Hepatocita-szerű sejtek karakterizálása a humán embrionális őssejtek máj irányú differenciáltatása során. Erdélyi-Belle Boglárka

Átírás

1 Hepatocita-szerű sejtek karakterizálása a humán embrionális őssejtek máj irányú differenciáltatása során Doktori értekezés tézisei Erdélyi-Belle Boglárka Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola Molekuláris sejt- és neurobiológia program Témavezetők: Prof. Schaff Zsuzsa, (SOTE) Dr. Homolya László, (RCNS, HAS) A Biológia Doktori Iskola vezetője: A Molekuláris sejt- és neurobiológia program vezetője: Prof. Erdei Anna Prof. Sass Miklós Enzimológiai Intézet, Természettudományi Kutatóközpont, Magyar Tudományos Akadémia II.sz. Patológiai Intézet, Semmelweis Egyetem Budapest, Hungary 2014

2 Bevezetés Az irreverzibilis máj rendellenességben szenvedők számára manapság a máj transzplantáció az egyetlen szóba jöhető megoldás, azonban a szervdonorok hiánya miatt más alternatív lehetőségeket is számba kell venni, mint például a sejt alapú terápiát, melynek során a különböző típusú őssejtek (mint például, humán embrionális őssejtek, indukált pluripotens őssejtek, csontvelő eredetű őssejtek) segítségével igyekeznek regenerálni a sérült máj szövetet. Kísérleteink során két humán embrionális őssejt vonalat tanulmányoztunk a HUES1-et és a HUES9-et, melyeket úgy, ahogy a többi embrionális őssejt vonalat, a humán blasztociszták belső sejtjeiből állítottak elő. Különböző növekedési faktorok és morfogének hatására ezek a pluripotens embrionális őssejtek mindhárom csíralemez kialakítására képesek. A differenciáció folyamatát jól lehet jellemezni különböző differenciációs stádiumokra specifikus markerekkel. A máj szöveti parenchimájának fő alkotó elemei a hepatociták és a kolangiociták eltérő funkciót töltenek be a máj működésében valamint különböznek egymástól ABC transzporter és a tight junction (TJ) komponens expressziós mintázatukban is. A TJ komponenseknek fontos szerepük van az érett hepatociták polarizációjának kialakításában. A hepatocitákban a polarizáció során kialakult bazolaterális (szinuszoidális), és apikális (kanalikuláris) membránoknak különböző a ABC transzporter készletük, amik elengedhetetlenek a máj funkciójának betöltéséhez (anyagcsere folyamatok, glikogén raktározás, epekiválasztás, koleszterol szintézis, detoxifikáció, stb.). Mindezidáig még nem vizsgálták a humán embrionális őssejtek májirányú differenciáltatása során számos ABC transzporter, bicelluláris TJ komponens; mint például a claudinok, és a legújabban azonosított, három sejt között kapcsolatot tartó tricellulin valamint az extracelluláris mátrix protein, agrin génexpressziójának változását. A TJ komponensek expressziójának megváltozása és a malignus transzformáció között szoros kapcsolatot feltételeznek, ezért céljaink között szerepelt még különböző szöveti eredetű (máj és hasnyálmirigy) rákos megbetegedések TJ komponens készletének vizsgálata. 1

3 Célkitűzések A munkánk elsődleges célkitűzése a humán embrionális őssejtek máj irányú differenciáltatása volt, amihez előszöris ki kellett választani a hepatocita irányú differenciációra leginkább alkalmas humán embrionális őssejtvonalat, ki kellett választani a leghatékonyabban és a legkönnyebben reprodukálható differenciációs protokolt, ezt követően célunk volt, a jól karakterizált differenciációs állapotokra jellemző markerek expressziós szintváltozásának vizsgálatával nyomon követni a differenciáció folyamatát, valamint funkcionális esszékkel karakterizálni a differenciáció során kapott hepatocita-szerű sejteket és egyben a differenciációs folyamat hatékonyságát. Munkánk során célul tűztük ki, a humán embrionális őssejtek máj irányú differenciációs folyamatának jól karakterizált állapotaiban elsőként feltérképezni az expressziós szintváltozását a hepatociták bazolaterális (szinuszodális) membránján kifejeződő ABCA1, ABCC1 (MRP1), ABCC3 (MRP3), ABCC6 (MRP6), és a hepatociták apikális (kanalikuláris) membránján kifejeződő ABCB1(MDR1), ABCB4 (MDR3), ABCB11 (BSEP), ABCC2 (MRP2), ABCC4 (MRP4), ABCG2 (BCRP), ABCG5/G8 valamint a kolangiocita specifikus ABCC7 és végül a máj makrofágokban is kifejeződő ABCG1 géneknek, valamint feltérképezni számos TJ komponens, mint például a claudin-1, -4, -5, -7, tricellulin, valamint az agrin, extracelluláris matrix protein gének expressziós szintváltozását. A legtöbb rákos szövetburjánzás a szervezetben előforduló rákos őssejtekből eredeztethető, amik az őssejtekhez nagyon hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek; ilyen például az önmegújítóképesség, és a pluripotencia, ezért céljaink közt szerepelt továbbá összehasonlítani a különböző szöveti eredetű rákos megbetegedéseket a hozzájuk tartozó ép szövetekkel a TJ komponens és ABC transzporter génjeik expressziós és protein lokalizációs mintázatuk alapján, ezt követően pedig, páruzamot vonni a tumorok kialakulása és súlyossága valamint, a differenciáció során tapasztalt eredményeink között. 2

