A sejtciklus és szabályozása

Átírás

1 A sejtciklus és szabályozása április 21. Lippai Mónika

2 Az osztódó sejt élete sorá egkülö öztethető az M-fázis (mitózis és citokinézis) és az interfázis szakasza Már korai fénymikroszkópos vizsgálatok során is felismerték, hogy a sejt élete során elkülö íthető fázisok va ak.

3 A sejt élete során a kromoszómák állapota periodikusan változik: a kromoszóma-ciklus zöld: mikrotubulus kék: kromoszóma piros: kinetochor interfázis profázis prometafázis metafázis anafázis telofázis

4 Míg a sejt RNS- és fehérjetartal a fol a atosa ő az interfázis során, DNS-tartalmának duplázódása az interfázison elül eg köz ülső időszakhoz, az -fázishoz köthető

5 A sejtciklus során a sejt DNS-tartalma (C) változik G 1 S G 2 M DNS replikáció citokinézis mitózis 2C 4C 2C C: a haploid sejt (például az ivarsejt) DNS-tartalma

6 Citoplazma-ciklus: a sejtciklus során a sejtméret is ciklikusan változik Sejttérfogat Csökkentett tápanyag-ellátottság Az osztódást a sejt térfogata is befolyásolja. Ha a sejt elért egy bizonyos, az adott sejttípusra jelle ző éretet, osztódhat. Ehhez egfelelő tápanyagellátás és növekedési faktorok jele léte kell. A egfelelő éret azo a sak szükséges, de nem elégséges feltétel: ha valami nincs rendben a sejtben (pl. sérült a genom), normális körülmények között nem osztódhat a sejt.

7 A sejt méretét befolyásoló faktorok Haploid wee (kináz) Cdk1 (kináz) Tetraploid A fehérje B fehérje osztódás növekedés: A fehérje B fehérje mennyisége csökken (kihígul) osztódás Tetraploid szalamandrák utóagyában a sejtek jóval nagyobbak, mint a haploidokban Hasadóélesztők wee mutánsai kisebbek, mert túl hamar osztódnak

8 A sejtciklus-szakaszok időtarta á ak eghatározása G2 G2 S Az S fázis a levő sejtek DN -ének megjelölése 3 H-timidinnel

9 A sejtciklus-szakaszok időtarta á ak eghatározása G2 G2 G2 + M G2 + M + S stb.

10 Az eukarióta sejt ciklusának tipikus fázisai és átlagos hosszuk sejttenyészetben M-FÁZIS INTERFÁZIS M-FÁZIS INTERFÁZIS M-FÁZIS 1 óra M-fázis: mitózis + citokinézis 4 óra 11 óra 24 óra 8 óra

11 A centroszóma-ciklus

12 A centroszóma-ciklus Interfázis centroszóma egy centriólum párral mindkét centroszóma mikrotubulusok képződésének kiindulópontja G 1 centriólum szeparálódás a centriólum replikáció kezdete G 1 S G 2 Profázis Sejtmag centroszóma szeparáció Profázis Metafázis Kialakul az Anafázis Telofázis orsórendszer mikrotubulusok asztrális mikrotubulusok poláris mikrotubulusok A centroszómák távolodnak, a sejt megnyúlik (közben a kromatidák is szeparálódnak) (Az ábrán a kromoszómák nincsenek feltüntetve)

13 Milyen mechanizmusok, mely gének teszik lehetővé a övekedési/osztódási fol a atok összehangolását? A sejtciklus szabályozása

14 E lőssejtek vizsgálatához: szi kro izált sejttenyészet készítése szükséges Sejt interfázisban Sejt mitózisban Tápoldat Mitotikus lerázás Sejtek mitózisban Gyakori módszer ma: - a mikrotubulusok dinamikájának gátlása (metafázis-blokk) - tápanyag-megvonás (G1-fázis blokk)

15 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata I: ejtfúziós kísérletek e lőssejtekkel S G 1 S G 2 G 1 G 2 G 1 azonnal S-be megy A G 2 marad, bevárja az S-t, majd együtt M-be A G 2 marad, bevárja G 1 -et, és együtt M-be S fázisban van valami, ami a G 1 -fázisú sejtet ei dítja A G 2 -es sejt nem replikálja újra a DNS-ét. Ugyanakkor nem is lép a maga idejében M-fázisba valami akadályozza ebben A G 2 -es sejt nem replikálja újra a DNS-ét. Ugyanakkor nem is lép M-fázisba valami akadályozza ebben re-replikációs blokk és G 2 /M kontroll pont

