Tudományos Diákköri Dolgozat Ozohanics Oliver Tömegspektrométeres adatgyűjtőrendszer fejlesztése és alkalmazásai Témavezető: dr. Frigyes Dávid Általános és Szervetlen Kémiai Tanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2005.
TARTALOM JEGYZÉK: Munkám motivációja... 3 Bevezetés... 4 A tömegspektrométer felépítése... 4 1. A vákuumrendszer... 5 2. Mintabeviteli rendszer... 6 3. Az ionforrások... 7 3.1 Az EI forrás... 8 3.2 A FAB... 9 3.3 A MALDI... 10 3.4 Az Electrospray technika... 10 4. Az analizátor... 11 4.1 A mágneses analizátor... 11 4.2 Egyéb analizátortípusok... 13 5. A detektor... 14 6. Az adatgyűjtőrendszer... 14 7. A tömegspektrum... 16 A KRATOS MS-80 tömegspektrométer jellemzése... 17 Rendelkezésre álló hardware/software... 17 1. Az adatgyűjtő-kártya... 17 2. A LabView rövid ismertetése... 19 Vizsgált anyagok... 21 A tömegspektrometriai vizsgálatok irodalmi előzményei... 22 Célkitűzések... 24 Adatgyűtőrendszer fejlesztése... 25 A felhasználói felület... 28 A blokkdiagram... 31 Tömegspektrometriai vizsgálatok... 33 Kalkonok... 34 Pirazolinok... 37 Pirazolok... 41 Az eredmények összefoglalása... 46 További tervek... 47 Köszönetnyilvánítás... 48 Röviditésjegyzék... 49 Irodalomjegyzék... 50 2
Munkám motivációja Előző diákköri dolgozatomban 1, ferrocéntartalmú kalkon, pirazol és pirazolin típusú vegyületeket állítottam elő. A vegyületek tömegspektrometriás vizsgálata révén kerültem kapcsolatba az ELTE Kémiai Intézet Tömegspektrometriai Laboratóriumával. A laboratórium KRATOS MS-80 típusú tömegspektrométerének adatgyűjtőrendszere meghibásodott, így bekapcsolódtam az új adatgyűjtőrendszer fejlesztésébe. Jelen dolgozatomban beszámolok egy tömegspekrométeres adatgyűjtőrendszer fejlesztéséről és ennek alkalmazásáról az előállított vegyületek vizsgálatában. A dolgozatomban először egy tömegspektrométer felépítésével foglalkozom, majd jellemzem a munkám tárgyát képező berendezést és programozási nyelvet. Röviden összefoglalom a vizsgált anyagokat is. A munkám ismertetését az adatgyűjtőrendszer fejlesztésével kezdem, ezt követi az anyagok tömegspektrometriai vizsgálatának eredménye és az eredmények diszkussziója. A tárgyalást az eredmények összefoglalásával és a munka további céljainak ismertetésével zárom. A dolgozat végén mellékelek egy rövidítés- és jelölésjegyzéket, a leírtak áttekintésének megkönnyítésére. 3
Bevezetés A tömegspektrometria napjainkban egyre több területen jól használható módszer ismeretlen anyagok azonosítására és szerkezetvizsgálatra. A felhasználási területek között szerepel többek között a rovarirtó szerek azonosítása víz- és levegőmintákban, szteroidok kimutatása sportolók vérében vagy éppen ppq mennyiségű fémek vízbeli kimutatása. Hasznosnak bizonyult 14 C izotópos kormeghatározások elvégzésére, űrszondákon az élet nyomainak felderítésére, esetleg izotópok tömegének 70 ppt pontosságú megállapítására. A tömegspektrométer felépítése A tömegspektrométer egy olyan berendezés amelyben, egyedi folyamatban izolált gázfázisú ionokat állítunk elő, ezeket tömeg/töltés szerint analizáljuk, majd detektáljuk 2 : így kapjuk a tömegspektrumot. Egy tömegspektrométer felépítése a következő ábrán látható: Ionforrás (Gázfázisú ionok) Analizátor Iondetektor Minta- beeresztés Vákuumrendszer Adatfeldolgozórendszer 1. ábra: Tömegspektrométer vázlatos felépítése 4
1. A vákuumrendszer 3 A készülék egyik fontos része a vákuumrendszer. Ez alatt azoknak a komponenseknek az összességét értjük, ami a berendezésben alacsony nyomás létrehozásához és fenntartásához szükséges; tartalmazza nemcsak a különböző szivattyúkat, a szelepeket, nyomásmérő és szabályzó egységeket, de minden olyan részt, amelyben ionokkal dolgozunk ionforrástól a detektorig. Minden tömegspektrométerben nagyvákuumban működik az analizátor és a detektor. A mintabevitel és az ionforrás a tömegspektrométer típusától függően nagyvákuum, elővákuum vagy atmoszférikus nyomáson van. Mi is az a vákuum? A gyakorlat szempontjából minden olyan tér, amelynek nyomása kisebb, mint a környezeté. Elméleti megfogalmazásban a vákuum olyan tér, amelyben a közepes szabad úthossz nagyobb, mint az edény karakterisztikus mérete. A vákuumrendszerre szükségünk van, hogy minimalizáljuk az ionok közötti ütközéseket, hiszen egy ütközés által az ionok reagálhatnak, vagy energiát cserélhetnek környezetükkel. Az ionok élettartalmának viszont elég hosszúnak kell lennie, hogy detektálni tudjuk őket. A rendszer egy elővákuum és egy nagyvákuum részből áll. Az elővákuum nyomástartománya 1000 10-3 mbar; általában a nagyvákuum előállításához használt berendezések igényelik. Elővákuumot legtöbbször rotációs szivattyú használatával állítanak elő. A nagyvákuum jellemzői hogy a részecskék (molekulák, ionok, atomok) keveset ütköznek, kicsi a hővezetés, a termikus egyensúly beállta csak lassan, hősugárzáson keresztül valósul meg, valamint molekuláris áramlási viszonyok lépnek fel. Csak unimolekuláris reakciók játszódnak le. yomástartománya 10-4 10-8 mbar és ilyen nyomások eléréséhez több szivattyútípust használhatunk. Elterjedtek a turbomolekuláris és a diffúziós szivattyúk, de bizonyos készülékekben (ICR) szükség van még alacsonyabb nyomásra ezért, az előzők valamelyikéhez krioszivattyú is társulhat. 5
2. ábra: Vákuumrendszer felépítése 2. Mintabeviteli rendszer Ahhoz hogy mérni tudjunk egy anyagot, gázfázisú ionokat kell előállítani belőle. A mintát valamilyen módon atomizáljuk (ezt a kifejezést a tömegspektrometriás szleng a minta eloszlatására használja, természetesen nincs szó a minta szabad atomokra bontásáról), majd ionizáljuk, vagy egy lépésben állítunk elő ionokat belőle. Atomizálást elérhetünk úgy is, hogy a mintát elpárologtatjuk. Ebben nagy szerepet játszik a vákuum ugyanis, egy nagyságrend nyomáscsökkenés durván 20 C forráspont-csökkenésnek felel meg. A minta bevitelének és ionizációjának módja a minta fizikai-kémiai tulajdonságaitól és a mátrixtól függ. Több mintabeviteli eljárást 4 is kidolgoztak tömegspektrometriás használatra. Ha a minta elég könnyen elpárolog, termikus stabilitása nagy, eljárások sora áll rendelkezésre. A gázok és nagy gőznyomású minták általában melegítés nélkül az ionforrásba kerülnek, míg szilárd és folyadékminta esetén fűtéssel növelik a gőznyomást. Ha a minta termikusan nem elég stabil vagy nincs lehetőség elpárologtatására, akkor a minta eloszlatását és az ionizálást egy lépésben végezhetjük. Ilyen módszerekről az ionforrások között lesz szó. Röviden ismertetni szeretnék néhány technikát, elsőként a direkt mintabeeresztést. Direkt mintabeeresztéskor a szilárd mintát egy fűtött mintatartó végére visszük fel a lehető legkisebb mennyiségben, majd a mintát az ionforrásba juttatjuk, ahol az elpárolog. Ezt az eljárást használhatjuk olyan szilárd minták vizsgálatára is, amelyek légköri nyomáson elbomlanának forráspontjuk elérése előtt. A minta vákuumban van, nem kap nagy hőterhelést, így kíméletesebb az elpárologtatás. 6
