Az igazságügyi genetikai vizsgálatok elméleti és gyakorlati háttere. Hülberné Dobos Ágota Bűnügyi Szakértői és Kutatóintézet november 20.

Átírás

1 Az igazságügyi genetikai vizsgálatok elméleti és gyakorlati háttere Hülberné Dobos Ágota Bűnügyi Szakértői és Kutatóintézet november 20.

2 A biológiai minták típusai Folyékony vér és vérfoltok Ondó és hüvelyváladék Nyál Köröm Csont és fog Vizelet Testnedvek Hajhagymával rendelkező hajszál Egyéb szövetek és szervek

3 Humán személyazonosítási vizsgálatok Bűnügyekben gyanúsított és helyszíni minta lehetséges kapcsolatának vizsgálata Apasági vizsgálatok -- biol. apaság megállapítása Eltűnt személyek maradványainak vizsgálata Tömegszerencsétlenségek -- kegyeleti célú vizsgálatok Történelmi jelentőségű vizsgálatok DNS-profil nyilvántartások

4 Fő kérdések 1. Az élő anyag mely összetevője bír információtartalommal a személyazonosítás szempontjából? 2. Ez az összetevő megváltozik-e az idő folyamán, ha igen milyen mértékben? 3. Ha összehasonlításra kerül sor, akkor a megállapított típusok egyezése milyen mértékben bizonyítja a biológiai nyom adott személytől való származását?

5 BIOLÓGIAI MINTÁK VIZSGÁLATA TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Kémiai módszerek Szerológiai módszerek (vércsoport meghatározás) Elektroforetikus módszerek (fehérje-polimorfizmus) Molekuláris biológiai módszerek (DNS-polimorfizmus) RFLP első humán DNS marker felfedezése Alec Jeffreys: első igazságügyi célú DNS vizsgálat, PCR technika feltalálása (Mullis) FBI: DNS azonosítás bűnügyekben első humán STR marker leírása 1992-első magyarországi igazságügyi DNS laboratórium: BSzKI 2000-Új DNS labor: mitokondriális DNS vizsgálat: BSZKI

6 Igazságügyi szerológia Biológiai anyagmaradványokból (vér, vérfolt, haj, ondó stb.) történő személyazonosítás Az ABO- vércsoport-rendszer, az Rh fenotípus rendszerbe való besorolás ABO: A 42% B 18% O 31% AB 8.8% Fehérjékben, enzimekben, immonológiai markerekben rejlő polimorfizmust (sokféleséget) használja fel; pl: Alacsony polimorfizmus Emberi vérsavók használata; megszűnése Egyéb készítmények megbízhatatlansága -Fehérjeszerkezet érzékeny a környezeti hatásra

7 PCR technika előnyei az igazságügyi személyazonosításban Szubanalitikus mennyiségű DNS-t az analitikai vizsg. érzékenységi szintje fölé emeli nagyon kevés DNS-t tartalmazó mintákból is: low copy number DNA Bomlott állapotú DNS-t tartalmazó mintákból is Viszonylag gyorsan és egyszerűen kivitelezhető Jól azonosítható (diszkrét) allélek: kevert minták analízise és statisztikai interpretáció differenciált DNS extrakció

8 A DNS vizsgálat korlátai, befolyásoló tényezők A biztosított minta DNS tartalma (mennyiség és minőség: detektálási küszöb) A biztosított minta degradálódása, bomlási folyamatok - enzimatikus (endogén és exogén) - ultraibolya sugárzás - természetes hordozók (pl. cser- és huminsavak) Kontamináció (detektálási küszöb csökkenése!!!) Feltételrendszer (anyag, eszköz, személy, költség)

9 DNS az emberi sejtben Kromoszóma Sejtmag Kettős szálú DNS-molekula PCR célterület Egyedi nukleotidok

10 Definíciók Nukleotid: DNS alegysége (dezoxiriboz, foszforsav, N-tartalmú bázisok: adenin/a, Timin/T, Guanin/G,Citozin/C) A DNS által kódolt információ a nukleotidok sorrendjében rejlik, ez a DNS-szekvencia Genom: szervezet teljes örökítő információját jelenti, amely a DNS-ben van kódolva Gének: olyan nukleinsav-szakaszok a sejtek magjainak kromoszómáiban, melyek a szervezet működését és növekedését befolyásoló fehérjék szabályozásához és előállításához szükséges információkat tartalmazzák Allél: a DNS-lánc egy kitüntetett helye Polimorfizmus: A DNS-lánc egy kitüntetett helyén mutatkozó egyedi változat Lókusz vagy marker: A polimorfizmust mutató DNS-szakasz DNS- profil: A személy/egyed vagy biológiai minta örökítő anyagának polimorf genetikai lokuszain (markerein) megállapított allélok összessége (DNS-mintázat, genotípus, haplotípus)

