GENETIKA ÉS GENOMIKA

1 GENETIKA ÉS GENOMIKA Szerkesztette: Szalai Csaba, MTA doktora, egyetemi tanár Szerzők: 1., 9.,10.,11.,12.,13.,14., 15. fejezetek: Szalai Csaba, MTA doktora, egyetemi tanár 2. fejezet: László Valéria, PhD, egyetemi docens 3., 4., 5.,7., 8. fejezetek: Tóth Sára, PhD, egyetemi docens 6. fejezet: Pap Erna, PhD, egyetemi docens 16. fejezet: Falus András, MTA tagja, egyetemi tanár és Oberfrank Ferenc, PhD, KOKI A könyv a Semmelweis Egyetem orvostan-, gyógyszerész-, és fogorvostan-hallgatók számára tartott genetika és genomika tárgy előadásainak és részben gyakorlatainak anyagát tartalmazza. A 2015-ben frissített anyagú könyv első fejezete a középiskolai genetikai, és a biokémiai alapismereteket foglalja össze. A további 15 fejezet a humángenetikának leginkább az orvostudományokhoz kapcsolódó részeit tárgyalja bővebben. A fejezetek nagyobb része orvosi genetikával foglalkozik, és ismertetik a genetikai információátadás folyamatát, citogenetikát, epigenetikát, fejlődésgenetikát, onkogenetikát, immungenetikát, populációgenetikát, evolúciógenetikát, illetve a humángenetikából kinőtt új tudományágnak a humángenomikának az alapismereteit, és alkalmazásait, például komplex betegségek vizsgálatában, farmakogenomikában, nutrigenomikában, vagy a genom-környezet kölcsönhatásának tanulmányozásában. Mivel a genomika a rendszerbiológiai tudományokhoz tartozik, egy fejezet a rendszerbiológiai alapfogalmakat ismerteti, szintén orvosbiológiai, betegségközpontú megközelítéssel. A modern humángenetika és genomika eredményei számos társadalmi, jogi és etikai problémát vethetnek fel. Egy fejezet ez utóbbiakkal foglalkozik. Minden fejezet végén kérdések találhatók, amelyekkel az olvasók ellenőrizhetik, hogy megértették, feldolgozták-e a fejezet által közvetített ismereteket. Mivel e- könyvről van szó, bizonyos fogalmak nem kerülnek részletes ismertetésre, hanem néhol wikipédia szerűen kapcsolva vannak a világhálón található részletesebb anyaghoz. A könyvet az egyetemi hallgatókon kívül mindazok figyelmébe is ajánljuk, akik igénylik, hogy orvosgenetikai és genomikai ismereteik naprakészek legyenek. Kulcsszavak: Mitózis, meiózis, mutációk, polimorfizmusok, citogenetika, epigenetika, mendeli öröklődés, fejlődésgenetika, a nem genetikája, őssejtbiológia, onkogenetika, immungenetika, humángenomika, komplex betegségek genomikája, genomikai módszerek, populációgenetika, evolúciógenetika, farmakogenomika, nutrigenetika, gén-környezet kölcsönhatás, rendszerbiológia, bioetika. Szakmai lektor: Molnár Viktor; Csertex Kutatólaboratórium vezetője 2015-ben frissített változat

2 COPYRIGHT: Falus András, László Valéria, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Szalai Csaba, Tóth Sára, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. ISBN 978 963 279 185 2 Készült a Typotex Kiadó gondozásában Felelős vezető: Votisky Zsuzsa Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, Konzorcium a biotechnológia és bioinformatika aktív tanulásáért című projekt keretében.

3 Tartalomjegyzék 1. Genetikai és molekuláris biológiai alapok... 8 1.1. Genetika alapjai... 8 1.1.1. Az öröklődésmenetek néhány példája... 9 1.1.1.1. Domináns-recesszív öröklődés... 9 1.1.1.2. Nemhez kötött öröklődés... 11 1.1.1.3. Kapcsolt öröklődés, rekombináció... 12 1.1.2. Mutáció... 13 1.2. Molekuláris biológia alapjai... 13 1.2.1. A humán DNS főbb jellemzői... 14 1.2.2. Replikáció... 15 1.2.3. Transzkripció... 15 1.2.4. Transzláció... 17 1.3. Javasolt irodalom... 18 2. A GENETIKAI INFORMÁCIÓ ÁTADÁSA... 19 2.1. A SEJTCIKLUS ÉS SZABÁLYOZÁSA... 19 2.1.1. G0 G1 átmenet... 22 2.1.2. G1 S átmenet, S-fázis... 23 2.1.3. G2 M átmenet... 24 2.1.4. M-fázis... 26 2.1.4.1. A kromoszóma szerkezete... 27 2.1.4.2. A sejtmaghártya eltűnése és újraképződése... 30 2.1.4.3. A mitotikus orsó felépítése és szerepe a mitózisban... 31 2.1.4.4. A metafázis anafázis átmenet... 34 2.1.5. A citokinézis legfontosabb folyamatai... 36 2.1.6. Ellenőrzési pontok... 37 2.1.7. Kromoszóma territóriumok... 38 2.2. A MEIÓZIS... 40 2.2.1. A meiózis szakaszai... 41 2.2.2. Oogenezis... 45 2.2.3. Spermatogenezis... 47 2.2.4. A meiózis szabályozása... 51 2.3. A fejezethez tartozó kérdések... 53 3. Genetikai variációk... 54 3.1. Mutáció és polimorfizmus... 54 3.2. A mutációk csoportosítása... 55 3.3. Génmutációk... 58 3.4. DNS-hibajavítás (repair)... 64 3.5. Mutagenitási vizsgálatok... 67 3.6. Genetikai variációk nevezéktana... 69 3.6.1. A variációk szintjei... 69 3.6.2. A variációk pozíciója... 70 3.6.3. Genetikai variánsok jelölése... 70 3.7. A fejezethez tartozó kérdések... 72 4. CITOGENETIKA... 73 4.1. Szerkezeti kromoszómamutációk = strukturális kromoszómaaberrációk... 74 4.1.1. Deléciók... 75 4.1.2. Duplikációk... 76 4.1.3. Transzlokációk... 76 4.1.3.1. Reciprok transzlokációk... 76 4.1.4. Inverziók... 79 4.1.5. Gyűrű (ring) kromoszóma... 79 4.1.6. Izokromoszóma... 80 4.1.7. Dicentrikus kromoszóma... 84 4.1.8. Acentrikus fragment... 84 4.2. Számbeli kromoszómamutációk = numerikus aberrációk... 84

