ÚJ DIFFERENCIÁCIÓS ÉS DIFFERENCIÁLDIAGNOSZTIKUS MARKEREK VIZSGÁLATA HUMAN HEPATOBLASTOMÁBAN Doktori tézisek Dr. Halász Judit Semmelweis Egyetem Patológiai Doktori Iskola Témavezető: Dr. Schaff Zsuzsa egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Hivatalos bírálók: Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kovács Gábor, egyetemi docens Dr. Bodó Miklós, egyetemi tanár Dr. Keller Éva, egyetemi tanár Dr. Abonyi Margit, egyetemi docens Dr. Simon Károly, osztályvezető főorvos Budapest 2010
1. BEVEZETÉS A hepatoblastoma a csecsemőkor és a kisgyermekkor leggyakrabban előforduló rosszindulatú primer májdaganata; mégis relative ritka, mivel az összes gyermekkori rosszindulatú daganatnak csupán 1 %-át alkotja. A Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) 1972 és 1992 között végzett vizsgálati adatai szerint a gyermekkori rosszindulatú májdaganatok évente mintegy 5 %-os növekedést mutatnak. Kialakulásának oka pontosan nem ismert, de tény, hogy a genetikai és környezeti tényezők mellett a fiúknál és a koraszülött, alacsony súllyal született kisgyermekeknél nagyobb gyakoriságot mutat. A hepatoblastoma általában 3 éves kor alatt jelentkezik, de az átlagéletkor a diagnózist illetően 1 év. A hepatoblastoma prognózisa az idősebb gyermekekben és a fiatal felnőttekben sokkal rosszabb, mint csecsemőkorban és a korai gyermekkorban (1-3 év). A hepatocelluláris daganatok felismerésének vagy nyomonkövetésének a leghasznosabb markere a szérum AFP. A hepatoblastomák 80-90 %-ában észlelhető a szérum AFP-szint emelkedése. Hepatoblastomában az alacsony AFP vérszint (<100 ng/ml) kifejezetten rossz prognózissal jár. A hepatoblastoma a máj éretlen ún. precursor sejtjeiből származtatható, de egyre több bizonyíték szól amellett, hogy a daganat a máj pluripotens őssejtjeiből ered. A hepatocellularis carcinomával ellentétben, amely gyakran alakul ki cirrhosis talaján, a hepatoblastoma cirrhosismentes májban fejlődik ki. A hepatoblastomák karyotipizálása során a 2-es és a 20-as, valamint a 8-as kromoszóma triszómiáját írták le, ezeknek vélhetően a tumorgenezis korai szakaszában lehet jelentőségük. A tumorban megtalálható a Beckwith- Wiedemann szindróma lókusz hiánya is: loss of heterozygosity (LOH) 11p. A Beckwith- Wiedemann szindróma (macroglossia, visceromegalia, hasfali defektus, hemihypertrophia) gyakran társul hepatoblastomával. A familiaris adenomatosus polyposis szindrómában (FAP) szenvedő betegekben ugyancsak gyakrabban fordul elő a hepatoblastoma. Az adenomatosus polyposis coli (APC) tumorszupresszor gén csírasejtes mutációja vastagbél polyposishoz (FAP) és végül adenocarcinomához vezethet. Az APC gén terméke, az APC fehérje, amely a sejtadhézióban és egyéb jelátviteli folyamatokban játszik fontos szerepet. Az APC gén mutációja funkcióvesztéssel jár, amely során a β-catenin nevű protoonkogén citoplazmatikus degradációja nem történik meg, intracellulárisan akkumulálódik, majd transzlokálódik a sejtmagba és ott a TCF-4-hez kötődik. Ennek során a transzkripciós faktorok segítségével egyes oncogének pl.: c-myc, cyclin D1, TCF/LEF aktiválódnak, melyek serkentik a proliferációt, a dedifferenciációt és gátolják az apoptózist. A β-catenin mutáció, függetlenül a szövettani típustól, a hepatoblastomák közel 50%-ában megtalálható. 1
A daganat szövettani klasszifikációja szerint megkülönböztetünk epithelialis, azaz csak hámelemek tartalmazó és kevert, azaz hám- és mesenchymalis elemeket egyaránt tartalmazó típusokat. Ez utóbbi teratoid és nem-teratoid szubtípusra osztható. Az epithelialis típus két eltérő differenciáltságú hámkomponensből épül fel, melyek változó arányú keveredése alapján tisztán fetalis ill. fetalis/embryonalis szubtípusokat különböztetünk meg. Emellett ide tartoznak a fentiektől megjelenésükben eltérő macrotrabecularis és kissejtes differenciálatlan szubtípusok is. A fetalis komponensben a tumorsejtek növekedési mintázata hasonlít a normális májsejtek elrendeződésére: kötegeket, trabekulákat alkotnak, míg az embryonalis komponens leginkább clusterekben elhelyezkedő, kissé elongált, ovoid alakú differenciálatlan daganatsejtekből épül fel, melyek mitotikus aktivitása kifejezett. Az embryonalis komponens daganatsejtjei gyakran képeznek ún. pszeudorozettákat. A daganat differenciálatlan sejtjei leginkább a blastema sejtekhez hasonlítanak, ezért differenciáldiagnosztikailag az ún. kis, kerek, kék sejtes daganatok (nephroblastoma, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, lymphomák) jönnek számításba. A hepatoblastoma két komponense gyakran keveredik egymással. A hepatoblastoma kezelése az európai SIOPEL (International Childhood Liver Tumour Strategy Group) csoport szerint elsősorban a szisztémás kemoterápiás kezelésen, másodsorban a tumor minél eredményesebb sebészi eltávolításán alapul. Észak Amerikában a Children s Cancer Study Group (CCSG), a Pediatric Oncology Group (POG) és a Children s Oncology Group (COG) a SIOPEL csoporttal ellentétben elsődlegesnek a tumor sebészi eltávolítását tartja, és csak ezután kapnak a