11 Mit tudunk a DNS-ről? Dezoxiribonukleinsav

12 Hossz-polimorfizmus a kromoszómákon A lókusz Allél 1 Allél 2 Homológ kromoszómapár 4 5 Allél 1 Allél 2 Homológ kromoszómap 3 B lókusz Figure 2.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press 6

13 de/ A humán genom 23 pár kromoszóma + mtdns Sejtmagban Autoszómák 2 példány sejtenkén t Mitokondriumokba n (több példány sejtenként) mtdns 16,569 bp X Y sejtmagi DNS 3.2 milliárd bp Ivari kromoszómá k Mitokondriális DNS Sejtenként több 100 molekula! Figure 2.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

14 Genetikai állományunk öröklődése Mitokondriális DNS: kizárólag anyai öröklődés!

15 DNS-profilok öröklődési mintázata

16 Nyomkutatás és mintabiztosítás bűnügyekben Sokféle bűnjelminta: sértett bcs. idején vagy után viselt ruházata, gyanúsított bcs. idején viselt ruházata, ágynemű, szőnyeg, gépjármű, textilhuzat, tisztálkodás céljára használt anyagok (pl. törlőkendő, zsebkendő), egészségügyi ill. tisztasági betét, tampon, óvszer, törletminták (pl. testüregek, testfelszín, egyéb tárgyak), natív ill. festett kenetek, hüvelymosó folyadék, körömnyiradék, szőrképlet, hám- illetve izzadmány, vérszennyeződés, izom, csont, abortum, stb. Nyomkutatás: szabad szemmel természetes fényben, alternatív fényforrás segítségével sötét helyiségben (fluoreszcencia), kémiai elővizsgálat (pl. savanyú foszfatáz) Mintabiztosítás: minta típusának legmegfelelőbb hordozó, lehető legtöbb információ kinyerésére való törekvés

17 Mintabiztosítási megoldások Stb.

18 Anti-kontaminációs útmutatók I. Extrém elővigyázatosság (szájmaszk, gumikesztyű) Munkafelület rendszeres tisztítása (Hypo, Microsol) Steril (ha lehetséges) egyszerhasználatos eszközök Egyes bűnjelek között kesztyűcsere Használd minimálisan használd ki legjobban! Egy időben egy tárgy és egy minta Eszköz a mintához és nem fordítva Mintákat, tárgyakat más személy ne érintse!

19 Anti-kontaminációs útmutatók II. Már biztosított mintát nem bolygatjuk Sértetti és gyanúsítotti minták, bűnjelek szétválasztása Csomagolás és címkézés rögtön a biztosítás után Ne csomagoljunk egybe több mintát, bűnjelet Megfelelő méretű bűnjelzsák, szélein leragasztva Mintatárolót ne használjuk újra Ne együnk, igyunk, dohányozzunk közben Mintabiztosító személyek DNS mintái

20 Nukleáris DNS vizsgálat elvégzésére alkalmas biológiai anyagok Vér és vérnyomok Ondó, ondófolt, gumióvszer tartalom Hüvelyváladék, hüvelykenet Nyál, nyálfolt, cigarettavég Orrváladék Csontszövet, fogak, egyéb szövet Hajszál gyökérrel

21 Vizsgálati stratégia bűnügyekben Elővizsgálatok: Bűnjelszemle alkalmával Laboratóriumi megerősítő vizsgálatok: vér (FOB-teszt), nyál (amiláz), ondó (PSA-teszt), szőrképlet, hámszövet (fénymikroszkóp), faji eredet meghatározása nem emberi szennyeződések esetén DNS-kinyerés: a hordozó anyagának és a minta szöveti típusának figyelembe vételével kiválasztott egyszerű vagy frakcionált preparálási eljárás (pl. kevert szennyeződés spermium frakció + laphám frakció) Alkalmazása Koncentráció meghatározás: valamennyi minta esetében kötelező a szennyeződés lehetőség szerinti minél pontosabb interpretálása érdekében STR vizsgálatok: számításba vehető hipotézisek és minta típusa alapján meghatározott vizsgálati stratégia Eredmények értékelése Szakértői vélemény

22 Vérelőpróbák I. Mikor és melyiket használjuk? előpróbák (prezumptív, nem specifikus) vérspecifikus tesztek pozitív és negatív kontrollok Vérelőpróbák: a hemoglobin hem csoportjának katalitikus peroxidáz aktivitásán alapszanak (pszeudo-peroxidáz) H 2 O 2 2 (OH - ) Érzékenység: 1 : (min. mennyiség is elég!) Aspecifikus reakciók: egyéb növényi és állati hem növényi peroxidázok (hagyma, káposzta) rozsda?, stb.

