendritikus sejtek és a makrofágok, amelyek IL-12 szekrécióval a Th1 sejtek érését stimulálják, vagy a természetes ölosejtek, amelyek INF-? termeléssel az immunrendszer egyensúlyát helyrebillentik (119-122). Azonban számos olyan fertozés ismeretes, mely az allergia súlyosbításához vezet: ilyen pl. az influenza vírus, a rhinovírus (RV)-14, vagy RV-16, 19
melyek a Th2 sejtek által termelt mediátorok (RANTES és IL-6) termelését vonják maguk után (123, 124). Azonban nincs adat arról, hogy a Th1 sejtek közvetlenül, aktívan elfojtanák a Th2 dominanciával létrejött gyulladást (25). A nem allergiás egyénekbol létrehozhatók ugyan allergén specifikus Th1 klónok (125), de ezek nem mutathatók ki a nem allergiás egyének nazális, vagy pulmonáris mucosa-jaban, ezért védo szerepük nem bizonyítható. A légúti gyulladást állatkísérletes modellrendszerben kevert, Th1-Th2 immunreakció váltja ki (25), valamint emberekben is megfigyelheto a Th1 válasz (126). Azt is bizonyították (25), hogy az allergén specifikus Th1 sejtek súlyos légúti gyulladást okoznak T sejt hiányos (SCID) egerekben, és az allergén specifikus Th2 sejtek általi gyulladást nemhogy gyengítik, hanem még súlyosbítják is. Kimutatták továbbá, hogy az IL-18 (Th1 citokin) fokozta a tracheába és a BAL-ba az eozinofil infiltrációt (127). Ennek fordítottjáról, mármint a Th2 sejtek Th1 irányú serkento hatásairól, az autóimmun encephalomyelitis-ben (128) és diabetes mellitus-ban (129) láttak meglepo eredmények napvilágot: a Th2 sejtek nemcsak hogy egyes esetekben képtelenek ellensúlyozni a Th1 választ, hanem még súlyosbíthatják, vagy modulálhatják is azt. Bár az állatkísérletekbol nyert eredmények nem vihetok át egy az egyben az emberi szervezet leírására, mégis elgondolkoztatók, és valószínusítik, hogy a Th1-Th2 paradigma lényegesen komplexebb, mint azt korábban feltételezték. Azt, hogy az immunrendszer polarizációja mely irányba tolódik el, nem elore determinált, azoktól a szignáloktól függ, melyek az egyik, vagy a másik Th szubpopulációra hatnak. A leginkább talán az IL-4 és az IL-12 kezdeti koncentrációviszonyai szabják meg, (bár ezek pontos sejtes forrásai még mindig nem ismertek), de egyéb molekuláknak, például a hisztaminnak is, fontos szerepet tulajdonítanak (130-132). Összefoglalva a Th1 és Th2 sejtek szerepét a jelenlegi ismeretek alapján, a következoket állapíthatjuk meg: A Th1 sejtek az asztma/allergia kifejlodése elott, védelmet nyújthatnak a betegség kialakulásával szemben. Azonban, ha a kór már kialakult, és a Th2 sejtek terminálisan differenciálódtak kialakítva saját citokin (133) és citokin receptor (IL-12R, IL-18R) (134-135) profiljukat, akkor az aktív Th1 sejtek már nem képesek változtatni rajtuk; ezért funkcióik révén csak további tüneteket váltanak ki. 20
2.4 Az allergiás betegségek patomechanizmusa 2.4.1 Az AEDS patomechanizmusa Az AEDS a leggyakoribb borbetegségek közé tartik. Az élet hosszát akár 20%-al is megrövidítheti (136), és a betegség elofordulási gyakorisága egyre no (137). Klinikailag krónikus, vagy krónikussá alakuló, jellegzetes ekcémás léziókkal jellemezheto, erosen viszketo borbetegség; ami magas szérum össz IgE, illetve allergénspecifikus IgE koncentrációval, valamint dermális eozinofiliával jár együtt (18). A borléziók hisztopatológiai képén sejtes beszurodés figyelheto meg, amelyben az eozinofil granulocitákon kívül foleg aktivált CD4+ memória T sejtek, és monociták/makrofágok (138) találhatók meg. Az allergiás egyének allergén provokációs vizsgálataiból származó kísérletek szerint mindenesetre kétségkívül az eozinofil granulociták alkotják az infiltrálódott sejtek többségét (akár 60%-át is) (139). A léziókban ezenkívül nagyszámú Langerhans sejt, és Fc? receptort expreszáló dermális dendritikus sejt is van (140, 141). Az utóbbi idoben a T limfocitáknak egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a betegség kialakulásában (20, 24). A kezdodo