4 4.2.1. Euploid kromoszómamutációk... 84 4.2.2. Aneuplod kromoszómaaberrációk... 85 4.2.3. A leggyakoribb számbeli kromoszóma-rendellenességek... 88 4.2.3.1. 21-es triszómia... 89 4.2.3.2. 13-as triszómia... 89 4.2.3.3. 18-as triszómia... 89 4.2.4. Nemi kromoszómák számbeli kromoszóma-rendellenességei... 90 4.2.4.1. Turner-szindróma... 90 4.2.4.2. Klinefelter-szindróma... 91 4.2.4.3. Triplo X-szindróma... 91 4.2.4.4. Dupla Y-szindróma, szuper férfi, Jacobs-szindróma... 91 4.3. Uniparentális diszómia (UPD)... 92 4.4. Mixoploid mutációk... 92 4.4.1. Mozaicizmus... 93 4.4.2. Kimérizmus... 93 4.5. A fejezethez tartozó kérdések... 95 5. EPIGENETIKA... 96 5.1. Epigenetikus változások-molekuláris módosulások... 96 5.1.1. DNS-metiláció... 97 5.1.2. CpG mint mutációs forrópont... 97 5.1.3. Hisztonmódosulások... 98 5.2. Nem-kódoló RNS-ek... 99 5.3. Epigenetikus jelenségek... 99 5.3.1. X-kromoszóma inaktiváció... 99 5.3.2. Genomikus imprinting... 101 5.3.2.1. Imprintinggel összefüggő betegségek... 102 5.3.2.2. Az imprinting célja... 103 5.4. Az epigenetikai hatások jelentősége... 104 5.5. A fejezethez tartozó kérdések... 107 6. Mendeli öröklődés: autoszomális öröklődés... 108 6.1. Bevezetés... 108 6.2. Genetikai alapfogalmak, értelmezésük... 110 6.2.1. Mitől domináns vagy recesszív egy jelleg?... 111 6.3. Fogalmak/jelenségek, amelyek befolyásolják/árnyalják a klasszikus monogénesnek vélt öröklődést. 111 6.4. Autoszomális domináns öröklődés... 115 6.4.1. Az autoszomális domináns (AD) öröklődés általános jellemzése... 115 6.4.2. Struktúrgén mutációja által okozott betegségek... 115 6.4.2.1. Marfan-szindróma... 115 6.4.2.2. Osteogenesis imperfecta... 116 6.4.3. Receptorgén mutációja által okozott betegségek... 116 6.4.3.1. Achondroplasia... 116 6.4.3.2. Familiáris hiperkoleszterinémia... 116 6.4.3.3. Policisztás vese... 116 6.4.4. Jelenleg ismeretlen funkciójú fehérjét kódoló gén mutációja... 117 6.4.4.1. Huntington Chorea... 117 6.4.5. Protoonkogének mutációja... 117 6.4.6. Farmakogenetikai betegségek... 117 6.4.6.1. Porfiria... 117 6.4.6.2. Malignus hypertermia... 117 6.5. Autoszomális recesszív öröklődés... 118 6.5.1. Az autoszomális recesszív (AR) öröklődés általános jellemzése... 118 6.5.2. Enzimopátiák... 118 6.5.2.1. Fenilketonúria... 118 6.5.2.2. Klasszikus albinizmus... 119 6.5.2.3. Congenitális adrenalis hyperplasia... 120 6.5.2.4. Xeroderma pigmentosum... 120 6.5.3. Cisztás fibrózis... 120 6.5.4. Hemoglobinopátiák... 120

5 6.5.4.1. Sarlósejtes anémia... 120 6.5.4.2. Thalassemiák... 120 6.6. Gének és tumorok... 121 6.7. Gének és gyógyszerek... 121 6.8. Konklúzió... 122 6.9. Kérdések... 123 7. A NEM SZEREPE AZ ÖRÖKLŐDÉSBEN... 125 7.1. X-KROMOSZÓMÁHOZ KÖTÖTT ÖRÖKLŐDÉS... 125 7.1.1. X-hez kötött domináns (XD) öröklődés... 125 7.1.2. X-hez kötött recesszív (XR) öröklődés... 127 7.2. Y-KROMOSZÓMÁHOZ KÖTÖTT (HOLANDRIKUS) ÖRÖKLŐDÉS... 129 7.3. NEM ÁLTAL BEFOLYÁSOLT ÖRÖKLŐDÉS... 129 7.4. NEMRE KORLÁTOZÓDÓ ÖRÖKLŐDÉS... 130 7.5. GENOMIÁLIS IMPRINTING... 130 7.6. CITOPLAZMATIKUS ÖRÖKLŐDÉS... 130 6.6. 1. Anyai hatás... 130 6.6. 2. Mitokondriális öröklődés... 131 6.7. AZ X-KROMOSZÓMA INAKTIVÁCIÓJA... 133 6.8. A fejezethez tartozó kérdések... 135 8. BIOLÓGIAI FOLYAMATOK GENETIKÁJA... 136 8.1. FEJLŐDÉSGENETIKA... 136 8.1.1. Morfogének... 137 8.1.2. Homeobox gének... 137 8.2. A NEM GENETIKÁJA... 138 8.2.1. A hímnem kialakulása emlősökben... 138 8.2.2. A női nem kialakulása emlősökben... 141 8.3. ŐSSEJTBIOLÓGIA... 143 8.4. ONKOGENETIKA... 145 8.4.1. Onkogének... 145 8.4.2. Tumorszuppresszor gének... 146 8.4.3. Anti-apoptotikus gének... 147 8.4.4. Telomeráz... 148 8.5. IMMUNGENETIKA... 148 8.6. A fejezethez tartozó kérdések... 154 9. Bevezetés a genomikába... 155 9.1. Genomika... 155 9.2. Humán Genom Projekt... 155 9.3. DNS szekvenálás... 157 9.4. Résztvevők a humán genom projektben... 159 9.5. A HGP néhány eredménye... 159 9.6. A humán genom variációi... 162 9.7. Junk DNS a humán genomban... 165 9.8. Komparatív genomika... 167 9.9. Irodalom... 169 9.10. Fejezethez tartozó kérdések... 170 10. A komplex betegségek genomikai megközelítése... 172 10.1. Komplex betegségek általános jellemzői... 172 10.2. Környezeti tényezők... 173 10.3. Miért fontos kutatni a multifaktoriális betegségek genomikai hátterét?... 173 10.4. Öröklődés bizonyítása... 174 10.5. Az öröklődő hányad számítása... 174 10.6. Multifaktoriális betegségek genomikai hátterének tisztázását nehezítő jellemzők... 175 10.7. Genomika módszerek fejlődése, nehézségek... 177 10.8. Ritka variációk problémája... 178 10.9. Epigenetikai problémák... 179 10.10. A genom véletlenszerű viselkedése... 179 10.11. Statisztikai problémák... 179 10.12. Megoldáshoz közelítő utak... 180

6 10.13. Miért gyakoribbak manapság a multifaktoriális betegségek?... 181 10.13.1. Takarékos gén hipotézis... 182 10.13.2. Tisztaság hipotézis... 183 10.13.3. További elméletek... 184 10.14. Irodalom... 186 10.15. Fejezethez tartozó kérdések... 187 11. Betegségek genomikai vizsgálati módszerei... 188 11.1. Genetikai markerek... 188 11.2. Betegségek genomikai hátterének vizsgálati módszerei... 189 11.2.1. Genetikai variációk szerepének vizsgálata betegségekben... 189 11.2.2. GWAS... 190 11.2.3. GWAS eredmények értékelése... 192 11.2.4. Parciális genomszűrések... 193 11.2.5. Pozícionális klónozás... 193 11.2.6. Személyre szabott genomika... 193 11.2.7. Újgenerációs szekvenálás (NGS)... 194 11.2.8. Génexpresszió mérés... 195 11.2.9. Egyéb mikroarray alapú módszerek... 195 11.3. Állatmodellek... 196 11.3.1. Állatmodellek előnyei... 196 11.3.2. Állatmodellek hátrányai... 198 11.3.3. Kísérleti betegségmodellek... 198 11.4. Irodalom... 199 11.5. Fejezethez tartozó kérdések... 200 12. Populáció- és evolúciógenetika... 200 12.1. Populációgenetika... 201 12.1.1. Mintagyűjtések típusai... 201 12.1.2. Biológiai minta gyűjtése populációgenetikai vizsgálatokhoz... 202 12.1.3. Hardy Weinberg eloszlás... 203 12.1.4. Kapcsoltság és haplotípus... 204 12.1.5. Founder populációk... 206 12.1.6. Asszociációs vizsgálatok... 207 12.1.7. Kockázatszámítás... 209 12.2. Evolúciógenetika... 209 12.2.1. A humán genomot formáló gén környezet kölcsönhatások... 209 12.2.2. Genetikai sodródás... 210 12.2.3. Miért gyakori néhány súlyos betegséget okozó mutáció?... 211 12.2.4. Példák a genomot formáló szelekciós hatásokra... 212 12.3. Irodalom... 215 12.4. Fejezethez tartozó kérdések... 216 13. A genom és a környezet kölcsönhatása... 218 13.1. Mutációk penetranciája... 218 13.2. Nagy penetranciájú mutációk és a környezet kölcsönhatása... 219 13.3. Példák kis penetranciájú mutációk és a környezet egymásra hatására... 219 13.4. Dohányzás és a genom kölcsönhatása... 220 13.4.1. Dohányzásra való hajlam genomikai háttere... 220 13.4.2. Dohányzás-gén kölcsönhatás betegség-hajlamokban... 222 13.4.3. Dohányzás-gén kölcsönhatás multifaktoriális betegségekben... 224 13.5. Példák gén-környezet kölcsönhatásokra... 226 13.6. Gén-környezet kölcsönhatás vizsgálata a genomikai érában... 230 13.7. Nutrigenetika és nutrigenomika... 234 13.8. A gén-környezet kölcsönhatás vizsgálat jövője... 235 13.9. Irodalom... 236 13.10. A fejezethez kapcsolódó kérdések... 238 14. Farmakogenomika... 240 14.1. Farmakogenomika céljai... 240 14.1.1. Gyógyszerfejlesztés... 240 14.1.2. Gyógyszermellékhatások... 240