23 Vérelőpróbák Benzidin reakció pillanatszerű sötétkék színreakció preparálás: rövid- és hosszútávra (benzidin + ecetsav + etanol + 3% H 2 O 2 ) érzékenység: 1 : karcinogén o-tolidin 3,5,3,5 -tetrametilbenzidin

24 Vérelőpróbák Leucomalachit zöld reakció a leuko komponens színtelen, a malachit sötétzöld preparálás: hagyományos és Na 2 BO 4 +ecetsav+up érzékenység: 1 : nem karcinogén

25 Vérelőpróbák Fenolftalein reakció színtelen redukált forma Zn jelenlétében élénk rózsaszín preparálás: fenolftalein + NaOH + Zn + UP + H 2 O 2 érzékenység: 1 : ??? nem karcinogén egyéb peroxidázok kevésbé befolyásolják???

26 Vérelőpróbák Luminol teszt minimális mennyiségű, nem látható vérszennyeződések chemilumineszcens reakció: vér esetén kékes-fehér fény preparálás: luminol + Na 2 CO 3 + H 2 O 2 v. Na 2 BO 4 utólagos DNS vizsgálatot nem befolyásolja érzékenység: 1 : idősebb, degradált vérnyomok szenzitivitása fals pozitív reakció Cu és Zn vegyületek jelenlétében permanens video dokumentáció Egyéb tesztek: tesztcsíkok (Helostix, Combi-teszt)

27 Előnyök: Vérelőpróbák II. extrém kis mennyiségű vér kimutatására is alkalmasak könnyen kivitelezhetők akár a helyszínen is gyors eredmény hozzávaló reagensek relatíve olcsók negatív eredmény kizárásként értékelhető (kivételek!!!) Hátrányok: nem specifikusak a vérre (Cu, Zn és nehézfémsók, rozsda, növényi peroxidázok, jód, stb.) megerőstíő vizsgálatokat igényel humán és állati eredetű vér között nem tesz különbséget

28 NYÁLSZENNYEZŐDÉS KIMUTATÁSA

29 Nyálszennyeződések kimutatása Nyálhordozó anyagok, nyálminták biztosítása: cigarettavég ruházat, ágynemű (kevert szennyeződések) bőrfelszín, poharak, üvegek, stb. (double-swab) A nyál -amiláz (ptyalin) kimutatása: a nyál szárazanyagtartalmának 60%-a amiláz mucin egyéb biol. anyagban is (vérszérum, tej, ondó, hüvelykenet, verejték, széklet, de igen kis menny.!!!) keményítő és glikogén: D-glükóz molekulák (1-4) kötésével amilóz hélix alakul ki. A Lugol-oldat I 2 molekulái a hélixbe bediffundálva sötétkék színűek. Az amiláz enzim az (1-4) kötéseket bontja. A hélix szerkezet felbomlik dextrin -amiláz + keményítő + Lugol-oldat = sárga kék pozitív és negatív kontroll! higítási sorral spektrofotometriásan mérhető

30 Ondószennyeződések I. Hordozóanyagok, mintabiztosítás: tárgylemezen natív, festett hüvelykenet vattatamponra biztosított hüvelyminta hüvelymosó folyadék ágyneműn, ruházati anyagon ondófolt gumióvszer Kevert biológiai minta: különböző eredetű sejtek abszolút és relatív mennyiségének eltérése Ondógyanús szennyeződésből közvetlen elővizsgálatot nem végzünk!!! Kivétel: UV-fény vizsgálat acriflavin: kék-fehér fluoreszcencia

31 Ondószennyeződések II. Ondóalkotók: foszforil-kolin, savanyú-foszfatáz, citromsav, fruktóz, spermium (kivéve sterilitás esetén) Savanyú-foszfatáz (ACP) vizsgálat: nem specifikus! az enzim nagyságrendekkel nagyobb koncentrációban van jelen az ondóban (prosztata eredetű), mint egyéb testváladékban (pl. hüvelyváladék) érzékenység 1 : 1000 alifás és aromás ortofoszforsav-észtereket hidrolizálja gyengén savanyú (ph=5) közegben szubsztrát: naftil-acetát; reagens: diazóniumsók; vízben oldhatatlan vörös-lila azofesték képződik pozitív és negatív kontroll Phosphatesmo KM tesztcsík (DNS vizsgálathoz is)