4 Vizsgálati módszerek A laboratóriumunkban rendelkezésre álló őssejtvonalak, HUES1 és HUES9 irányított differenciációját két féle, az irodalomban leírt eljárással végeztük. A hepatikus differenciáció végén, a kapott hepatocita-szerű sejt populációt morfológiai vizsgálatokkal, és különböző funkcionális módszerekkel jellemeztük, mint például; glikogén tárolás, organikus anion felvétel/leadás, albumin és urea szekréció mérésével valamint CDF-DA hidrolízis vizsgálattal. A differenciációs folyamatát különböző, jól karakterizált fázisaiban a különböző őssejt és hepatocita markerek mrns expressziós mintázatának változását is nyomon követtük Az ABC transzporter és TJ komponens gének expresszióját mrns-szinten kvantitatív valós idejű (RT) PCR-el határozzuk meg a fent említett differenciációs stádiumokban. Ezt követően néhány májrákos megbetegedést hasonlítottunk össze a hozzájuk tartozó ép szöveti mintákkal; a sejtkapcsoló készletük gén expresszós mintázata alapján kvantitatív RT-PCR-el, valamint a sejtkapcsoló fehérjéik lokalizációja alapján immunhisztokémiával. Majd igyekeztünk párhuzamot vonni a különböző súlyosságú rákos megbetegedések és a rákos szövetek TJ gén expressziója között kvantitatív RT-PCR-el. Eredmények A kiválasztott differenciációs protokoll relatív egyszerű és jól definiált differenciációs stádiumokra volt bontható. A HUES9 sejteket három napig differenciálatlan állapotban tartottuk, amik öt napig tartó Activin A kezelés hatására endoderma-szerű sejtekké alakultak. További hét napig tartó hepatocita növekedési faktorral (HGF) való kezelés hatására pedig hepatocita-szerű sejtekké differenciálódtak. A HUES9 sejtek máj irányú differenciáltatásának hatékonyságát különböző módszerekkel vizsgáltuk (morfológia vizsgálatával, funkcionális esszékel, őssejtmarkerek és májmarkerek expressziójának vizsgálatával RT-PCR-el), amik segítségével igazoltuk, hogy sikerült a humán embrionális őssejtekből májszerű sejteket differenciáltatnunk. A differenciáltatási folyamat különböző időpontjaiban nyomon követtük a sejtek morfológiájában végbemenő változásokat. A folyamat végére a hepatocita-szerű sejtek sokszögletűek lettek és a citoplazmájukban sok glikogén tartlamú granulum volt látható, hasonlóan a sejtkultúrában tenyésztett normál humán hepatocitákhoz. A humán embrionális őssejt eredetű hepatocita-szerű sejtek hepatocitákra jellemző funkcionális aktivitást mutattak. 3

