A TUBERKULÓZIS MIKROBIOLÓGIAI DIAGNOSZTIKÁJA

INFEKTOLÓGIA A TUBERKULÓZIS MIKROBIOLÓGIAI DIAGNOSZTIKÁJA Orvosi Mikrobiológiai Szakmai Kollégium I. Alapvetõ megfontolások 1. A PROTOKOLL ALKALMAZÁSI/ÉRVÉNYESSÉGI TERÜLETE 1.1. A protokoll témája a tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikája a járó- és fekvõbeteg-szakellátásban. 1.2. A protokoll célja az egységes hazai gyakorlat kialakítása, figyelembe véve a témában meghatározó jelentõségû nemzetközi (WHO, IUATLD, EuroTB, ECDC) és más külföldi szervezetek (CDC, FDA) ajánlásait és az érvényben lévõ hazai rendelkezéseket. 1.3. A protokoll célcsoportjai (a protokollt alkalmazó ellátók köre): mikrobiológiai laboratóriumok mikobakterológiai részlegei, önálló mikobakteriológiai laboratóriumok, klinikai osztályok, szakrendelõk, pulmonológiai gondozó hálózat 1.4. Ellátottak: tuberkulózisfertõzés és - megbetegedés gyanúja, tuberkulózissal fertõzöttek, tuberkulózis betegségben szenvedõk, tuberkulózis betegségre veszélyeztetettek. 1.5. A protokollt alkalmazó ellátók: mikobakteriológiai diagnosztikát végzõ mikrobiológiai laboratóriumok. 1.6. Ellátási szint: II. és III. kompetencia szintû mikrobiológiai laboratóriumok, melyek mikobakteriológiai diagnosztikát, mikobakteriológiai laboratóriumi szakellátást végeznek. 2. DEFINÍCIÓK: bakteriológiailag igazolt eset; bakteriológiailag nem igazolt eset; újonnan igazolt eset; korábban tuberkulózis miatt már kezelt eset; antituberkulotikum-rezisztens tuberkulózis, polirezisztens, multidrogrezisztens (MDR) és extensively-drug resistant (XDR) eset. II. Diagnosztikai eljárások Tuberkulózis gyanúja esetén a mikrobiológiai diagnosztikai módszerek széles skálájával és korszerû technikáinak felhasználásával (direkt mikroszkópos vizsgálatok, tenyésztés, identifikálás, nukleinsav-amplifikációs technikák) törekedni kell arra, hogy a fertõzõ ágenst a lehetõ legrövidebb idõn belül igazoljuk, és a definitív diagnózist követõen a rezisztenciavizsgálatok eredményét a kezelõ orvossal közöljük. KÖTELEZÕ (MINIMÁLISAN ELVÉGZENDÕ) MIKROBIOLÓGIAI DIAGNOSZTIKAI VIZSGÁLATOK ÉS AZOK GYAKORISÁGA A tuberkulózis definitív diagnózisának felállításának alapfeltétele a M. tuberculosisnak a beteg testnedveibõl (köpet, pleuralis folyadék, vizelet, hörgõmosó folyadék stb.) tenyésztéssel történõ kimutatása vagy a kórokozó direkt nukleinsavamplifikációs módszerekkel történõ detektálása direkt mikroszkópos vizsgálattal kapott saválló-pozitivitás mellett. A diagnózis felállításához minimum három, maximum öt adekvát vizsgálati mintára van szükség. A terápiában még nem részesült vagy két hónapnál kevesebb ideig kezelt beteg elsõ M. tuberculosis-tenyészetébõl a kezdeti 1 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS rezisztenciavizsgálatok kötelezõen elvégzendõk. Ismert fertõzés fennállásakor pedig követni kell a beteg fertõzõképességét (mikroszkópos vizsgálatok), és monitorozni kell a gyógyulás folyamatát (tenyésztés és rezisztenciavizsgálatok). A kezelés 4. hónapját követõen is baktériumot ürítõ beteg esetén a rezisztenciavizsgálat megismétlendõ. A beteg akkor tekinthetõ gyógyultnak, ha a kezelés alatt, illetve annak befejezése után megfelelõ számú negatív tenyésztési lelettel igazolták, hogy nem ürít baktériumot. 1. SZAKMAI HÁTTÉR A mikobakteriológiai laboratóriumok alapvetõ szerepet játszanak a tuberkulózis elleni hatékony védekezésben, hiszen a definitív klinikai diagnózis felállításához nélkülözhetetlen feltétel a kórokozó baktérium izolálása és identifikálása. A mikobakteriológiai vizsgálatok elengedhetetlen információkat szolgáltatnak az antituberkulotikus kezelés összetételének meghatározásához, valamint a kezelés hatásosságának monitorozásához is, részben a kórokozó kimutathatóságával, részben az izolálást követõ rezisztenciavizsgálatok eredményeivel. Magyarországon a bakteriológiailag igazolt tbc-betegek aránya évek óta mindössze 46% körüli értéken van. Ennek okai között szerepet játszik, hogy az ország legtöbb tbclaboratóriumában jelenleg alkalmazott bakteriológiai módszerek érzékenysége nem megfelelõ, illetve hogy a betegek egy jelentõs százalékában (bakteriológiailag negatív esetek egyharmadában) egyáltalán nem készül tenyésztés, illetve az adatközlés nem megfelelõ. További gond, hogy a tenyésztés és az ebbõl végzett rezisztenciameghatározás átfutási ideje klinikai szempontból elfogadhatatlanul hosszú. Így a terápiarezisztens betegek idõbeni felismerése, illetve érzékeny Mycobacterium okozta fertõzés esetében a kezelés 8. hetének végén szükséges gyógyszer-kombináció szûkítés, valamint a kezelés hatékonyságának megfelelõ monitorozása megoldatlan. Ezt a megállapítást támasztják alá a gyógyeredmények, melyek szerint a gyógyult betegek aránya nem éri el a 60%-ot, a nemzetközi 80%-os elvárásokkal szemben. 2. BAKTERIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK 2.1. Mintavétel, mintatovábbítás, tárolás (1 3) A tuberkulózis és az egyéb mycobacterialis fertõzések megbízható, pontos és fõleg gyors mikrobiológiai diagnosztikájának alapja a megfelelõ mennyiségû, minõségû és kellõ számú minta továbbítása a laboratóriumba. Az inadekvát mintavételbõl fakadó problémákat a legmodernebb molekuláris biológiai módszerek sem képesek kiküszöbölni. Nagyon fontos, hogy a minták késedelem nélkül megérkezzenek a laboratóriumba, mivel egyes vizsgálatok átfutási idejét (pl. mikroszkópos vizsgálat és direkt nukleinsav-amplifikáció eredménye 24 órán belül) és minõségét (tenyészetek befertõzõdése) nagyban befolyásolhatja, ha a vizsgálati anyagot a laboratórium mintavételt követõ 24 48 órán belül nem kapja kézhez. Mikobakteriológiai vizsgálatra alkalmatlan a nyálköpet, a gyûjtött köpet, a tamponnal vett garat és sebváladék. A reggeli, ébredés utáni köpet begyûjtésére kell törekedni. A felköhögött köpetet a beteg ürítse az erre a célra rendszeresített steril edénybe. A legmegfelelõbb a 30 50 ml térfogatú, steril, milliliteres beosztású, kónuszos aljú, csavaros fedelû, mûanyag centrifugacsõ. Optimális esetben a köpet 5 10 ml térfogatú. Ügyelni kell a mintavételi csövek megfelelõ címkézésére az azonosíthatóság érdekében. A mintavételi edények 1 2 órán át szobahõmérsékleten, 24 72 órán át 2 8 C-on, hûtõben tárolandók. Nagyobb nyári meleg esetén érdemes azonnal hûtõszekrényben tárolni a mintákat. Amennyiben a laboratórium nem házon belül van, akkor a centrifugacsöveket jól zárható fémtartályokba, majd ezeket papírdobozba csomagolva a megfelelõ kísérõ papírokkal ellátva kell továbbítani a laboratórium részére. INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 2 2009. NOVEMBER