32 Ondószennyeződések III. Prosztata specifikus antigén (PSA, p30 fehérje): a prosztata epithelium sejtekben termelődő glikoproteid prosztatába választódik ki ondó folyóssá tétele ondóra specifikus ( ng PSA/ml) egyéb szövetekben nem választódik ki (kivétel: prosztata daganatban szenvedő férfiak vérszéruma) azoospermiás ondó (férfiak 1-9 %-a) kimutatása

33 Ondószennyeződések III. folyt. PSA kimutatása ma: immunkromatográfiás membránteszt: adszorbens, migrációs és teszt membránterülettel, mobilis monoklonális anti-humán PSA antitestfesték konjugátum, immobilizált poliklonális anti-humán PSA antitestek, immobilizált anti-ig antitestek érzékenység: 4 ng PSA/ml

34 Ondószennyeződés biztosítása Hordozó: Ruházat, bőr, ágynemű stb. Észlelés: Vizuális észlelés sárgásfehér szinű Alternativ: Bűnügyi fényforrás, Polilight lámpa Vérfoltok: 415nm elnyelési max. Ondófolt: széles tartoményban gerjeszthető, fluoreszkál.

35 SPERMIUM MIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATA Spermium sejt

36 SPERMIUM MIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATA Megerősitő teszt Karácsanyfa festés (sperm sejt) A festett preparátum megjelenése: Spermasejt: Fej eleje gyenge rózsaszíntől átlátszóig Fej hátsó része sötétvörös Középrész zöld Ostor zöld Epitheliális sejt: Mag rózsaszín Citoplazma világos kékeszöldtől zöldig

37 Humánspecifikus vérpróbák FOBteszt Egylépéses immunkromatográfiás vizsgálat Humán hemoglobinra specifikus (HbAo, HbA2, HbF, HbS) jelölt monoklonális anti-humán Hb antitest konjugátum Immobilizált poliklonális anti-humán Hb mint elfogó Immobilizált anti-ig antitest mint kontroll Nincs keresztreakció állati hemoglobinnal és növényi peroxidázokkal (főemlősök!) Nagyfokú érzékenység 1 : = 1 l vér 1 l vízben 2000 g/ml koncentrációig nincs Hook-effekt Többéves vérfoltok esetén hosszabb extrakció idő!

38 Fajspecifitási vizsgálatok Hagyományos szerológiai módszerek: antigénantitest prec. gyűrű próba Ouchterlony géldiffúzió elektroforetikus technikák (immunelektroforézis, counter, rocket elektroforézis) Immunkromatográfiás membrán tesztcsíkok DNS-alapú fajmeghatározás: Fajspecifikus hibridizációs próbák: QuantiBlot mtdns szekvencia alapján (cytb gén) PCR-RFLP DNS-chip

39 DNS tisztítás - szerves extr. és ultraszűrés

40 Amit a DNS-profilról tudni kell 1. Minden személy genomja egyedi (egypetéjű ikreket kivéve) és a szülőktől örököljük. 2. Genetikai variációkat mutatunk ki annak érdekében, hogy az egyedeket megkülönböztessük egymástól (statisztikai számítások minden esetben!). 3. Jelenleg alkalmazott standard DNS tesztek nem géneket vizsgálnak egyáltalán nem vagy csak kevés információt adnak a vizsgált személy rasszbeli, etnikai hovatartozásáról, betegségre való hajlamról, vagy egyéb külső tulajdonságáról (szemszín, magasság, hajszín, stb.). 4. DNS tipizálásnak hatékonynak és reprodukálhatónak kell lennie (bíróság előtt is ellenőrizhető legyen!).

41 A humán nukleáris genom Kódoló DNS (a humán nukleáris genom ~ 25 %) Protein kódoló (gén) szabályozó szekvenciák Gén: (< 30 ezer db) - monomorf - polimorf (vér- és szérumcsoportok, enzim polimorfizmusok) szekvenciapolimorf: HLA- DQ, GYPA, GC, LDLR, HBGG, Repetitív DNS (a humán nukleáris genom ~60 %) szétszórt elemek tandem ism. elemek (a genom ~45 %) (a genom ~15 %) - SINEs 500 bp - Szatellit DNS (Alu-repeat, 13 %) (Alphoid repeatek) (~ kópia) (171 bp centromer) - LINEs 500 bp - VNTRs (Kpn-repeat, 21 %) (miniszatellitek) (~ kópia) (D1S80, ApoB) - STRs (mikroszatellitek) (TH01, VWA, stb.)

