Igazságügyi Genetikai vizsgálatok. Szemes Áfonya Bűnügyi Szakértői és Kutatóintézet

Igazságügyi Genetikai vizsgálatok Szemes Áfonya Bűnügyi Szakértői és Kutatóintézet 2014.10.07.

DNS összehasonlító vizsgálati módszer Helyszíni minták: Vér Ondó Nyál Köröm (alatti hám) Hajhagymás haj Egyéb szövetek (pl. abortum, vizeletben hám) LCN (Low Copy Number) Egyezés? Rokonsági kapcsolatok? Minta gyanúsítottól Szájnyálkahártya-törlet Folyékony vér sértettől, eliminációs minták: Szájnyálkahártya-törlet Folyékony vér Azonosítatlan személyek, holttestek: Vér Szövet Csontminta Egyezés? Rokonsági kapcsolatok? DNS-profil nyilvántartás Eltűnt személyek mintái: Személyes tárgyak (fogkefe, borotva, ékszer, óra, protézis stb.) Rokonok mintái

Honnan vegyünk mintát? Vizsgálat Ultra Viola fényben Fluorescencia UV fehér fény UV sötét folt Elnyeli az UV-t, csak hő szabadul fel Ondófolt Hő szabadul fel Vér

Kémiai vérelőpróbák Benzidin Hemoglobin pszeudoperoxidáz aktivitásán alapszik pillanatszerű sötétkék színreakció preparálás: benzidin + ecetsav + etanol + 3% H2O2 érzékenység: 1 : 300 000 500 000 karcinogén fals pozitív reakciók; nem specifikus humán vérre! Luminol: chemilumineszcens reakció: vér esetén kékes-fehér fény preparálás: luminol + Na2CO3 + H2O2 v. Na2BO4 utólagos DNS vizsgálatot nem befolyásolja érzékenység: 1 : 5 000 000

Nyál kimutatása Nyál -amiláz (ptyalin) kimutatása: a nyál szárazanyagtartalmának 60%-a amiláz mucin egyéb biol. anyagban is (vérszérum, tej, ondó, hüvelykenet, verejték, széklet, de igen kis mennyiségben!!!) Phadebas amylase teszt: nem vízoldékony keményítőhöz kötött kék festékanyagot tartalmaz. Amiláz jelenlétében a keményítő bomlása miatt a kék festék felszabadul, az oldatot kékre színezi.

Ondó kimutatása Ondóalkotók: foszforil-kolin, savanyú-foszfatáz, citromsav, fruktóz, spermium (kivéve sterilitás esetén) Savanyú-foszfatáz (ACP) vizsgálat: alifás és aromás ortofoszforsav-észtereket hidrolizálja gyengén savanyú (ph=5) közegben az enzim nagyságrendekkel nagyobb koncentrációban van jelen az ondóban (prosztata eredetű), mint egyéb testváladékban (pl. hüvelyváladék) érzékenység 1 : 1000 nem specifikus! a savanyú foszfatáz az alfa-naftil foszfátot hidrolizálja, a keletkező naftol reagál az o-dianisidinnel, ennek következtében egy lila színű festék szabadul fel Phosphatesmo KM tesztcsík

Immunológiai tesztek Ondó teszt: PSA=Prosztata specifikus antigénre specifikusak (prosztatában termelődik, ondóra specifikus kiv. prosztata daganatban szenvedő férfiak (vér, vizelet), Semelogeninre specifikusak Azoospermiás ondó (férfiak 1-9 %-a) kimutatása! Vérteszt: Hemoglobinra specifikus (pl. Hexagon OBTI) Terhességi teszt: hasonló elv Csepp T Csepp T

Festett kenet Kernechtrot-Picroindigocarmine (AlSO4, Nuclear Fast Red, Pikrinsav, Indigókármin) (balra) Sperm Hy-liter (Fluorescens) (lent)

DNS felszabadítása lineáris folyamat, egymásra épülő lépések SEB SDS sejthártya felszabadítása (hétköznap: mosószer) U.a. mint a lízis puffer Proteinase K sejtet körülvevő ill. DNS-t rögzítő fehérjék emésztése, kicsapása (hétköznap: húspuhító enzim) DTT Dithiothreitol diszulfid hidakat tartalmazó fehérjék bontása spermiumokban, hajban van ilyen

DNS tisztítása Van az oldatunkban DNS + sejttörmelék, fehérje és sejthártya lebontva. Gátló anyagoktól meg kell tisztítani a DNS-t! Oldhatóság különbsége alapján (felület ) Mágnesgyöngyhöz kötjük a DNSt Tris-EDTA szerepe: Endogén nukleázok inaktiválása

Egy különleges lehetőség: spermium és hám differenciált feltárása SDS, EDTA és proteináz K (sejt lízis puffer) Inkubálás 37 o C-on Centrifugálás Elkövető spermium sejtjei az áldozat hámsejtjeivel keveredve SDS, EDTA és proteináz K + DTT DTT: a spermium sejtfal lebontása spermium üledék Felülúszó: hámsejtekből származó DNS Férfi Frakció spermium üledék Figure 3.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press Női Frakció

Mit tudunk a DNS-ről? Dezoxiribonukleinsav Savgyök milyen töltésű?