INFEKTOLÓGIA Egyebekben a 121/2000 Postaügyi értesítõ 32. Fertõzõ anyagok kezelése címû utasítása a mérvadó. A kísérõlap feltétlenül tartalmazza a beteg adatai mellett, hogy a kért vizsgálat célja a diagnózis felállítása/megerõsítése vagy a kezelés eredményességének ellenõrzése. Fel kell tüntetni azt is, hogy korábban tuberkulózis miatt nem kezelt, vagy tuberkulózis miatt már korábban is kezelt betegtõl származik-e a vizsgálatra küldött minta. Ha ismert, fel kell sorolni azokat az antituberkulotikumokat (legfõképpen a rifampicin vonatkozásában) is, amelyekre a beteg izolátuma a korábbi vizsgálatok során rezisztens volt. Utóbbi információk kiemelten fontosak a rezisztenciavizsgálatok indítása és értékelése szempontjából a laboratórium és a klinikus számára is. Amennyiben a beteg alkalmatlan értékelhetõ köpet adására, úgy meg lehet kísérelni hipertóniás (5 10%) sóoldattal való inhaláltatást követõen ún. indukált köpet gyûjtését, illetve ébredés utáni, még az ágyban levett éhgyomori gyomorbennék-aspirátum (és nem mosás) nyerését. Négy órát meghaladó tárolás esetén a gyomorsav mycobacteriumokat is elölõ hatását 100 mg steril szódabikarbóna segítségével semlegesíteni kell. A köpeten kívül a leggyakrabban beküldött minták a következõk: bronchusmosó folyadék, bronchoalveolaris lavage, pleuralis, pericardialis vagy ascitesfolyadék (steril edényben, utóbbi három esetében 0,2 mg/ml steril heparin hozzáadásával vagy közvetlenül folyékony táptalajba oltva), vizelet (>40 ml, reggeli középsugaras vagy katéteres, nem gyûjtött, nem katéterzsákból, kellõ genitális toalettet követõen), széklet (>1 g), liquor (>2 5 ml), seb vagy tályogváladék (steril fecskendõbe felszíva, amennyit csak lehetséges), menstruációs folyadék, biopsziás minta (nem formalinba ágyazott, csak fiziológiás sóoldatban). A ritkábban elõforduló minták esetében a mintavétel elõtt érdemes a laboratórium tanácsát kérni a mintavételi, tárolási és szállítási elõírásokat illetõen. A mikroszkópos vizsgálatokat minden esetben három különbözõ alkalommal levett mintából, a tenyésztéseket öt különbözõ alkalommal levett mintából kell végezni. 2.2. A minta elõkezelése: homogenizálás, dekontaminálás (1 4, 6) A minta elõkezelése, homogenizálása, dekontaminálása a fertõzésveszély elkerülése érdekében laminális bokszban (minimálisan BSL2) kell történjen. A mycobacteriumok osztódási ideje meglehetõsen hosszú (16 20 óra) ezért a nem steril testtájékokról származó minták (pl. köpet, vizelet, széklet) nem mycobacterialis, ún. kontamináns baktériumai számottevõen gyorsabb növekedési ütemüknek köszönhetõen könnyen túlnõhetik az adott klinikai minta mycobacteriumait. Az álnegatív eredmények elkerülése céljából a mikobakteriológiai laboratóriumok ezeket a klinikai mintákat ún. dekontaminációs eljárásnak vetik alá. A dekontamináció steril minták esetében (pl. liquor, pleuralis folyadék) nem szükséges. A dekontaminálás során alkalmazott vegyszerek a kontamináns baktériumok vagy gombák elölésén kívül segítenek a gyakran erõsen purulens minták homogenizálásban, valamint a centrifugálási lépések közbeiktatásával azok koncentrálásában is. A dekontaminálás hatékonyságát befolyásolja az alkalmazott reagens toxicitása, expozíciós ideje és a centrifugálási lépés során keletkezõ hõ károsító hatása. Mindezektõl függõen még a legenyhébbnek számító dekontaminálási módszer a N-acetil-L-cisztein-NaOH (NALC- NaOH) is elpusztítja a minta Mycobacteriumtartalmának legalább 33%-át, míg erõsebb reagensek (pl. klórhexidin-diglükonát) alkalmazása esetén ez az érték könnyen 70%- ra emelkedhet, ami jelentõsen csökkentheti a tenyésztés érzékenységét. A táptalajbeszennyezõdés mértékébõl következtetni lehet az alkalmazott eljárás helyességére. Így szilárd táptalajon a 3%-nál alacsonyabb, ill. folyékony táptalajt használva az 5 8%-nál alacsonyabb kontaminációs ráta esetén a dekontaminálás túl erõs, míg az ezen értékek feletti arány túl gyenge dekontaminálásra utal. 3 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS Többféle elõkezelési technika ismert. A hazai tbc-tenyésztéssel foglalkozó laboratóriumok 1976 óta egységesen a klórhexidin-diglükonátos eljárást alkalmazzák, ami a maga idejében egyszerûsége, olcsósága miatt megfelelõ választás volt. A módszer nem túl munkaigényes, egyszerûen kivitelezhetõ, nem kell a vizsgálati anyagot centrifugálni, semlegesíteni, ezért tömeges minta feldolgozására is kiválóan alkalmas. Számításba kell azonban venni, hogy közel 30 évvel ezelõtt a laboratóriumok a mai mintaszámnak több mint hússzorosát dolgozták fel. A módszer hátránya, hogy jobban károsítja a mycobacteriumokat, mint a NALC-NaOHtechnika, és csak szilárd alapú tenyésztéshez alkalmazható. A két eljárás összehasonlító vizsgálata szerint a LJ-en történõ tenyésztés pozitivitásának aránya közel duplájára emelkedett a NALC-NaOH-elõkezelés mellett. A klórhexidines módszer folyékony táptalajon történõ tenyésztésre alkalmatlan (roncsolja a táptalajt), így napjainkban az újabb folyékony alapú táptalajok hazai elterjesztésének gátjává vált. Ezen okok miatt a CDC, valamint a jelentõsebb nyugat-európai mikobakteriológiai referencialaboratóriumok is a NALC-NaOHelõkezelést ajánlják. A folyékony tenyésztõrendszerek rutinszerû alkalmazásának feltétele az adekvát elõkezelési technika használata, ezért elengedhetetlen ennek az új módszernek a fokozatos hazai bevezetése. Bizonyos betegcsoportok megkülönböztetett figyelmet igényelhetnek a dekontaminálás vonatkozásában. Így például a cisztikus fibrosisban szenvedõ betegek légúti mintájából egyre gyakrabban izolálják a klinikai szignifikanciával (pl. transzplantálhatóság kérdése) bíró nem tuberkulózist okozó Mycobacterium-ot (NTM). Azonban a betegek 80%-ánál a minta P. aeruginosá-t is tartalmaz, amely könnyedén túlnövi a tenyésztés során a mintában jelen lévõ NTM-ot, és álnegatív tenyésztéshez vezet még a rutinszerûen alkalmazott dekontaminálási módszerek mellett is. Ezért az ilyen betegek esetében speciális 5% oxálsavas kezeléssel kiegészített dekontaminálás javasolt. 