42 A DNS polimorfizmus főbb típusai (A) Szekvencia polimorfizmus AGACTAGACATT AGATTAGGCATT (B) Hossz-polimorfizmus -----(AATG)(AATG)(AATG) (AATG)(AATG)

43 Mit tudunk a DNS-ről? Örökítő anyag Kódoló szakaszok Nem kódoló, szemét DNS Pl.

44 Igazságügyi genetikai aspektusból validált DNS markerek DNS MARKER Szekvenciapolimorfizmus HLA-DQA1 LDLR GYPA HBGG D7S8 GC VNTR Apo B D1S80 Autoszóma Nemi kromoszóma mt DNS Hosszpolimorfizmus Amelogenin HPRTB DYS STRs STR HV-I HV-II HV-III D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, VWA, D8S1179, TPOX, FGA, D2S1338, D19S433, Penta E, Penta D PowerPlex16 és Identifiler multiplex PCR rendszerek

45 Eltérő öröklődési mintázat Leszármazási markerek Autoszómás marker (az összes felmenőnktől örököljük részletekben) Y-kromoszóma (csak a fiú gyermekek öröklik apjuktól) Mitokondriális DNS (minden gyermek az édesanyjától örökli) Figure 9.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

46 Biológiai minták DNS tartalma* Folyékony vér ng/ml Vérfolt ng/cm 2 Ondó ng/ml Hüvelykenet ng/kenet Gyökeres hajszál - kitépett ng/hajszál - kihullott 1-10 ng/hajszál Folyékony nyál ng/ml - szájtörlet ng/törlet Vizelet 1-20 ng/ml Csont 1-10 ng/mg * A vizsgálatok össz. DNS igénye a minta állapotától függően: 0,3-1 ng

47 DNS vizsgálat lépésről lépésre Helyszíni v. összehasonlító DNS minta DNS tisztítás Biológia DNS kvantálás Több STR marker PCR felsokszorozása Felsokszorozott DNS elválasztása és detektálása (STR Allélek) Technológia Minta genotipizálás Mintákból nyert genotípusok összehasonlítása Genetika Egyezés esetén a DNS profil összevetése populációs adatbázissal Szakértői vélemény statisztikai interpretációval

48 Az izolálás fő lépései: -sejtlízis, sejtfeltárás -endogén nukleázok inaktiválása -nukleinsav elválasztása a sejttörmeléktől, fehérjéktől és az egyéb szennyezőktől -nukleinsav tisztítása

49 DNS izolálás csoportosítása: A minta típusa: Az extrakció típusa: Folyékony vér Vérfolt, cigaretta Kevert váladékok Körömminta Csont Egyéb szövetek speciális Szerves (fenol-kloroformizoamil alkohol) Chelex 100 (kelátképző gyanta) Anorganikus (pl.alkálihidroxidok; NaCl) Egyéb (Kit, FTA-papír)

50 DNS tisztítás különböző minta típusokból Szerves extrakció vérfolt SDS, DTT, EDTA és proteináz K Inkubálás (56 o C, 12h) Centrifugálá s VORTEX DNS kvantálás Phenol, chloroform, isoamyl alcohol Centrifugálá Vizes fázis átvitele új csőbe s PCR reakció TE buffer DNS koncentrálás (Centricon/Microcon-100) Centrifugálá s vérfolt CHELEX Víz Inkubálás (szobahő) Centrifugálá s Felülúszó eltávolítása 5% Chelex Inkubálás (56 o C) Inkubálás (100 o C) DNS kvantálás PCR reakció Centrifugálá s FTA papír PUNCH Mosás extrakciós pufferben PCR reakció Vércsepp az FTA-papíron beszárítva Felülúszó eltávolítása PCR reagensek Nincs DNS kvantálás: tipikusan egyforma mintákon (pl. adatbázis) végezhető Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

51 Kevert biológiai nyom, váladék biztosítása Kevert biológiai nyomok DNS tisztítása SDS, EDTA és proteináz K (sejt lízis buffer) Inkubálás 37 o C-on Elkövető spermium sejtjei az áldozat hámsejtjeivel keveredve SDS, EDTA és proteináz K + DTT Centrifugálá s DTT: a spermiu m sejtfal lebontás a spermiu m üledék Felülúszó Férfi Frakció spermiu m üledék Női Frakció Figure 3.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