7 14.2. Gyógyszermellékhatások genomikai háttere... 243 14.3. Farmakogenomikai kutatások nehézségei... 244 14.4. Farmakokinetikát befolyásoló gének, génvariációk... 245 14.5. Farmakodinamikát befolyásoló gének, génvariációk... 246 14.6. Példák farmakogenetikai vizsgálatokra, eredményekre... 247 14.6.1. Farmakogenetika az onkológiában... 247 14.6.2. Statinok farmakogenetikája... 248 14.6.2.1. Clopidogrel... 250 14.6.3. MODY... 250 14.6.4. Az asztma farmakoterápiája... 251 14.6.5. β-agonisták farmakogenetikája... 252 14.7. A farmakogenomika jövője... 255 14.8. Irodalom... 256 14.9. A fejezethez kapcsolódó kérdések... 258 15. Betegségek rendszerbiológiai megközelítése... 259 15.1. Bevezetés... 259 15.2. Kölcsönhatások ábrázolása... 259 15.3. A humán interaktom... 260 15.4. Betegséggének a hálózatokban... 261 15.5. Betegséghálózatok... 264 15.6. Csomópontok és élek... 265 15.7. Közös gén hipotézis... 265 15.8. Közös metabolikus útvonal hipotézis... 267 15.9. Közös mirns hipotézis... 267 15.10. Fenotípus betegséghálózat... 268 15.11. Betegségmodulok és a humán interaktom... 268 15.12. A rendszerbiológiai módszerek alkalmazása... 269 15.13. Irodalom... 272 15.14. A fejezethez tartozó kérdések... 274 16. A genetikai kutatás bioetikai, kutatásetikai kérdései... 275 16.1. Előzmények... 275 16.2. A genetikai kutatás etikai kihívást hordozó területei, a határok kérdése... 276 16.3. A biobankok... 278 16.4. Néhány általános etikai vonatkozású kérdés... 280 16.5. A genetikai kutatásokra specifikus bioetikai és kutatásetikai kérdések... 280 16.6. A genetikai eredetű információk kereskedelmi hasznosításának etikai kérdései... 280 16.7. A genetikai kutatás, a biobankok, adatok kezelésének etikai és jogi szabályozása... 281 16.8. Konklúzió... 282 16.9. Irodalom... 282 16.10. Fejezethez tartozó kérdések... 283

8 1. Genetikai és molekuláris biológiai alapok Szalai Csaba 1.1. Genetika alapjai Az öröklődés törvényszerűségeit a genetika vizsgálja. A különböző tulajdonságok öröklődésében az élő szervezetekben található nukleinsavak (DNS, RNS) központi szerepet töltenek be. A DNS-molekulában található információk az egyik nemzedékről a másikra, a szaporodás folyamatában öröklődnek. Az örökítőanyag tehát a DNS, illetve ennek azon egységei, amelyek meghatározzák egy-egy tulajdonság természetét, vagyis a gének. Gén fogalma: Az öröklődés fizikai egysége, amely az élő szervezetekben legtöbbször DNS formájában található. Régebben csak olyan DNS szakaszokat hívtak génnek, amelyek fehérjét kódoltak. Manapság azokat a DNS szakaszokat is géneknek hívjuk, amelyekről olyan funkcionális RNS íródik át, amelyből nem lesz fehérje. Ezeket nem-kódoló RNS-eknek is szokták nevezni. Megjegyzés: Egyes, ún. RNS-vírusokban (pl. influenza, HIV) a gének RNS formájában találhatók. Az egyednek a gének működése (és a környezeti hatások) következtében kialakuló megjelenését, szervezeti és működési jellegeinek az összességét nevezzük fenotípusnak. A genetikai háttér alkotja az élőlény genotípusát. A sejtek DNS-állománya kromoszómákba tömörül. Az egymásnak megfelelő, homológ kromoszómák a diploid sejtekben kromoszómapárokat alkotnak. Ezekben minden génből kettő található, amelyek az apai és az anyai eredetű kromoszóma ugyanazon helyén helyezkednek el. A természetben egy adott génnek különböző változatai lehetnek, ezeket a génváltozatokat közös néven alléloknak nevezzük. Egy adott populációban a leggyakrabban előforduló allélt vad típusnak nevezik. Ha a diploid sejtekben a homológ kromoszómák egy adott helyén (lókuszán) azonos allélok vannak, akkor homozigóta, ha különböző a két allél, akkor heterozigóta az élőlény az adott lókuszon. A genetika tudományának megalapítója Johann Gregor Mendel volt. Mendel borsón végzett keresztezéses kísérleteinél homozigóta szülőkből indult ki. Most foglaljuk össze Mendel törvényeit:

9 Az uniformitás (hasonlóság) szabálya szerint az első hibridnemzedék (F1) valamennyi egyede egyforma. Az F1 nemzedék minden egyede heterozigóta. Fenotípusa a domináns-recesszív öröklésmenetben a/domináns tulajdonság, az intermedier öröklésmenetben pedig az intermedier tulajdonság. A szegregáció (hasadás) szabálya kimondja, hogy a második hibridnemzedékben (az F2-ben) a szülői tulajdonságok szétválnak. Ennek az a magyarázata, hogy a második hibridnemzedék egyedei között a heterozigóták mellett a homozigótak is megjelennek. A független öröklődés törvénye, amely kimondja, hogy a különböző tulajdonságok egymástól függetlenül öröklődnek. Megjegyzés: A fenti törvények csak akkor igazak, ha a vizsgált tulajdonságokat meghatározó gének nem ugyanazon a kromoszómán, egymás közelében vannak (akkor ugyanis kapcsoltságról, kapcsolt öröklődésről beszélünk, mert ezek jellemzően együtt öröklődnek tovább). Ld. később. 1.1.1. Az öröklődésmenetek néhány példája 1.1.1.1. Domináns-recesszív öröklődés. Ha egy adott génnek egy egyedben két, fenotípusosan is megjelenő funkcionális allélja létezik, akkor a következő esetek fordulhatnak elő: Az egyedben csak az egyik allél hatása látszik (jelenik meg fenotípusosan). Ezt az allélt domináns allélnak hívjuk, míg a másik allélt recesszívnek. A recesszív allél csak akkor érvényesül, ha az egyed homozigóta rá nézve. Pl. Mendel kísérletei alapján: 1. Jelöljük a borsó magszín génjének egyik allélját Y-nal (a yellow = sárga angol kifejezés kezdőbetűjéből), ez az allél áll a sárga magszín hátterében, a másik allélt pedig y-nal jelöljük, ez felelős a zöld magszín kialakításáért. 4. Egy növény bármely kombinációban hordozhatja egy gén két allélját, azaz lehet: Y/Y, y/y, Y/y (a / jel jelöli, hogy az általa elválasztott allélok egy génpár tagjai). 5. A Y/y növényekben a Y allél dominál, ezért a fenotípus sárga magszín. A Y/y növények fenotípusa tehát meghatározza azt, hogy az Y a domináns allél, és y a recesszív allél. Ld.: 1. ábra.

