QUANTA Lite TM β 2 GPI IgA 708675 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

QUANTA Lite TM β 2 GPI IgA 708675 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM β 2 GPI IgA egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a β 2 GPI IgA antitestek szemikvantitatív kimutatására humán szérumban. A β 2 GPI IgA antitestek jelenléte felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtt bizonyos autoimmun betegségekhez társuló thrombotikus folyamatok diagnosztikájában, mint amilyen a szisztémás lupus erythematosusban (SLE) vagy más lupus-szerű betegségben szenvedő páciensekben kialakuló másodlagos thrombosis. A teszt összegzése és magyarázata Anticardiolipin antitestek (ACA) jelenléte erősen összefüggésbe hozható a vénás és arteriás thrombosisokkal. 1-5 Ezt először a szisztémás lupus erythematosus (SLE) tanulmányozása kapcsán figyelték meg, amelyik betegség számos tünete között gyakran fordul elő thrombosis. 6,7 Újabb tanulmányok 8-12 kimutatták, hogy egy 50kD szérum kofaktor szükséges az SLE-s betegekben képződött cardiolipin antitestek számára ahhoz, hogy képesek legyenek kötődni a műanyag lemezek felületére rögzített cardiolipinhez. A kofaktort azonosították, és megállapították, hogy az a β 2 - glycoprotein I vagy más néven apolipoprotein H. 8,12,13,14 Bár a β 2 GPI-ről ismert, hogy in vitro gátolja a véralvadási folyamat intrinsic útvonalon történő aktivációját, 15 az ADP-dependens aggregácót 16 és az aktivált thrombocyták prothrombinase aktivitását, 17 a tulajdonképpeni fiziológiás szerepe még nincs tisztázva. Kiderült, hogy anti-phospholipid szindrómában (APS) a betegekben található anticardiolipin ellenanyag egy módosult β 2 GPI struktúrát ismer fel, nem pedig a cardiolipint, a natív β 2 GPI-et vagy egy olyan epitopot, ami szerkezetileg meghatározott mind a cardiolipin, mind pedig a β 2 GPI molekulán. 8-12 Galli és munkatársai. 9 és Viard és munkatársai 18 egymástól függetlenül közölték, hogy az autoimmun betegekből (SLE és/vagy APS) származó anti-cardiolipin antitestek a polisztirén mikrotiter lemezekhez kötött β 2 GPI molekulával reagáltak. Koike 11 és Matsuura 12 erre alapozva kimutatta, hogy valójában a β 2 GPI az az antigén, amelyhez a betegekből származó sokféle anticardiolipin antitest kötődik, és a foszfolipid egyszerűen csak a β 2 GPI fehérjét rögzíti a szilárd fázishoz. A hagyományos anticardiolipin teszteknek van egy jól ismert hajlama a téves pozitív eredmények produkálására, ami a mintában előforduló foszfolipideknek tulajdonítható. Ez egyes fertőző betegségek, leginkább jellemzően syphilis esetében, valamint más autoantitestek, például a kettős láncú DNS ellen irányuló ellenanyagok jelenlétében 2,3 fordulhat elő. Ha elhagyták a foszfolipidet a szilárd fázis készítésekor, és kizárólag β 2 GPI-et alkalmaztak, a teszt még specifikusabbá vált a potenciális alvadási problémák detektálása szempontjából. A megnövekedett specificitást több kutatócsoport következetesen kimutatta. 11,12,16,17,19,20,21,22 A β 2 GPI autoantitest kimutatása jól használható, és specifikusabb eljárás, amely a hagyományos anticardiolipin tesztekkel, és a lupus anticoaguláns kimutatásával együtt ajánlott a kockázati csoportok thrombosis rizikójának vizsgálatára. IgG osztályba tartozó β 2 GPI antitesteket találtak 47 SLE beteg közül 17-ben (36%). 18 Ebből a 47 SLE betegből kilencnek volt thrombosisa, és közülük 8-ban (89 %) volt kimutatható a β 2 GPI antitest. Hisham és munkatársai 20 IgG osztályba tartozó β 2 GPI antitestet talált mind az öt betegében (100%) akinél az APS-nek legalább két dokumentált klinikai manifesztációját lehetett kimutatni. Mind az 5 beteg a magas β 2 GPI antietst szinttel jellemezhető csoportba tartozott. Nyolcan a 14 alacsony szintű β 2 GPI antitesttel rendelkező beteg közül (57%) legalább 1 alkalommal thrombotikus eseményt szenvedtek el. Tsutsumi és munkatársai 22 β 2 GPI ellenes IgG és IgM antitesteket találtak 308 véletlenszerűen kiválasztott japán SLE beteg 10.1% és 5.8%-ában. Az IgG β 2 GPI antitestek gyakrabban fordultak elő olyan betegekben, akik kórtörténetében szerepelt thrombosis. Ez a kutatócsoport beszámolt arról is, hogy 15 ismételt vetélés miatt vizsgált betegből 20 % volt IgG β 2 GPI pozitív. Azt is kimutatták, hogy azok a betegek, akiknek a kórtörténetében thrombosis szerepelt, nagyobb valószínűséggel voltak IgM β 2 GPI pozitívak, és az IgM β 2 GPI szintek magasabbak voltak a thrombosisos betegekben, mint azokban, akiknél nem fordult elő thrombosis. 15 olyan páciens közül, akiknek a kórtörténetében nem szerepelt vetélés, egy sem volt IgM β 2 GPI pozitív. Cabiedes és munkatársainak 23 tanulmányában 94 SLE beteg szerepel, közülük 39-ben fordult elő az APS valamilyen klinikai manifesztációja. A klinikai manifesztációk sokkal szorosabb összefüggést mutattak a β 2 GPI antitestekkel, mint a hagyományos ACA tesztek pozitivitásával. IgG β 2 GPI antitestek jelen voltak a 18 APS beteg közül 16-nak (89%) a szérumában. A 22 ACA pozitív betegből, akiknek emellett nem voltak APS-re utaló klinikai tünetei, egy sem volt β 2 1