2.3. Direkt vizsgálatok 2.3.1. Mikroszkópos vizsgálatok (1 3, 6, 9 12) A direkt mikroszkópos vizsgálat a mikobakteriológiai vizsgálatok legolcsóbb, legegyszerûbben kivitelezhetõ és leggyorsabb módszere. Egyes laboratóriumokban a minta a dekontaminálás elhagyásával, közvetlenül kerül mikroszkópos vizsgálatra, az így készült keneteket direkt keneteknek, az így végzett vizsgálatotokat direkt mikroszkópos vizsgálatnak nevezzük. A mikroszkópos vizsgálat leggyakoribb módja azonban, hogy a mintákat dekontaminálják, és a mikroszkópos kenet nem közvetlenül a klinikai mintából, hanem a minta elõkezelt, centrifugált üledékébõl készül. Magasabb érzékenysége miatt a direkt módszerrel szemben ez a módszer választandó, azonban tudni kell, hogy a dekontaminálás során felhasznált steril desztillált víz tartalmazhat elölt saválló környezeti baktériumokat, amelyek fals pozitívvá tehetik a kenetet, ezért ilyenkor szûrt, steril desztillált víz használata ajánlott. A kenetkészítést követõen a festés a Ziehl- Neelsen (ZN), Kinyoun-féle karbolfukszinalapú vagy auraminalapú fluoreszceineljárásokkal történhet. A Kinyounféle festés alacsony érzékenysége miatt nem ajánlott módszer. A ZN-festést követõen a mycobacteriumok vörös pálcákként észlelhetõek a kék vagy zöld háttér kontrasztja mellett. Az auraminfestést követõen a mycobacteriumok sárgászölden fluoreszkálnak fekete háttér mellett. A fluoreszceinmikroszkópia elsõsorban azon laboratóriumok számára ajánlható, amelyek nagy esetszámmal dolgoznak. A sötét háttér mellett ugyanis a mycobacteriumok könnyebben észlelhetõk, a fluoreszcens mikroszkóp látótere nagyobb, mindezek miatt egy-egy kenet áttekintése gyorsabb. Ez a módszer azonban még a ZNvizsgálathoz képest is nagyobb gyakorlatot igényel, a kevésbé tapasztalt vizsgáló gyakran jelez vissza álpozitív eredményt, a fluoreszcein festékrögöket nézve baktériumnak. Emellett a fluoreszcens festés a karbolfukszinhoz képest sokkal jobb hatásfokkal képes megfesteni az antituberkulotikus kezelés miatt már INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 4 2009. NOVEMBER

INFEKTOLÓGIA károsodott saválló baktériumokat, így a mikroszkópos pozitivitás a fluoreszcens festés mellett hosszabb ideig detektálható egy kezelt beteg esetében, amely nem feltétlenül jelenti azt, hogy a kezelés inadekvát vagy a beteg még mindig fertõzõ. További eltérés a ZNfestéshez képest, hogy a mintában esetlegesen jelen lévõ vér álpozitivitást okozó fluoreszcenciát eredményezhet. Mindezek miatt minden újonnan felismert beteg esetében a fluoreszcens mikroszkópos pozitivitást ZNvizsgálattal meg kell erõsíteni. 2.3.1/a Módszer érzékenysége, specificitása A mikroszkópos vizsgálat legnagyobb hátránya, hogy nem kellõen érzékeny, és a negatív eredmény kiadásához minimum 100 300 látótér áttekintése szükséges, ami meglehetõsen munkaigényes. A mikroszkópos vizsgálat érzékenysége az adott betegpopuláción belül a kiterjedt tuberkulózisban szenvedõ betegek hányadától, a vizsgált minta típusától (felsõ légúti vs. mély légúti), a mintagyûjtés minõségétõl, a Mycobacteriumok mintán belüli számától, az alkalmazott dekontaminálási és centrifugálási módszertõl (citocentrifugálás), a centrifuga minõségétõl (legalább 3000 x g) függõen 50 75%. Míg a pozitív mikroszkópos eredmény a tuberkulózis preszumptív diagnózisa mellett szól, addig a negatív eredmény, az alacsony érzékenységi mutató miatt, nem zárja ki a tuberkulózis lehetõségét. Legalább 10 000 Mycobacterium milliliterenkénti jelenléte szükséges ahhoz, hogy egy kenet teljes átvizsgálását követõen legalább néhány saválló pálcát találjunk. A mikroszkóposan pozitív betegek tehát megkülönböztetett figyelmet igényelnek, hiszen az általuk ürített baktériummennyiség miatt ezek a betegek a legfertõzõbbek. Éppen ezért, hogy az ilyen esetben szükséges izolációs lépések idõben foganatosíthatóak legyenek, a mikroszkópos vizsgálat eredményét a laboratórium 24 órán belül vissza kell jelezze a vizsgálatkérõ számára. Nem szabad elfeledkeznünk azonban arról a tényrõl sem, hogy a mikroszkópia nem képes különbséget tenni élõ és élettelen Mycobacterium között. Így egy megfelelõen kezelt és ellenõrzött beteg esetében a mikroszkópos vizsgálat negatívvá válást követõ esetleges pozitivitása nem feltétlenül a klinikai romlás jele. Ugyancsak fontos szem elõtt tartani azt a tényt is, hogy a mikroszkópos vizsgálat nem tud különbséget tenni a M. tuberculosis-komplex és a NTM-ok között. Azaz a kenetpozitivitás atípusos Mycobacterium jelenlétének eredménye is lehet, ami nem biztos, hogy klinikai fontossággal bír. Egy hazai felmérés szerint ugyan Magyarországon a mikroszkópos vizsgálat pozitivitásának hátterében az esetek több mint 90%-ában M. tuberculosis jelenléte igazolható tenyésztéssel, de HIV-fertõzött vagy egyéb immunszupprimált betegek esetében vagy olyan földrajzi területeken, ahol bizonyos NTM elõfordulási gyakorisága magas, mindig gondolni kell NTM jelenlétére is. Emellett az aerob Actinomycetaceae-k, Legionellák egyes fajai is saválló pozitivitást mutathatnak. Mindezek miatt a mikroszkópos vizsgálat eredményét saválló baktérium pozitív vagy negatív megjelöléssel kell visszajelezni. 2.3.1/b Minõségbiztosítás Pozitív és negatív kontrollt kell alkalmazni minden új festék charge használatánál. Minden kenet pozitív mintát és a negatívak legalább 10%-át egy második vizsgálónak ellenõriznie kell. Ugyancsak figyelemmel kell kísérni a mikroszkóposan pozitív és tenyésztéssel negatív betegek arányát is. Az ilyen betegek (elsõsorban az újonnan nyilvántartásba vett betegekrõl van szó) arányának kevesebb mint 1%-nak kell lennie. Az ennél magasabb arány dekontaminálási, tenyésztési (táptalajminõség, rövid inkubációs idõ) hibát, nehezen tenyészthetõ NTM (pl. M. haemophilum, M. genavense) jelenlétét vagy laboratóriumi keresztfertõzést jelezhet. 5 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS 2.3.2. Direkt nukleinsav-amplifikációs módszerek (2, 6, 7, 12, 14, 15) A direkt nukleinsav-amplifikációs módszereknek (DNAM) a mikobakteriológiában való alkalmazása a lassan tenyészthetõ M. tuberculosis és a bizonyos speciális tenyésztési feltételeket igénylõ, ezért nehezen izolálható NTM-ok direkt (közvetlenül a klinikai mintából) történõ detektálásának gyors, 24 órán belüli kivitelezésének lehetõségét teremtette meg. A módszer minden mintából történõ rutinszerû alkalmazása szükségtelen. Mikroszkópos vizsgálattal pozitívnak bizonyuló mintából csak akkor javasolt a teszt elvégzése, ha olyan betegrõl van szó, akinél NTM kóroktani szerepe vetõdik fel (pl. HIVfertõzött, transzplantált beteg, cisztikus fibrosis). A tesztek érzékenysége a mikroszkóposan pozitív légúti minták esetében közel 100%. Mikroszkóposan negatív beteg esetében csak akkor végezzünk ilyen vizsgálatot, ha a tuberkulózis diagnózisának felállítása komoly differenciáldiagnosztikai problémát jelent a rendelkezésre álló egyéb klinikai adatok tükrében. A tesztek érzékenysége ezen betegcsoport esetében függ az alkalmazott módszertõl, mérvadó irodalmi adatok alapján 70 90%. Az eredmények értékelése mindig individuálisan történjék. Elengedhetetlen, hogy a direkt nukleinsavamplifikációs vizsgálatra kerülõ mintákból a mikroszkópos és tenyésztéses vizsgálatokat is elvégezzék. A módszerek légúti vizsgálati anyagokra vannak validálva, érzékenységük extrapulmonalis minták esetében alacsonyabb. Extrapulmonalis kórképekben a módszer szenzitivitását jelentõsen csökkenti a minta jellemzõen alacsonyabb csíraszáma és az amplifikációt gátló inhibitorok jelenléte, amelyek aránya szignifikánsan magasabb, mint a légúti anyagokban. A központi idegrendszer tuberkulózisa a humán gümõkór legveszélyesebb formája, ezért ebben a kórképben a gyors diagnózis felállítása kiemelkedõen fontos. A publikált esetek alacsony száma és a módszerek elégtelen szenzitivitása miatt a meningitis basilaris diagnózisának gyors felállítására jelenleg nincs nemzetközileg ajánlott módszer. Az utóbbi idõben megjelent metaanalízis megállapítása szerint a DNAM-technikák érzékenysége extrapulmonalis esetekben a vizsgálóhelyektõl és -módszerektõl függõen széles határok között (27 85%) mozog. Meningitisben átlagosan 56% körüli. A Pulmonológiai Szakmai Kollégium a módszerek indikációjára vonatkozó, 2000-ben kiadott korábbi állásfoglalása továbbra is mérvadó. Ennek megfelelõen a DNAM indikációi: mikroszkóposan negatív, akut súlyos állapotú betegnél tuberkulózis gyanúja esetén (pl. lélegeztetést igénylõ pneumónia); bármilyen rendkívüli sürgõsséget igénylõ esetben (pl. nem tüdõbeteg-ellátó intézmény ellátására szoruló beteg esetében); mikroszkóposan pozitív immunszupprimáltaknál NTM-fertõzés fokozottabb veszélye miatt; szervtranszplantált betegeknél; fertõzési veszély vélelmének kizárására fokozottan veszélyeztetettek védelmében (mikroszkópos negativitás mellett). A DNAM legfontosabb elõnye, hogy 6 8 órán belül elvégezhetõek, ezért a klinikus részérõl elvárható, hogy az eredményeket még a mintafeldolgozás napján, de legkésõbb 24 órán belül visszajelezzék. Jelenleg többféle kereskedelmi teszt van forgalomban (Amplicor PCR-Roche Molecular Systems, Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test AMTD-Gen-Probe Inc., BDProbeTec-Becton-Dickinson, GenoType Mycobacteria Direct-HAIN, Genotype MTBDRplus-HAIN), amelyek a minta elõkezelésébõl, nukleinsav izolálásából, amplifikációból és detektálásból állnak, és minden egyes kit lépésenként más-más módszert alkalmaz. Egyes tesztek csak a M. tuberculosis-komplexet detektálják, mások a M. tuberculosis-komplexet és az izonicid- INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 6 2009. NOVEMBER

INFEKTOLÓGIA (INH) és a rifampicin- (RMP) rezisztenciához társuló mutációkat is, és megint mások a M. tuberculosis-komplexen belüli specieseket, ill. a gyakori és klinikailag releváns nem tuberkulózist okozó mycobacteriumokat (NTM) is képesek kimutatni. A módszerek szenzitivitása alapvetõen a kenet pozitivitásának függvénye, de az alkalmazott tesztenként is változó. 2.4. Tenyésztés (1 6, 9, 11, 12) A mikobakteriológiai vizsgálatok következõ lépése a dekontaminált minta tenyésztése, amely továbbra is nélkülözhetetlen a következõ okok miatt: a tenyésztés érzékenysége nagyságrendekkel nagyobb, mint a mikroszkópos vizsgálatoké; a M. tuberculosis-komplexen belüli differenciáláshoz, a különbözõ NTM azonosításához, a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok elvégzéséhez (DNS-ujjlenyomat vizsgálata) megfelelõ mennyiségû biomasszára van szükség, amelyet a tenyésztés biztosít; a rezisztenciavizsgálatok elvégzéséhez élõ kórokozót ugyancsak a tenyésztés biztosít. A mycobacteriumok izolálására használt talán legismertebb táptalaj a tojásalapú, szilárd Löwenstein Jensen (LJ)-táptalaj. Az agaralapú táptalajok, mint amilyen a Middlebrook 7H10 vagy 7H11 agar, a LJ-táptalajhoz képest a némileg gyorsabb tenyésztési idõ és a transzparenciájuk folytán megvalósítható egyszerûbb kolóniamorfológia-vizsgálat lehetõsége miatt kedveltek. Mindazonáltal, ezeken a hagyományos szilárd táptalajokon a M. tuberculosis telepei általában 3 6 hét elteltével jelennek csak meg. Az izolálást követõ identifikálás, majd rezisztenciameghatározás további 3 6 héttel növelheti ezt az amúgy is tetemes tenyésztési idõt. Mindemellett vizsgálatok azt is igazolták, hogy csak szilárd táptalajon tenyésztve a klinikailag egyértelmûen tuberkulózisként diagnosztizált betegek mintáinak mintegy 20 30%-ában nem sikerült a M. tuberculosis izolálása. Ez az adat világosan jelzi, hogy a szilárd táptalajon való tenyésztés érzékenysége, bár lényegesen jobb, mint a mikroszkópos vizsgálaté, mégsem haladja meg a 70 80%-ot. A CDC és a WHO jelenlegi ajánlása az, hogy a TBC izolálása, identifikálása, valamint az ezt követõ rezisztenciavizsgálatok lehetõleg a mintavétel idõpontjától számított 2 3 (izolálás, identifikálás), illetve 2 5 (rezisztenciameghatározás) héten belül történjenek meg. Ez az átfutási idõ nélkülözhetetlen ahhoz, hogy a klinikus a kezelés nyolcadik hetének végén el tudja dönteni, hogy az alkalmazott négyes kombinációból biztonsággal elhagyhatja-e a pirazinamidot (PZA) és az etambutolt (EMB). Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen, nélkülözhetetlen az újabb, folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerû alkalmazása. Folyékony táptalajon tenyésztve a tenyésztési idõ a minta Mycobacterium tartalmától függõen 1 3 hétre rövidíthetõ. Emellett a folyékony táptalajok szenzitivitása 90% feletti. Hátrányuk, hogy jóval hajlamosabbak a befertõzõdésre. 2.4/a A módszer érzékenysége Bár a folyékony táptalajok alkalmazása jelentõsen csökkenteni képes a tenyésztési idõt, szilárd táptalajra azért továbbra is szükség van, mivel bizonyos törzsek nem növekednek jól folyékony miliõben. A tenyésztés érzékenységét jelentõsen befolyásolja a szilárd táptalaj ph-értéke is. Felmérések azt jelzik, hogy a rutinszerûen alkalmazott ph 7-es LJtáptalaj nem felétlenül alkalmas minden Mycobacterium optimális tenyésztésére. Így olyan helyeken, ahol bizonyos NTM okozta megbetegedések gyakoribbak (pl. HIVfertõzöttek) vagy endémiásak, szükség lehet egy savanyú ph-érékû LJ-re vagy a ph 6 értékû Ogawa (Japánban elterjedt tojásalapú táptalaj) táptalajra való leoltásra is. A szilárd táptalaj további elõnye, hogy a növekedés kvantitatív formában is visszajelenthetõ, a kolóniamorfológia és a pigmenttermelés is vizsgálható, illetve kellõ biomassza biztosítható az identifikálást segítõ biokémiai tesztekhez. 