5 A PAS (periodic acid-schiff) esszét rutinszerűen alkalmazzák a májsejtekre jellemző citoplazmatikus glikogén felhalmozódás kimutatására. A differenciációs folyamat végén a hepatocita-szerű sejtek PAS pozitívak voltak. A működőképes májsejtek kimutatására alkalmas módszer az ICG (indocyanin green) organikus anion felvételének és leadásának vizsgálata. A humán embrionális őssejtekből differenciáltatott májszerű sejtek felvették az ICG-t, azonban a differenciálatlan őssejtek nem voltak erre képesek. A máj funciót mutató sejtek a felvett ICG-t hat óra múlva eliminálták. A sejtek máj karakterét támasztja alá, hogy a differenciációs folyamat végére a sejtek urea szekréciója szignifikánssan megnőtt. Azonban a differenciáltatott sejtek albumin szekréciója az endoderma állapot végén volt a legmagasabb, ami a hepatocita állapot végére kissé lecsökkent, összességében elmondható, hogy a differenciáció során nőtt az albumin szekréció. A CDF-DA hidrolízis vizsgálattal a polarizálódó hepatocitákban az epe kanalikulusok kialakulását és tipikusan azok membránján expresszálódó ABCC2 (MRP2) jelenlétét vizsgáltuk, melynek során azt láttuk, hogy a zöld CDF festék a hepatocita-szerű sejtekben és a sejtek közti térben halmozódott fel, kanalikulus képződést azonban nem tapasztaltunk. Mindez arra utalt, hogy a differenciáció végén a hepatocita-szerű sejtek polarizációja és ez által a membrán proteinek megfelelő helyre juttatása még folyamatban van. A differenciáció hatékonyságát őssejt marker gének expressziójának nyomon követésével is vizsgáltuk, melynek során az Oct3/4 és Nanog gének szignifikáns csökkenését tudtuk kimutatni kvantitatív RT-PCR-el, ami arra utalt, hogy a differenciáció során a sejtek elvesztették az őssejt karakterüket. A differenciációs folyamat végére a hepatocita marker gének, az α-fötoprotein és az albumin expressziója szignifikánsan megemelkedett. Ezt követő vizsgálataink rámutattak arra, hogy a humán embrionális őssejtekből differenciáltatott hepatocita-szerű sejtek többé-kevésbé a hepatocitákra jellemző ABC transzporter és TJ készlettel rendelkeztek. A kvantitatív RT-PCR-el végzett vizsgálatinak során azt tapasztaltuk, hogy az általunk vizsgált négy tipikusan a polarizált hepatociták bazolaterális (szinuszoidális) membránján expresszálódó ABC transzporter közül az ABCA1 (15-ször), az ABCC3 (MRP3) (15-ször) és az ABCC6 (MRP6) (30-szor) gének expressziója növekedett meg szignifikánsan a differenciáció során. Az általunk vizsgált nyolc apikális (kanalikuláris) ABC transzporter közül, pedig az ABCB11 (BSEP) (110-szer), az ABCC2 (MRP2) (30-szor), és az ABCG5 (8-szor) gének expressziója növekedett meg szignifikánsan. Az apikális ABCG2 (BCRP) (20-szor) expressziója a differenciáció folyamata során kezdetben csökkent, amit a folyamat végére szignifikáns növekedés váltott fel, ez egybevág az irodalmi adatokkal. A tipikusan máj makrofágok (Kupffer sejtek) membránján 4

6 expresszálódó ABCG1 (85-ször) és az epevezetéksejtek membránján expresszálódó ABCC7 (CFTR) (80-szor) géneknek szintén szignifikáns növekedését tapasztaltuk a hepatikus differenciáció során. A TJ komponens készletben végbemenő változásokat vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az endoderma-szerű sejtek szignifikánsan több claudin-1-et (30-szor) expresszáltak, mint a hepatocia-szerű sejtek. A differenciáció során szignifikáns mértékben emelkedett a claudin-4 (20-szor), és agrin (10-szer) gének expressziója, és a legmagasabb szintet a differenciáció végén érték el. Azonban a hepatocita-szerű sejtek nem expresszáltak több claudin-7, és tricellulin gént a kiindulási sejtekhez képest. A tumoros megbetegedések vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy amíg a hasnyálmirigy duktuláris adenokarcinómák (PDAC) dedifferenciáltságával csökkent a tricellulin expressziója, addig a hepatocelluláris karcinomás (HCC) esetekben a dedifferenciáltság megnövekedett tricellulin termelődéssel és egyben rossz prognózissal járt együtt. A tricellulin expressziót megvizsgáltuk továbbá cirrózisos (CIR) és fokális noduláris hiperpláziás (FNH) esetekben is és azt tapasztaltuk, hogy amíg a CIR esetében enyhén, addig az FNH-ban fokozódott a tricellulin protein expressziója. Az általáunk vizsgált megbetegedések közül a HCC-ben tapasztaltuk a legnagyobb mértékű tricellulin termelődést. Vizsgálataink során azt láttuk, hogy a fibrolamelláris carcinomában (FLC) kevesebb claudin-1 és tricellulin, azonban több claudin-5 expresszálódik, mint a hepatocelluláris carcinomában (HCC). A humán máj és hasnyálmirigy rákok esetében mi detektáltuk elsőként a tricellulin jelenlétét. Következtetések A humán embrionális őssejteket (ES) in vivo különböző morfogének és növekedési faktorok hozzáadásával akár mindhárom csíravonal irányába lehet differenciáltatni. Célunk az volt, hogy figyelemmel kísérjük az őssejtek máj irányú differenciálódási folyamata során a tight junction (TJ) komponensek, és az ABC (ATP-binding cassette) transzporterek génexpressziós változását. A differenciációs folyamat során a humán ES sejtekből először endoderma-szerű sejtek lettek, amiket tovább differenciáltatva hepatocita-szerű sejteket kaptunk. A differenciáltatott sejtek sokszögletű morfológiája és funkcionális vizsgálata (pl. glikogén tárolás, organikus anion felvétel/leadás, albumin és urea szekréció) is máj karaktert 5