borgyulladásban emelkedett számú, foleg Th2 citokineket termelo (IL-5) limfocita van, majd a krónikus léziókban a Th1 citokinek mennyisége is egyre inkább emelkedik (142, 143). A betegség kezdo fázisában tehát a Th2 sejtekbol származó citokinek a meghatározók, majd az általuk kialakított gyulladás odavonzza és aktiválja a beszurodo sejteket (pl. eozinofil granulocitákat és makrofágokat), amelyek IL-12-t termelnek (24). Ez a citokin a Th1 és Th0 sejtek nem specifikus és allergén-specifikus aktivációjához vezet, majd az általuk szecernált citokinek (INF-?) alakítják ki a betegség krónikus, súlyos fázisát. A betegség feltételezett molekuláris patomechanizmusának ismert lépéseit a 3. ábra szemlélteti (24, 31): (a) Az AEDS kezdeti szakaszában az allergének (pl. a házi por atka, pollen) bekerülnek (és felhalmozódnak) a borbe és (b) direkt, vagy allergén-ige komplex kialakulás révén, az Fc? receptoron keresztül indirekt úton aktiválják az epidermális (és dermális) dendritikus sejteket. (Az epidermális dentritikus sejt az ábra bal oldalán látható, egy keratinocitától jobbra.) Az aktivált dendritikus sejtek proinflammatorikus mediátorokat (TNF-?, GM-CSF [granulocita-monocita 21
kolóniastimuláló faktor] és IL-1? ) bocsátanak ki, melyek által aktiválódnak a keratinociták és dermális fibroblasztok, és így megkezdik saját citokin és kemokin termelésüket. (A keratinociták pl. CTACK-ot (cutaneous T cell-attracting chemokine), a fibroblasztok pl. RANTES-t termelnek.) Ezek a mediátorok a borbe vonzzák a T sejtek elso hullámát (c). A borbe beszurodo allergén specifikus Th2 sejtek és eozinofil granulociták ismételten találkoznak specifikus antigénjeikkel (d) (az eozinofilek az IgE által, az Fc receptoruk segítségével), aktiválódnak, és Th2 citokineket IL-4-et és IL- 13-at és eotaxint termelnek. A Th2 citokinek felszabadulása pozitív visszacsatolást idézhet elo a gyulladásos helyeken. A dermális fibroblasztok által termelt RANTES (e) a CCR3-on keresztül újabb és újabb Th2 sejteket (és eozinofil granulocitákat) vonzhat a gyulladás helyére a vérbol (f). Majd a dendritikus sejtek a lokális nyirokcsomókba vándorolhatnak (g), ahol beindíthatják a limfociták proliferációját. A RANTES nemcsak a Th2, hanem a CCR5 közremuködésével a Th1 sejtek toborzásában is részt vehet. A dermális léziókba vonzott aktivált Th1 sejtek Th1 citokineket (pl. INF-?) szecernálnak, így a keratinociták és Langerhans sejtek révén (az ábra jobb felso sarka) hozzájárulnak a betegség krónikus fázisának kialakításában. 3. ábra Az AEDS feltételezett molekuláris patomechanizmusa (21) 2.4.2 Az allergiás asztma patomechanizmusa Az asztmával kapcsolatos legkorábbi ismereteink az asztmában elhunytak tüdejének postmortem vizsgálataiból származnak (144, 145), melyek a légutak 22
nagymértéku patológiás elváltozásairól számolnak be: a tüdo puffadásáról, elasztikus rugalmasságának elvesztésérol. Ezeket, a tüdoben sok helyen megtalálható hámlott epitéliumot, makrofágot, és aktivált eozinofil granulocitát tartalmazó viszkózus nyákdugók hozzák létre. A légutak elváltozásain kívül megfigyeltek simaizom hipertrófiát és hiperpláziát, bazalmembrán megvastagodást, kehelysejt hiperpláziát is. Asztmának a mindezekhez vezeto patofiziológiai elváltozásokat hívják, amelynek diagnosztizálható patológiai képe: a légúti gyulladás és túlérzékenység (12, 146-148). Az elsoként említett tünetet, amely már az enyhén/frissen diagnosztizált asztmások tüdejében is megfigyelheto (R-2/4-6), egyedülálló sejtkompozíció alakítja ki: a légutak falába limfociták, eozinofil granulociták és hízósejtek szurodnek be (149) (13-16, 149). Egyes adatok szerint ennek a gyulladásnak a mértéke korrelál az asztma súlyosságával (149). A gyulladásos sejtek mediátoraik (pl. citokinek és kemokinek) és sejtfelszíni molekuláik révén hatnak egymásra: befolyásolják egymás proliferációját, differenciációját, kemotaxisát, aktivációját. A