7 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS Önmagában tehát sem a szilárd, sem a folyékony táptalaj érzékenysége nem éri el a 100%-ot, azaz mindkét táptalajtípus esetében elõfordulhatnak olyan törzsek, amelyek vagy csak az egyik, vagy csak a másik táptalajtípuson képesek növekedni. Ez az oka, hogy jelenleg a nemzetközi ajánlásoknak megfelelõen a mycobacteriumok izolálása szilárd és folyékony táptalaj kombinációján kell alapuljon a kórokozó minél gyorsabb és érzékenyebb detektálása, valamint a rezisztenciavizsgálatok minél gyorsabb elvégezhetõsége érdekében. Amennyiben a beoltott szilárd vagy folyékony táptalajokon növekedés nem észlelhetõ, úgy negatív tenyésztési eredmény 8, illetve 6 hetes inkubálást követõen adható ki. 2.4/b Minõségbiztosítás az elõkezelési és tenyésztéses vizsgálatok ellenõrzéséhez Általános: összes eszköz és berendezés szabályozott idõközönkénti kontrollvizsgálatát el kell végezni, különös tekintettel a laminális bokszokra és a centrifugákra. Naponként: reagensek lejárati idejének kontrollja: a NALC-ot mindig a munkafolyamat kezdetén kell a NaOH-hoz adni, NALC- NaOH oldatot 24 órán túl nem szabad felhasználni; monitorozni kell a szennyezett minták százalékos elõfordulását: ha 10 elõkezelt mintát véres táptalajra inokulálunk, 24 48 óra múlva szennyezõ baktérium nem, ill. minimális mennyiségben tenyészhet csak ki; ha ismételten azonos szennyezõ baktérium tenyészik ki, ellenõrizni kell az összes felhasznált reagens sterilitását; a dekontaminálás kezdetén és végén 1-1 csõ (5 ml) steril desztillált víz, ill. fiziológiás sóoldattal is el kell végezni a munkafolyamatot; az elõkezeléshez használt reagenseket a munkafolyamat elõtt véres agárra kell oltani; ellenõrizni kell a táptalajok és reagensek lejárati idejét; minden új, házilagosan gyártott táptalaj charge minõségi vizsgálatát M. fortuitum (ATCC 6841), egy gyorsan növõ NTM-mal ajánlott elvégezni; a kereskedelmi forgalomban kapható, minõségbiztosítási bizonylattal ellátott táptalajokat nem szükséges ellenõrizni, de a felhasznált táptalajok gyártási számát fel kell jegyezni. Hetente: meg kell határozni a szennyezett tenyészetek százalékos elõfordulását. Szilárd táptalaj esetén az >5%, folyékony táptalaj esetén a >8 10% kontamináció inadekvát elõkezelési munkafolyamatra utal. A <3% szennyezõdés túl erõs dekontaminációt jelez. Havonta: monitorozni kell a M. tuberculosis-pozitív tenyészetek számát; monitorozni kell a kenetben pozitív és tenyésztéssel negatív minták számát; ha az ilyen minták száma meghaladja az 1%-ot, ez túl erõs elõkezelésre, megfelelõ minõségû táptalajokra, különleges igényû mycobacteriumokra vagy antituberkulotikum kezelés alatt álló beteg mintájára utal; monitorozni kell a kenetnegatív, tenyésztéssel pozitív minták számát. Az elvárhatóság kb. 30%; monitorozni kell a kenetnegatív és mindössze egy pozitív tenyészettel rendelkezõ betegek számát; monitorozni kell a kenetben és tenyésztéssel is pozitív esetek arányát; az elvárt mérték 95%; monitorozni kell a tenyészetek pozitívvá válásának idejét külön a szilárd és folyékony táptalajok esetében mind kenetpozitív, mind kenetnegatív mintáknál. A fenti értékektõl való szignifikáns eltérés nem megfelelõ elõkezelési eljárásra vagy fals pozitív tenyészetek elõfordulására utal. INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 8 2009. NOVEMBER

INFEKTOLÓGIA Fals pozitív tenyészetek elõfordulása kenetpozitív mintákkal történõ kontamináció következtében A mikobakteriológiai laboratóriumokban az elõkezelési és tenyésztéses eljárások során a vizsgálati anyag keresztfertõzése következtében fals pozitívvá válhat. A fals pozitív tenyészetek elfogadható aránya kb. 3%. A keresztfertõzés létrejöhet az elõkezelõ szer adagolása vagy a semlegesítés során az aeroszolképzõdés miatt, esetleg a reagens csövek vagy oldatok kontaminálódhatnak saválló baktériummal. Ez utóbbiak könnyen szennyezõdhetnek a vízben gyakran elõforduló atípusos Mycobacteriumokkal (M. gordonae, M. xenopi), ha a felhasznált víz nem volt steril. A vizsgálati anyagok átfertõzõdésének esélyét csökkenti, ha a laminális bokszban kisebb mennyiségû reagenst használunk, a manipulációk során alkalmanként csak egy minta csöve van nyitva, és a centrifugacsövek zárókupakját lassan nyitjuk ki az aeroszolképzõdés csökkentése érdekében. 2.5. Identifikálás (1 3, 6, 11, 12) 2.5.1. Identifikálás hagyományos módszerrel A különbözõ Mycobacterium-fajok egymástól való elkülönítésének, identifikálásának hagyományos útját a különbözõ hõmérsékleti szinteken mutatott növekedési sajátságok, a telepmorfológia és pigmenttermelés vizsgálata, valamint különbözõ enzimaktivitás vagy növekedésgátlás kimutatását célzó biokémiai reakciók elvégzése jelenti. Ezeknek a hagyományos identifikálási teszteknek a legnagyobb hátránya, hogy elvégzésük jelentõs mennyiségû biomasszát igényel, amely szubkultúrákra való átoltással és a primer izolálást követõen még további többhetes tenyésztéssel és idõveszteséggel jár. Emellett a vizsgálatok elvégzése munkaigényes, az eredmények értékelése sok esetben szubjektív. Az utóbbi évek során nagy számban írtak le olyan új NTM-törzseket, amelyek identifikálása a hagyományos módszerek segítségével egyáltalán nem lehetséges, ezeket a fajokat csak az új molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával lehet felismerni. Mindezen okok miatt a hagyományos identifikálási módszerek szerepe világszerte igen jelentõsen visszaszorulóban van. A M. tuberculosiskomplex identifikálására és az ehhez szükséges alapvetõ hagyományos identifikálási módszerek elvégzésére (niacin-, nitrát-reduktáz-teszt) minden mikobakteriológiai laboratóriumnak képesnek kell lennie. Az átfutási idõ mérséklésére azonban hazai viszonylatban is meg kell teremteni a molekuláris vagy egyéb gyors identifikálási módszerekhez való hozzáférés lehetõségét legalább a magasabb kompetenciájú, regionális laboratóriumok számára. 2.5.2. Identifikálás molekuláris biológiai és egyéb technikákon alapuló módszerekkel A kereskedelmi forgalomban napjainkban többféle identifikáló teszt kapható, amelyek különbözõ géntechnikai, kromatográfiás vagy tömegspektrográfiás módszert alkalmaznak a Mycobacterium speciesek azonosítására. 2.5.2.1. Nukleinsav-hibridizációs módszer A kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ AccuProbe (Gen-Probe Inc., San Diego, CA) nukleinsav-hibridizációs teszt bevezetése jelentõsen meggyorsította a M. tuberculosiskomplex, a M. avium-komplex, a M. gordonae és a M. kansasii identifikálását. Mivel a teszt nem alkalmaz amplifikációs lépést, így közvetlenül a klinikai mintából való kórokozó kimutatásra alkalmatlan, pozitivitásához legalább 10 5 számú baktérium jelenléte szükséges. A teszt azonban kiválóan alkalmas a pozitív folyékony vagy szilárd tenyészetek esetében (ahol a teszt érzékenységéhez szükséges baktériummennyiség többszöröse rendelkezésre áll) a kitenyészett saválló baktérium identifikálására 1 2 órán belül. 