7 mutatott. Az őssejt marker gének (Oct3/4 és Nanog) expressziós szintje a differenciáció előre haladtával szignifikánsan lecsökkent, míg a májra jellemző gének (α-fötoprotein, albumin) expressziós szintje a differenciálás végén érte el a csúcspontját. Az endoderma-szerű sejtek claudin-1 expressziója volt a legmagasabb, amely végül a hepatocita-szerű sejtekben csökkent. A kolangiocita markerek expressziós szintje (claudin-4, CK-7, CK-19, és agrin) a differenciálás végén volt a legmagasabb. A hepatocita-szerű sejtek a differenciálódási folyamat végén néhány hepatocita-specifikus apikális (kanalikuláris) ABC transzportert (ABCC2/MRP2, ABCG5 ABCB11/BSEP), úgy ahogy néhány hepatocita-specifikus bazolaterális (szinuszoidális) ABC transzportert (ABCA1, ABCC3/MRP3 és ABCC6/MRP6) szignifikánsan magas szinten expresszáltak. Az eddigi eredmények alapján elmondhatjuk, hogy a differenciációs folyamat végén lévő sejtek egyaránt mutatnak hepatocita és kolangiocita szerű karaktert. A HUES9-ből differenciálatatott hepatocelluláris és egyben kolangiocelluláris karakterű sejtek segítségével a különböző típusú rákos megbetegedések molekuláris mechanizmusait modellezhetjük. Eredményeink alátámasztják, hogy a hepatikus differenciáció során a TJ komponensek és az ABC transzporterek nyomonkövetésével jobban megérthetjük az in vivo máj organogenezist. Összehasonlítottunk különböző máj és a hasnyálmirigy rákos megbetegedéseket (FLC, HCC, FNH, CIR, PDAC) az ép máj és hasnyálmirigy szövetekkel a különböző TJ komponensek és ABC transzporterek génexpressziója és fehérje lokalizációja alapján. Azt találtuk, hogy míg a HCC-kben a magas tricellulin expresszió, addig a PDAC megbetegedésekben az alacsony tricellulin expresszió társult rossz prognózissal. Eredményeink előre vetítik annak a lehetőségét, miszerint a TJ komponenseket a tricellulint és az ABC transzportereket a rák gyógyítás potenciális célpontjaiként tarthatjuk számon. 6

8 Saját publikációk az értekezés témakörében B. Erdélyi-Belle, Á. Apáti, Gy. Török, B. Sarkadi, Zs. Schaff, A. Kiss, L. Homolya Expression profiling of hepatocyte-like cells initiated from human embryonic stem cells PATHOLOGY AND ONCOLOGY RESEARCH (2014) accepted (IF: 1.555) Somorácz A, Korompay A, Törzsök P, Patonai A, Erdélyi-Belle B, Lotz G, Schaff Z, Kiss A. Tricellulin Expression and its Prognostic Significance in Primary Liver Carcinomas. PATHOLOGY AND ONCOLOGY RESEARCH In press: p. In press. (2014) IF: Korompay A, Borka K, Lotz G, Somorácz Á, Törzsök P, Erdélyi-Belle B, Kenessey I, Baranyai Zs, Zsoldos F, Kupcsulik P, Bodoky Gy, Schaff Zs, Kiss A Tricellulin expression in normal and neoplastic human pancreas HISTOPATHOLOGY 60:(6B) pp. E76-E86. (2012) IF: Patonai A, Erdélyi-Belle B, Korompay A, Somorácz Á, Straub BK, Schirmacher P, Kovalszky I, Lotz G, Kiss A, Schaff Zs Claudins and tricellulin in fibrolamellar hepatocellular carcinoma VIRCHOWS ARCHIV-AN INTERNATIONAL JOURNAL OF PATHOLOGY 458: pp (2011) IF: Apáti Á, Orbán T, Varga N, Németh A, Schamberger A, Krizsik V, Erdélyi-Belle B, Homolya L, Várady G, Padányi R, Karászi É, Kemna EW, Német K, Sarkadi B High level functional expression of the ABCG2 multidrug transporter in undifferentiated human embryonic stem cells. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOMEMBRANES 1778:(12) pp (2008) IF: Egyéb publikációk Patonai A, Erdélyi-Belle B, Korompay A, Somorácz A, Törzsök P, Kovalszky I, Barbai T, Rásó E, Lotz G, Schaff Z, Kiss A. Molecular Characteristics of Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma. Pathol Oncol Res Jan;19(1): doi: /s Epub 2012 Aug 8. IF:

9 Konferencia absztraktok B. Erdélyi-Belle, Á. Apáti, B. Sarkadi, L. Homolya Expression profiling of ABC transporters during hepatic differentiation initiated from human embryonic stem cells Magyar Őssejt Konferencia, Budapest Erdélyi-Belle Boglárka Az ABC-transzporterek expressziós szintváltozásának vizsgálata a humán embrionális őssejtek máj-irányú differenciáltatása során 39. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg Korompay Anna, Borka Katalin, Lotz Gábor, Kovalszky Ilona, Somorácz Áron, Patonai Attila, Erdélyi-Belle Boglárka, Kiss András, Schaff Zsuzsa A tricellulin jelenlétének, lokalizációjának és mennyiségi változásainak vizsgálata humán pancreasban és egyes daganataiban PHD TUDOMÁNYOS NAPOK, Budapest, április Erdélyi-Belle Boglárka ABC transzporterek expressziós mintázata őssejt-eredetű májszerű sejtekben 40. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg Patonai A, Törzsök P, Korompay A, Erdélyi-Belle B, Somorácz Á, Kovalszky I, Lotz G, Kiss A, Schaff Zs. Characteristics of fibrolamellar hepatocellular carcinoma: expression of tight junction proteins. EASL Special Conference on Hepatocellular Carcinoma: from Genomics to Treatment, Dubrovnik, Croatia, June 25-26, 2010 Korompay A, Borka K, Erdélyi-Belle B, Somorácz Á, Törzsök P, Lotz G, Kovalszky I, Patonai A, Kiss A, Schaff Zs. A tricellulin jelenlétének, lokalizációjának és mennyiségi változásainak vizsgálata egér hasnyálmirigyben, illetve humán pancreasban és egyes daganataiban. 69. Patológus Kongresszus, Siófok, szeptember 30-október 2, 2010 Korompay A, Erdélyi-Belle B, Apati A, Homolya L, Kiss A, Schaff Zs. Expression profiling of tight junction proteins during hepatic differentiation initiated from human embryonic stem cells. 46 th Annual Meeting of EASL, Berlin, Germany, March 30-April 3, 2011 A. Korompay, B. Erdelyi-Belle, Á. Apati, L. Homolya, A. Kiss, Z. Schaff 8

10 981 EXPRESSION PROFILING OF TIGHT JUNCTION PROTEINS DURING HEPATIC DIFFERENTIATION INITIATED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS Journal of Hepatology - J HEPATOL, vol. 54, pp. S391-S391, March 2011 Somorácz Á, Korompay A, Patonai A, Erdélyi-Belle B, Törzsök P, Lotz G, Schaff Zs, Kiss A. Expression of tricellulin, a recently identified tight junction protein in normal liver and in primary liver cancers. 46 th Annual Meeting of EASL, Berlin, Germany, March 30-April 3, 2011 Á. Somorácz, A. Korompay, A. Patonai, B. Erdélyi-Belle, P. Törzsök, G. Lotz, Z. Schaff, A. Kiss 251 EXPRESSION OF TRICELLULIN, A RECENTLY IDENTIFIED TIGHT JUNCTION PROTEIN IN NORMAL LIVER AND IN PRIMARY LIVER CANCERS Journal of Hepatology - J HEPATOL, vol. 54, pp. S103-S103, March 2011 DOI: /S (11) Á. Somorácz, A. Korompay, P. Törzsök, A. Patonai, B. Erdélyi-Belle, G. Lotz, Z. Schaff, A. Kiss 751 TRICELLULIN EXPRESSION CORRELATES WITH OVERALL SURVIVAL IN HEPATOCELLULAR AND CHOLANGIOCELLULAR CARCINOMAS Journal of Hepatology Vol. 56 Supplement 2, Page S295, April