10 1. ábra. A sárga és zöld magszín öröklődésének szemléltetése Az ember számos tulajdonságának és betegségének is a domináns-recesszív öröklődésben találták meg az okát. Ilyen betegség pl., az albinizmus, amely recesszív öröklődést mutat, azaz a betegség akkor jelenik meg, ha az egyed mindkét homológ génjén hibás allélt hordoz. Kodominancia: A domináns-recesszív öröklődés egy változata. Az AB0 vércsoport öröklődését vizsgálva azt lehet megállapítani, hogy az A és a B vércsoport a 0-sal szemben

11 domináns, míg egymással kodomináns öröklődést mutat, azaz egy A, és egy B vércsoportot meghatározó gének öröklésekor az illető AB vércsoportú lesz. A fentiek mellett létezik olyan is, hogy egy tulajdonságot egynél több allélpár határoz meg. Igazából tulajdonságaink túlnyomó többségénél ez a jóval bonyolultabb jelenség figyelhető meg (ld. később poligénes öröklődés). Előfordul a fentivel ellentétes eset, amikor egynél több tulajdonság kialakulásáért egyetlen allélpár a felelős. Itt egy adott gén terméke közvetve befolyásol több anyagcsere-folyamatot, amelyek tovább hatnak az egyes szervek működésére, így egyetlen gén allélpárjának hatása többféle fenotípusos következménnyel járhat (ld. később pleiotrópia). 1.1.1.2. Nemhez kötött öröklődés Eddig az ún. testi kromoszómákról, vagy autoszómákról beszéltünk, amelyek a genetikai állomány nagy részét kiteszik. A legtöbb állat és növényfajban a nemek kialakulásával összefüggésben álló speciális kromoszómapár is jelen van. Ezeket ivari vagy szex kromoszómáknak nevezzük. Az ivari kromoszómák az autoszómákkal megegyező módon szegregálnak a meiózis során, de az általuk hordozott gének esetében az utódok fenotípus aránya az autoszómális génekhez képest eltérést mutat. A legtöbb állatfaj és sok növényfaj ivari dimorfizmust mutat (vannak női ivarú és hím ivarú egyedek). A legtöbb esetben az ivar kromoszómálisan meghatározott. Az élővilágban többféle módon történhet az ivari kromoszómákon alapuló nem meghatározása. Itt most csak az XX- XY nem meghatározást tárgyaljuk. Ilyenkor: a nőstények XX (homogamétás: a petesejtek mindegyike X kromoszómát hordoz) a hímek XY (heterogamétás: a spermiumok fele X, másik fele Y kromoszómát hordoz) Az utód nemét a spermium szabja meg. Ez a rendszer jellemző az emlősökre (emberre is), az egyik fontos genetikai modellszervezetre, a muslicára (Drosophila melanogaster), továbbá a kétlaki növényekre (pl. Fehér mécsvirág, Melandrium album). Az X és Y kromoszómák citológiailag jól megkülönböztethetők: az Y kromoszóma jóval kisebb az X-nél. Mindkét kromoszóma tartalmaz homológ (hasonló) és nem-homológ (differenciális = megkülönböztető) részeket. A nem-homológ szakaszok olyan géneket hordoznak, amelyeknek nincs megfelelője a másik nemi kromoszómán. A nem-homológ szakaszokra eső gének hemizigóta (pár nélküli) állapotban vannak a hímekben. Az X és Y kromoszóma a homológ szakaszaik mentén képesek párosodni a meiózis I. profázisában, és

12 ennek köszönhetően kromoszómapárként viselkedve külön utódsejtekbe szegregálnak. Tehát annak köszönhetően, hogy az X és az Y heteromorf kromoszómák mendeli módon szegregálódnak az ivarsejt képzés során, az X és Y kromoszómát hordozó spermiumok felefele arányban jönnek létre. Az XX egyedekben az X kromoszómához kötött gének dózisa kétszerese az XY egyedekéhez képest, mely dózis különbség kompenzálódik. A dóziskompenzáció az élővilágban többféle mechanizmussal is megvalósulhat, az ivari kromoszómákon lévő gének aktivitásának befolyásolásával. Emlősöknél a nőstényekben a kompenzáció az egyik X kromoszóma inaktiválásával valósul meg. Az inaktiválás a korai embrionális fejlődés alatt történik. Az inaktivált X heterokromatikus rögként látszik, amit Barr testnek nevezünk (a hímek sejtjeiben nincs Barr test). Az inaktiváció azáltal vezet az X kromoszómán lévő gének elcsendesítéséhez (kifejeződésük, átírásuk csökkentéséhez), hogy erősen csomagolt, heterokromatin szerkezetet vesz fel az adott X kromatin. Véletlenszerű, hogy egy adott embrionális sejtben a kettő közül melyik X kromoszóma inaktiválódik, és az erre vonatkozó információ a további sejtosztódások során az utódsejteknek átadódik. Nemhez kötött emberben például a vérzékenység, vagy más néven hemofília öröklődése. E betegségben elsősorban a fiúk szenvednek. A hemofíliás fiúk szülei legtöbbször egészséges fenotípusúak, de a betegséget okozó recesszív gént az anya hordozza X kromoszómáján. 1.1.1.3. Kapcsolt öröklődés, rekombináció Ha két gén egymás közelében helyezkedik el egy kromoszómán, akkor az általuk hordozott tulajdonságok együtt öröklődnek, ezt hívjuk kapcsolt öröklődésnek. Az ivarsejtek szaporodása során a meióziskor a homológ kromoszómapárok között bizonyos mértékben kicserélődik a genetikai anyag. Ennek következtében a kromoszómapár adott szakaszán allélkicserélődés jön létre. Ezen allélkicserélődés, azaz rekombináció során a kapcsolt gének megváltoztatják elrendeződésüket (2. ábra)

13 2. ábra: A homológok közötti szakaszcsere citológiai igazolása kukorica kromoszómán Meiózisban az egyed apai és anyai eredetű kromoszómái keverednek, újrakombinálódnak és véletlenszerű eloszlásban kerülnek az ivarsejtekbe. Az élőlények genetikai változékonyságának egyik alapja a rekombináció jelensége. 1.1.2. Mutáció Az örökítőanyag, a DNS, általában ismeretlen okú megváltozását mutációnak nevezzük. A környezeti (mutagén) hatásokon kívül mutáció következhet be a DNS molekula másolása közben. Átlagosan minden 100 millió nukleotidból egy rossz helyre épül be. A mutációk hatása többnyire fenotípusosan nem jelenik meg, azonban ha funkcionálisan fontos helyen történik, akkor akár súlyos betegség (pl. rák, öröklődő betegségek) lehet a következménye. A génekben történő mutációt génmutációnak hívjuk. A kromoszómák törékeny szerkezetek, az őket érintő mutációs változásokat kromoszómamutációknak hívjuk. Kromoszómamutáció lehet pl.: kiesés, kettőződés, megfordulás, áthelyeződés. 1.2. Molekuláris biológia alapjai A molekuláris biológia centrális dogmája (3. ábra) értelmében (néhány RNS vírus kivételével) minden fehérjeszerkezetre vonatkozó információ, illetve azok kifejeződésének körülményei, a sejt DNS állománya által meghatározott. A következőkben szeretnénk rövid áttekintést adni tervrajzunkról, a DNS-ről és a centrális dogma mentén megvalósuló tervről. 3. ábra. A molekuláris biológia centrális dogmája

14 1.2.1. A humán DNS főbb jellemzői A sejtjeink DNS állománya által kódolt fehérjék határozzák meg sejtjeink szerkezetét és funkcióját. Amennyiben DNS állományunk megváltozik, sérül, megváltozhat az általuk kódolt fehérje szerkezete, ezáltal funkciója is, amely igen gyakran betegségekhez vezethet. Vegyük szemügyre kicsit alaposabban genetikai háttértárunkat, sejtjeink DNS állományát. A DNS-ben a nukleotidok dezoxiribóz-foszfát láncot alkotnak, a cukor részről lógnak le a purin, vagy pirimidin bázisok. A DNS kettős spirált alkot, a feltekeredő két láncot a bázisok között létrejövő hidrogén-kötések tartják össze. A két lánc egymáshoz képest antiparalel elrendeződésű és egymással komplementer. Adeninnel szemben timin, guaninnal szemben citozin található, így a bázispárokat (bp) mindig egy purin és egy pirimidin bázis alkotja. A humán sejtek két kompartimentumban tartalmaznak örökítő anyagot, DNS-t a sejtmagban (nukleáris, ndns) és a mitokondriumban (mitokondriális, mtdns). Nukleáris DNS: A sejt DNS állományának legnagyobb része kettős magmembránnal védve, a sejtmagban található. A sejtmagban található DNS több mint hárommilliárd (3,3*10 9 ) bázispárból áll. Ez a hárommilliárd bázispárnyi DNS 46 db (23 pár) kromoszómán oszlik meg. Az ivarsejtek és még néhány sejt kivételével minden egyes humán sejt minden kromoszómából két kópiát, egy apai és egy anyai eredetű kópiát tartalmaz. Mitokondriális DNS: A mitokondriális DNS (mtdns) jóval kisebb méretű, mint a nukleáris mindössze 16569 bp-ból áll. A lineáris nukleáris DNS-sel ellentétben cirkuláris (a bakteriális DNS-hez hasonlóan), ezzel is bizonyítékul szolgáltatva a mitokondrium bakteriális eredetére. A mtdns kizárólag anyai ágon öröklődik, kizárólag a petesejtekben található mtdns-ek határozzák meg a születendő gyerek mtdns-ét. A kisméretű mtdns összesen 37 gént tartalmaz. A 37 gén közül 13 gén fehérjét kódol, 2 gén rrns-t, 22 gén trns-t. Az mtdns által kódolt fehérjék a mitokondriális elektron transzfer lánc fontos alkotói. A mtdns-ben bekövetkezett mutációk, éppen ezért a sejtek energiatermelő folyamataira lesznek hatással. Ezért különösen a nagy energiaigényű szövetek (ideg, szívizom, vázizom, máj) esetében kell súlyos következményekkel számolnunk. A mtdns pedig különösen magas mutációs rátával rendelkezik, aminek oka lehet rossz hibajavító apparátusa, a mitokondriumban termelődő nagy mennyiségű reaktív oxigénvegyület, a mtdns nem rendelkezik klasszikus hiszton fehérjékkel, ez tovább fokozza védtelenségét. Mindezek hozzájárulhatnak ahhoz, hogy jelenleg több mint 5000 különféle mtdns mutációt

15 ismerünk. Az mtdns mutációk száma a kor előrehaladtával nő, így az idősebb korosztályt hangsúlyosabban érinti. 1.2.2. Replikáció Sejtjeink tervrajzát, a DNS-t, megismerve haladhatunk tovább a molekuláris biológia centrális dogmája mentén. A replikáció jelentősége az öröklődés során érhető tetten. A sejtek, vagy a DNS rendelkező sejtszervecskék (mikokondrium, növényekben a színtest) osztódását mindig replikáció előzi meg, így biztosítva, hogy mindkét utódsejtbe (vagy sejtorganellumba) azonos genetikai állomány kerüljön. A folyamat neve is árulkodó, hisz a replikáció szó, másolást jelent. A folyamat során a kettős szálú DNS lemásolódik, a replikáció végén két egymással egyező, kettős szálú DNS-t kapunk. A replikáció során a két DNS szál elválik egymástól, és mindkét szál mintául szolgál egy új, a minta szállal komplementer, így a másik minta szállal megegyező szekvenciájú másolat megszintetizálásához. A keletkező új szálak az egyik eredeti szállal fognak egy új kettős spirált alkotni. Ezt a mechanizmust a DNS szemikonzervetív replikációjának hívjuk. Mindkét keletkező kettős szál egyik fele az eredeti szálból származik, a másik fele pedig újonnan szintetizálódott. A két DNS szál egymásnak komplementere, ezért információvesztés nem történik. 1.2.3. Transzkripció A transzkripció neve is rendkívül beszédes, átírást jelent. A DNS bizonyos szakaszáról RNS másolat készül. A keletkező RNS-ek több csoportba sorolhatók. A transzkripció szempontjából a három legfontosabb csoport az mrns-ek, a trns-ek és az rrns-ek csoportja. Az mrns-ek (messenger RNS-ek) nukleotid-szekvenciája szolgál alapul a fehérjék aminosav szekvenciájának létrehozásához. A trns-ek (transzfer RNS-ek) szállítják a megfelelő aminosavakat a fehérjeszintézis helyére. Az rrns-ek (riboszómális RNS-ek) a riboszómákban találhatóak, ahol RNS-fehérje komplexeket alkotnak. A riboszómák felületén történik a polipeptid láncok szintézise. Az RNS-ek szintézise nagyban hasonlít a DNS-szintéziséhez. A ribonukleotidok, ebben az esetben is a komplementer bázispárosodás elvének megfelelően épülnek be a szintetizált RNS

16 szálba. Egy kis különbség azért akad, az RNS szálban az adeninnel szembe nem timin, hanem uracil bázist tartalmazó nukleotid épül be. Az RNS már keletkezése során leválik a DNS templátról, a keletkezett RNS egyszálú marad, azonban az RNS szál hosszabb-rövidebb szakaszai képesek részleges bázispárosodásra az RNS-en belül, így az RNS-nek is kialakulhat harmadlagos szerkezete. Ez azonban nem annyira állandó, mint a fehérjék esetében, kivéve néhány speciális esetet (pl. trns-ek). Az eukariotákban az átíródott mrns még nem alkalmas arra, hogy róla fehérje-átíródás következzen be. Előbb ennek az elő, vagy pre-mrns-nek módosulnia kell. A módosulások a sejtmagban következnek be, a sejtmagot már csak az érett mrns-ek hagyják el. Lássuk milyen érési folyamatokon mehetnek keresztül az eukarióta sejtben frissen szintetizált RNS molekulák. Többnyire már a transzkripcióval egy időben a pre-mrns 5 végére kapcsolódik egy 7-metil guanilát nukleotid. Az 5 sapka elkészítése már akkor elkezdődik, amikor a készülő mrns 5 vége elhagyja az RNS polimerázt. A sapka az 5 exonukleázok ellen biztosít nagyfokú védelmet. A második fontos módosulás, hogy a transzkripció terminációja után az RNS 3 végéből levágódik egy rövidebb darab (kb. 20-50 nukleotid), majd poliadenilát-polimeráz enzim és ATP segítségével egy hosszú, maximum 250 nukleotidnyi poli-a farok szintetizálódik hozzá. A poliadenilát farok megnöveli az RNS stabilitását. A harmadik fontos poszttranszkripciós módosulás, az ún. splicing mechanizmusa. Az eukariota génekben az információ nem összefüggően, hanem szakaszosan tárolt. Az mrns-en az információt nem tároló részeknek (intronok) ki kell vágódniuk az információt tároló részek (exonok) közül. Az exon-intron határokat konszenzus szekvenciák jelölik. Bizonyos esetekben nem minden exon marad bent az érett RNS-ben, közülük néhány az intronokkal együtt kivágódik. Ezt a mechanizmust nevezzük alternatív splicingnak. A mechanizmus jelentősége abban áll, hogy ugyanarról a génről többféle fehérje íródhat át. A gének kifejeződését génexpressziónak hívjuk. Míg egy élőlény testi sejtjeinek DNS tartalma, azaz genomja, néhány kivételtől eltekintve ugyanaz, addig a különböző szövetek, sejtek génexpressziója nagymértékben különbözhet. Ez azt is jelenti, hogyha funkcionálisan különböző sejteket hasonlítunk össze, azokban teljesen eltérő expresszálódó géneket és ebből kifolyólag fehérjéket találhatunk. Ezt a folyamatot egy máig sem teljesen feltárt, igen bonyolult, többszintű szabályozómechanimus befolyásolja. Ennek egy fontos funkcionális egysége a gén 5 részén, azaz a géntől upstream (felfelé) elhelyezkedő promóter régió (4. ábra).