betegek kemoterápiás kezelést. A különböző terápiás megközelítések ellenére az 5 éves túlélési eredmények hasonlóan 70 % felett vannak. A claudinok (CLDN) a tight junction (TJ) típusú sejtkapcsoló struktúrák felépítésében vesznek részt. A molekulacsalád felfedezésére 1998-ban került sor és jelenleg a gerinces szervezetben 24 tagja ismert. Minden claudin molekula 4 transzmembrán szegmentumból áll, valamint két extracelluláris hurokkal rendelkezik; az N és C terminális régió intracitoplazmatikusan helyezkedik el. Funkciójukat tekintve a TJ-k egyrészt intercelluláris kapcsolatot hozhatnak létre, másrészt lezárják és kompartmentekre osztják a sejtek közötti teret. A claudinok, mint TJ proteinek elsődleges funkciói a gate vagy kapufunkció (az intercellularis rések lezárása, a paracelluláris szelektív diffúzió irányítása) és a fence vagy kerítésfunkció (az apicalis és basolateralis membrán közötti fehérjék és lipidek eltérő összetételének fenntartása). Néhány claudin molekula (CLDN-2, -4 és -16) szelektív ioncsatornaként is funkcionál. A TJ-t alkotó molekulák a jelátvitel többlépcsős folyamatának is résztvevői, reagálnak a membrán felől érkező különböző szignálokra; szerepük van a sejtek 2
növekedésének és differenciációjának szabályozásában és a tumorgenezisben is. A claudinok hiánya vagy csökkent jelenléte, megváltozott expressziója a sejtadhézió csökkenésével, a daganatos infiltráció fokozódásával, azaz metasztázisképződéssel járhat. Számos daganatban - ahol az invázióban feltehetően a TJ-k megváltozott struktúrája is szerepet játszik - bizonyos claudinok fokozott expresszióját írták le. A claudinok szerv- és szövetspecifikus molekulák. A CLDN-1 fokozott expressziója pl. oralis laphámrákokban megnövekedett invázióval és aggresszív hisztológiai képpel függ össze. Oesophagus eredetű laphám daganatokban a CLDN-1 magasabb expresszióját találták a nem daganatos laphámhoz képest. A normál hámhoz képest a CLDN-1 (és CLDN-7) expresszió emelkedik a cervix diszplasztikus elváltozásaiban (CIN) és csökken az invazív rákban a diszplasztikus elváltozásokhoz képest. A CLDN-2 fehérje a gasztrointesztinális hámsejtekben és az azokból kiinduló daganatokban fokozottan expresszálódik. Az endothelsejtek és a belőlük kiinduló tumorok CLDN-5 pozitivitást mutatnak. Az epeúti daganatok fokozott CLDN-4 expressziója elkülöníti ezen tumorokat a hepatocellularis carcinomáktól. Pancreas eredetű adenocarcinomában szintén a CLDN-4 fokozott expressziója igazolódott. A CLDN-1 expressziójának növekedését találták pl. colorectalis carcinomákban, sőt a CLDN-1 nukleáris lokalizációja is észlelhető volt annak metasztázisaiban. Primer colorectalis carcinoma sejteket vizsgálva a CLDN-1 expressziója ugyancsak fokozott volt. A tüdőben a magas CLDN-3 expresszió kissejtes daganatra utal, elkülönítve azt az atípusos carcinoidtól, adenocarcinomától és laphámcarcinomától. Néhány daganatban az expresszió mértéke a prognózisra is utal. Például a CLDN-1, -3, -4 és -5 fehérje expressziója a kifejezetten rossz prognózisú, diffúz típusú gyomor daganatokban alacsonyabb, a jobb prognózisú intestinalis tumorokhoz viszonyítva. Invazív, metasztatikus emlő daganatokban a CLDN-1 és -7 fehérje csökkent expressziója látható. A CLDN-10 a recidív HCC kiváló markere. Human hepatoblastomában a claudinok expressziójára vonatkozóan nincs adat az irodalomban. Egyes claudinok a kórokozóknak a sejtbe való bejutását segítik elő, míg mások a kórokozók receptoraként funkcionálnak. A CLDN-1 (CLDN-6, CLDN-9 és occludin) molekulának a Hepatitis C vírus sejtbe való belépésében tulajdonítanak jelentős szerepet. Ez az említett claudin molekulák antivirális terápiában való jelentőségét veti fel. A CLDN-3 és -4 a Clostridium perfringens enterotoxinjának (CPE) receptora, amely a fehérjéket expresszáló sejtek lízisét okozza. Egyes közlemények szerint a CPE az említett claudin molekulákat expresszáló daganatsejtek (pancreas adenocarcinoma, prostata carcinoma) lízisét okozza; amely célzott terápia bevezetését teszi lehetővé. 3
A dlk-1 egy sejtfelszíni transzmembrán protein, mely hat EGF-szerű elemet tartalmazó extracellularis doménnel, egy transzmembrán doménnel és egy rövid intracellularis farokkal rendelkezik. A fehérjét, amely az epidemalis-növekedési-faktor szerű (EGF-like), ún. homeotic fehérjecsalád tagja, a DLK-1 gén kódolja. A dlk-1 protein aminosav szekvenciája és cisztein gazdag régiói az individuális EGF-szerű ismétlődésekben nagyon hasonlítanak a delta proteinre (innen az elnevezés), mely a Drosophilában előforduló Notch receptor ligand. A dlk-1 molekula funkciója nem ismert, egyes közlemények szerint a Notch1 jelátviteli folyamat negatív regulátora. A dlk-1 számos embryonalis szövetben expresszálódik (máj, nyelv, csigolyák, vázizomzat, porc és hasnyálmirigy), az érett szervezetben pedig a mellékvese zona glomerulosajában, az agyalapi mirigy somatotroph sejtjeiben, a központi idegrendszer monoaminerg neuronjaiban, a here és az ovarium Leydig- és hilusi sejtjeiben, valamint az endokrin pancreas β-sejtjeiben van jelen. A dlk-1 protein a human és az egér embrionális máj hepatoblastjaiban erősen kifejeződik, míg a biliaris epithelium és a hemopoetikus sejtkompartmentben nem mutatható ki. A dlk-1 protein expresszióját számos humán daganatban leírták: neurofibrómában, mielodiszpláziás szindrómában, glioblastoma multiformében, mellékvesekéreg carcinomában, phaeocromocytomában és mellékvese kéreg adenomában. Biliaris atresiában a dlk-1 fokozott expressziója és a fibrogenezis között írtak le szoros összefüggést, miszerint a dlk-1 szerepet játszik a máj stellata sejtjeinek myofibroblastokká való transzformálásában. 4