3. ábra: Direkt mintabeeresztés A módszer nagy hátránya, hogy nem minden vegyület párologtatható el. Ilyenek többek között a fehérjék, de ide sorolható a legtöbb 1000 feletti moltömeggel rendelkező vegyület, valamint a sok hidrogénkötést tartalmazó vagy sószerű vegyületek, mint például az arginin. Más mintabeviteli eljárások a kapcsolt technikák között keresendők. Gázkromatográftömegspektrométer (GC-MS) esetén a mintát a gázkromatográf segítségével juttatják az ionforrásba. A HPLC/LC-MS használata az utóbbi évtizedben terjedt el, mivel a folyadékminták ionizálásához szükséges módszerek régebben nem álltak rendelkezésünkre. 3. Az ionforrások 5 Az ionforrásokban az ionizáció módja elektron eltávolítása vagy töltésaddíció leggyakoribb a H + addíció. Az ionizáció során a mintának átadott energia szerint megkülönböztetünk lágy és kemény ionizációs eljárásokat. A módszerek különböznek a minta halmazállapotában is. Léteznek gázfázisú mintát igénylő módszerek, deszorpciós technikák és spray eljárások. Gázfázisú elpárologtatott mintából több ionforrás típussal is tudunk ionokat előállítani. Vannak, amelyek nagyvákuumot igényelnek, mások elővákuum körülmények között használhatók. agyvákuumban izolált molekuláris viszonyok között jönnek létre az ionok. Ilyen körülményeket igényel az úgynevezett elektronütközéses ionforrás, továbbiakban EI (Electron Impact). Elővákuumban ion molekula reakciók is lejátszódhatnak és a termikus egyensúly gyorsan beáll. 7
A deszorpciós technikákban egy primer részecskenyaláb használatával kondenzált fázisú anyagot egy lépésben ionizálnak, így nincs szükség a minta külön elpárologtatására. Ezek közül a fontosabbak a gyorsatom bombázás, röviden FAB (Fast Atom Bombardment), és a mátrixszal elősegített lézeres deszorpciós ionizáció, a MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption ionization). A spray ionizációs eljárások atmoszférikus nyomáson működnek. Az oldott mintát különböző módszerekkel porlasztják és a finom eloszlású cseppeket ionizálják. Egyik gyakran nagynyomású folyadékkromatográfiához (HPLC - High Pressure Liquid Chromtography) kapcsolt technika az electrospray ionizáció, röviden ESI (Electrospray ionization). 3.1 Az EI forrás Az elektronütközéses ionizáció az egyik legelterjedtebb tömegspektrométeres ionizációs módszer. Lényege hogy az ionok gyors elektronok és minta molekulák ütközése által jönnek létre az alábbi folyamatban: M (g) + e M + + 2e Az ionoknak olyan az energia-eloszlása hogy lesz olyan molekula, amely molekulaionként hagyja el a forrást, mások különböző unimolekuláris folyamatokban vesznek részt, fragmensionként távozva. A módszer jól működik gázfázisú (pl. elpárologtatott vagy gázkromatografált) minta esetén. Az így kapott spektrumok jól reprodukálhatók, ezért elterjedten használják spektrumkönyvtárak létrehozására. A nagy gerjesztési energia azonban nagy mértékű fragmentációhoz vezet, ami strukturális információt hordoz, de sok esetben a molekulaion nem megfigyelhető. 8
É I katód ev=70 V + e - M + lencserendszer anód D minta + U repeller 4. ábra Az EI forrás felépítése A fenti ábrán egy EI forrás felépítése látható. A katód egy fűtött fémszál (W), amelyből kilépő elektronokat általában 70 V potenciállal gyorsítjuk. A minta gázfázisú molekulái az elektronnyaláb útjába kerülnek. Az elektronok a molekulákkal ütközve elektronokat ütnek ki a molekulákból. Az eredeti 70 ev-ból 0-10 ev használódik fel a minta ionizálására, általában egyszeres töltésű kationokat eredményezve, a gerjesztési energia néhány ev, a maradék energia elsősorban az elektronok energiájaként távozik. Szerves molekulákból mindig gyökionokat kapunk. Az elektronütközéses ionizáció hatáskeresztmetszetét (valószínűségét) az energia függvényében maximumgörbe írja le. Azt mondhatjuk, hogy a legtöbb vegyület esetén a maximum 70 és 100 ev között található, ezért optimális a 70 ev elektron energia. Elméleti számítások a várható spektrumot illetően meglehetősen nehezek. Az ionok energiaeloszlása nem pontosan ismert. A spektrum elméleti becsléséhez számtalan párhuzamos és konszekutív reakció termodinamikai és kinetikus viszonyait kellene figyelembe venni, ami jelenleg nem rutinszerű. A spektrum tapasztalati szabályok alapján azonban általában jól magyarázható. 3.2 A FAB A módszer előnye, hogy egy lépésben állít elő gázfázisú ionokat folyékony vagy szilárd mintákból. A minta felületre felvitt, mátrixban oldott szerves anyag. Egy nemesgázatomnyalábot irányítanak a mintára. A nagy energiájú ütközés révén a molekulák kiszakadnak a kondenzált fázisból és ionizálódnak. A FAB egy lágy ionizációs módszer; jellemzően 9
kismértékű fragmentálódás megy végbe. Általában protonált molekulaion [M+H] + jelenik meg. Ez a módszer jól működik pár ezres molekulatömegig. Mivel a mátrixban oldott molekulák kis hőterhelésnek vannak kitéve, termikusan instabil vegyületek vizsgálatára is jól alkalmazható. 3.3 A MALDI A MALDI mátrixszal elősegített lézeres deszorpciós ionizáció gyakran használatos természetes és mesterséges polimerek, proteinek vizsgálatára 200 000 Da moltömegig. Ez a technika lézerimpulzust használ a minta atomizálására és ionizálására. A mintát szilárd mátrixban viszik a spektrométerbe. A mátrix tipikusan karbonsav elnyeli a lézerfényt, majd ionizálja a mintát. Ezzel a lágy ionizációs módszerrel nincs, vagy nagyon kicsi a fragmentáció. A spektrumban leggyakrabban [M+H] +, esetleg [2M+H] +, [M+2H] 2+ ion látható. 3.4 Az Electrospray technika 5. ábra Electrospray ionforrás működése, nagyított kapilláris és folyadékcseppek Az ESI módszer poláros vegyületek vizsgálatára alkalmas. Elterjedését az LC/MS-ek sikerének köszönheti. Gyakran használják peptidek és fehérjék vizsgálatára. A megfelelő oldószerben oldott mintát vákuumban elporlasztják. A fém kapilláris végére nagy feszültséget kapcsolnak. A folyadékcseppek felülete a térerősségnek köszönhetően feltöltődik. A párolgás miatt a cseppek felülete egyre kisebb lesz és egy idő után a Coulomb-taszítás nagyobb lesz, mint a cseppet összetartó felületi feszültség. Ennek következtében az szétrobban és többszörösen töltött, ionizált molekulák (tipikusan [M+nH] n+ ) kerülnek a gáztérbe. A 10