52 DNS kvantálás - Célok Bűnjelminta tartalmaz-e DNS-t? (van/nincs) Bűnjelminta tartalmaz-e humán/állati/stb. DNS-t? (van/nincs) DNS állagának, minőségének meghatározása (tisztaság) Koncentráció meghatározása további reakciók optimális kivitelezése érdekében PCR-termék koncentrációjának megállapítása EtBr SYBR Gold

53 Célok Bűnjelminta tartalmaz-e DNS-t? (van/nincs) Bűnjelminta tartalmaz-e humán/állati/stb. DNS-t? (van/nincs) Bűnjelminta tartalmaz-e bizonyos (pl. mitokondriális) DNS-t? (van/nincs) DNS állagának meghatározása Koncentráció meghatározása az optimális PCR érdekében Koncentráció meghatározása egyéb reakciók (pl. szekvenálás) optimális kivitelezése érdekében Egyszálú DNS (ssdna) pl. primer cc. meghatározása PCR-termék koncentrációjának megállapítása

54 Agaróz gélelektroforézis ng/ l ng/ l EtBr SYBR Gold

55 Szükséges? Referencia minták (pl. vér, vérfolt, szájnyálka-hártya-törlet) standardizált feldolgozása esetén nem feltétlenül szükséges osztrák nemzeti bűnügyi DNS-nyilvántartás Bizonyos esetekben nincs is mód rá: minimális mennyiségű DNS-extraktum DNS-tisztítás FTA kártyáról

56 Technikai feltételek... D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 VWA TPOX D18S51 Amel D5S818 FGA

57 PCR definíciója: in vitro folyamat DNS egy tetszőleges szakaszáról milliómilliárd másolatot készít. ciklikus enzimatikus reakció ismételt módon másolja a DNS-t adott ciklus termékei a következő ciklusok templátjaiként szolgálnak szub-analitikai mennyiségű DNS mennyiségét a vizsgálati küszöbszint fölé emeli

58 A Polimeráz láncreakció Kiinduló DNS templát Forward primer 5 3 Szálak szétválása (denaturálás) Primerek tapadása Reverse primer Másolás (primerkiterjesztés) Ciklusok ismétlése, Exponenciális DNS másolás Figure 4.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

59 Hőmérséklet A Polimeráz láncreakció 94 o C 94 o C 94 o C 94 o C 72 o C 72 o C 72 o C 60 o C 60 o C Egy Ciklus 60 o C Az első ciklusban a DNS denaturálás ~10 percre beállítva AmpliTaq Gold DNS-polimeráz hot-start PCR-hez Idő Általában ciklus a PCR típusától függően Figure 4.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

60 Multiplex - PCR (A) Három lokusz szimultán amplifikálása egy reakcióban Locus A Locus B Locus C (B) PCR termékek elválasztása fragmens méret alapján A B C small large Figure 4.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press

61 Multiplex PCR előnyei 10 vagy több STR lokusz egyidejű felsokszorozása kereskedelemben beszerezhető, validált STR kitek A multiplex PCR előnyei: megnövelt információnyerés egységnyi idő alatt csökkent mennyiségű labormunka csökkent mintaigény

62 Mitokondriális DNS vizsgálat mintatípusok Bizonyíték minta Hajszálak Csontok Fogak Vizelet Ürülék Hányadék Low Copy Number DNA Ha az STR vizsgálat nem járt eredménnyel!

63 A humán mitokondriális DNS ND5 ND4 ND4L HV1 Kontroll Régió (D-loop) cyt b ND6 O H 1/16569 HV S rrns bp O L 16S rrns ND1 ND2 Sejten belüli nagy kópiaszám (~1000) Maternális öröklésmenet: nincs rekombináció! Nagy mutációs ráta: DNA repair? Kódoló Régió: 37 gén Hipervariábilis szakaszok (HV1, HV2) Cambridge referencia szekvencia ND3 COIII ATP6 ATP8 COII COI Szekvencia adatbázisok: EMPOP