17 A legtöbb gén esetében a transzkripciós kontrol kiemelkedően fontos. Ez könnyen belátható, ha belegondolunk, hogy ez az egyetlen lehetőség, hogy a sejt ne gyártson felesleges RNS és fehérje köztitermékeket. Ez a szabályozás egy gazdaságos, de korántsem leggyorsabb módja. Érvényre juttatása több (vagy pont kevesebb) RNS szintézisét, azok érését és fehérjére történő lefordítását igényli. A teljes folyamat együttesen több órába, akár egy egész napba is beletelhet. A szabályozás lényege minden esetben az, hogy az RNS polimeráz DNS-hez kötését, a transzkripciós iniciációs komplex összeszerelődését gátolják, vagy segítik különböző a DNShez kapcsolódni képes fehérje faktorok, ezáltal kevesebb, vagy több RNS és fehérje képződik 4. ábra. A génexpresszió vázlata A DNS a promóter és a stopkodon között íródik át RNS-be, melyből aztán a splicing során kivágódnak az intronok, majd egyéb módosításokkal érett transzkriptum jön létre. Ez alapján fog elkészülni a fehérje. 1.2.4. Transzláció A transzkripció, majd az érés során elkészült mrns nukleotid sorrendje pontosan meghatározza a fehérjék aminosav sorrendjét. A génekben kódolt genetikai tartalom fehérjék nyelvére történő lefordítását nevezzük transzlációnak. Az élőlények fehérjeláncai 20-féle aminosavból állnak. Ezek kódolására nem elegendő az RNS-ben található 4-féle nukleotid. Ha 2 egymás melletti nukleotid kódolna egy aminosavat, akkor is csak 4x4=16 féle lehetőségünk lenne. Azonban ha 3 nukleotidos kódot

18 használunk, akkor 64-féle variáció áll rendelkezésünkre, ami bőven elegendő a 20 aminosav kódolására. Tehát 3 nukleotidnyi ún. triplet kódolja 1 aminosav beépülését. Az mrns-en lévő tripleteket ezért kodonoknak hívjuk. Mivel 64 lehetőségre mindössze 20 aminosav esik, lesz olyan aminosavunk, amelyet majd többféle kodon is kódol. Ezt úgy hívjuk, hogy a genetikai kód degenerált. Ismert aminosav sorrendből tehát nem fogjuk tudni megmondani, hogy pontosan milyen volt az őt kódoló gén nukleotid sorrendje. A 64-féle kodonból 3 nem kódol aminosavat, ezek az ún. STOP kodonok, ezeknél a részeknél a fehérjeszintézis leáll. A kodonok az egész élővilágban ugyanazokat az aminosavakat kódolják (nagyon kevés kivétellel), ami bizonyítja az összes élőlény közös eredetét. A mitokondriumokban és a színtestekben a saját genetikai állomány mellett saját fehérjeszintetizáló apparátus is működik. Ezen két sejtorganellumban a genetikai kódszótár eltér az univerzális genetikai kódszótártól. A keletkezett fehérjék gyakran további transzlációt követő (poszttranszlációs) módosulásokon mehetnek keresztül. Ezek során cisztein oldalláncuk oxidálódhat (intramolekuláris diszulfid hidak alakulnak ki), felvehetnek ionokat, prosztetikus csoportokat, glikozilálódhatnak, mirisztilálódhatnak, proteolitikusan hasítódhatnak, stb. Ezek a módosítások hozzájárulnak a megfelelő funkció ellátásához szükséges térszerkezet elnyeréséhez. 1.3. Javasolt irodalom Lénárd Gábor: Biológia 12. Nemzetek Tudása Tankönyvkiadó Zrt. 2007.

19 2. A GENETIKAI INFORMÁCIÓ ÁTADÁSA László Valéria Az élőlények felépítését és működését a bennük található genetikai információ a környezettel való kölcsönhatás során határozza meg. Ennek a DNS-ben tárolt információnak az átadása eltérő módon valósul meg egy szervezeten belül, illetve a generációról generációra történő átadás során. Az előbbi esetben az a cél, hogy az információátadás hiánytalanul és hibátlanul történjen, ugyanakkor a következő nemzedékre történő átadás során a genetikai információ mennyiségének változatlansága mellett a variabilitás fokozása a cél, legalábbis a magasabb rendű élőlények esetében. Először a szervezeten belüli, sejtről sejtre történő információátadással foglalkozunk. 2.1. A SEJTCIKLUS ÉS SZABÁLYOZÁSA A genetikai információ (DNS) sejtről sejtre egy adott szervezeten belül, a sejtciklus során adódik át. A sejtciklusban a sejtek megkettőződnek, majd kettéosztódnak. Különbséget kell azonban tennünk a sejtmagban és a citoplazmában történő események között. A sejtmag DNS-e nagyon pontosan és szabályozottan duplikálódik, majd kromoszóma formában kettéosztódik, aminek az lesz a következménye, hogy osztódással két, genetikailag azonos sejt keletkezik. Kevésbé szigorúan szabályozott a citoplazma megkettőződése, lényegében növekedése, majd kettéosztódása. A sejt anyagainak megkettőződése az interfázisban történik, amelyben a G 1 (preduplikációs, a DNS megkettőződését megelőző), az S (DNS szintézis) és a G 2 (posztduplikációs) szakaszokat különítjük el. Az M fázisban először a kromoszómák osztódnak ketté, ez a mitózis, amit a citoplazma kétfelé osztódása, azaz a citokinézis követ. Sokszor ezt a két szakaszt együtt nevezik mitózisnak. A soksejtű szervezetek sejtjei igen eltérő intenzitással osztódnak, a sejtek nagy része ún. G 0 szakaszban van, ahol se osztódás, sokszor még növekedés sincs. Ahhoz hogy a sejtek újból belépjenek a G 1 szakaszba, ún. növekedési faktorokra és/vagy más sejtekhez vagy az extracelluláris mátrixhoz történő letapadásra van szükségük.