többszörös töltésnek köszönhetően a spektrumban az ionok kisebb m/z-nél láthatók, mint a molekulatömegük. 4. Az analizátor Miután a forrásban ionok képződtek, ezeket a repeller egy gyorsító feszültséggel kilöki a forrásból a lencserendszer felé. Az analizátor a lencserendszer után található, melynek feladata az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása. Több analizátortípus létezik, amelyek eltérő a felbontásuk, pásztázási sebességük, tömegtartományuk és hatékonyságuk. A relatív felbontás úgy definiálható, mint az a legnagyobb tömeg, ami még eltválasztható az eggyel nagyobbtól. Ez megadható az M/ M hányadossal. Az egységnyi felbontás azt jelenti, hogy a teljes tömegtartományban meg tudjuk különböztetni az egész tömegeket. A pásztázási sebesség az az idő, ami alatt egy teljes tömegspektrumot fel tudunk venni, vagy a mérni kívánt tömegtartományt végig- pásztáztuk. Ez megadja az analízis időigényét, ami kapcsolt technikák esetén fontos. I Μ 5% M m/z 6. ábra Relatív felbontás A következő analizátortípusokat különböztetjük meg: nyaláb-típusú analizátorok: mágneses szektor, kvadrupól analizátorok csapdázó analizátorok: kvadrupól ioncsapda, FT-ICR analizátorok repülésiidő-analizátorok (TOF - Time of Flight). 4.1 A mágneses analizátor Az első mágneses analizátor Thomson nevéhez fűződik. Ezzel impulzusuk szerint tudta elválasztani a részecskéket. 11
A mágneses analizátor 6 a nyaláb típusú analizátorok családjába tartozik. Egy mágneses szektorból vagy kétszeres fókuszálású kivitel esetén egy mágneses szektorból és egy elektrosztatikus analizátorból áll. A mágnes előtt az ionokra egy U feszültségű gyorsítótér hat, ami az ionokat m/z-nek megfelelően gyorsítja. A mágneses szektorba belépő ionokra eltérítő erő hat: F = q(v B). A különböző sebességgel rendelkező ionok más és más körpályára állnak, ahogy ez a következő képletből is látszik (r a körpálya sugara): m z = 2 B er 2U 2 Változtatjuk a B mágneses indukciót, így mindig egy adott m/z-vel rendelkező ionok állnak olyan körpályára, hogy a kilépőrésen keresztül távozzanak. A mágneses szektor megfelelő tervezés esetén az egy pontból különböző irányba induló ionokat összegyűjti, ezek a kilépőrésnél találkoznak, vagyis szögfókuszálást végez. Probléma azonban, hogy különböző energiájú, de azonos m/z-vel rendelkező ionok, különböző B esetén lépnek ki a mágnesből. Ennek a kiküszöbölésére a mágnes elé vagy után, egyenes geometriájú illetve fordított geometriájú készüléknél, egy elektrosztatikus analizátort raknak, így egy kétszeres fókuszálású mágneses analizátort kapunk. Az elektrosztatikus analizátor energiafókuszálást végez, ezzel kiküszöbölve az ionok energiaszórását. Egy ilyen analizátorral a relatív felbontás M/ M > 50 000, tömegtartomány néhány ezer Da. 7. ábra Kétszeres fókuszálású mágneses analizátor felépítése 12
A tömegspektrométerben metastabil ionok is keletkeznek. Ezek olyan ionok, amelyek nem a forrásban bomlanak el. Ha valamelyik analizátorban bomlanak el, a spektrumban nem látjuk őket (elkenődve beleolvadnak a háttérzajba), de ha a két analizátor közötti térmentes tartományban, akkor általában kis intenzitású, elkenődött csúcsként jelennek meg. Ebben az esetben, a spektrumban jól meghatározott m/z-nél jelentkeznek, amit az alábbi képlettel közelíthetünk: m* = m 2 leányion m anyaion A metastabil ionokat felhasználhatjuk fragmentációs lépések bizonyítására. 4.2 Egyéb analizátortípusok A kvadrupól analizátorok négy, egymással párhuzamos, körkeresztmetszetű elektródból állnak. A két-két szemben lévőt azonos, egymással ellentett potenciálra kapcsolják. A potenciált egy egyenfeszültség és egy rádiófrekvenciás jel összege adja. A két feszültség megfelelő megválasztása azt eredményezi, hogy csak egy adott m/z-vel rendelkező ion juthat át. A két feszültségkomponens megfelelő hangolásával felvehető a tömegspektrum. Ezek az analizátorok olcsóbbak, mint a mágneses társaik, de rendszerint csak pár ezer m/z-ig használhatók (tipikusan 1000 m/z) és egységnyi felbontással jellemezhetők. 8. ábra: A kvadrupól felépítése A repülésidő-analizátorok a szerint választják szét az ionokat, hogy mennyi időt töltenek el az analizátorban. Az ionokat elektromos térrel gyorsítják, ekkor a tömeg/töltés szerinti sebességre tesznek szert. Különböző sebességű ionok különböző ideig tartózkodnak az analizátorban. Az ilyen analizátorok előnye a nagyon nagy ( végtelen ) tömegtartomány, jó felbontás és gyors működés; hátrány a magas ár. 13
5. A detektor A tömegspektrométerben a detektorba jutó ionok viszonylag kis áramot váltanak ki, amelyet közvetlenül nem tudunk megfelelő pontossággal mérni. Ezért szükséges olyan berendezés használata, amely erre a kis áramra is érzékenyen reagál. A követelmény a detektorokkal szemben a nagy érzékenység, a kis zaj és a linearitás. Az érzékenység az áram-erősítéssel függ össze: 10 6 10 7 erősítésre van szükség, hogy kevés iont is detektálni tudjunk. Több detektortípust fejlesztettek ki az idők során. Ezek az ionokat a töltésük alapján detektálják. A Faraday-cella egy olyan detektortípus, amely lineáris, de érzékenysége viszonylag kicsi, ezért nagy ionáram esetén használható. Legegyszerűbb esetben egy fémlapból áll, ami 10 10 Ω ellenállással földpotenciálhoz van kapcsolva. Működése azon alapszik, hogy az ionok a cella falába csapódva áramot eredményeznek, így az eredő áram arányos lesz a becsapódott ionok (töltések) mennyiségével. Az elektronsokszorozó sok egymás után elhelyezett fémlemezből, úgynevezett dinódákból áll. Ezekre egyre növekvő pozitív potenciált kapcsolunk. Az első dinódára becsapódó ionok több elektront kilöknek belőle, amely elektronok a következő dinódába csapódnak és exponenciálisan növekvő elektronáramot eredményeznek. agy erősítést lehet velük elérni, ám a folyamatos ionbecsapódások könnyen elszennyezhetik az első dinódát, amit ezért úgy alakítanak ki, hogy könnyen cserélhető legyen. A csatorna-elektronsokszorozó (channeltron) hasonló elven működik, mint a dinódás elektronsokszorozó. Lényegében egy kis méretű kerámia cső, melynek falára félvezető réteget párologtattak fel. 6-7 nagyságrendű erősítési faktorral rendelkeznek, de linearitásuk rosszabb, mint a dinódás detektoroké. A Microchannel Plate (MCP) tulajdonképpen egy channeltron mátrix, amellyel helyfüggően detektálhatjuk az ionokat. 6. Az adatgyűjtőrendszer A tömegspektrométer a spektrumokat időben folytonosan változó feszültségjelként állítja elő. Ahhoz hogy ezt egy számítógép kezelni tudja, digitalizálni kell, vagyis a feszültséget digitális értékekké kell átalakítani. Ennek a feladatnak az elvégzésére analóg-digitális (A/D) átalakítókat használunk. Ez úgy működik, hogy a bemenő jelből jól megszabott időközönként 14