2. CÉLKITŰZÉS A legújabb adatok szerint a hepatoblastoma prognózisa, mint egyéb gyermekkori malignus daganatok esetében is (Wilms tumor, neuroblastoma), a szöveti differenciálódással alapvetően összefügg. A hepatoblastoma különböző differenciáltságú szövettani típusaiban és/vagy szubtípusaiban a daganat pontosabb eredetét feltáró markerek vizsgálata intenzív kutatás tárgya. Egyes embryonalis markerek hepatoblastokban való expressziója egyre inkább a daganat embryonalis és/vagy fetalis progenitor sejt eredetét támasztja alá. A claudin molekulák expressziós profiljának vizsgálata számos szervben és daganatban ígéretes eredményeket mutat. Ez egyrészt a molekula funkciójának pontos felderítéséhez, másrészt a különböző differenciáltságú és prognózisú daganatok vagy daganattípusok (szubtípusok) elkülönítéséhez nyújt segítséget. Mindezek alapján célunk volt, hogy megvizsgáljuk a claudin molekulák és a hepatoblastokban fiziológiásan előforduló dlk-1 fehérje jelenlétét humán hepatoblastomák eltérő differenciáltságú epithelialis komponenseiben. A következő kérdések megválaszolását tűztük ki célul: 1. Expresszálódnak-e a vizsgált claudin fehérjék human hepatoblastomában? Vizsgálni kívántuk a CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 fehérjék expresszióját human hepatoblastomákban immunhisztokémiai módszerrel. 2. A vizsgált claudinok vonatkozásában látható-e expressziós különbség a daganat eltérő differenciáltságú epithelialis komponensei (embryonalis és fetalis) között? Célunk volt a fetalis és az embryonalis hámkomponens CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 expressziós mintázatátának összehasonlítása az immunhisztokémiai reakciók és az RT-PCR módszer során kapott eredmények alapján. 3. Van-e összefüggés a szöveti differenciáció, a proliferatios markerek (PCNA, Ki- 67) és a vizsgált claudinok expressziója között? Vizsgálni kívántuk a hepatoblastomák különböző differenciáltságú, azaz eltérő proliferációs készséggel rendelkező két hámkomponensében (fetalis és embryonalis) egyes claudinok és bizonyos proliferációs markerek (Ki-67, PCNA) expresszióját immunhisztokémiai módszerrel, és célunk volt azokat egymással összehasonlítani. 5
4. Kimutatható-e a vizsgált hepatoblastomákban a Wnt/β-catenin jelátvitel károsodása? Célunk volt a hepatoblastomák β-catenin expressziójának fehérje szintű vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel, ezen belül a daganat embryonalis és fetalis komponensének β-catenin expressziós mintázatát kívántuk egymással összehasonlítani. Terveztük a két komponens Wnt/β-catenin jelátvitel károsodását jelző mag-pozitív eseteiből a β-catenin gén mutációs analízisének elvégzését, mellyel a génben bekövetkezett lehetséges mutáció(k) igazolása és a mutáció(k) jellegének pontos identifikálása volt célunk. 5. Kifejeződik-e a dlk-1 fehérje human hepatoblastomában, human hepatocellularis carcinomában és egyéb, differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganatokban (ganglio/neuroblastoma, Wilms tumor, infantilis hemangioenothelioma, medulloblastoma, rhabdoid tumor, AFP pozitív csírasejtes tumorok, máj MPNST)? Vizsgálni és egymással összehasonlítani kívántuk a human hepatoblastoma, human hepatocellularis carcinoma és a fentebb felsorolt egyéb, differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganatok dlk-1 fehérjeexpressziós mintázatát immunhisztokémiai módszerrel és annak szerepét elemeztük a differenciáldiagnosztikában. 6
3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. Betegek és szövetminták A Semmelweis Egyetem II. sz. Pathológiai Intézetének és az I. Sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetének archívumából kiválasztott, formalin fixált, paraffinba ágyazott blokkjaiból készült metszeteken végeztünk retrospektív vizsgálatokat a Semmelweis Egyetem Regionális Etikai Bizottságának engedélyével (TUKEB#172/2003). Vizsgálatainkban összességében 31 db humán hepatoblastoma 24 db human hepatocellularis carcinoma és 30 db egyéb differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganat szerepelt. A claudinokkal végzett vizsgálatainkban 14 db hepatoblastoma esetet tanulmányoztunk immunhisztokémiai módszerrel. Az esetek átlagéletkora 3 év volt, a nemeket illetően 8 fiú és 6 lány szerepelt a vizsgálatokban. Az esetek szövettanilag túlnyomórészt az epithelialis típus (9 db) közé tartoztak, melyek közül tisztán fetalis (2 db), valamint fetalis/embryonalis (7 