20 A sejtciklusban egy nagyon bonyolult irányító, vezérlőrendszer működik, amelynek alapvető komponensei a ciklin dependens (függő) protein kinázok, a Cdk-k. Nevüket az aktivitásukhoz szükséges ciklinekről kapták. Ez utóbbiak mennyisége a sejtciklus során periódikusan, ciklikusosan változik. A ciklin-dependens kinázok aktivitását a megfelelő ciklinszinten kívül még más tényezők is befolyásolják. Ezek közé tartoznak a Cdk-aktiváló és -gátló kinázok, amelyek a Cdk-okat foszforilálják. Az aktiváló kináz hatására foszforilálódott Cdk aktív, a gátló kináz által foszforilált viszont inaktív lesz. Ezeket a foszfátcsoportokat foszfatázok távolítják el, értelemszerűen az előbbi eltávolítása gátolja, az utóbbié pedig serkenti az enzim működését. Egy másik csoportja a fehérjéknek, a ciklin dependens kináz gátlók, nevükből adódóan gátolják az enzim működését. A Cdk-ok működése igen sokrétűen szabályozható még a fentieken kívül is. Mindegyik, már említett fehérje expressziója szabályozható a transzkripció és a transzláció szintjén, és természetesen a proteaszómában történő lebontás, illetve az azt megelőző ubiquitinálás szintjén is. Ez teszi olyan hihetetlenül bonyolulttá, de egyben rendkívül finoman szabályozhatóvá a sejtciklust. A ciklin dependens kinázok különböző célfehérjék foszforilálásán keresztül irányítják a sejtciklust. Az utóbbi években mutatták ki, hogy a ciklin dependens kinázokon kívül még más kinázok is (pl. Polo, Aurora stb.) szerepet játszanak a sejtciklus regulációjában. A sejtciklus szakaszai nem cserélhetők fel, szigorú sorrendben követik egymást. Az, hogy tovább lehet-e lépni az egyik szakaszból a másikba, az ún. ellenőrzési pontoknál dől el. Az ellenőrzés célja, hogy valóban genetikailag azonos sejtek keletkezzenek az osztódás során (1. ábra).

21 1. ábra. A sejtciklus fázisai (G 1, S, G 2, M) és ellenőrzési pontjai (G 1, G 2, M). Az irányító rendszer csak abban az esetben engedi folytatni a sejtciklust, ha az ellenőrző pontokon semmilyen hiba nem állítja meg a folyamatot. Az ellenőrzés három fő ponton történik. Az első a G 1 fázis végén van, ez a G 1 ellenőrzési pont (magasabb rendűekben restrikciós pontnak nevezik), ahol elsősorban a DNS épségét ellenőrzi a rendszer. A második ellenőrzési pont a G 2 fázis végén van, ez a G 2 ellenőrzési pont, ahol ismét a DNS sértetlenségét, valamint a megkettőződés hibátlanságát ellenőrzi a rendszer. Végül az M ellenőrzési pont az osztódás metafázisában van, ahol az a kérdés, hogy vajon pontosan rendeződtek-e a kromoszómák az egyenlítői síkban, azaz hogy pontos lesz-e a kromatidák szétválása. A sejtciklus csak akkor folytatódik, ha a DNS nem sérült, pontosan duplikálódott és a kromoszómák megfelelően helyezkedtek el az egyenlítői síkban. És most röviden összefoglaljuk a soksejtűekre jellemző sejtciklus folyamatait és azok szabályozását.

22 2.1.1. G0 G1 átmenet Mivel a felnőtt soksejtű szervezetekben a legtöbb sejt G 0 szakaszban van, a sejtciklusba vissza kell térnie a sejtnek. Ez lényegében a G 1 -ben R, azaz restrikciós ponton való átjutást jelenti. A restrikciós pont előtt különböző környezeti hatások érik a sejteket. Amennyiben ekkor megfelelő extracelluláris mátrix komponens és vagy növekedési faktor stimulus éri a sejtet, akkor az addig hiányzó ciklin: a ciklin D átírása és transzlációja is megnő, ugyanakkor néhány Cdk-gátló mennyisége viszont lecsökken úgy, hogy elsősorban a proteaszómában való lebomlásuk fokozódik. Ezek a Cdk-gátlók a p16, p15, p18 és p19 és jellemzőjük, hogy specifikusak, kizárólag a Cdk4 és a Cdk6 működését gátolják, oly módon, hogy megakadályozzák a D ciklin kötődését, de a már kialakult a komplexnek az aktivitását is gátolják. Az aktív Cdk4/6- D ciklin komplex legfontosabb szubsztrátja a prb (retinoblasztoma, a retina tumoros megbetegedését okozó gén terméke) és a p107, valamint a p130 fehérjék. Foszforilálatlan állapotban ezek mindegyike megköti az E2F-eket, a folyamatban központi szerepet betöltő transzkripciós faktor család tagjait. A prb és a másik két fehérje térszerkezete a foszforilálódás hatására úgy változik meg, hogy elengedik az átírást serkentő E2F proteineket. Ez a foszforilálódás jelenti a sejtciklus restrikciós pontján való átlépést. Az E2F család tagjai ezután számos, az S fázisba lépéshez szükséges, illetve arra jellemző gén transzkripcióját indukálják. Ilyenek pl. az E ciklin, az A ciklin, a timidin kináz, a DNS polimeráz stb. Az E ciklin a Cdk2-vel kapcsolódik és a Cdk4/6-D-ciklinhez hasonlóan az Rb proteint foszforilálja elsősorban (pozitív visszacsatolás). Az A ciklin a Cdk2-vel kapcsolódva viszont nélkülözhetetlen az S fázis beindításához (2. ábra). A külső környezeti hatások természetesen kedvezőtlenek is lehetnek, ilyen pl. a hipoxia (nagymértékű sejtproliferáció esetén a sejtek vérellátása nem megfelelő), vagy a DNS sérülését okozó tényezők (itt van a már említett G 1 ellenőrzési pont, aminek a működésére még visszatérünk). Ezekben az esetekben, a sejtekben nagy mennyiségben mutatható ki aktív p53 fehérje, ami szintén egy transzkripciós faktor, és fokozza egy másik, általános Cdk gátló fehérjének, a p21-nek az átíródását. A p21 viszont gátolja mindegyik, G 1 fázisban jelen lévő Cdk komplex (a Cdk4 6-D ciklin, a Cdk2-E ciklin és a Cdk2-A ciklin) aktivitását is, tehát nem engedi a sejtet az S fázisba lépni. Ennek az általános Cdk-gátló családnak van még két ismert tagja, a p27 és a p57. Ezek

23 a proteinek megakadályozzák a hibás DNS megkettőződését, felfüggesztik a sejtciklust, lehetővé téve a hiba kijavítását. Röviden, meggátolják, hogy genetikailag különböző sejteket eredményezzen a sejt osztódása (2. ábra). 2. ábra. Összefoglaló ábra a G 0 fázisból a sejtciklusba való visszatérés feltételeiről és a visszatérés gátlásáról. A fentiekben említésre került a két legismertebb tumorszuppresszor géntermék. Az egyik a p53, amelynek a hiánya vagy nem funkcióképes formája a tumorok felében kimutatható. A tumorok kialakulásának másik gyakori oka az rb gén recesszív mutációja. Lényegében az összes felsorolt Cdk-gátlót kódoló gén a tumorszuppresszorok közé tartozik, hiszen mindegyik gátolja a Cdk-k aktivitását, és így a sejt osztódását. 2.1.2. G1 S átmenet, S-fázis Az S fázis legfontosabb eseménye a sejt DNS-ének a megkettőzése, replikációja. Mivel az eukariótasejtekben igen nagy mennyiségű DNS van a prokariótákhoz képest, egy kromoszómán belül több helyen található origó, ahonnan egyszerre indul el mindkét irányba a replikáció. Ide kötődnek az iniciációs fehérjék, a DNS szétcsavarodik, majd a