9 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS 2.5.2.2. Reverz hibridizáción alapuló identifikáló tesztek A tesztek során egy speciális DNS-szakaszt sokszorozunk PCR segítségével, majd a DNSterméket egy tesztcsíkon elhelyezett, az egyes mycobacteriumokra specifikus próbákkal hibridizáltatjuk. Ez a rendszer a GenoType MTB-HAIN módszer esetében a M. tuberculosis-komplexen kívül az összes jelenleg ismert klinikailag szignifikáns NTM kimutatására is alkalmas. Az InnoLipa (Innogenetics) módszerrel a M. tuberculosiskomplex, a M. avium, a M. intracellulare, a M. kansasii, a M. xenopi, a M. gordonae, a M. scrofulaceum és M. chelonae azonosítható. 2.5.2.3. DNS szekvenálás A DNS-szekvenálás a mycobacteriumok identifikálásának jelenleg a legpontosabb módszere. Az egyes törzsek azonosításán kívül információval szolgál az egyes fajok filogenetikájáról és rokonsági fokáról is. A DNS-szekvenálás során egyes gének olyan fajspecifikus szakaszainak bázissorrendjét határozzák meg, amelyet azután már ismert és jól karakterizált törzsek bázissorrendjével vetnek össze. A referencia bázissorrendadatbázis összeállítása történhet házilagosan, de kereskedelmi forgalomban árult adatbázisok is rendelkezésre állnak. A rutinalkalmazásban mintegy referenciamódszerként legelterjedtebb DNS-szekvenálás a 16S rrns hipervariábilis régiójának vizsgálatán alapszik. Automata DNSszekvenáló mûszer segítségével a vizsgálat 1 3 nap alatt elvégezhetõ. A DNS-szekvenálás lehetõvé tette olyan NTM-fajok felfedezését is, amelyek nem vagy nagyon nehezen tenyészthetõek, potenciálisan patogének vagy egyelõre még nem kellõen karakterizáltak, nem minden szempontból ismertek (patogenitás, rezervoár, transzmisszió stb.). A módszer alkalmazása referencialaboratóriumban indokolt. 2.5.2.4. Magas hatékonyságú folyadékkromatográfia (high-performance liquid chromatography; HPLC) A Mycobacterium sejtfala fajonként változó és specifikus mikolsav összetételének gyors és pontos vizsgálati lehetõségét kínálja a HPLC, amellyel számos ismert, sõt új, korábban még azonosítatlan Mycobacterium-faj identifikálása lehetséges. A HPLC berendezés megléte esetén a mérés olcsó és gyors, 2 órán belül elvégezhetõ. A módszer hátránya, hogy a szükséges mûszer költséges és az eredmények értékelése gyakorlatot, nagy tapasztalatot igényel. A módszer alkalmazása referencialaboratóriumban indokolt.. 2.5.2.5. A tömegspektrometriás módszer egy olyan új, modern technika, amellyel a lézerrel ionizált sejtkomponensek tömegét mérik, az eredményt egy detektoron regisztrálják, így megkapják az egyes speciesekre jellemzõ spektrumprofilt. Egy szoftver segítségével a spektrumprofil alapján a törzs beazonosítható. A módszer alkalmazása referencialaboratóriumban indokolt. 2.5.2.6. A Capilia TB Test (Tauns, Numazu, Japan Nippon Becton-Dickinson Tokio) Az egyszerû és gyorsan elvégezhetõ, immunokromatográfiás assay a M. tuberculosiskomplexet különíti el a NTM-törzsektõl. A módszer a M. tuberculosis-törzsekre specifikus MPB64 protein és a gén által termelt monoklonális antitestek reakcióján alapszik. Pozitív reakció esetén a cellulózmembránhoz kötött anti-mpb64 monoklonális antitestek reakcióba lépnek a MPB64 proteinnel, és 15 percen belül egy piros gyûrû válik láthatóvá. A módszer specificitása a vizsgálatok szerint 100%, és a szenzitivitása is 90% feletti. INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 10 2009. NOVEMBER

INFEKTOLÓGIA 2.6. A M. tuberculosis és a NTM genotipizálása, molekuláris epidemiológiai vizsgálómódszerek (2, 6) Az utóbbi években a DNS-ujjlenyomat vizsgálata, a PCR alapú spoligotyping és VNTR- MIRU (Variable Numbers of Tandem Repeats of Mycobacterial Interspersed Repetitive Units), valamint a tömegspektrometriás módszerek segítségével lehetségessé vált a M. tuberculosis nagy pontosságú tipizálása. A spoligotyping és VNTR-MIRU-technikák a PCR-rel amplifikált DNS-t detektálják. A spoligotipizálás dot blot módszerrel mutatja ki a speciális DR locuson a spacer szekvenciák jelenlétét vagy hiányát, a VNTR-MIRU a különbözõ számban ismétlõdõ mycobacterialis repetitív egységeket detektálja azok mérete alapján. Ezekkel a módszerekkel az izolátumok un. klaszterekbe sorolhatók, és a klonális tipizálásra kiválóan alkalmasak. A tömegspektrometriás módszerrel a lézerrel ionizált sejtfehérje-komponensek tömegét mérik, egy detektoron regisztrálják, így megkapják a Mycobacterium spektrumprofilját, azaz a specifikus ujjlenyomatát. Jelenleg a molekuláris epidemiológia arany standard módszere a DNSujjlenyomat Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)-vizsgálat. Az enzimemésztés során nyert fragmentumok molekuláris mérete oly módon variálódik, hogy két nem rokon M. tuberculosis-törzs egymástól eltérõ mintázatot mutat a jelölt IS6110-próbával való hibridizációt követõen. A DNS-ujjlenyomat vizsgálatát sikeresen alkalmazzák különbözõ járványok vizsgálatára, a tuberkulózis aktív transzmisszióját befolyásoló rizikótényezõk vizsgálatára (pl. antituberkulotikumrezisztencia), a konvencionális módszerekkel azonosíthatatlan kontaktok kiszûrésére és ezáltal a fertõzési lánc felderítésére, különbözõ veszélyeztetett szubpopulációkon belül a tuberkulózis transzmissziójának vizsgálatára és a laboratóriumi keresztfertõzések okozta téves diagnózisok kiszûrésére. Az ezekben a helyzetekben szükséges prevenciós lépések meghatározásához és megtételéhez hazánkban is szükséges a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok bevezetése legalább a referencialaboratóriumban. 2.7. Rezisztenciameghatározás (1 3, 8, 9, 11, 12) 2.7.1. Alapfogalmak Az eddigi genetikai vizsgálatok szerint a M. tuberculosis antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciájának megjelenéséért vagy a gyógyszer támadáspontját kódoló génekben, vagy a gyógyszer aktiválásáért felelõs enzimeket kódoló génekben kialakuló spontán pontmutációk a felelõsek. A rezisztenciával kapcsolatos pontmutációkat, deletiókat és inszerciókat az összes elsõ vonalbeli szernél (izonicid [INH], rifampicin [RMP], pirazinamid [PZA], etambutol [EMB]) és már néhány másodvonalbeli újabb szernél (sztreptomicin, etionamid, fluorokinolonok, makrolidek) is felismerték. Mindezek alapján nagy valószínûséggel kizárható egy olyan egyedüli gén jelenléte, amelynek mutációi önmagukban vezetnének a polirezisztens (rezisztencia RMP mellett több más antituberkulotikummal szemben) illetve az MDR (rezisztencia legalább INH-del és RMP-nel szemben; MDR) fenotípus kialakulásához. Az XDR Mycobacteriumtörzsek (rezisztencia RMP és INH mellett