mintát vesz, és ezt átalakítja egy kódsorozattá. Az analóg jelek digitalizálása során a cél az, hogy egy analóg értéket a lehetőségek szerint egyértelműen azonosítsunk egy bináris kódsorozattal. Ahhoz hogy ez teljesüljön, az eredeti jelből a mintavétel megfelelő gyorsan kell, hogy történjen. Ezt a mintavételi sebességet szabja meg a Shanon-yquist-tétel, amely kimondja, hogy a tökéletes visszaállíthatósághoz egy jelből legalább a benne előforduló legnagyobb frekvencia kétszeresével kell mintát venni. A gyakorlatban impulzusszerű jelek esetén (amilyen a tömegspektrum is) elvárjuk, hogy legalább 3-5 mintavétel jusson egy csúcsra. A digitális technikában egy szám ábrázolása bináris számként, adott szóhosszal (adott számú bittel) történik. Egy A/D átalakító felbontása is attól függ, hogy a folytonos feszültségjelet hány diszkrét értékre tudja átváltani. Ezt általában bitekben fejezik ki. Például egy 8 bites átalakító 2 8 =256 különböző szinté alakítja a bemenő jelet. A bitszám (n) és a teljes feszültségtartomány (U MAX ) ismeretében tehát kifejezhető az a legkisebb feszültségkülönbség (U LSB Least significant bit- legkevésbé szignifikáns bit), amit az átalakító még észlelni tud: U LSB U = 2 MAX n Analóg feszültség Digitális értékek Idõ(folyamatos) Idõ(diszkrét) 9. ábra: Digitalizálás Digitalizálás után egy tömegspektrum felvétele történhet kétféle módon: vagy minden rendelkezésünkre álló adatot elmentünk-ilyenkor ún. profil spektrumot kapunk, vagy először feldolgozzuk az adatokat, és csak az így kapott spektrumot mentjük el. A feldolgozást általában számítógépes programok végzik és több lépésből áll. 15
Legelőször meg kell határozni egy nulla szintet vagy alapvonalat, aminek ismeretében majd ki tudjuk számítani az egyes csúcsok integrálját. A nulla szint megfelelő megválasztása matematikailag meglehetősen bonyolult. Míg egy ember szemmel könnyen megállapítja azt a szintet, ami alatti értékeket zajnak tekint, számítógéppel ez már nehezebb. Vigyázni kell, hogy a szint ne legyen se túl magas (ekkor ui. tényleges csúcsokat is zajnak értelmezünk), se túl alacsony (ekkor viszont a zajt is csúcsként értelmezhetjük). Csúcsnak azt tekintjük, ami egy bizonyos számú pontot tartalmaz az alapvonal felett. Ezek után meghatározzuk a csúcsok súlypontját; ez adja majd meg a csúcs helyét a spektrumban. A csúcsok integrálját is kiszámítjuk, azokat a pontokat figyelembe véve, amelyek a nulla szint felett vannak. A súlypontot és az integrált minden csúcsra kiszámítva megkapjuk a centroid (centroid = súlypont) spektrumot. A spektrumot centroid csúcsintegrál párokként mentjük el, kihagyva az alapvonal alatt lévő pontokat. Az előzőekben elmondottakból látszik hogy a profil spektrum információgazdagabb, ugyanakkor egy centroid spektrum tárigénye töredéke a profil spektrum tárigényének. A fenti elvek gyakorlati alkalmazását nagymértékben nehezíti, hogy a jeleket mint minden elektromos jelet több-kevesebb zaj terheli. Ezt megszüntetni nem, csak csökkenteni lehet. A zajcsökkentés néhány fontos eleme: Minél kevesebb lógó vezeték legyen a rendszerben, hogy a külső zajforrásokat feleslegesen ne tápláljuk a berendezésbe. A bemenetek lehetőleg differenciálisak legyenek, vagyis két feszültség különbségeként adódó jelet mérjünk, ekkor ui. a két vezetéken jelentkező zaj egymás hatását gyengíti. 7. A tömegspektrum A tömegspektrum 7 egy olyan grafikon, amelyen az abszcisszán a tömeg/töltés értékek atomi egységekben, az ordinátán pedig az intenzitások találhatók. Elpárologtatásnál a tömegspektrum kiegészítői az úgynevezett összionáram (Total Ion Current TIC) és az ionkromatogram (Ion Chromatogram IC) is. A TIC tartalmazza az ionáram változását az idő függvényében, így ez alapján láthatjuk, mikor párolog el egy anyag vagy komponens és megfelelő sebességű elpárologtatásnál különböző komponensek szétválaszthatók/azonosíthatók Az IC egyes ionok időbeli intenzitásváltozását adja meg. Azonos anyaghoz tartozó ionok IC görbéjének lefutása azonos. 16
A KRATOS MS-80 tömegspektrométer jellemzése Laboratóriumunkban egy KRATOS MS-80 tömegspektrométer található. Ez a típus egy kétszeres fókuszálású mágneses analizátorral felszerelt készülék. A mintaadagolás történhet direkt mintabeeresztéssel vagy kapcsolt gázkromatográfon keresztül. Több ionforrással is használható: elektronütközéses forrás, kémiai ionizáció vagy gyorsatombombázás. Mi csak az EI forrást használjuk direkt mintabeeresztéssel. Tömegtartománya 4000 m/z-ig terjed, 10-20000-es felbontással jellemezhető. Detektora diszkrét dinódás elektronsokszorozó. Eredetileg nem számítógépes adatgyűjtőrendszerrel való együttműködésre tervezték, hanem UV oszcillográffal történő spektrumfelvételre. Minden mérés oszcilloszkópon követhető. Később a KRATOS cég gyártott hozzá adatgyűjtőrendszert, ez azonban már régen nem működött, az utóbbi évben egy általános tömegspektrométeres rendszert használtak a laboratóriumban, azonban ez is elromlott. A berendezés teljes spektrum felvételére és egy-egy csúcs nagyfelbontású pontos tömegmérésére használható. Tömegspektrum felvételekor a mágneses indukciót változtatjuk időben exponenciálisan, csökkenő tömegszámok felé, ezzel a tömegcsúcsok szélessége nagyjából azonos a teljes tömegtartományban. A pásztázási sebesség viszonylag nagy, maximális értéke 0,2 s/dekád (az m/z érték ennyi idő alatt csökken a tizedrészére). A szkenek indítása történhet manuálisan, egy külső elektromos jelre, vagy automatikusan ismétlődve. Pontos tömegméréskor a mágneses indukció értéke rögzített, csak az iongyorsító-feszültséget változtatjuk az eredeti érték (4 kv) 100-40000 ppm-es környezetében. A tömegspektrométer egy, az elektromágnes indukciójával arányos analóg jelet (B), továbbá három, az észlelt ionok mennyiségével arányos jelet (I, 10xI, 100xI) szolgáltat. A B jel 0-tól 10 V-ig terjedhet; az ionjelek -6 +6 V között mozognak. Rendelkezésre álló hardware/software 1. Az adatgyűjtő-kártya A ational Instruments által gyártott, I PCI-6014 kódjelzésű eszközt használtuk a tömegspektrométerrel történő kommunikációra. Ez 16 csatornás analóg bemenettel, két analóg kimenettel és 8 digitális bemenet/kimenettel rendelkező PCI csatolófelületű 17