16 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata I: ejtfúziós kísérletek e lőssejtekkel M G 1 M S M G 2 A G 1, az S és a G 2 sejtek is M-be mennek. MPF = Mitosis Promoting Factor van jelen a citoplazmában

17 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: két élesztőgo afaj élet iklusa Diploid sejtek Idő ké t a diploid sejtjek is szaporodnak Meiózis és spóraképzés Meiózis (általában rögtön a spórák kihajtása után) Konjugáció (általában rögtön a spórák kihajtása után) Konjugáció A spórák kihajtanak A spórák kihajtanak Idő ké t a haploid sejtjek is szaporodnak Haploid sejtek Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Eg sejtű, de eukarióta szervezetek. Haploid formában is szaporodnak a recesszív mutációk által okozott fenotípus is megjelenik

18 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: hő érséklet-érzéke élesztő utá sok A sejtciklust befolyásoló faktorokat kódoló géneket mutációk indukálásával el lehet rontani, és haploid ge o al re delkező sejtek e hatásuk azo al látszik. Azonban az ilyen mutáció, ha letalitást okoz, nem tartható fenn. Kondicionális mutánsok izolálásával elérhető, hog a fenotípus csak restriktív körülmények között jelenjen meg. Ha ekkor a sejtciklus valamely fázisában egakad a sejt, e e ol a gé ro lott el, a el ek ter éke szükséges lenne a ciklus folytatásához. Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008

19 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: sejt iklust sza ál ozó gé ek utá iójá ak izolálása élesztő e G 2 /M kontroll pont cdc (cell-division-cycle) mutáns Mi az ép cdc + funkciója? G 1 /S kontroll pont

20 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: módszer cell-division-cycle (cdc) mutánsok izolálására Kondicionális letális mutáns Élesztősejtek mutagenezise Mesterlemez permisszív hő érséklete Replika restriktív hő érséklete Kondicionális letális mutáns-g űjte é

21 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: gének izolálása hő érséklet-érzékeny cdc mutánsok alapján Plazmidok az élesztőge o különféle szakaszaival Mutáns cdc allél Az ép cdc + gén TRANSZFEKCIÓ haploid sejt A mutáns sejtek restriktív körülmények között nem osztódnak parciális diploid sejt Restriktív körülmények között csak a plazmidban az ép cdc + gént hordozó sejtek osztódnak

22 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata II: gének izolálása hő érséklet-érzékeny cdc mutánsok alapján Plazmidok ép élesztő DN szakaszokkal Egyfajta cdc mutáns sejtek tenyészete Élesztősejtek restriktív hő érséklete Restriktív körülmények között csak azok a sejtek osztódnak, amelyekben a plazmid éppen a egfelelő, ép cdc + gént hordozza Ezeket a sejteket felszaporítják, előlük plazmidot izolálnak. A plazmidokból izolálják az ép cdc + gént

23 A sejtciklus szabályozásának vizsgálata III: Xenopus petesejt vizsgálata (nagyok, szinkronizáltak) Petesejt Sejtmag Progeszteron ÉRÉS Meiózis I Pete Megtermékenyülés AKTIVÁLÓDÁS Diploid sejtmag Embrió Osztódások A petesejt az 1. meiotikus osztódás G 2 fázisában vesztegel Citoplazma injekció M fázisú sejt ől Sejtmag Az első meiotikus osztódás M fázisa Sarki test Magorsó képződik A petesejt a 2. meiotikus osztódás M fázisában vesztegel Sarki test Citoplazma injekció interfázisos sejt ől Zigóta interfázisban Petesejt G 2 fázisos petesejt A petesejt M fázisba jut A petesejt G 2 fázisban marad

24 M-fázisú petesejtben: Maturation Promoting Factor = Mitosis Promoting Factor, MPF!!

25 Te geri sü ől izolálták az első olyan fehérjét, amely szintje követi a sejtciklust ciklinek 1. osztódás 2. osztódás idő Fehérjék osztódó sejtek ől gélelektroforézissel szeparálva

26 Nobel-díj 2001: for their discoveries of key regulators of the cell cycle". Leland H. Hartwell Tim Hunt Paul Nurse pékélesztő tengeri sün hasadóélesztő