64 Mitokondriális DNS: Tulajdonságok Néhány sejt is elegendő a vizsgálathoz, mivel a sejt citoplazma akár 1000 példányban is tartalmazhat mtdns-t Kis mennyiségű vagy erősen degradálódott mintákból is kivonható (pl. csont, fog, hajszál) és PCR-rel felsokszorozható. Az amplifikált termékből szekvenálással határozzuk meg a mtdns típust Testvérek és az összes anyai ági leszármazott ugyanazzal a mtdns szekvenciával rendelkezik mert a mtdns kizárólag anyai ágon öröklődik mtdns szekvenciákból nyert információ segíthet eltűnt személyek azonosításában és bizonyos esetekben kizárhat gyanús személyeket

65 Élelmiszer azonosítás

66 Y-kromoszómás polimorfizmusok Az autoszómás STR markerek nagyobb megkülönböztető erővel (PD), és azonosító hatékonysággal rendelkeznek, ezért alkalmazásukat előnybe kell részesíteni amikor csak lehetséges. Az Y-kromoszóma STR markerek elsősorban extrém arányú nő és férfi eredetű kevert biológiai nyomok férfi komponensének azonosítására alkalmazható (pl. ha differenciált lízis nem alkalmazható, mint köröm-kaparékok esetében).

67 Az Y-kromoszóma tulajdonságai PAR1 X From David C. Page Y PAR2 2%-a a teljes humán genomnak (60 Mbp) A PAR régiók homológiát mutatnak az X- kromoszóma azonos régióival 95% nem homológ az X- kromoszómával (MSY)

68 Az Y-kromoszómás vizsgálatok előnye Nemi erőszakos ügyben előforduló DNS-profil:

69 Igazságügyi alkalmazásra hitelesített PCR-alapú DNS markerek Autoszóma Ivari kromoszóma mtdns Hossz-polimorf AMPFLP ApoB D1S80 STR LPL F13B FES/FPS F13A01 TH01 TPOX CSF1PO D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 Szekvencia-polimorf HLA-DQA1 LDLR GYPA HBGG D7S8 GC Amelogenin X-Y spec. alfoid HPRTB DYS19 DYS385 DYS389 I-II DYS390 DYS391 DYS392 DYS393 HV I HV II

70 A vizsgált lokuszok jellemzői Lokusz Lokáció Repeat szerkezet TH01 11p15.5 (AATG) n TPOX 2p23-2pter (AATG) n CSF1PO 5q (AGAT) n D3S1358 3p TCTA (TCTG) 1-3 (TCTA) n vwa 12p12-pter TCTA (TCTG) 3-4 (TCTA) n FGA 4q28 (TTTC) 3 TTTT TTCT (CTTT) n CTCC (TTCC) n D8S (TCTR) n D21S11 21q11-q21 (TCTA) n (TCTG) n [(TCTA) 3 TA (TCTA) 3 TCA (TCTA) 2 TCCA TA] (TCTA) n D18S51 18q21.3 (AGAA) n D5S818 5q21-31 (AGAT) n D13S317 13q22-31 (GATA) n D7S820 7q11.23-q21 (GATA) n

71 Allélgyakorisági adatbázis D13S317 A 11,12 genotípus 54-szer fordult elő 302 személyben (604 vizsgált kromoszóma) Table 20.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press nyomán

72 Multiplex STR-vizsgálat 3 lokuszos elektroferogramja 1: allél-létra 2, 3, 5: három személy DNSprofilja 4: helyszíni nyom (cigarettacsikk) DNS-profilja D3S1358 vwa FGA 3: A személy 16/17 14/16 22/23 4: Cigarettacsikk 15/18 14/17 23/25 5: B személy 15/18 14/17 23/25 Különböző eredet = Kategorikus kizárás Azonos eredet? = Származás? Véletlen egyezés valószínűsége?

73 A DNS vizsgálat három lehetséges kimenetele Egyezés Az összevetett STR profilok csúcsai ugyanazt a genotípust mutatják és a profilok között nincsen megmagyarázhatatlan eltérés. A szakértői véleményben az egyezés fokát statisztikai értékeléssel, valószínűsítő véleményadással is alá kell támasztani. Kizárás (nincs egyezés) A mintákból kimutatott DNS-profilok összehasonlítása olyan genotípusbeli különbözőséget mutat, ami csak a minták különböző eredetével lehet megmagyarázni. Inkonkluzív Az adatok kiértékelése során nem állapítható meg, hogy a profilok megegyeznek-e egymással (pl. ha két szakértő ellentétes véleményre jut egy profil kapcsán és nincs egyéb információ bármelyik következtetés alátámasztására).