db) szubtípusokat vizsgáltunk. Kevert típust (5 db) ugyancsak tanulmányoztunk Egyéb szövettani típusokat, mint macrotrabecularis vagy kissejtes differenciálatlan HB nem vizsgáltunk. Az egyes hámkomponenseket makrodisszekálva 5 esetben (fetalis/embryonalis) Real Time RT-PCR módszerrel mrns színtű, további 4 esetben (fetalis/embryonalis) pedig mutáció analízis vizsgálatokat is végeztünk. A 14 db hepatoblastoma esetnél a továbbiakban AFP, HSA, CK-7, Ki-67, PCNA és β-catenin ellenes antitestekkel végzett immunhisztokémiai reakciókat is elvégeztünk. A dlk-1 fehérje kimutatását mind a 31 db hepatoblastoma [nemek: 17 fiú, 14 lány; átlagéletkor: 3,16 év; szövettan: epithelialis (21 db) ebből fetalis (4 db), fetalis/embryonalis (27 db) és kevert (10db)] esetében elvégeztük. Emellett vizsgáltuk a dlk-1 fehérje expresszióját 24 db hepatocellularis carcinomában (nemek: 20 férfi, 4 nő, átlagéletkor: 61,3 év; tumor Grade: 13 db Grade II és 11 db Grade III) és a fentebb részletezett egyéb, differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganatokban [AFP pozitív csírasejtes tumor (2 db yolk sac, 2 db teratocarcinoma, 1 db seminoma és 1 db éretlen teratoma, nemek: 6 férfi; átlagéletkor: 22,8 év), 5 db Wilms tumor (nemek: 4 fiú, 1 lány, átlagéletkor: 5,7 év), 9 db ganglio/neuroblastoma (nemek: 3 fiú, 6 lány, átlagéletkor: 3,2 év), 5 db medulloblastoma (nemek: 3 fiú, 2 lány, átlagéletkor: 7,6 év), 1 db rhabdoid tumor (1 éves fiú), 2 db infantilis hemangioendothelioma (2 fiú, átlagéletkor: 2 hónap), 1 db mesenchymalis hamartoma (6 7
hónapos lány) és 1 db máj MPNST (23 éves lány)] vizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel. Ezen esetekben AFP és CK-19 immunhisztokémiai reakciókat is végeztünk. 3.2. Módszerek 3.2.1. Szövettani és hisztokémiai vizsgálatok A formalinban fixált és paraffinba ágyazott daganatokból származó szövetmintákat hematoxilin-eozinnal festettük. Kiegészítő festésként picrosirius festést, valamint perjódsav- Schiff (PAS), diasztáz emésztett PAS reakciókat és Berlini kék festéseket alkalmaztunk. 3.2.2. Immunhisztokémia 3.2.2.1. CLDN-1,-2, -3, -4 és -7 ellenes antitestek alkalmazása Paraffinba ágyazott blokkokból, deparaffinált metszeteken az endogén peroxidáz blokkolás és antigén feltárás után az elsődleges ellenanyagok kerültek alkalmazásra, melyek közül a CLDN-1 (KAT.: 187362), -3 (KAT.: 341700) és -7 (KAT.: 349100) antitest poliklonális, a CLDN-2 (KAT.: 187363) és -4 (KAT.: 187341) antitest monoklonális volt (Zymed Inc, San Francisco, CA, USA). A megfelelő biotinilált másodlagos ellenanyagot, avidin-streptavidin-enzim konjugátumot a Ventana immunautomata protokollja szerint alkalmaztuk. A reagensek és másodlagos ellenanyagok a Ventana cég (Tuscon, AZ, USA) termékei. A reakciót diaminobenzidinnel (DAB: Ventana, Tuscon, AZ, USA) vizualizáltuk, magfestésként hematoxilint alkalmaztunk. Negatív kontroll készítésénél az elsődleges antitest helyett nem-immun nyúl és egér szérumot használtunk, illetve az elsődleges antitesttel való inkubálást elhagytuk. Pozitív kontrollként a következő szövetmintákat használtuk: CLDN-1 kimutatásához bőrből származó epitheliumot; CLDN-2, -3 és -4 esetében normál colon nyálkahártyát, a CLDN-7 detektálására emlő ductushámsejteket. A reakciót lineáris membrán-pozitivitás esetén pozitívként értékeltük, kivéve a CLDN- 2 esetében, ahol granuláris citoplazmatikus reakció volt megfigyelhető. 8
3.2.2.2. Dlk-1, AFP, β-catenin, HSA, CK-7, CK-19, Ki-67 és PCNA ellenes antitestek alkalmazása Az antitestek közül a dlk-1 (kecske polyclonalis, R&D Systems - AF1144, Minneapolis, MN, USA), AFP (nyúl polyclonalis, DAKOCytomation A0008, Glostrup, Dánia), CK-19 (egér monoclonalis, Biogenex MU246-UC, San Remon, CA, USA) és β- catenin (egér monoclonalis, BD Transduction - 610154, San Diego, CA, USA) reakciókat kizárólag manuálisan; a HSA (egér monoclonalis, Novocastra - 760-4350, New Castle, UK), CK-7 (egér monoclonalis, DAKOCytomation - M7018, Glostrup, Dánia), Ki-67 (egér monoclonalis, DAKOCytomation - M7240, Glostrup, Dánia) és PCNA (nyúl polyclonalis, DAKOCytomation - M0879, Glostrup, Dánia) reakciókat pedig a Ventana ES immunfestő automatával (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) végeztük. A jel előhívása a Ventana iview kit DAB detection Kittel történt. A manuálisan végzett reakciók közül az AFP, a CK-19 és a dlk-1 esetében a Vectastain ABC Elite Kit (Vector Laboratories, Burlingname, CA, USA); a β-catenin esetében a Dako Cytomation EnVision+ System Labelled Polymer-HRP Anti-Mause (Dako North America, Inc. USA) detektálórendszert alkalmaztuk. Kromogénként 3,3 - diaminobenzidin (DAB) szolgált (CELL MARQUE, USA). A negatív kontroll készítésénél az elsődleges antitest helyett nem-immun nyúl és kecske szérumot használtunk az elsődleges antitestnek megfelelő hígításban, illetve az elsődleges antitesttel való inkubálást elhagytuk. A HSA és a CK-7 kimutatásához pozitív kontrollként humán máj-és epeúti sejteket, a CK-19-hez tranzícionális hámot; a β-cateninhez, Ki-67-hez és a PCNA-hoz nyirokcsomót használtunk. Az AFP és a dlk-1 kimutatásához pozitív kontrollként acetaminofluorén/partialis hepatectomia kísérlettel előídézett patkány máj ovális sejteket alkalmaztunk (Am J Pathol 164, 1347-1359, 2004). 3.2.3. Az immmunreakciók értékelése A claudinokkal, valamint a HSA és s CK-7 ellenes antitestekkel végzett vizsgálatokban a szemikvantitatív analízis során 10 random kiválasztott nagy nagyítású látótérben (400X) 100-100 sejtet vizsgáltunk, majd az immunreakciók eredményét a pozitívan festődő sejtek százalékában fejeztük ki. A szemikvantitatív értékelésnél a következő pontrendszert alkalmaztuk: 0 (0-5% pozitivitás), 1 (6-20% pozitivitás), 2 (21-40% pozitivitás), 3 (41-60% pozitivitás), 4 (61-80% pozitivitás), 5 (81-100% pozitivitás). A 0 9