számítógépes bővítőkártya. Az analóg bemenetek 16 bit felbontással és maximum 200 000 minta/s mintavételezési sebességgel rendelkeznek. Az analóg kimenetek úgyszintén 16 bitesek, 10000 minta/s mintavételezési sebességgel. A digitális I/O csatornákhoz 24 bites időalap párosul. Az eszközön csak digitális trigger van, ez azt jelenti, hogy a mérést csak külön digitális jellel (felfutó vagy lefutó éllel) lehet indítani, a mért jel adott szintjével (ez lenne az analóg triggerelés) nem. 10. ábra: I PCI-6014 felépítése / blokkdiagram A kártya blokkdiagramját a 10. ábra mutatja. Az analóg bemeneti rész a bal felső sarokban található. 16 analóg bemenet van, differenciális mérés esetén 2-2 bemenet alkot egy csatornát (+ ill. előjellel), így 8 csatornát tudunk mérni. Mivel a kártya csak egy A/D átalakítóval rendelkezik, a csatornák számától függ az egyes csatornán elérhető mintavételi sebesség, az egy csatornán elérhető legnagyobb érték a már említett maximum és a csatornák számának hányadosa. Az analóg multiplexer (Analog Mode Multiplexer) időben egymás után mintavételezi a bemeneti csatornákat. A multiplexer után változtatható erősítésű műszererősítő található (PGIA Programmable Gain Instrumentation Amplifier). Ez pontosan az érkező jelek különbségét méri. A PGIA kimenete jut a digitalizáló egység bemenetére. A feszültségarányos bináris kód egy memóriaegységbe kerül (FIFO=First-infirst-out: először be először ki memória), majd a belső adatbuszra. Az adatbuszról a jelek a 18
PCI illesztőn keresztül jutnak a számítógép memóriájába. Külső triggerelés a PFI vonalakon keresztül lehetséges, melyek az ábra bal oldalán, középen láthatók. 2. A LabView rövid ismertetése A LabView egy negyedik generációs grafikus programozási nyelv, amit a ational Instruments fejlesztett ki 1986-ban. Ezt a nyelvet elterjedten használják mérési feladatok elvégzésére és hardware közeli programozásra. A könnyen használható grafikus felület miatt ideális választás, programozásban kevésbé jártas kutatók számára. A felhasználási területei többek között a gyári terméktesztelés és minden olyan eset, amikor valamilyen készülék felügyeletére vagy vezérlésére van szükség. Az eszközökkel való kommunikáció egyszerűen megvalósítható a mellékelt meghajtók segítségével. LabView-ban a programozás egy ikonkészlet segítségével történik. Ezek az ikonok jelölik a LabView grafikus objektumokat, melyek a felhasználói felületén jeleníthetők meg, és függvényeket. Egy LabView program két részből áll: az előlapból és a blokkdiagramból, melyek külön ablakban szerkeszthetők. Az előlapon találhatjuk a gombokat, kijelzőket, adatbeviteli mezőket, melyek nagyon hasonlítanak az igazi műszerek kinézetére. Ez az, amiért egy LabView programot VI-nak hívnak (Virtual Instrument = virtuális mérőeszköz). 11. ábra: LabView függvények 19
12. ábra: LabView VI előlap Példaként be szeretnék mutatni egy egyszerű LabView programot, amely előlapja a fenti ábrán látható. Ez a program egy jelet állít elő a bemeneti paraméterek függvényében, melyeket az ábra bal oldalán látható beviteli mezőkben tudunk megadni. A jobboldalon látható Waveform feliratú objektum egy kijelző, amely a generált jelet mutatja, akárcsak egy oszcilloszkóp kijelzője. Egy program futtatásához a menü alatt található fehér nyílra kell kattintani. Jellegzetes tartozéka a LabView programoknak a Stop gomb, amelyre kattintás esetén a VI-ok végrehajtása befejeződik. 13. ábra: LabView VI blokkdiagram A 13. ábra mutatja az előbb említett program blokkdiagramját. A különböző ikonok egy része az előlapon látható elemeket jelölik, így ugyanazt a feliratot kapják. Az ábra közepén látható ikon egy beépített LabView sub-vi -t jelöl. Ez tartalmazza azt a kódot, amely a jelet generálja. 20
Vizsgált anyagok Az előző dolgozatomban 1 leírtam számos ferrocénszármazékot. Három családba tartozó vegyületekkel foglalkoztam: ferrocenil-pirazolok, -pirazolinok és -kalkonok. A kalkon kifejezést egy egész vegyületcsalád megnevezésére használják; jellemző rájuk, hogy a molekulában 1, 3-diaril-prop-2-en-1-on-molekularészlet található. Több olyan vegyületet is megvizsgáltam, amelyet az Általános és Szervetlen Kémiai Tanszéken működő MTA Szerkezeti Kémiai Kutatócsoportban állítottak elő. Az alábbi táblázatokban összefoglalom a vizsgált vegyületeket. Fc a ferrocenil, az Ac az acetil, a Ph a fenil csoportot jelöli. A Glü jelöli a glüko-piranózt, a GlüAc pedig a tetraacetil-glükopiranózt. A szubsztituált fenilgyűrű minden esetben para helyzetben kapcsolódik a molekula többi részéhez. R 2 R 2 H O R 1 R 1 R 1 H R 2 R 3 R 3 Pirazol Pirazolin Kalkon 1. Táblázat: A vizsgált anyagok Pirazolinok és pirazolok R1 R2 R3 pirazolin pirazol Fc Ph Ph x x Fc Ph C 6 H 4 -O 2 x x Fc Ph Ac x x Fc C 6 H 4 -OGlüAc Ac x Fc C 6 H 4 -OGlüAc Ph x x Fc Ph H x Fc C 6 H 4 -OAc Ph x Fc C 6 H 4 -OGlüAc Me x x C 6 H 4 -OGlüAc Fc Me x x Kalkonok R1 Fc Fc C 6 H 4 -OAc Fc C 6 H 4 -OH Fc Fc Fc R2 Ph C 6 H 4 -OAc Fc C 6 H 4 -OH Fc C 6 H 4 -OGlüAc C 6 H 4 -OGlü C 6 H 4 -H2 21