27 Az MPF ciklikus aktivitást mutat, ami összhangban van a ciklin B koncentrációjának növekedésével MITÓZIS INTERFÁZIS MITÓZIS INTERFÁZIS MITÓZIS Relatív koncentráció MPF ciklin B A sejtfúziós, genetikai és biokémiai vizsgálatok közös eredményre vezettek: az MPF egyik komponense a ciklin B d evű, minden sejtciklus végén lebomló, majd újra szintetizálódó fehérje, másik komponense egy ciklin dependens kináz (CDK1, = d, a el aktivitása függ a ikli B jele lététől. Idő

28 A CDK ciklinnel komplexet képezve aktiválódik, és foszforilálja specifikus célfehérjéit

29 Többféle ciklin va, eltérő expressziós mintázattal. Minden sejtciklus során újra szintetizálódnak, majd lebomlanak

30 Élesztők e eg etle CDK található, a el a sejt iklus eg es stádiumaiban más- ás ikli hez köt eltérő ese é eket indít el ciklin B MITÓZIS MPF MPF : CDK+ciklin B SPA : CDK+ciklin D CDK CDK (ciklin dependens kináz) (Az ábrán csak az SPA -nak és az MPF - ek egfelelő ko ple ek szerepelnek) SPA REPLIKÁCIÓ ciklin D

31 Gerincesekben négyféle CDK található, amelyek a sejtciklus külö öző stádiu ai a képez ek aktív ko ple et PA MPF

32 A sejt iklus elle őrzési po tjai Az összes DNS replikálódott? Megfelelőek a körül é yek? G2/M kontrollpont BELÉPÉS A MITÓZISBA Minden kromoszóma ikrotubulushoz kötődött? Metafázis-anafázis átmenet ANAFÁZIS MEGKEZDÉSE; CITOKINÉZIS BELÉPÉS A SEJTCIKLUSBA, S-FÁZIS KEZDETE Start/restrikciós pont Megfelelőek a körül é yek? Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008

33 A G1 fázisban nincs CDK-aktivitás, a sejt addig nyugalomban marad, amíg mitogén jelet nem kap az osztódásra génszabályozó fehérje aktiválódása génexpresszió BELÉPÉS A SEJTCIKLUSBA, S-FÁZIS KEZDETE Start/restrikciós pont Megfelelőek a körül é yek? CDK4- ciklind génszabályozó fehérje génexpresszió Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008

34 A CDK4-ciklinD komplex aktiválódása a sejtosztódást gátló Rb (retinoblasztóma) fehérje gátlódását eredményezi Az Rb inaktiválódása olyan CDK-ciklin komplexek kialakulásához vezet, amelyek beindítják az S fázist, a DNS replikációját. A pozitív visszacsatolások gyors és éles G1-S-fázis átmenethez vezetnek. Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008 aktív Rb fehérje inaktív E2F fehérje aktív CDK4/ ciklind aktív E2F fehérje S-fázis gének átíródása aktív CDK2/ cikline cikline ciklina aktív CDK2/ ciklina DNS SZINTÉZIS inaktív Rb fehérje

35 A re-replikációs blokk: a DNS-szintézis egy cikluson belül e kezdődhet újra replikációs kezdőpo t jogosító faktor komplex A G1 fázis elején kialakulhat a jogosító faktor komplexe Cdk2/ ciklina Kezdődik a replikáció; ezen a cikluson belül nem alakulhat ki újra a jogosító faktor, mert egyes elemei lebomlanak vagy kikerülnek a sejtmagból jogosítófaktor proteolízis exportálódik a sejtmagból ORC origi re og itio o ple : felis eri és kötődik a DN -en a replikációs origóhoz G1 fázisban (amikor i s CDK aktivitás. Ezutá kötődhet hozzá a jogosító faktor komplex többi eleme, köztük Mcm fehérjék: helikáz-aktivitás!