GPI pozitív. Cerrato és munkatársai 24 IgG anti-β 2 GPI elleanyagot talált 32 beteg 87.5%-ában, akiknek kórtörténetében kimutatható volt a thrombosis (APS). IgM anti-β 2 GPI-t találtak ugyanennek a 32 tagú betegcsoportnak a 71.9%-ában. Sebastiani és munkatársai 25 IgG anti-β 2 GPI-t detektált 110 betegben (20.3%) és IgM-et 109 betegben (20.1%) összesen 542 SLE beteg vizsgálata során. Az anti-β 2 GPI jelenléte szoros összefüggést mutatott az ACA -val (p < 10-5 ). Kimutatták továbbá, hogy az IgG és IgM β 2 GPI antitestek kapcsolatban voltak mind az artériás, mind a vénás thrombosis előfordulásával. A módszer elve Tisztított β 2 GPI antigént rögzítettek polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához, olyan körülmények között, ami az antigén natív állapotát képes megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő β 2 GPI IgA antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgA konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgA számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgA felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta-edényekben kialakult szín intenzitását egy ötpontos kalibrációs görbe hasonló adataival vetjük össze. Az eredményt szemi-kvantitatív módon, standard IgA anti-β 2 GPI (SAU) egységben fejezzük ki. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított β 2 GPI antigénnel (12-1 x 8 mérőhely) bevonva, tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán β 2 GPI antitestek, 3. β 2 GPI IgA ELISA Kontroll, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum β 2 GPI antitestekkel, 4. β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor A, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum β 2 GPI antitestekkel, 5. β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor B, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum cardiolipinβ 2 GPI antitestekkel, 6. β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor C, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum β 2 GPI antitestekkel, 7. β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor D, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum β 2 GPI antitestekkel, 8. β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor E, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum β 2 GPI antitestekkel, 9. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínű, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 10. HRP Mosó Koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 11. HRP IgA Konjugátum, (kecske), anti-humán IgA, 1 üveg szalmasárga színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 12. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 13. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a β 2 GPI IgA ELISA Kontroll, β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátorok és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként 2

kezelendő. 26 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadékmaradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy 3

lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése, A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 β 2 GPI ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgA ELISA Kontroll előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor A előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor B előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor C előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor D előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor E előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Mosó Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP IgA Konjugátum, (kecske), anti-humán IgA 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény az HRP Mosó Koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó, ami képes az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP Mosó Koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP Mosó Koncentrátumos üveg tartalmát 975mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2.0 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 1 hétig stabil 2 8 C között tárolva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátorokat, a β 2 GPI IgA ELISA Kontrollt vagy az ELISA Negatív Kontrollt. 4. A β 2 GPI antitestek jelenlétének vagy hiányának meghatározása céljából használjon minden egyes kalibrátor és kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. 5. A standard görbe készítése: Az 5 pontos standard görbe pontjainak meghatározásához A-tól E-ig, használja az ELŐHÍGÍTOTT β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátorokat A-tól E-ig közvetlenül a reagens-üvegből. Az öt pontos standard görbe értékei a következők: 4