A tömegspektrometriai vizsgálatok irodalmi előzményei A ferrocéntartalmú kalkonok eddigi tömegspektrometriás vizsgálata nem különösebben kiterjedt. esmeyanov és munkatársai elektronütközéses tömegspektrumokat vettek fel néhány ilyen típusú vegyületről 8. Munkájuk során olyan ferrocenil-kalkonokat vizsgáltak, ahol a másik szubsztituens fenil, p-br-fenil vagy p-metoxi-fenil. Ezek közül az R 1 =Fc, R 2 =Ph a jelen munkámban is szerepel. Az általuk talált főbb fragmensek és vesztések: a molekulaion minden vegyület esetén megjelenik. Látható továbbá ciklopentadienil vesztés, valamint CpFe + és Fe + megjelenése is. Az általuk felvett spektrumokban nem jellemző az Fc-C + =CH, hanem az FcH + ion megjelenése. 2. Táblázat: esmeyanov és tsai. átlal vizsgált vegyületek R1 R2 Fc Ph Fc C6H4-OMe Fc C6H4-Br Ph Fc C6H4-OMe Fc C6H4-Br Fc Mendez 9, ill. Maynadié 10 és munkatársai szempontunkból kevésbé érdekes vizsgálatokat közöltek: ezekben FAB módszerrel mért molekulatömeget használtak ilyen vegyületek azonosítására. A ferrocéntartalmú pirazolinokról esmeyanov és munkatársai közöltek értékes munkát 11. Az általuk tárgyalt vegyületekre jellemző ionok: az [M-H] + és [M-H 2 ] + néhány esetben megjelenik (18 vegyület közül [M-H 2 ] + 6 esetben), de 10% körüli intenzitással. Jellemző a ciklopentadienil vesztés, valamint az FcC + megjelenése. Tudomásom szerint ferrocéntartalmú pirazolokról eddig nem jelent meg tömegspektrometriai munka. A vizsgált vegyületekhez távolabbról kapcsolódó anyagok közül a szubsztituált ferrocéntartalmú vegyületeket rendkívül kiterjedten vizsgálták 12. Az alapvegyület fragmentációja rendkívül egyszerű: intenzív molekulaion mellett a ciklopentadienil (Cp) ligandumok egymás utáni elvesztéséből áll, más típusú ionok (pl. FeC 3 H + 3 [m/z=95], 22
FeC 3 H + 2 [m/z=94], FeC 2 H + [m/z=81]) intenzitása kicsi. A szubsztituált vegyületekre is elsősorban a szubsztituált Cp-gyűrű kilépése jellemző, de acetilénvesztések, sőt speciális átrendeződési reakciók is fellépnek, pl. O + O + + CH 3 Fe CH 3 Fe CH 3 Fe A molekulaion általában nagyon intenzív, egyszerű molekulákban ez a bázision. Kivételek ott lépnek fel, amikor a szubsztituens nagyon erősen fragmentáció-irányító (pl. telített szénatomhoz kapcsolódó OH-csoportot tartalmaz). A különböző szubsztituált pirazolok tömegspektrumát is alaposan vizsgálták 13. Ezek molekulaionja is intenzív. A váz fragmentációját túlnyomórészt meg lehet magyarázni H-, HC- 2 -, ill. C 2 H 2 -vesztések egymásutánjával. Ha a szubsztituens fragmentáció irányító hatása jelentős, akkor az erre jellemző fragmentációs folyamatok is megjelennek (pl. nitrovegyületnél 16-, 30-, 46-vesztés, acetil-szubsztitúciónál 42- vagy 43-vesztés, ill. m/z=43- as ion). 23
Célkitűzések Célom volt egy olyan tömegspektrometriás adatgyűjtőrendszer fejlesztése, amely egyszerűen adaptálható tetszőleges rendszerhez, mivel általában az adatgyűjtő rendszer romlik el először. Ennek a rendszernek kényelmesen kezelhetőnek kell lennie, hogy rutin feladatok elvégzésére alkalmas legyen: napi 10-15 minta mérését el lehessen végezni. Feltétel továbbá az egyszerű kalibráció és más rendszerekkel való kompatibilitás. Ennek érdekében lehetséges kell legyen az adatok számos formátumban történő mentése. További cél volt, hogy a korábban előállított vegyületek szisztematikus tömegspektrometriai vizsgálatát elvégezzem. Ez azért fontos, hogy a későbbiekben új vegyületek azonosításánál az MR méréseket tömegspektrometriás mérésekkel lehessen alátámasztani, valamint olyan minták is vizsgálhatók legyenek, amelyek esetében az MR nem ad használható információt (szennyezett és kismennyiségű (<1 mg) minták). A szisztematikus vizsgálatok alapján spektrális szabályszerűségeket kívántam felállítani, ami lehetővé teheti ismeretlen minták esetén azonos tömegű, de eltérő szerkezetű vegyületek megkülönböztetését (pl. fordított R 1 /R 2 szubsztituens-sorrend a pirazol-, ill. pirazolinvegyületekben). 24
Adatgyűjtőrendszer fejlesztése Az adatgyűjtőrendszer fejlesztésének első lépése a tömegspektrométer és a számítógép közötti kapcsolat felépítése. A KRATOS MS-80 tömegspektrométer kimenő jelei a mágneses indukcióval arányos B, továbbá az ionjelek I, 10xI és 100xI. Ezek a jelek bipolárisak, mivel eredetileg tükrös galvanométerrel való használatra tervezték a tömegspektrométert. Azért ezeket a jeleket használjuk, mert túlfeszültség ellen védve vannak, viszont az adatgyűjtőkártya bemeneteinek nincs védelme. Szükségünk van továbbá egy időzítő jelre, amit az oszcilloszkópról veszünk. Ezeket az adatgyűjtőkártya megfelelő bemeneteire kapcsoljuk. A továbbiakban a programunk feladata e jelek kezelése és az adatok mentése. A mérés úgy történik, hogy a spektrométer időben ismétlődően, automatikusan végigpásztázza a beállított tömegtartományt. A pásztázás sebességét 1 vagy 3 másodperc/dekádnak választjuk. Az első, spektrum felvételére már alkalmas megoldás egy egyszerűsített program volt, amely az adatokat szkenenként (pásztázásonként) egy-egy szöveges fájlba írta ki. Ez azt jelentette, hogy minden adatpontot tárolunk (úgynevezett raw =nyers spektrumot), de nagy hátránya ennek a megoldásnak, hogy óriási tárigénye volt. A mintavételi frekvenciát 5 khz-nek választva 1 s/dekádban is jó minőségű spektrumot lehet felvenni. Így egy szken adatai, ha csak a B-t, az ebből számított tömegszámokat és az egyszeres ionjelet (I) írjuk ki, 0,75 MB helyet foglal; egy átlagos mérés legalább 100 szkenből áll, tehát legalább 75 MB a tárigénye. em állt rendelkezésünkre megfelelő tömegspektrometriai program ennek a nagy adatmennyiségnek a kezelésére, ezért az adatokat az Origin nevű tudományos programmal dolgoztuk fel. Egy ilyen spektrumot mutat a 14. ábra. Jól látható, hogy a spektrum a csúcsfeliratok kuszasága miatt nehezen értékelhető. 25
U IO / V 4 429 295.9 2 0 27.6 31.7 42 43 77.3 224 239 222 193.6 213.1 121.3 133.3 134.3 148.2 164.2 171.2 175.2 185.1 198 206.1 207.1 253.9 266.9 280.9 385.9 369.9 309.9 326.9 341.8 355.9 395.9 414 0 200 400 m/z (atomi egység) KS3:05050602 14. ábra: Originnel készített tömegspektrum A készülék kalibrációja is nehézkes volt. Előnye az ilyen formában történő adatfeldolgozásnak, hogy a kétszeres töltésű és a metastabil ionok is felismerhetők a spektrumban. Erre példák a következő ábrákon láthatók. Az alábbi ábrán két intenzív csúcs látszik, 202,1 és 209,5 tömegszámnál. Ezek a 404, illetve 419-es tömegű, kétszeres töltésű ionok. U IO / V 0.2 202.1 209.5 202.6 201.5 201 200.6 203.1 209 210.1 210.6 0.0 200 208 m/z (atomi egység) 15. ábra: Kétszeres töltésű ionok A 16. ábra két metastabil iont mutat, melyek közűl a 266,76-nál található bizonyíték a 296-os fragmensből történő metilvesztésre (266,76 281 2 /296). 26