74 Nemzetközi DNS minőségi kontroll vizsgálatok # 1.1 GEDNAP (1994 -)

75 Populációs adatbázisok Mekkora a DNS-profil előfordulási gyakorisága a lehetséges bűnelkövetők populációjában? Mintavétel a népességből Kik a lehetséges bűnelkövetők? Az adott ügyben érintett lehetséges bűnelkövetők reprezentatív és releváns populációját (ún. random minta) a gyakorlatban lehetetlen pontosan definiálni és az összes lehetséges tettes személy DNS-profilját megállapítani Nincs is rá szükség. Gondosan kiválasztott ún. komfort (convenience) anonim minták (populációs adatbázisok) statisztikailag megfelelőek (N 100): vérbank minták kriminalisztikai / apasági tesztlaboratóriumokban vizsgált minták laboratóriumi személyzet földrajzi, néprajzi, antropológiai, etnikai alapon gyűjtött minták

76 CODIS indexek rendszere Gyanúsított Elítélt Helyszíni minta

77 A DNS-profil nyilvántartás technikai háttere A személyi- és bűnügyi adatok kezelése a Közigazgatási Elektronikus Közszolgáltatások Központi Hivatala (KEKKH) bűnügyi nyilvántartó rendszerében, a DNS-profil adatok jogszabályban előírt elkülönült kezelése pedig a Bűnügyi Szakértői és Kutatóintézet (BSZKI) Hemogenetikai Osztály informatikai rendszerében történik A DNS-profilokat nyilvántartó informatikai rendszer alapját az FBI által fejlesztett és ezidáig 34 ország 236 laboratóriumában telepített CODIS (Combined DNA Indexing System) képezi CODIS hazai működésének kezdete 2004 CODIS adatok (2010. június 30.): Hazai személyi DNS-profilok száma Hazai helyszíni DNS-profilok száma Külföldi DNS-profilok száma Összes kezelt DNS-profil

78 Szexuális bűncselekmények DNS-vizsgálata # 1 VWA TH01 TPOX CSF1PO Gyanúsított Ondófolt

79 Szexuális bűncselekmények DNS-vizsgálata # 2 LPL F13B FES F13A01 Sértett Abortum Gyanúsított

80 Halálos közúti baleset gondatlan okozása vérszennyeződések vizsgálata én körüli időben Szekszárd és Hőgyész között egy Ford Transit tehergépkocsi letért a jobb oldali útpadkára, árokba hajtott majd egy fának ütközött. Ennek következtében T.L. kisebb sérüléseket szenvedett, míg társa K.G. életét vesztette. A helyszínre elsőként érkező tanuk elmondása alapján a baleset következtében mindkét személy kiesett a tehergépkocsiból. Biztosításra került az érintett személyek vérmintája valamint a tehergépkocsi szélvédőjének vérgyanús szennyeződéses jobb oldali része

81 Ismeretlen holttestek vizsgálata Tiszalök (1) Sz. Lné N. N. női holttest Többszörös kizárás!

82 Ismeretlen holttestek vizsgálata Gönyü (1) N. N. férfi holttest S. G G. Cs Valószínűségi érték: 99,999994%

83 Interpol szerepe a DNS-profil adatok nemzetközi összehasonlításában Interpol évi felmérés eredménye: Interpol keretében együttműködő tagállamok száma: 187 DNS-vizsgálati lehetőséggel rendelkező tagállamok száma: 118 (63%) Nemzeti DNS-adatbázissal rendelkező tagállamok száma: 57 (30%) Interpol DNS-adatbázist használó tagállamok száma: 48 (lsd. térkép)

84 Egyéb lehetőségek... A Forensic Science Service által kidolgozott, rokoni kapcsolatok keresésén alapuló ún. familial searching eljárás egyes kiemelt ügyekben jelenthet megoldást. A helyszíni mintából meghatározott teljes gyanúsítotti DNSprofil birtokában lehetőség van olyan személyek adatbázisból történő leválogatására, akik az ismeretlen elkövető esetleges rokonai lehetnek. Ilyen módon sikerült azonosítani pl. egy 1973-ban elkövetett hármas nemi erőszakos gyilkosság elkövetőjét (Joe Kappen, 2002). Az angol rendőrség által között lefolytatott 185 familial searching eddig összesen 33 esetben sikerült olyan családtagot találni a DNS-profil nyilvántartásban, akinek révén el lehetett jutni az elkövetőhöz. Az íly módon megoldott ügyek eddigi végeredménye a következő: 5 elhunyt, 28 vádemelés, amelyből 1 személy felmentésre került míg 27 vádlott elítélésre került (kb. 18% sikerességi ráta).

85 Köszönöm megtisztelő figyelmüket!