fluorokinolonokra, és iv. adagolható kanamycinra, capreomycinra és amikacinra) megjelenése és terjedése tovább erõsíti azt az igényt, hogy a rezisztenciavizsgálat minden elõször izolált törzs esetében megtörténjen. Úgy tûnik, hogy a MDR és XDR több, egymással párhuzamosan, illetve lépcsõzetesen kialakuló mutációk sorozatának az eredménye a különbözõ génszakaszokon. Rezisztencia leggyakrabban a nem megfelelõ gyógyszeres kombináció és dózis, a beteg nem megfelelõ compliance-a következtében, az egyébként természetes körülmények között is mindig elõforduló, de csak igen kis kópiaszámban jelen lévõ mutáns törzsek szelektálódásával alakul ki. A Nemzeti Tuberkulózis Program szabályozásának megfelelõen minden újonnan felismert, tuberkulózisban szenvedõ beteg elsõként izolált tenyészeteibõl kötelezõen rezisztenciavizsgálatokat kell végezni (kezdeti 11 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS rezisztenciavizsgálat). Ellenõrzõ rezisztenciavizsgálatok végzése akkor szükséges, ha a beteg kontrolltenyésztései a kezelés negyedik hónapja után is pozitivitást mutatnak, illetve ha radiológiai romlás vagy reaktiváció jelei észlelhetõk. Rezisztens Mycobacterium okozta infekció veszélye merül fel akkor, ha a beteg ismert rezisztens M. tuberculosis okozta infekcióban szenvedõ beteg kontaktja; a beteg korábban már antituberkulotikus kezelést kapott; a beteg az alkalmazott antituberkulotikus kezelés ellenére progressziót mutat (tenyésztései a három hónapos kezelés után is pozitívak); a beteg olyan országból származik, ahol a rezisztens Mycobacterium okozta infekció gyakorisága magas. 2.7.2. Szilárd és folyékony alapú rezisztenciavizsgálat, a vizsgálat átfutási ideje 2.7.2.1. A szilárd táptalajon (proporciós módszer) végzett rezisztenciameghatározás bár pontos, de meglehetõsen idõ- (az izolálást követõ további 3 5 hetes tenyésztés) és munkaigényes. A vizsgálat biomasszaigénye miatt szükség van az identifikált kórokozó LJ vagy egyéb szubkultúrán történõ felszaporítására, vagy ha a M. tuberculosist NTM-mal együtt ún. kevert tenyészet formájában izolálták, akkor a tenyészetnek az álrezisztenciához vezetõ NTM-tól való megtisztítására, ami újabb többhetes idõveszteséget okozhat. 2.7.2.2. Folyékony alapú rezisztenciavizsgálatok A Bactec MGIT, a radiometriás Bactec 460 TB vagy a Bact/Alert rendszer segítségével az öt elsõ vonalbeli antituberkulotikumon kívül a másodrendû szerek többségével szembeni rezisztenciavizsgálatok kb. 4 6 nap alatt elvégezhetõk és a klinikus számára visszajelezhetõk. Mind az antituberkulotikum-érzékeny, mind a rezisztens kórokozót hordozó betegek esetében az adekvát kezelés folytatásához, a beteg compliance-ának megtartásához és javításához kívánatos, hogy a rezisztenciavizsgálatok eredményei mihamarabb, de a mintavételtõl számított legkésõbb 8 héten belül rendelkezésre álljanak. Ehhez a kórokozó izolálásához, identifikáláshoz és a rezisztenciavizsgálatokhoz alkalmazott gyorsabb átfutási idõt biztosító újabb módszerek hazai rutinszerû bevezetése szükséges. 2.7.2.2./a Külsõ minõségi kontroll A rezisztenciavizsgálatok megbízhatósága kiemelten fontos, ezért elengedhetetlen, hogy minden rezisztens izolátum kontrollvizsgálata megtörténjen, és a vizsgálat eredményét a referencialaboratóriumban megerõsítsék. Különösen fontos a MDR-törzsek rezisztenciájának minõségi kontrollja. A MDRtörzsek ellenõrzõ vizsgálata mellett a referencialaboratórium automatikusan elvégzi a másodvonalbeli szerekkel szembeni rezisztenciameghatározást is, ezért ezen törzseknek a referencialaboratóriumba történõ továbbítása kötelezõ. 2.7.3. Rezisztencia meghatározása géntechnikai módszerrel (13) A rifampicin kulcsfontossággal bír a tuberkulózis kezelésében és a gyógyszerrel szembeni rezisztencia mihamarabbi felismerése vitális a beteg számára. Mindemellett a RMP-monorezisztencia ritka, a RMP-rezisztencia leggyakrabban polirezisztencia vagy az INH-rezisztenciához társulva MDR formájában jelentkezik. Így a RMP-rezisztencia gyors kimutatása nemcsak a kezelés optimalizálása szempontjából, hanem a legveszélyeztetettebb MDR-törzs okozta megbetegedésben szenvedõ betegek gyors azonosítása szempontjából is fontos. A RMPrezisztenciát okozó mutációknak a kimutatása néhány órán belül elvégezhetõ az rpob gén speciális szakaszának DNS-szekvenálásával vagy a PCR és reverz hibridizáción alapuló (GenoType HAIN és Inno-LiPA Rif TB Innogenetics) line probe assay-k segítségével. INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 12 2009. NOVEMBER

INFEKTOLÓGIA Az újabb, kereskedelmi forgalomban kapható tesztek a rifampicin rpob génjének és az izonicid (INH) katg és inha génjének mutációját szimultán is képesek kimutatni az izolált törzsbõl (GenoType MTBDR HAIN), és közvetlenül a mikroszkópos vizsgálattal saválló pozitívnak bizonyult beteg mintájából is (GenoType MTBDRplus HAIN). A MDR tuberkulózis fenyegetõ mértékû globális terjedése miatt, a gyors rezisztenciaeredményekhez való hozzájutás érdekében a WHO új diagnosztikai algoritmus bevezetését javasolja elsõsorban a mikroszkópos vizsgálattal saválló pozitív betegek esetében. A WHO állásfoglalása szerint: a line probe assay-k alkalmasságát a mikroszkóposan pozitív esetek RMP-, ill. INH + RMP rezisztencia detektálására megfelelõ számú evidencián alapuló vizsgálattal bizonyították; a módszerek bevezetését a referencialaboratóriumokban, ill. a technikailag jól felszerelt és képzett munkaerõvel rendelkezõ mikrobiológiai laboratóriumokban ajánlják; ha a line probe assay érzékeny törzset detektál, az érzékeny M. tuberculosis okozta infekció diagnózisa elfogadható, és a kezelés az elsõrendû szerekkel azonnal megkezdhetõ; ha a line probe assay rezisztens törzset detektál, további tenyésztés, majd a kitenyészett törzsbõl az elsõ- és másodrendû szerek iránti rezisztenciavizsgálat is azonnal elvégzendõ; a szükséges közegészségügyi intézkedések késedelem nélkül beindíthatók. Az 1. ábra a mycobacteriumok okozta infekciók egyszerûsített diagnosztikus sémáját, algoritmusát mutatja. 