U IO / V 294.9 M etastabil ionok 263 0.03 264.9 267.9 264 279.9 283.9 299 0.00 270 280 290 300 m/z (atomi egység) KS3:05050602 16. ábra: Metastabil ionok A spektrumok feldolgozását akartam megkönnyíteni, ehhez az adatokat olyan formában kell elmenteni, hogy a legtöbb tömegspektrometriai adatfeldolgozó program be tudja olvasni. Elterjedten használják a JCAMP-DX fájlformátumot (JCAMP Chemical Spectroscopic Data Exchange Format, továbbiakban JDX), ezért mi is ezt választottuk. Ebben a formátumban csak olyan adatpontokat mentünk el, amelyek a spektrumban valamelyik cúcshoz tartoznak, így töredékére csökken a tárigény. Egy mérés adatai legtöbbször kevesebb, mint 1 MB helyet foglalnak. Az ilyen fájlformátumban felvett spektrumok előnye, hogy olvashatóbb spektrumok készítésére van lehetőség. A 14. ábrán bemutatott Originnel készített spektrum JDX változatát mutatja a 17. ábra. 100% 429 296 42 63 77 90 133 175 194 224 281 385 411 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 R3: 24172 13% m( 53-65) f8419.jdx * KS3/Túrós Gyuri 17. ábra: JDX fájlformátumban feldogozott spektrum 27
A felhasználói felület A program felhasználói felületét a 18. ábra mutatja. Három grafikus kijelző segít a mérés követésében. Az ábra jobboldalán találhatók a Centroid és a Profile feliratú kijelző, melyek a centroid, illetve raw spektrumot mutatják. Mindkettő felett található egy-egy gomb, amivel be, illetve ki lehet kapcsolni az általuk megjelenített adatok mentését. Ily módon centroid, illetve raw spektrumot is tudunk menteni egyszerre. Kihasználjuk mindkét formátum előnyeit, ugyanis csak akkor mentünk raw formátumban, ha a spektrum jó minőségű. A bal felső sarokban található táblázat az aktuális spektrumban azonosított csúcsok centroidját és azok intenzitását mutatja. Alatta találhatók a threshold és width mezők, amelyekben megadható paraméterek alapján azonosítja a számítógép a csúcsokat. A threshold paraméter az adatgyűjtő rendszerek tárgyalásánál ismertetett nulla szintet jelenti, míg a width a csúcs minimális szélességét adja meg. Az ábrán, a B feliratú kijelző alatt található mezőkben, a felhasználó megadhatja milyen módon szűrjük a B jelet; a filter type mező a szűrő típusát adja meg és ennek függvényében használhatjuk a low cutoff (alsó határfrekvancia) és high cutoff (felső határfrekvancia) mezőket. A csúcskeresést és a szűrést részletesebben a blokkdiagram szakaszban tárgyaljuk. 28
18. ábra: Programom felhasználói felülete A felhasználói felületen megadhatjuk a spektrumok elmentési könyvtárát és fájlnevét, valamint a JDX formátumban való mentés esetén egy tetszőleges címet, ami alapján később egyszerűen azonosítható a mért minta, rendszerint a beküldő neve és a minta jele. Erre szolgálnak a Path - elérési út, vagyis a könyvtár -, a Filename a fájlnév és a Title, azaz a cím mezők. Ehhez a program verzióhoz egy kalibráló ablak is tartozik, amelyet az alábbi ábrán látható Show Calibration Window feliratú gombbal jeleníthetünk meg. A felhasználói felületen a Profile feliratú kijelző alatt megtalálható még a kalibráló koefficiensek beolvasását szolgáló Coeff read gomb is. 29
19. ábra: A kalibráló ablak A A kalibráló ablak feliratú ábrán alul látható a Coeff File Path mező, ahol megadhatjuk, hogy hová mentse el a program a kiszámított koefficienseket. A kalibráló ablakban jobboldalon található Update DATA gomb kétállapotú: lenyomott állapotban frissíti a megjelenő spektrumot, felengedett állapotban viszont a spektrum nem frissül, a csúcsok helye és alakja nem változik, így alkalmas a beállított kalibráció rögzítésére. Tehát kalibrálni csak akkor lehet, ha az Update DATA gomb felengedett állapotban van. Három csúcsra tudunk kalibrálni, ezek között fülekkel választhatunk (ld. közvetlenül a grafikon fölött). Ez azt jelenti, hogy három spektrumon kiválaszthatunk egy-egy csúcsot, kinagyítjuk, majd a kurzort beállítjuk a csúcs közepére. A spektrum alatt található Peak Expected Location feliratú mező, ahová a csúcs várt helyét kell beírni. Ha mindhárom csúcs helyét beállítottuk, a Peaks Locked gomb megnyomásával a program elvégzi a kalibrációt és átadja a koefficiensek értékeit a főprogramnak. Az Update DATA gomb megnyomásával a spektrum frissül, ábrázolásához a program az új koefficienseket használja. Így ellenőrizhető, hogy a kiválasztott csúcsok a megfelelő helyen vannak-e. Amennyiben igen, kiléphetünk az Exit SUB gombbal, visszatérve a fő felhasználói felülethez. emleges válasz esetén újra kalibrálhatunk, a már ismert módon. 30
A blokkdiagram Profile kijelzõ RAW Kimeneti szûrõ RAW Fájl MS Ion jel 10x, 100x B Kompozit ion jel Szûrés B m/z = f(b) m/z Felhasználói engedély Csúcskeresés Paraméterek Rendezett csúcs tömb Centroid kijelzõ JDX Kimeneti szûrõ Felhasználói engedély JDX Fájl Kalibráló rendszer 20. ábra: A program vázlatos felépítése A LabView nyelvben, a programok futásakor a szerint hajtódnak végre a műveletek, hogy merre áramolnak az adatok. Az fenti ábrán szereplő nyilak is az adatáramlást jelenítik meg. A tömegspektrométer felől érkező jeleket két csoportra bontjuk: ionjelek és a mágneses indukcióval arányos B jel. Kezdetben megpróbáltuk felhasználni a tízszeres és százszoros ionjelet a dinamikus tartomány növelésére, de mint kísérleteinkből kiderült, a zaj is arányosan növekedett a jel intenzitásával. Ez alapján elmondhatjuk, hogy a zaj nem külső forrásból származik, hanem a tömegspektrométerből, ezért a későbbiekben csak az egyszeres ionjelet használtuk. Ahhoz, hogy a kapott jelekből tömegspektrumot kapjunk, a B jel értékeit át kell alakítani tömegszámmá. Még mielőtt ezt megtennénk, egy szűrést alkalmazunk. Ezzel a célunk az esetleges nagyfrekvenciás zaj eltávolítása, és ezáltal a mérések reprodukálhatóságának növelése. Ehhez egy Bessel aluláteresztő szűrőt használunk, melynek paramétereit a felhasználó módosíthatja. A szűrés után következik a B m/z értékekké való átalakítása. Munkánk során kiderült, hogy az exponenciálisan lecsengő B jelet jól lehet közelíteni egy négyzetes függvénnyel, így a konverziós függvény a következő alakban írható fel: m / z = x*b 2 + y*b+z ahol x, y, z a kalibrációs koefficiensek, B pedig a mágneses indukcióval arányos feszültségérték. A koefficiensek meghatározására szolgál a kalibráló rendszer. 31