Mit tudunk a DNS-ről? Örökítő anyag Kódoló szakaszok (humán genom kb. 25 %-a) Nem kódoló, junk DNA szemét DNS ismétlődő, repeat régiók. STR: short tandem repeat Minden személy DNS-e egyedi, kivéve az egypetéjű ikreket (bár itt is vannak / lehetnek eltérések)

PCR (polimeráz láncreakció) Kary B. Mullis és a hőforrásban élő baktériumok (Thermus aquaticus) polimeráz enzime Hot start! Thermus aquaticus Kary B. Mullis

Hőmérséklet PCR 94 o C 94 o C 94 o C 94 o C 72 o C 72 o C 72 o C Idő 60 o C Denatruáció 60 o C Egy Ciklus 60 o C Általában 25-35 ciklus a PCR típusától függően

Real-time PCR DNS mennyiség mérése A PCR optimális működéséhez 0,5-1 ng DNS bevitelre van szükség!

Gélelektroforézis DNS molekulák futóversenye egy pókhálószövedéken át Agaróz, vagy akrilamid közegben A több ismétlődő egységből (repeat) álló molekulák lassabban futnak! - + Kiindulási állapot - + Kb. 1 óra múlva

Gélelektroforézis

Gélelektroforézis kiértékelése

Eltérő öröklődési mintázatok Leszármazási markerek Autoszómás marker (az összes felmenőnktől örököljük részletekben) Y-kromoszóma (csak a fiú gyermekek öröklik apjuktól) Mitokondriális DNS (minden gyermek az édesanyjától örökli) PAR1 X Y From David C. Page PAR2 Figure 9.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

Női DNS-profil

Y-haplotípus

Definíciók Nukleotid: DNS alegysége (dezoxiriboz, foszforsav, N-tartalmú bázisok: adenin/a, Timin/T, Guanin/G,Citozin/C) A DNS által kódolt információ a nukleotidok sorrendjében rejlik, ez a DNS-szekvencia Genom: szervezet teljes örökítő információját jelenti, amely a DNS-ben van kódolva Gének: olyan nukleinsav-szakaszok a sejtek magjainak kromoszómáiban, melyek a szervezet működését és növekedését befolyásoló fehérjék szabályozásához és előállításához szükséges információkat tartalmazzák Lokusz: a DNS-lánc egy kitüntetett helye, mely változatosságot (polimorfizmus) mutathat. Polimorfizmus: A DNS-lánc egy kitüntetett helyén mutatkozó egyedi változatosság Egy konkrét változat neve: allél DNS- profil: A személy/egyed vagy biológiai minta örökítő anyagának polimorf genetikai lokuszain (markerein) megállapított allélok összessége (DNS-mintázat, genotípus, haplotípus)

A DNS vizsgálat eredménye Egyezés Az összevetett STR profilok csúcsai ugyanazt a genotípust mutatják és a profilok között nincsen megmagyarázhatatlan eltérés. A szakértői véleményben az egyezés fokát statisztikai értékeléssel, valószínűsítő véleményadással is alá kell támasztani. Kizárás (nincs egyezés) A mintákból kimutatott DNS-profilok összehasonlítása olyan genotípusbeli különbözőséget mutat, ami csak a minták különböző eredetével lehet megmagyarázni. Inkonkluzív Az adatok kiértékelése során nem állapítható meg, hogy a profilok megegyeznek-e egymással.

Statisztika: a vád és a védelem hipotézise Helyszíni Összehasonlító Annak az esélye, hogy a biológiai nyom XY-on kívül más személytől származhatott: Gyanúsított Gyanúsított + Sértett (sértett profilja ismert) Gyanúsított + Vétlen (vétlen profilja ismeretlen) Gyanúsított + nem teljes profil Gyanúsított + Sértett (sértett profilja ismert) + nem teljes profil Gyanúsított Y-kromoszómás vizsgálat Gyanúsított Gyanúsított Gyanúsított Gyanúsított Gyanúsított Gyanúsított 1 : 8*10 18 1 : 6*10 16 1 : 1*10 11 1 : 1*10 15 1 : 2*10 14 1 : ~2*10 4 0 a 69 064-ből