értéket immuhisztokémiai szempontból negatívnak tekintettük. A PCNA, Ki-67 és β-catenin ellenes antitestekkel végzett vizsgálatokban a magi pozitivitást százalékban fejeztük ki. A dlk-1 vizsgálatokban az immunhisztokémiai reakciók erősségét szemikvantitatív pontrendszerben (- és +++ között) értékeltük, és meghatároztuk a pozitívan reagáló sejtek százalékos arányát, valamint a festődés mintázatát (cytoplasmaticus / membranosus / canalicularis / pontszerű). 3.3. Molekuláris biológiai vizsgálatok 3.3.1. Real-time (RT-) PCR A paraffinba ágyazott szövetblokkokból teljes RNS-t izoláltunk High Pure RNA Paraffin kit segítségével (Roche, Indianapolis, Indiana, USA), majd a totál RNS-ből reverz transzkripcióval cdns-t állítottunk elő MmulV reverz transzkriptázt, (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), random hexamert (Applied Biosystems) alkalmazva RNáz inhibitor jelenlétében (Applied Biosystems). A SYBR Green alapú RT-PCR-hez mintánként 12,5 µl Sybr Green Master Mixet (BIO-RAD 1708882), illetve az általunk megtervezett primerekből (Primer Expressz program segítségével - Applied Biosystems) 300nM koncentrációban 0,5-0,5 µl-t, a korábban előállított cdns mintákból 2 µl-t, valamint 9,5 µl desztillált vizet használtunk fel. A reakciókat az ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) készülékkel végeztük a következő paramétereket alkalmazva: 95 C 2 perc, 95 C 20 másodperc, 60 C 30 másodperc, 72 C 30 másodperc, ciklusszám: 40. 3.3.2. β-catenin mutáció-analízis Négy db immunhisztokémiailag magi pozitivitást mutató HB esetet választottunk ki, melyek mindegyike egyszerre tartalmazott megfelelő mennyiségű fetalis és embryonalis komponenst. A paraffinba ágyazott szövetblokkokból makrodisszekció alkalmazásával PCR Template Kit-tel (Roche) izoláltunk DNS-t. Az izolált DNS-t tartalmazó mintákból a szekvenálást a Genoid Kft. végezte el. A direkt szekvenálás céljára először egy 232 bázispár hosszúságú terméket amplifikáltunk a β-catenin gén potenciálisan pontmutációt hordozó 3. exonjáról ABI Prism BigDye Terminator Kit-tel az alábbi primerekkel: Fwd 5 - AGCTGATTTGATGGAGTTG-3 (815-833) és Rev 5 - ACCAGCTACTTGTTCTTGAG-3 10
(1027-1046) (RefSeq GI: 6682315). A talált mutációkat kétirányú szekvenálással erősítettük meg. A szekvenálás ABI373 (Applied Biosystems) berendezésen történt. 3.4. Statisztikai módszerek Az immunhisztokémiai vizsgálatok esetében a statisztikai analízist a claudin, β- catenin, proliferációs markerek (Ki-67 és PCNA), CK-7 és HSA esetében Mann-Whitney U teszttel végeztük, amely során az immunhisztokémiai pontértékeket hasonlítottuk össze a hepatoblastoma különböző epithelialis (fetal/embryonal) sejtcsoportjaiban. A dlk-1 vizsgálatokban az értékelés eredményeit tartalmazó kontingencia-táblákat Fisher s exact tesztnek vetettük alá. A Real Time RT-PCR vizsgálatok során az adatok analíziséhez és a statisztikai vizsgálatokhoz a REST software-t (Relative Expression Software Tool, www.wzw.tum.de/gene-quantification) és a Pairwise Fixed Reallocation Randomization Testet használtuk. A relatív kvantifikációhoz referencia génként β-actin használtunk. Az értékeket valamennyi statisztika esetében akkor tekintettük szignifikánsnak, ha P<0,05. 11
4. EREDMÉNYEK 4.1. Claudin expresszió vizgálatata a tumormentes, környező májban immunhisztokémiai módszerrel. A hepatocyták a CLDN-1 esetében többnyire csak a lumináris pólusukon adtak gyenge lineáris membranózus reakciót, míg a CLDN-2 esetében a luminalis pólusok mentén a citoplazmában láttunk gyenge granuláris pozitivitást. A CLDN-3, CLDN-4 és CLDN-7 proteineket a hepatocyták többnyire nem expresszálták. Az epeutak a vizsgált claudinokat többnyire expresszálták. 