2.8. Latens és aktív tuberkulózisfertõzés kimutatása immunológiai módszerekkel A kereskedelmi forgalomban levõ technikák (T-SPOT-TB és Quantiferon-TB Gold) olyan gyors vértesztek, amelyek a M. tuberculosis specifikus antigénjei által aktivált immunsejtek (T-sejtek) fokozott jelenlétét, ill. a sejtek által termelt γ-interferon kimutatását teszik lehetõvé. A tesztek a Mantoux-próbát helyettesítik, de annál határozottan specifikusabb módszerek, fajlagosságukat a BCG-vakcináció és az atípusos mycobacteriumok (NTM) okozta infekciók többsége nem befolyásolja. Immunszupprimált betegeken a módszer érzékenysége még nem kellõen bizonyított. III. A diagnosztikus vizsgálatok megfelelõségének indikátorai Direkt mikroszkópos, tenyésztéses és genetikai vizsgálatok eredményinek összevetése (szenzitivitás, specificitás, pozitív és negatív prediktív érték). A bakteriológiailag igazolt esetek aránya a regisztrált esetekhez viszonyítva. Tenyésztéssel pozitív esetekben a rezisztenciavizsgálatok aránya. A M. tuberculosis-sal szemben a NTM esetében egyes kivételektõl eltekintve (M. avium, M. kansasii, gyorsan növõ NTM-ok) a rutinszerû rezisztenciameghatározás a megfelelõen standardizált módszerek hiányában nem javasolt. 13 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS IV. A protokoll bevezetésének feltételei A tárgyi és személyi feltételeket a kompetenciaszinteknek megfelelõen a 15/2004. ESZCSM-rendelet tartalmazza. 1. TÁRGYI FELTÉTELEK A Mycobacterium-diagnosztika az ország egész területén elérhetõ, jelenleg összesen 10 tbc-tenyésztõ laboratórium és a Nemzeti Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium mûködik. A tbc-tenyésztõ laboratóriumok alkalmasak direkt mikroszkópos, tenyésztéses vizsgálatok végzésére és legalább a M. tuberculosis identifikálására, egyes laboratóriumok rezisztenciavizsgálatokat is végeznek. Egyes III. kompetenciaszintû mikrobiológiai laboratóriumok néhány molekuláris genetikai vizsgálat végzésére is alkalmasak. A referencialaboratóriumban történik a rezisztens törzsek kontrollvizsgálata, az atípusos Mycobacterium (NTM)-törzsek identifikálása, egyes esetekben rezisztenciavizsgálata és a molekuláris technikák alkalmazása (direkt kimutatás, species identifikálása, rezisztenciagének detektálása, tipizálás epidemiológiai érdekbõl). 2. SZEMÉLYI FELTÉTELEK A kompetenciaszinteknek megfelelõ személyi feltételek: a 15/2004. ESZCSM-rendelet szerinti megfelelõ számú diplomás és egészségügyi szakdolgozó. 3. SZAKMAI KÉPZÉSI FELTÉTELEK A jelen protokoll oktatása a szakorvosképzés, egyéb diplomásképzés és továbbképzés keretében történik. V. Irodalom 1. Kent, PT, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for a level III laboratory. Center for Disease Control, Atlanta (GA), 1985. 2. Dunlap NE, Bass J, Fujiwara P, Hopewell P, Horsburgh J, Salfinger M, Simone PM. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. This official statement of the American Thoracic Society and the Centers for Disease Control and Prevention was adopted by the ATS Board of Directors, July 1999. This statement was endorsed by the Council of the Infectious Disease Society of America, September 1999. Am J Respir Crit Care Med. 2000;161:1376 1395. 3. Metchock BG, Nolte FS, Wallace, RJ. Mycobacterium. In Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.). Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC, 1999, 399v437. 4. Szabó N, Lipót Z, Vámos M, Nagy J. A mycobactériumok tenyésztésének hatásfoka különbözõ elõkezelési eljárások és tenyésztési módszerek függvényében. Medicina Thoracalis. 2003;56:188 192. 5. Somoskovi A, Kodmon C, Lantos A, Bartfai Z, Tamasi L, Fuzy J, Magyar P. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Lowenstein-Jensen medium. J Clin Microbiol. 2000;38:2395 2397. 6. Somoskovi A, Mester J, Hale YM, Parsons LM, Salfinger M. Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Clin Chest Med. 2002;23:585 597. 7. Update: Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2000;49:593 594. 8. Mester J, Vadász I, Bártfai Z, Ködmön CS, Somoskövi Á. A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikumrezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis. 2002;55:30 36. 9. Fodor T, Lõrinczi I, Szikra L. A Mycobacterium tuberculosis és egyéb atípusos mycobacterium fertõzések bakteriológiai vizsgálatának módszerei. In Czirók É (szerk.). Klinikai és járványügyi bakteriológia kézikönyv. Melánia, Budapest, 1999, 555 557. 10. National plan for reliable tuberculosis laboratory services using a systems approach. Morb Mortal. Wkly Rep. 2005;54:RR-6. 11. Drobniewski FA, Hoffner S, Rüsch Gerdes S, Skenders G, Thomsen V. and the WHO European Laboratory Strengthening Task Force. Recommended standards for modern tuberculosis laboratory sevices in Europe. Eur Respir J. 2006;28:903 909. 12. Somoskövi Á, Szabó N, Nagy E. A tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikájának irányelvei. A Tüdõgyógyászati Szakmai Kollégium és az Orvosi Mikrobiológiai Kollégium közös állásfoglalása. Med Thor. 2004;57:116 137. 13. World Health Organization. Molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) policy statement 27 June 2008. 14. Pai M, Flores LL, Pai N, Hubbard A, Riley LW, Colford JM. Jr. Diagnostic accuracy of nucleic acid amplification tests for tuberculosis meningitis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2003;3:633 643. 15. Rock RB, Olin M, Baker CA, Molitor TW, Peterson PK. Central nervous system tuberculosis: Pathogenesis and clinical aspects. Clin Microbiol Review. 2008;21:243 261. INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 14 2009. NOVEMBER

INFEKTOLÓGIA 1. ÁBRA MYCOBACTERIUMOK OKOZTA INFEKCIÓK EGYSZERÛSÍTETT DIAGNOSZTIKUS SÉMÁJA Pulmonalis tbc gyanúja esetén legalább 3 egymást követõ napon levett köpetminta, bronchoszkóppal vett minta, gyomormosó folyadék Extrapulmonalis kórképek esetén megfelelõ mennyiségû releváns vizsgálati anyag a folyamat helyének megfelelõen A minta elõkezelése (koncentrálás, emésztés, dekontaminálás) klórhexidin vagy NALC-NaOH vagy más módszerrel Közvetlen kenet vizsgálata Ziehl-Neelsen- vagy fluorokróm festéssel Tenyésztés Molekuláris biológiai módszer 1 (PCR, LCR, TMA, egyéb) Pozitív (elõzetes lelet kiadható) Negatív Az eredményt össze kell vetni a tenyésztés és a kenet eredményével Szilárd táptalajon 2db (L J és/vagy agaralapú ttj.) Folyékony táptalajon 1db (MGIT, Bact/Alert stb.) Negatív Pozitív (identifikálás, rez. meghatározása) Pozitív (kenet, tenyésztés L-J táptalajon) Negatív Megjegyzés: 1. Csak a közvetlen kenet mikroszkópos vizsgálatával és a tenyésztéssel párhuzamosan végezhetõ, elsõsorban differenciáldiagnosztikai céllal vagy speciális esetben, ha a fertõzésveszély gyors kizárása szükséges negatív kenet mellett. Saválló pozitív kenet- és negatív PCR-vizsgálat atípusos mycobacterium jelenlétére utal. Irodalom: 1. American Thoracic Society. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children Am J Respir Crit Care Med. 2000;161:1376-1395. 2. Heifets L.: Dilemmas and realities of rapid 15 2009. NOVEMBER INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ

TUBERKULÓZIS INFEKTOLÓGIAI ÚTMUTATÓ 2009. NOVEMBER