számtalan mediátor sokféle gyulladásos sejtre gyakorolt hatása jelenlegi tudásunk alapján értelmezhetetlen, csupán az egyes komponensek kiragadásával sejthetünk meg törvényszeruségeket a folyamatból. Epidemiológiai és klinikai megfigyelések egyaránt kapcsolatba hozzák az IgE molekulát az asztma súlyosságával, és a légutak allergének által okozott kezdeti károsodásával (150). Az allergén specifikus IgE molekulák kialakulásának kezdeti lépéseinél az antigénbemutató sejtek (APC-k) (foleg éretlen dendritikus sejtek) bekebelezik az allergént, megérnek, majd bemutatják a T sejteknek, amelyek interakcióba lépnek a B sejtekkel (151). A T sejt B sejt interakcióban kétféle szignál nélkülözhetetlen az IgE szintézishez. Az elso (152) az IL-4 és IL-13, melyeket a B sejtek kötnek meg hasonló szignalizációs utat beindító receptoraikon. A második szignál kialakulásában a sejtfelszíni molekulák vesznek részt (153): a T sejt felszínén CD40L expresszálódik, ami a B sejt felszínén levo CD40-nel komplexet alkot. Ezek után más receptor-ligand párok (CD28 és B7,? 1? 2 integrin és ICAM-1) közötti kölcsönhatások kiegészítik, ill. felerosítik a B sejtek aktiválódását. A B sejtekbol kialakuló plazmasejtek ezután foleg IgE izotípusú antitestet termelnek. Az asztmának két fázisát lehet elkülöníteni: az allergénnel való találkozás után 1 órán belül a korai, 4-6 órával azután a késoi asztmatikus reakciót (154). Foleg a korai 23
asztmatikus reakció tevodik össze IgE-tol és hízósejtektol függo folyamatokból (155, 156). Kulcslépése, hogy az allergén keresztköti a hízósejtek és bazofil granulociták felszínén lévo, Fc?RI-en kötött IgE molekulákat (157). Ennek következtében a sejtekbol felszabadulnak az akut allergiás reakció tüneteiért felelos mediátorok (pl. hisztamin és lipid mediátorok). Bár egerekben az IgG1 is képes a hízósejtek szenzitizálására (158, 159), valószínuleg az IgE-nél lényegesen kisebb szerepe van (160). Állatkísérletek eredményi szerint az AHR egészséges állatokra allergén specifikus IgE-vel (és IgG1- gyel) át is viheto az Fc?RI-en keresztül (155, 158). A kis affinitású IgE receptor (Fc?RII, vagy CD23) többféle az asztmáért felelos sejttípuson (limfocita, eozinofil granulocita, makrofág) expresszálódik, azonban nem bizonyított, hogy részt vesz-e a sejtek aktiválásában és a gyulladásban. (Szolubilis változatáról feltételezik, hogy szerepe lehet az IgE szintézis szabályozásában.) A késoi asztmás reakciót elsosorban az allergiás gyulladás hozza létre, melyben a hízósejtek, T sejtek és különösképpen az eozinofilek, valamint azok mediátorai vesznek részt (12), és az IgE-nek kisebb szerep jut. Mivel kísérleteink során az asztma patomechanizmusait részletesebben vizsgáltuk, az említett sejtek asztmával kapcsolatos szerepeit kissé részletezve is tárgyaljuk. Limfociták Az utóbbi években egyre több megfigyelésbol és kísérletebol származó eredmény szerint a T sejtek az asztmás reakció karmesterei, az emelkedett légúti túlérzékenység elsodleges okozói (21, 25). Az asztmások légútjaiban, az allergén hatására no a limfociták száma és ezek a sejtek aktívak, expresszálják az IL-2 receptort (CD25) (13, 14). Bár általában nincsenek egyértelmu, egyetemesen elfogadható megfigyelések a CD4+, vagy a CD8+ T sejtek szelektív akkumulációjával kapcsolatban, annyi mindenesetre bizonyos, hogy azoknak az atópiás asztmás egyéneknek a BAL-jában, akik korábban már átestek késoi asztmás rohamon, az allergénnel való találkozás utáni 6-48 óra között megfigyelheto a CD4+ sejtek szelektív toborzása (161). A CD4+ Th2 szubpopuláció különösen elemi szerepére utal, hogy az általuk szecernált IL-3, IL-4, IL-5 és GM-CSF központi szerepet játszik az asztmás válasz beindításában és fenntartásában: a hízósejtek, bazofil és eozinofil granulociták differenciálódásának, toborzásának, növekedésének és proliferációjának (162), valamint az ellenanyag termelésének (151) a szabályozásában. 24