A DNS vizsgálat korlátai, A biztosított minta DNS tartalma befolyásoló tényezők (mennyiség és minőség: detektálási küszöb) A biztosított minta degradálódása, bomlási folyamatok - enzimatikus (endogén és exogén. Nedves környezetben: pár nap!) - ultraibolya sugárzás Gátló anyagok jelenléte Kontamináció (detektálási küszöb csökkenése!!!) Extrém elővigyázatosság (egyszerhasználatos maszk, öltözetek, kesztyűcsere bűnjelek közt, felületek és eszközök DNS-mentesítése. Egyszerre egy bűnjel vizsgálata, egy nyitott mintatároló cső, referenciaminták vizsgálata más helyiségben, vagy a helyszíni minták után, eliminációs adatbázis a rendőrségi, szakértői dologzóktól. Időbeniség nem meghatározható Másodlagos transzfer Feltételrendszer (anyag, eszköz, személy, költség)

Példaesetek

Az 1613 óta uralmon lévő Romanov orosz cári dinasztia bukását a polgári forradalom hozta el: 1917 márciusában lemondatták II. Miklós cárt, és családjával együtt őrizetbe vették. 1918 áprilisában a kommunista hatalomátvétel után a szovjet kormány parancsára Jekatyerinburgba hurcolták őket. 1918. július 16-ról 17-re virradó éjszaka itt, az Ipatyev-ház alagsorában gépfegyvertüzet zúdítottak II. Miklós cárra, feleségére, Alekszandra cárnéra, öt gyermekükre: Máriára, Tatyjanára, Anasztáziára, Olgára és a trónörökösre, Alekszejre, és kivégezték a balsorsukban is velük tartó néhány cselédjüket, köztük a család orvosát is. Holttestüket savval öntötték le, és a közeli erdőben, névtelen sírokba temették. Az Orosz cári család beazonosítása

Szélhámos örökös-jelöltek A cár halálhírét már másnap világra hozták, ám a többi rokonról ekkor még azt állították, hogy biztonságosabb helyre szállították. Ez az álhír adott később alapot arra, hogy az elkövetkező években szélhámosok egész sora adja ki magát a cári család túlélőjének, a szenzációs menekülésről szóló történetek és a gazdag rokonság által biztosítva megélhetését. Anna Anderson (jobbra), volt a legügyesebb szélhámos, aki Anasztáziának (balra) adta ki magát. A megdöbbentő hasonlóság mellett a család belügyeit is kimerítően ismerte.

DNS vizsgálattal azonosították a maradványokat Egy családhoz tartoznak? STR-analízis autoszómás markereken: a cár, felesége és 5 gyermekük kapcsolatát igazolta cselédeiket a családtól függetlenként azonosította Valóban a cári család csontjait fedezték fel? Miklós cár: 1891., Japán: szablyával támadtak a cárra, véres ingét relikviaként őrizték => egyezés Alexandra cárné és 5 gyermeke: Mitokondriális DNS-sel azonosították Fülöp edinburgh-i herceg (II. Erzsébet királyné férje) anyai ágon rokona Alexandra cárnénak Anna Andersont kizárták A cári család és Fülöp herceg rokonsága. A kék szín a közös mitkondriális DNS leszármazását jelzi.

Ismeretlen holttest azonosítása Ismeretlen holttestből égett csontmintából Eltűnt által használt borotvából Eltűnt lányának szájnyálkahártya-törletéből

Ismeretlen holttest azonosítása Borotva és csontminta függetlenek vs azonos személytől származnak: 1 : 53,4 trilliárdhoz NN férfi (csontminta) az eltűnt lányának biológiai apja, vs NN férfi (csontminta) az eltűnt lányával nem áll rokonságban: 29,5 millió : 1, ami a kérdéses rokoni kapcsolatra vonatkozóan 99,999997 %-os posteriori valószínűségi értéknek felel meg.

Bugyiból, férfi frakció Szexuális erőszak (volt feleség ellen) Bugyiból, női frakció Gyanúsított férfi profilja DNS Nyilvántartásból AMEL D8S1179 D21S11 D18S51 X/ Y 14/ 15 28/ 30 15/ 17

Szexuális erőszak (volt feleség ellen) Bugyiból, női frakció és férfi frakció eredménye (megegyezik)

Apa, anya 6 gyermek

Statisztika értelmezés Vád Védelem 1 Védelem 2 Védelem 3 Vád szerint allélbees és Vád szerint allélkies és 1 2 Lánygyermek + APA ANYA + APA Lánygyermek + Fiúgyermek Lánygyermek + APA + ANYA APA + NN APA + NN Lánygyermek + NN Lánygyermek + APA + NN Lánygyermek + NN NN + NN 7 0 25,2 426,9 ANYA + NN NN + NN 0 2 4,06E+14 3,24E+17 Fiúgyermek + NN NN + NN 8 0 6,8 0,1 Lánygyermek + ANYA+ NN NN + NN csak 2! 0 2 1,57E+11 7,15E+13

És az ikrekkel mi a helyzet?

Köszönöm a figyelmet!