4.2. Claudin expresszió vizsgálata hepatoblastomában immunhisztokémiai módszerrel. A vizsgált claudinok közül csupán a CLDN-1 és a CLDN-2 fehérjék fokozott expressziója volt megfigyelhető a daganat epithelialis (fetalis, embryonalis) komponenseiben. A CLDN-1 és a CLDN-2 reakciók esetében a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensei között egyértelmű expressziós különbség mutatkozott: a CLDN-1 és CLDN-2 a hepatoblastoma fetalis komponensében szignifikánsan magasabb expressziót mutatott az embryonalis komponenshez képest. Az embryonalis komponens (szórványos, gyenge pozitivitást leszámítva) negatív volt. 4.3. Proliferációs (Ki-67, PCNA) és egyéb markerek (HSA, CK-7) vizsgálata human hepatoblastomában immunhisztokémiai módszerrel. A Ki-67 és a PCNA fehérjék szignifikánsan magasabb nukleáris expressziót mutattak az embryonalis komponensben a fetalis komponenshez képest. A HSA a fetalis komponensben fokozott expressziót mutatott, míg az embryonalis komponens negatív volt. A CK-7 reakció a tumor mindkét komponensében negatív volt. 4.4. CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 mrns expressziójának vizsgálata a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensében (Real Time RT-PCR). A hepatoblastoma epithelialis, azaz fetalis és embryonalis komponenseiben elvégzett mrns expresszió vizsgálati eredményei az immunhisztokémiai reakciók során kapott eredményekkel korreláltak. A CLDN-1 (23-fold; P = 0.001) és CLDN-2 (8.5-fold; P = 0.001) mrns expresszió szignifikánsan magasabb volt a fetalis komponensben az embryonalishoz képest. A CLDN-3, -4 és -7 mrns expresszió (3.5, 2- és 2.2-fold) a fetalis komponensben ugyan magasabb volt, az expressziós különbségek azonban nem voltak szignifikánsak. 12
4.5. β-catenin expresszió vizsgálata human hepatoblastomában immunhisztokémiai módszerrel. Az általunk vizsgált 14 hepatoblastoma esetből összesen 13-ban láttuk a β- catenin magi festődését. Az fetalis és embryonalis komponens β-catenin expressziója között nem mutatkozott szignifikáns különbség. 4.6. A β-catenin gén mutációjának vizsgálata molekuláris biológiai módszerrel (mutáció analízis). A makrodisszekált mintákból (4 db fetalis/embryonalis) származó PCR amplikonok nukleotid szekvenciája a β-catenin génben egy-egy esetben mutatott missens mutációt mind a fetalis mind az embryonalis komponensben. Mindkét mutáció a 3. exon 37-es kodonjában jött létre, ahol a TCT TGT váltás egy szerin cisztein cserét eredményezett. 4.7. Dlk-1 fehérjeexpresszió vizsgálata human hepatoblastomában immunhisztokémiai módszerrel. Minden megvizsgált hepatoblastoma esetből elvégzett dlk-1 immunhisztokémiai reakció pozitív eredményt adott. A daganatban a festődés a legtöbb esetben fokális, míg a környező tumormentes májszövet minden esetben negatív volt. Pozitív reakció a tumornak csak az epithelialis komponenseiben (fetalis, embryonalis) volt detektálható, a mesenchymalis elemek (kevert hepatoblastoma) negatívak voltak. A dlk-1 fehérjeexpressziója a két hámkomponens között nem mutatott szignifikáns különbséget. 4.8. Dlk-1 fehérjeexpresszió vizsgálata hepatocellularis carcinomában és egyéb daganatokban immunhisztokémiai módszerrel. A hepatocellularis carcinomák (egy atípusos eset kivételével) és a differenciáldiagnosztikai vonatkozású, egyéb megvizsgált daganatok (ganglioneuroblastomában az érett ganglionsejtek kivételével) mindegyike dlk-1 negatív volt. 13
5. KÖVETKEZTETÉSEK / ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK 5.1. Human hepatoblastomában elsőként írtuk le a claudinok expresszióját. A hepatoblastoma epithelialis komponenseiben a vizsgált claudinok közül a CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék fokozott jelenléte igazolódott. A CLDN-3, -4 és -7 nem mutatott értékelhető pozitivitást. 5.2. A CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék a hepatoblastoma epithelialis komponensei közül a fetalis komponensben szignifikánsan magasabb expressziót mutattak az embryonalis komponenshez képest. Az embryonalis komponens (szórványos pozitivitást leszámítva) negatív volt. A Real Time RT-PCR vizsgálatok eredményei az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeivel korreláltak. Mindez arra utal, hogy hepatoblastomában a CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék differenciációs markernek tekinthetőek. 5.3. Hepatoblastomában a magasabb szöveti differenciáció fokozott CLDN-1 és CLDN-2 expresszióval és alacsonyabb proliferációs készséggel jár. Igazoltuk, hogy a magasabb szöveti differenciációt jelző CLDN-1 és -2 expresszió és a sejtproliferáció között fordított összefüggés áll fenn. 5.4. A hepatoblastomák csaknem mindegyikében (14/13) kimutattuk a β-catenin nukleáris akkumulációját, melynek eloszlása nem korrelált a hisztológiai szubtípussal. A kiválasztott esetek közül mind a fetalis, mind az embryonalis komponenst illetően egy-egy esetben igazolódott a β-catenin génjében (3. exon) bekövetkezett pontmutáció. Mindez arra utal, hogy a Wnt/β-catenin jelátvitel károsodása a hisztológiai szubtípustól függetlenül játszik szerepet a hepatoblastoma patogenezisében. 5.5. Hepatoblastoma eseteink mindegyike expresszálta a dlk-1 fehérjét. Az expresszió eloszlása nem korrelált a hisztológiai szubtípussal. A hepatocellularis carcinomák csaknem mindegyike (24/23) és a megvizsgált egyéb, differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganatok is mind dlk-1 negatívak voltak. Fentiek alapján bizonyítottuk, hogy a dlk-1 protein alkalmas a hepatoblastomának elsősorban a hepatocellularis carcinomától való elkülönítésére, expressziója így felhasználható a gyermekkori rosszindulatú hepatocellularis daganatok differenciáldiagnosztikájában. 14
6. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Megjelent közlemények impact faktora (IF): 18,378 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke (IF: 4,98): 1. Halász J, Holczbauer A, Páska C, Kovács M, Benyó G, Verebély T, Schaff Z, Kiss A. (2006) Claudin-1 and claudin-2 differentiate fetal and embryonal components in human hepatoblastoma. Hum Pathol, 37: 555-61. IF: 2,810 2. Dezso K, Halász J*, Bisgaard HC, Paku S, Turányi E, Schaff Z, Nagy P. (2008) Delta-like protein (DLK) is a novel immunohistochemical marker for human hepatoblastomas. Virchows Arch, 452: 443-8. IF: 2,082 3. Jakab Cs, Halász J, Kiss A, Szász A. M, Schaff Zs, Rusvai M, Kulka J. (2008) Külső pozitív kontrollok alkalmazása claudin-expressziós immunhisztokémiai vizsgálatokban. Magyar Állatorvosok Lapja, 130: 433-438. IF: 0,088 *megosztott első szerző Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények: 1. Jakab C, Halász J, Kiss A, Schaff Z, Rusvai M, Gálfi P, Abonyi TZ, Kulka J. (2009) Claudin-5 protein is a new differential marker for histopathological differential diagnosis of canine hemangiosarcoma. Histol Histopathol, 24: 801-13. IF: 2,194 2. Aigelsreiter A, Janig E, Sostaric J, Pichler M, Unterthor D, Halasz J, Lackner C, Zatloukal K, Denk H. (2009) Clusterin expression in cholestasis, hepatocellular carcinoma and liver fibrosis. Histopathology, 54: 561-70. IF: 4,131 (2008) 3. Jakab Csaba, Halász Judit, Kiss András, Schaff Zsuzsa, Pekár Magdolna, Keszthelyi Rita, Meczker Ágnes, Kulka Janina. (2007) Szöveti multiblokk (tissue micro-array- TMA) technika az állatorvosi onkopatológiai vizsgálatokban. Magyar Állatorvosok Lapja, 129: 310-315. IF: 0,104 4. Jakab Cs, Dudás Gy Z, Horváth É, Tóth A, Halász J. (2008) A májbiopsziás vizsgálatok jelentősége a kisállatpraxisban. Magyar Állatorvosok Lapja, 130: 39-47. IF: 0,088 5. Jakab Cs, Halász J, Kiss A, Schaff Zs, Pekár M, Szabára Á, Kulka J. (2008) Claudin- 5 fehérje expressziójának vizsgálata kutyák emlőmirigyeinek és emlőcarcinomáinak nyirokér endothelsejtjein immunhisztokémiai módszerrel. Magyar Állatorvosok Lapja, 130: 296-303. IF: 0,088 15
6. Jakab C, Halász J, Kiss A, Schaff Z, Szász AM, Rusvai M, Tóth ZA, Kulka J. (2008) Evaluation of microvessel density (MVD) in canine mammary tumours by quantitative immunohistochemistry of the claudin-5 molecule. Acta Vet Hung, 56(4): 495-510. IF: 0,624 7. Jakab C, Halász J, Szász AM, Kiss A, Schaff Z, Rusvai M, Gálfi P, Kulka J. (2008) Expression of claudin-1, -2, -3, -4, -5 and -7 proteins in benign and malignant canine mammary gland epithelial tumours. J Comp Pathol, 139: 238-45. IF: 1,398 8. Jakab C, Halász J, Szász AM, Batmunkh E, Kiss A, Schaff Z, Rusvai M, Gálfi P, Kulka J. (2008) Expression and localisation of claudin-1, -2, -3, -4, -5, -7 and -10 proteins in the normal canine mammary gland. Acta Vet Hung, 56(3): 341-52. IF: 0,624 9. Fuszek P, Horvath HC, Speer G, Papp J, Haller P, Fischer S, Halasz J, Jaray B, Szekely E, Schaff Z, Papp A, Bursics A, Harsanyi L, Lukovich P, Kupcsulik P, Hitre E, Lakatos PL. (2006) Location and age at onset of colorectal cancer in Hungarian patients between 1993 and 2004. The high number of advanced cases supports the need for a colorectal cancer screening program in Hungary. Anticancer Res, 26: 527-31. IF: 1,479 10. Fuszek P, Horváth HC, Speer G, Papp J, Haller P, Halász J, Járay B, Székely E, Schaff Z, Papp A, Bursics A, Harsányi L, Lukovich P, Kupcsulik P, Hitre E, Lakatos PL. (2006) A colorectalis rákok lokalizációjának változása Magyarországon 1993 és 2004 között. Orv Hetil, 147(16): 741-6. 11. Sobel G, Halász J, Bogdányi K, Szabó I, Borka K, Molnár P, Schaff Z, Paulin F, Bánhidy F. (2006) Prenatal diagnosis of a giant congenital primary cerebral hemangiopericytoma. Pathol Oncol Res, 12(1): 46-9. IF: 1,241 12. Csak T, Folhoffer A, Horvath A, Halász J, Diczházi C, Schaff Z, Szalay F. (2006) Holmes-Adie syndrome, autoimmune hepatitis and celiac disease: a case report. World J Gastroenterol, 12(9): 1485-7. 13. Lakatos PL, Gyori G, Halasz J, Fuszek P, Papp J, Jaray B, Lukovich P, Lakatos L. (2005) Mucocele of the appendix: an unusual cause of lower abdominal pain in a patient with ulcerative colitis. A case report and review of literature. World J Gastroenterol, 11(3): 457-9. 14. Vereckei A, Vándor L, Halász J, Karádi I, Lengyel M. (2004) Infective endocarditis resulting in rupture of sinus of Valsalva with a rupture site communicating with both the right atrium and right ventricle. J Am Soc Echocardiogr, 17: 995-7. IF: 1,427 15. Halász J, Kovács M, Illyés G, Máttyus I, Szolnoki J, Szabó A, Verebély T, Schaff Z. (2004) Malignant rhabdoid tumour in the liver. Orv Hetil, 145(27): 1439-43. 16. Lakatos PL, Halász J, Keresztes K, Fuszek P, Jäckel M, Poros A, Morvay K, Lakatos L. (2004) A familiaris adenomatosus polyposisról egy eset kapcsán. Orv Hetil, 145(15): 813-7. 16