Pont Standard IgA β 2 GPI Egységek (SAU) A Előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor A 150.0 B Előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor B 75.0 C Előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor C 37.5 D Előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor D 18.8 vagy 18.75 E Előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor E 9.4 vagy 9.375 A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t mind az öt kalibrátorból, a hígított beteg-mintákból, az ELISA Negatív Kontrollból és a β 2 GPI IgA ELISA Kontrollból a mérőedénykékbe. MEGJEGYZÉS: A β 2 GPI IgA ELISA Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll is előre meg van hígítva, és használatra kész. Az értékek és a β 2 GPI IgA ELISA Kontroll elfogadható tartománya az üveg címkéjén nyomtatott formában található. Ha a kontroll eredménye a címkén megadott elfogadási tartományon kívül esik, ismételje meg az analízist. Ha a kontroll értéke az ismételt mérés után is a megadott tartományon kívül van, kérjen segítséget az INOVA technikai szervíztől. Minden mintából ajánlott párhuzamos meghatározásokat végezni. 3. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérskleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 4. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon 200-300µL hígított HRP Mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 5. Adjon 100μL HRP IgA Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 3-ik lépésben. 6. Mosás: Ismételje a 4 lépést. 7. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 8. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 9. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátorok, a β 2 GPI IgA ELISA Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátorok, a β 2 GPI IgA ELISA Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt 5

kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor A abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított β 2 GPI IgA ELISA Kalibrátor A abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A β 2 GPI IgA ELISA Kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA Negatív Kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint 0.25. d. A β 2 GPI IgA ELISA Kontroll koncentrációja a címkén megadott tartományon belül kell legyen. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása 1. Határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. 2. Ábrázolja az átlagos abszorbancia értékeket az IgA assay kalibrációs görbéjén a megfelelő koncentrációk logaritmusával szemben. Használjon a pontoknak leginkább megfelelő illesztési módszert a görbe megrajzolásához. Alternatív eljárásként a log/log ábrázolás is alkalmazható. A kalibrátorokhoz rendelt SAU egységek az egyes kalibrátor üvegek címkéin megtalálhatók. 3. Határozza meg az ismeretlen minták β 2 GPI IgA koncentrációját standard β 2 GPI IgA egységekben (SAU) az "X" tengelyen, úgy, hogy hozzárendeli az "Y" tengelyen a megfelelő abszorbancia értékhez. 4. Negatív az eredmény 0-20 egység között. A pozitív eredmények nagyobbak, mint 20 SAU. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában β 2 GPI IgA antitestek vannak, és felveti a lehetőségét valamely autoimmun betegséghez társuló thrombotikus folyamatnak, mint amilyen a szisztémás lupus erythematosushoz, vagy más lupus-szerű betegséghez társuló másodlagos thrombosis. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs β 2 GPI IgA antitestje, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi meállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM β 2 GPI IgA ELISA használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott β 2 GPI IgA értékek ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgA érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. A β 2 GPI antitestek klinikai jelentősége az SLE-től eltérő más betegségekben még vizsgálatok tárgya. 2. Ha negatív anti-β 2 GPI eredményt kapunk klinikai tünetek fennállása mellett, lupus anticoaguláns, anticardiolipin, vagy más kiegészítő vizsgálatok elvégzése indokolt. 3. Diagnózis nem állítható fel kizárólag az anti-β 2 GPI vizsgálat eredménye alapján. Ezeket az eredményeket más orvosi vizsgálatok eredményével együtt kell értékelni. 4. Nem szabad kezelést indítani kizárólag egy pozitív anti-β 2 GPI titer alapján. További megerősítő klinikai indikációk együttes jelenléte szükséges a kezeléshez. 5. Előfordulhat, hogy egyes minták anticardiolipin pozitívak lesznek, és mégis anti-β 2 GPI negaítívak. Az anti-β 2 GPI teszt a thrombosis kockázatának sokkal specifikusabb markere. Az anticardiolipin teszt téves pozitív eredményt adhat az anti-dsdna antitestekkel, és egyes infekciók kapcsán megjelenő ellenanyagokkal. 6. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek és a specifikus működési jellemzők Összesen 215 normál mintát teszteltek a QUANTA Lite TM β 2 GPI IgA kittel. A férfiak és nők aránya körülbelül azonos volt ebben a csoportban, a vizsgált személyek életkora 18 és 58 év között volt. A minták közül hét (3.2%) lett IgA β 2 GPI antitest pozitív. A vizsgált normál populáció átlagos antitest koncentrációja 2.52 SAU-nak felelt meg. Az alábbi 6