24 replikációs komplex többi tagja is bekapcsolódik. Ezek számos, csak részben ismert fehérjéből álló komplexek. Mint az egész sejtciklus alatt, ebben a lépésben is a ciklin dependens kinázok játsszák a fő szerepet. A Cdk2-E-ciklin komplex aktiválásához szükség van a jelen lévő Cdk-inhibitor, a p27 lebontására, amit egy ubiquitin-ligáz, az SCF (Skp-Cullin-F-box protein) végez. Végül az aktivált Cdk2-k (és egy másik proteinkináz, a Cdc7) foszforilálják a replikációs komplex még pontosan nem ismert tagjait. Ez a hatás egyúttal meggátolja az újabb iniciációs komplexek kialakulását, illetve kötődését. Ennek a lépésnek az a jelentősége, hogy biztosítja, hogy csak egyszer duplikálódjon a DNS. A DNS-megkettőződés vagy -replikáció során a DNS mindkét szála mintaként, templátként szolgál, és a komplementaritásnak megfelelően épülnek be a nukleotidok a képződő láncba. Rádioaktív izotóppal jelzett monomerekkel végzett vizsgálatokkal igazolták a szintézis szemikonzervatív voltát, tehát azt, hogy a szintézis után keletkezett két molekulában az egyik szál mindig a régi, a másik pedig az újonnan készült. A bázispárosodás egyértelműsége miatt így a keletkező két DNS szükségszerűen megegyezik egymással. A S-fázisban azonban nem csak a DNS kettőződik meg, hanem a hisztonok és a kromatin egyéb fehérjéi is illetve az új DNS szálon kialakul a metilmintázat, amely megegyezik a templát DNS metilációs mintázatával (Lásd Epigenetika fejezet.) 2.1.3. G2 M átmenet A G 1 S átmenetnél jobban ismert a G 2 M átmenet szabályozása, az MPF kialakulása, aktiválódása és működése. Az MPF (maturation (vagy mitosis) promoting factor) egy ciklinfüggő kináz, a Cdk1 és a B ciklin komplexe, amelynek az aktiválásához további poszttranszlációs modifikációkra (fehérjeszintézis utáni átalakítások) van szükség. Ezek a következők: az inaktív MPF két, egy gátló és egy aktiváló kináz szubsztrátja, amelyek közül az előbbi tirozinon, az utóbbi treoninon foszforilálja az MPF-et. Ezután a még mindig inaktív MPF-ről egy foszfatáz (a CDC25 géncsaládba tartozó gén terméke) lehasítja a gátló kináz által felrakott foszfátcsoportot, és ezzel válik funkcióképessé, aktívvá az MPF (3. ábra).

25 3. ábra. Az aktív MPF kialakulása. A Cdk1-hez először a B ciklin kapcsolódik, majd a komplexet két, egy aktiváló és egy inaktiváló kináz foszforilálja. A még mindig inaktív MPF-ről egy foszfatáz lehasítja az inaktiváló foszfátcsoportot és így létrejön az aktív MPF. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk28366/figure/a4636/?report=objectonly 2013. 02. 20. Az MPF-nek számos szubsztrátja van, ezek közül a legelső a már említett Cdc25 fehérje, tehát az a foszfatáz, amelyik működése révén aktiválódik az MPF. Így ebben a folyamatban egy pozitív visszacsatolás típusú szabályozás során egyre több MPF aktiválódik. Emlőssejtekben három foszfatáz közül, Cdc25A, B és C, ezen a ponton az utóbbi működik. Ezután az MPF stimulálja a sejt M fázisba való lépését számos célfehérje foszforilációján keresztül. Először is foszforilálja a lamina fibrosa A, B és C laminjait, ennek következménye lesz a sejtmaghártya lebomlása. Az aktomiozin ATP-ázát is foszforilálja, ami az enzim aktivitását gátolja, így megváltozik a mikrofilamentumok elrendeződése is, aminek a sejt jellegzetes morfológiai megváltozása, a lekerekedés lesz a következménye és meggátolja az idő előtti citokinézist. A kromoszómák kondenzációját a kondenzinek foszforilálódása váltja ki. A hisztonok közül a H1 és a H3 is foszforilálódik. Közvetett módon ugyan, de az APC is aktiválódik a G 2 M-fázisátmenetben. Az MPF szubsztrátjai a MAP-ok (mikrotubulusokhoz asszociált proteinek) is. Ezek megváltozása eredményezi a sejt mikrotubulus rendszerének az osztódó sejtre jellemző átalakulását, tehát a mitotikus orsó megjelenését.

26 A G 2 M átmenet, az MPF aktivációja csak akkor lehetséges, ha az itt működő ellenőrzési rendszer a DNS-t és annak duplikációját hibátlannak találta. 2.1.4. M-fázis Az M-fázis, csakúgy, mint az interfázis, egy összetett folyamat, egymást követő lépések, események sorozatából áll, de néhány jellegzetes, morfológiailag is elkülöníthető szakaszra szokták bontani. A mitózis alatt a sejt DNS-ének kromoszóma formájában való kettéosztódása, az azt követő citokinézisben pedig a citoplazma feleződése történik. A mitózis szakaszai és eseményei röviden a következők: Profázis. A legfontosabb változás a sejtmagban történik, ugyanis a sejtmag kromatinállományából fokozatosan kialakulnak a kromoszómák. Ez a DNS maximális spiralizálódását jelenti. Mivel az M-fázist megelőzően a DNS replikálódik, minden kromoszóma két kromatidából (testvér vagy sister kromatidákból) áll. A citoplazmában pedig a szintén megkettőződött centroszóma (sejtközpont) kettéválik, a sejt két ellenkező pólusára kezd vándorolni, és megkezdődik a mikrotubulusokból álló mitotikus orsó kialakulása. Prometafázis. Eltűnik a sejtmagvacska, a kromoszómák kialakulása tovább folyik. A sejtmaghártya vezikulumokra esik szét. A kromoszómák centromér régiójánál megjelenik a kinetokor, kromatidánként egy. Ehhez kapcsolódnak a mikrotubulusok közül a kinetokor mikrotubulusok. A másik két fajta mikrotubulus, az asztrális és poláris is kialakul. Metafázis. A kinetokor mikrotubulusok közreműködésével a kromoszómák a sejt egyenlítői síkjába rendeződnek. A kinetokor régiók a sejt két pólusa felé néznek, a mikrotubulusok mindegyik kromoszómához, mindkét centroszóma irányából kapcsolódnak. Anafázis. A kromoszómák kromatidái kettéválnak, a sejt két pólusa felé vándorolnak. Az anafázis elején (anafázis A), a kromatidák egymástól való eltávolításában a kinetokor mikrotubulusok, a végén (anafázis B) pedig a poláris mikrotubulusok játszanak szerepet. Ez a fázis a mitózis legrövidebb szakasza.

27 Telofázis. A kinetokor mikrotubulusok eltűnnek, a sejt két pólusára került kromatidák, ill. utódkromoszómák körül megjelenik a sejtmaghártya. A kromoszómák despiralizálódásával ismét kromatinállomány alakul ki. Kialakulnak a magvacskák. A poláris mikrotubulusok még jobban megnyújtják a sejtet. A mitózis után nézzük a: Citokinézist. A citoplazma befűződése az anafázis végén kezdődik, és a telofázisban válik nyilvánvalóvá. A sejt közepénél, a mitotikus orsó tengelyére merőlegesen egy befűződés keletkezik, ami egyre mélyül, és így egyre szűkül a kapcsolat a két sejtfél között. A poláris mikrotubulusok átfedő régiójának a maradványából az ún. középtest (midbody) jön létre. Végül a sejt citoplazmája teljesen kettéválik, és a centroszómák irányításával az interfázisra jellemző mikrotubulus rendszer keletkezik. Az előzőekben röviden ismertetett folyamatokat most részletesebben is tárgyaljuk. 2.1.4.1. A kromoszóma szerkezete Ahhoz, hogy az eukarióták nagy mennyiségű, több cm hosszú, megkettőződött DNSe pontosan, törés nélkül megfeleződjön, kromoszómákba (néhány m hosszúságúak) kell rendeződnie. Eközben a DNS hossza eredeti hosszúságának tízezredére csökken. Azt, hogy ez pontosan hogyan is történik, még nem ismerjük. Az alábbiakban egy olyan modellt ismertetünk, amelynek bizonyos pontjai már bizonyítást nyertek (4. ábra).