17. Horvath A, Folhoffer A, Lakatos PL, Halasz J, Illyes G, Schaff Z, Hantos MB, Tekes K, Szalay F. (2004) Rising plasma nociceptin level during development of HCC: a case report. World J Gastroenterol, 10(1): 152-4. 18. Lakatos PL, Lakatos L, Fuszek P, Lukovich P, Kupcsulik P, Halász J, Schaff Zs, Papp J. A nyelőcső és a gastrooesophagealis junctio daganatainak gyakorisága és szövettani megoszlása 1993-2003 között. (2005) Orv Hetil, 146 (9): 411-6. 19. Csák T, Folhoffer A, Horváth A, Osztovits J, Halász J, Diczházi Cs, Schaff Zs, Szalay F. (2006) Autoimmun hepatitis, coeliakia és Holmes-Adie-szindróma együttes előfordulása. Magy Belorv Arch, 59: 55-58. Az értekezéssel összefüggő, lektorált folyóiratban megjelent, idézhető absztrakt: 1. Judit Halasz, A. Kiss, A. Holczbauer, Cs. Paska, M. Kovács, G. Benyo, K. Galantai, T. Verebely and Zs. Schaff. Expression of claudins in human hepatoblastoma. Z Gastroenterol 2005; 43. 2. Dezső K, Halász J, Paku S, Bisgaard HC, Schaff Zs, Nagy P. DLK a potential new immunohistochemical marker for hepatoblastoma: 43rd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Milan, Italy, April 23-27, 2008 Journal of Hepatology 48:(S2) p. S153. (2008) 3. Halász J, Holczbauer Á, Kiss A, Páska Cs, Kovács M, Benyó G, Galántai I, Schaff Zs. Expression of claudins in human hepatoblastoma. 20th European Congress of Pathology, Paris, France, September 3-8, 2005 Virchows Arch 447: 2005 (2005) 4. Halász J, Horváth A, Folhoffer A, Szalay F, Nagy P, Schaff Zs. Hepatocellular carcinoma in biliary cirrhosis with stem cell markers XXVI International Congress of the International Academy of Pathology, Montreal, Canada, 16-21 September, 2006 Modern Pathol 19 S3: 122-123 (2006) Egyéb kutatási témából készült, idézhető absztraktok: 1. Horváth A, Hantos M, Tekes K, Halász J, Illyés Gy, Schaff Zs, Folhoffer A, Lakatos PL, Szalay F. Hepatocellular carcinoma in a patient with primary biliary cirrhosis. Is nociceptin a marker for HCC? FALK Symposium, Freiburg, Germany, 2004. Z Gastroenterol 2003;41:439. 2. A Horvath, Folhoffer, T Csak, PL Lakatos, MB Hantos, K Tekes, A Szijarto, P Kupcsulik, A. Kiss, J Halasz, Z Schaff, F Szalay. High nociceptin content in human hepatocellular carcinoma tissue. DDW, New Orleans, USA, 2004. Gastroenterol 2004, 40 Suppl 1: A250. 3. Aigelsreiter, A; Janig, E, Halasz, J, Lackner, C, Sostaric, J, Pichler, M, Stumptner, C, Unterthor, D, Kufferath, I, Zatloukal K, Denk, H. (2007): Clusterin expression in cholestasis and liver fibrosis Virchows Archive 2007; 451(2):132-132.-21th European Congress of Pathology; SEPT 8-13; Istanbul, TURKEY. 17
4. Aigelsreiter, A; Halasz J, Lackner C, Sostaric J, Reihs R, Stark K, Kufferath I, Pichler M, Stumptner C, Zatloukal K, Denk H (2007): Hepatocellular carcinomas with Mallory bodies and/or Intracellular hyaline bodies: Correlation with steatohepatitic features Virchows Archive 2007; 451(2):370-370.-21th European Congress of Pathology; SEPT 8-13, 2007; Istanbul, TURKEY. 5. Győri G, Fuszek P, Járay B, Halász J, Schaff Zs, Lukovich P, Abonyi M, Lakatos PL. Mucocele of the appendix: An unusual cause of lower abdominal pain in a patient with ulcerative colitis. A case report. 46th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 1-5, 2004 Z. Gastroenterol 42: 414, 2004 (2004). Egyéb kutatási témából készült, nem idézhető absztraktok: 1. Horváth A, Hantos M, Tekes K, Halász J, Illyés Gy, Schaff Zs, Folhoffer A, Lakatos PL, Szalay F. Hepatocellular carcinoma in a patient with primary biliary cirrhosis. Is nociceptin a marker for HCC? 45 th Annual Meeting of the Gastroenterology Society, Balatonaliga, Hungary, 2003. 2. Halász J, Horváth A, Folhoffer A, Lakatos PL, Illyés Gy, Hantos BM, Tekes K, Nagy P, Szalay F, Schaff Zs. Primary biliaris cirrhosis in hepatocellular carcinoma. 63 th Congress of Pathology, Balatonszéplak, Hungary, 2004. 3. Judit Halász, Margit Kovács, György Illyés, István Máttyus, Judit Szolnoki, Antal Szabó, Tibor Verebély, Zsuzsa Schaff. Malignant rhabdoid tumor in the liver. FALK Symposium, Freiburg, Germany, 2004. 4. Judit Halasz, A. Kiss, A. Holczbauer, Cs. Paska, M. Kovács, G. Benyo, K. Galantai, T. Verebely and Zs. Schaff. Expression of claudins in human hepatoblastoma. FALK Symposium, Berlin, Germany, 2005. 5. P. Valyi, K. Danyi, J. Halasz, Z. Schaff, A. Fazekas, K. Bogi. Expression of the tight junction associated claudins in normal human gingiva. Joint meeting of the Continental European Division and Scandinavian Divison of the IADR, Amsterdam, Netherland, 2005. 6. P. Valyi, K. Danyi, J. Halasz, Z. Schaff, A. Fazekas, K. Bogi. Expression of occludin and ZO-1 in healthy stratified gingival epithelium. Joint meeting of the Continental European Division and Scandinavian Divison of the IADR, Amsterdam, Netherland, 2005. 7. Halasz J., Kiss A., Holczbauer A., Paska Cs., Kovacs M., Benyo G., Verebely T., Schaff Zs. Claudin expression in human hepatoblastoma. 64 th Congress of Pathology, Pécs, Hungary, 2005. 8. Halasz J., Verebely T., Kovacs M. VIP secreted ganglioneuroblastoma which caused WDHA-syndrome. 64 th Congress of Pathology, Pécs, Hungary, 2005. 18