táblázat foglalja össze a QUANTA Lite β 2 GPI IgA teszttel végzett belső és külső klinikai tanulmányok eredményeit. Páciens csoport Mintaszám Pozitívak száma (%) SLE + APS * 14 10 (71.4) APS 48 26 (54.2) SLE (APS nélkül) 24 7 (29.2) Infekció ** 30 0 (0.0) Normál 215 7 (3.2) * APS = antiphospholipid szindróma ** A fertőző betegek nagyobb részében a syphilis szerológia eredménye pozitív volt. A fenti vizsgálati eredmények alapján a β 2 GPI IgA antitest teszt klinikai szenzitivitása 58.1%. A specificitás és a klinikai egyezés 94.8% illetve 87.9% volt. Relatív szenzitivitás és specificitás Összehasonlítás az IgA cardiolipin teszttel Az IgA β 2 GPI kitet egy IgA anticardiolipin (ACA) teszttel hasonlították össze, azonos helyszínen, közvetlenül egymás mellett kivitelezve a két módszert. Tizennégy normál szérumot, 16 APS betegtől és 22 SLE betegtől származó mintát vizsgáltak. A betegeknek nem volt nyilvánvaló thrombotikus szövődménye. Az összehasonlító tanulmány eredményei az alábbi táblázatban foglalhatók össze: IgA β 2 GPI + - + 6 6** Relatíiv Szenzitivitás 50.0% IgA ACA Relatív Specificitás 80.0% - 8* 32 Relatív Hatékonyság 74.1% *A beteg közül 2 az APS csoporthoz, a többi 6 az SLE csoporthoz tartozott **Ebből a 6 páciensből 4 az APS csoporthoz, 2 az SLE csoporthoz tartozott. Hat minta volt pozitív mindkét módszerrel. Mind a hat minta az APS csoportból származott. Harminckét minta volt mindkét módszerrel negatív. Nyolc olyan mintát találtak, amelyik β 2 GPI pozitív lett és ugyanakkor ACA negtív. Kettő ezek közül az APS csoportból, a többi 6 pedig az SLE csoportból származott. Három a hat β 2 GPI pozitív és ACA negatív SLE beteg mintából csak gyengén pozitív volt β 2 GPI antitestre (21, 24 és 29 SAU). Volt 6 minta, amelyik IgA ACA pozitív és ezzel szemben β 2 GPI negatív lett. Ezek közül a betegek közül kettő az SLE csoportba, 4 pedig az APS csoportba tartozott. A 14 normál minta, a 16 APS beteg és a 22 SLE beteg IgA ACA és a β 2 GPI értékeire kiszámított regresszió 0.825 r értéket eredményezett, 1.31-es meredekséggel. Precizitás és reprodukálhatóság A módszer precizitását és reprodukálhatóságát egy negatív, egy erősen és egy mérsékelten pozitív minta hat alkalommal végzett analízisének eredményei alapján kalkulálták, amelyeket hat egymást követő napon végeztek. A negatív minta átlagértéke 18.2, a mérsékelten pozitív minta átlaga 37.2 és az erősen pozitív mintáé 79.6 volt. A sorozaton belüli (within-run) és a sorozatok közötti (between-run) eredmények az alábbi táblázatban láthatók: Negatív Mérsékelt Pozitív Erősen Pozitív SD CV SD CV SD CV Összesített 0.82 4.4% 1.61 4.3% 4.06 5.1% Sorozaton belül 1.22 6.6% 1.49 4.0% 4.07 5.2% Sorozatok között 1.22 6.6% 1.50 4.0% 3.40 4.2% Hivatkozások 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies; detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erthematosus. Lancet, 2: 1211-1214, 1983. 2. Koike, T., M. Seuishi, H. Funaki, H. Tomioka and S. Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp immunol, 56: 193-199, 1984 3. Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies; clinical associations. Postgrad Med J, 61:1081-7

1087, 1986. 4. Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: 152-156, 1985. 5. McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: 193-280, 1991. 6. Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: 591-609, 1985. 7. Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: 486-489, 1986. 8. McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 -glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: 4120-4124, 1990. 9. Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: 1544-1547, 1990. 10. Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: 177-178, 1990. 11. Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: 671-672, 1991. 12. Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fugimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: 3885-3891, 1992. 13. Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 -GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 -GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: 1217-1221, 1991. 14. Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: 1086-1091, 1985. 16. Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: 109-114, 1987. 17. Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: 142-149, 1986. 18. Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: 181-186, 1992. 19. Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: 305-313, 1995. 20. Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: 2233-2237, 1995. 21. Roubey, R.A. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: 1444-1454, 1996. 22. Tsutsumi, A. et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: 1466-1474, 1996. 23. Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899, 1995. 24. Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β 2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516, 1996. 25. Sebastiani, G.D. et al. Anti β 2 GPI and acl in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5: 519, 1996. 26. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 8

A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628675HUN May 2007 Revision HUN0 9