Paraméterek Spektrumok Ion kijelzõi Fõprogram jel m/z B m/z-b átalakítás B1 B2 B3 Paraméter illesztés x y z Paraméter tömb Fájl 1 2 3 m/z1 m/z2 m/z3 Csúcsok, m/z Csúcsok várt helye Felhasználó 21. ábra: A kalibráló rendszer működése A 21. ábra mutatja a kalibráló rendszer működését. A főprogramtól kapott ionjel és tömegszám-adatok (m/z) alapján a program kijelzi a spektrumokat. B és m/z alapján, a felhasználó által a spektrumokon kijelölt pontoknak megfelelő B értéket kiszámolja, majd a pontos tömegszám ismeretében ezekre egy másodrendű polinomot illeszt. Az így kapott paramétereket egy tömbbe foglalja, amit a főprogramnak visszaad, valamint fájlba is kiír. A felhasználó végezhet újabb kalibrálást vagy visszatérhet a főprogramba. A B jel m/z értékekké történő átalakítása után, a főprogramban következik a spektrum csúcsainak az azonosítása és tömbbe való kiírása. Annak ellenére, hogy a LabView beépített csúcskereső függvénnyel rendelkezik, a feladat megoldása közel sem volt egyszerű. A csúcskereső függvény a megfelelő tömegszámok helyett, a csúcs indexét adja vissza, ráadásul gyakran tört indexeket. Ezen indexek megfeleltetése a tömegszám skálával egy saját fejlesztésű függvénnyel történik. Az adatok mentése két formában történhet: RAW vagy JDX fájlként. A JDX kimeneti szűrő, úgyszintén saját fejlesztés, a spektrumokat tömegszám-intenzitás formában menti el. A régi programverzióval készült spektrumok feldolgozását megkönnyítendő, a JDX szűrő felhasználásával egy fájl konverziós programot is készítettem, ami a RAW formátumban felvett spektrumokat alakítja JDX fájlokká. 32
Tömegspektrometriai vizsgálatok A továbbiakban szó lesz többek között, az előző diákköri dolgozatomban leírt vegyületek tömegspektrometriai vizsgálatáról. Ezen vegyületeken kívül az újonnan előállított vegyületek vizsgálata is témája jelen dolgozatomnak. Direkt mintaadagolást használtam a vegyületek bevitelére a spektrométerbe. A tárgyalás alapját képező spektrumok EI forrást használva készültek és a legnagyobb intenzitású csúcsra (báziscsúcs) normáltak, ennek intenzitását tekintve 100-nak. A vizsgálatok elvégzéséhez a korábban leírt KRATOS MS-80 típusú tömegspektrométert használtam. Az anyagot kvarc bot végén juttattam a spektrométerbe, a mintatartó fűtése nélkül. A forrás hőmérséklete 200-240 C között változott, a mintát csak hősugárzás fűtötte. A méréseket a leírt, saját fejlesztésű adatgyűjtőrendszerrel végeztem. Kalibráláshoz pba-t (perfluor tributilamint) használtam referenciának, a spektrumából az 502, 219, 69-es csúcsokat választva az új paraméterek megállapítására (ld. kalibráció). A mérések során a legintenzívebb spektrumokról RAW formátumban is készült mentés. éhány vegyületet az EGIS Gyógyszergyár Rt. által a Kémiai Intézet Tömegspektrometriai Laboratóriumának ajándékozott FISOS TRIO 1000 spektrométeren mértem. A mérés körülményei: az anyag bevitele programozottan fűthető kvarcboton, az ionforrás hőmérséklete 200-230 C. A mintaadagoló fűtési programja: 2 percig 50 C, utána forráshőmérsékletig percenként 25 -al emelkedik a hőmérséklet. A mérési program: 0,4-0,5 s/pásztázás, 0,2 másodperc pásztázások közötti idő. A kalibráló anyag itt is pba, az adatgyűjtőrendszer a Masslab nevű program. A következő oldalakon az általam vizsgált vegyületek spektrumai láthatók. A tárgyalást a kalkonokkal kezdem, majd a pirazolinok és pirazolok következnek. A Glü jelöli a glükopiranózt, a GlüAc pedig a tetraacetil-glükopiranózt. Minden bemutatott spektrumon feltüntettem a hozzá tartozó vegyület képletét. Az egyes családokba tartozó vegyületek fragmentációját a spektrumok után tárgyalom. 33
Kalkonok 100% 267 O H H O H 3 C O 374 Fe 332 42 56 89 121 153 181 213 237 303 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 R3: 84556 23% m( 10-13) f8419.jdx * MV-228 74% O H H O H 3 C O 332 374 Fe 267 121 56 78 94 129 153 186 213 239 303 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 R3: 11048 18% m( 25-28) f8419.jdx * MV-239 100% 267 O 332 H OGlüAc H 374 Fe 662 56 109 169 213 303 416 458 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 R3: 112087 10% m( 69-76) f8419.jdx * MV-218 560 602 34
54% H O OGlü 267 332 H Fe 89 121 181 213 237 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 R3: 17369 25% m( 117-129) f8419.jdx * MV-221 303 358 388 419 448 494 *10 100% 267 O H OH 332 H Fe 44 56 89 121 145 165 181 214 237 286 303 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 R3: 10391 22% m( 180-184) f8419.jdx * MV-227 93% H 332 O OH H Fe 56 91 121 129 149 166 194 213 239 267 303 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 R3: 10074 23% m( 64-67) f8419.jdx * MVFc-279 35
20% H O H 2 266 Fe H 331 44 65 56 83 120 152 165 180 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 R3: 19535 41% m( 171-178) f8419.jdx * MV-Fc-266/A/1 212 238 302 A 22. ábra mutatja a ferrocenil-kalkonok általános fragmentációs sémáját. A molekulaion minden vegyületnél megfigyelhető volt, de tetraacetil-glükopiranóz tartalmú anyagok esetén csak kis intenzitással. Az ábrán látható X vesztés jellemző a fenil gyűrűn lévő szubsztituensre. Peracetilezett glükózt tartalmazó vegyület esetén a 288 (acetilvándorlás a fenolos oxigénre, majd ebből ketén vesztés, amit metastabil ion is bizonyít) és 330 vesztés, a glükopiranózra a 162 vesztés jellemző. O-acetil vegyületek ketén (-42) vesztést mutatnak, amelyet a spektrumban megjelenő metastabil ion is alátámaszt. H R 1 R 2 H O -X, a fenilgyûrûn lévõ funkciós csoporttól függ R -65-29 R 2 ' O 1 ' CH+ + 2-30 -28-56 -26 A feltüntetett ionok és vesztések megjelennek a spektrumban 22. ábra: Kalkonok fragmentációja 36
Amin- és hidroxil-csoportot tartalmazó vegyületeknél a további fragmentációs folyamatok közvetlenül a molekulaionból jelentkeznek. Az ábrán feltüntetett R 1 és R 2 a megfelelő R csoportokból visszamaradó részt jelöli, a már említett vesztések után (pl. C6H4-OAc-ból ketén vesztés után C6H4-OH lesz). Jellemző a ferrocenil kalkonokra a 65-ös vesztés, ami egy ciklopentadienilnek felel meg, és a legtöbb esetben metastabil ionként is megjelenik. A fragmentáció 30-as tömegű fragmens vesztésével folytatódik, majd Fe vesztést látunk (-56). Ha R 1 ferrocenil, a spektrumra a 181-es fragmension megjelenése jellemző, ha R 2 ferrocenil 186-os csúcsot láthatunk. A ferrocenil csoport helyzetére jellemző még a 237/239 csúcsok aránya, R1 = Fc esetén a 237-es, míg R2 = Fc esetén a 239-es csúcs intenzivebb. Pirazolinok 90% 404 Fe 121 186 212 56 77 91 133 153 202 235 289 314 339 374 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 R3: 18041 16% m( 242-254) f8419.jdx * MV-FC-251 37