36 A sejt csak akkor kezdheti el a mitózist, ha a DNS replikálódott, és teljesen ép - ez a G 2 /M kontrollpont legfontosabb feladata Az összes DNS replikálódott? Megfelelőek a körül é yek? G2/M kontrollpont BELÉPÉS A MITÓZISBA DNS károsodás p53 DNS reparáció p21 Sejtciklus feltartóztatás Apoptózis Genom-integritás egőrzése DNS-károsodás esetén a p53 nemcsak a G 2 /M, hanem a G 1 /S határon is megállíthatja a sejtciklust, ott a CDK4-ciklin D komplex aktiválódását gátolva. Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008

37 A p53 DNS-károsodás hatására stabilizálódik, és CDK-gátló fehérje p képződését serke ti Mdm2 DNS [ ATM/ATR, majd Chk1/Chk2 kináz aktiválódik ] DNS-sérülés p53 proteolízis (ubiquitinálódik, proteaszómákhoz irányítódik) p53 foszforilálódik TRANSZKRIPCIÓ TRANSZLÁCIÓ stabil, aktív p53: aktiválja a p21 gén átírását p21 gén p21 mrns p21 (CDK gátló fehérje) aktív CDK2- ciklin E/A inaktív CDK2- ciklin E/A Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008

38 Belépés a mitózisba: a CDK1-ciklinB komplex aktiválódása M-FÁZIS INTERFÁZIS M-FÁZIS INTERFÁZIS M-FÁZIS Relatív koncentráció aktív CDK1- ciklinb komplex ciklinb Idő Bár a ciklinb e isége fokozatosa ő, a CDK pedig fol a atosa jele van a sejtben, komplexük aktivitása mégis hirtelen emelkedik meg. Miért?

39 Belépés a mitózisba: a CDK1-ciklinB komplex aktiválódása CDK-gátló foszfátcsoport (gátló kináz) CDK-aktiváló foszfatáz CDK-aktiváló foszfátcsoport (aktiváló kináz, CAK) A CDK1- ikli B ko ple g ors és ag e iségű aktiválódása aktiváló és gátló enzimek (kinázok, foszfatázok eg ütt űködésével törté ik.

40 Belépés a mitózisba: a CDK1-ciklinB komplex aktiválódása inaktív foszfatáz ciklinb gátló foszfátcsoport CDK-aktiváló kináz CDK1 inaktív CDK1-ciklinB CDK-gátló kináz aktiváló foszfátcsoport inaktív CDK1-ciklinB aktív CDK1- ciklinb A CDK1- ikli B ko ple g ors és ag e iség e törté ő aktiválódása aktiváló és gátló e zi ek eg ütt űködésével és pozitív vissza satolás révén történik. (A cdc25 foszfatázt kezdet e valószí űleg a CDK -ciklina aktiválja). Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008

41 A CDK1-ciklinB komplex váltja ki a mitózis valamennyi kezdeti lépését kromatin tömörülése (hiszton H1, condensin komplex foszforilálása) felbomlik a maghártya (laminok és a póruskomplex fehérjéinek foszforilálása) mikrotubulus-hálózat átszerveződése agorsó (mikrotubulus-asszociált fehérjék (MAP-ok), motorfehérjék, centroszóma-fehérjék foszforilálása) profázis prometafázis a kinetochor a mikrotubulusokkal kapcsolódik (MAP-ok és kinetochor-fehérjék foszforilálása) metafázis

42 Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008 A mitózis csak akkor lép az anafázis szakaszba, ha valamennyi kromoszómában a kinetochorok az ellentétes pólusok irá á a ekötődtek Minden kromoszóma ikrotubulushoz kötődött? Metafázis-anafázis átmenet ANAFÁZIS MEGKEZDÉSE; CITOKINÉZIS INSTABIL INSTABIL INSTABIL STABIL

43 Az anafázis kezdetekor aktiválódik az Anaphase Promoting Complex (APC), amely ubikvitin ligázként proteaszomális bontásra ítéli célfehérjéit aktiváló alegység (cdc20) inaktív APC ciklinb poliubikvitin lánc CDK1 aktív APC ubikvitin ciklinb lebomlik Az aktiváló alegység csak akkor kapcsolódik az APC-hez, ha valamennyi kinetochorhoz mikrotubulus kapcsolódott, és a sejt a leánykromatidák között széthúzó erőt érzékel ekkor egszű ik az aktiváló aleg ség gátlása. Az aktív APC komplex a proteaszómához irányítja a ciklinb-t egszű ik az MPF-aktivitás. Ugyanakkor serkenti a kromatidákat összetartó fehérjék bontását elkezdődhet az a afázis! Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008

44 Alberts: Molecular Biology of the Cell, 2008 Az APC hatására lebomlanak a kromatidákat összetartó cohesin fehérjék, íg a ikrotu uláris húzófo alak e té kezdődhet a szétválás az anafázis [securin] aktiváló alegység [inaktív separase] a securin lebomlik inaktív APC aktív APC [cohesin complex] CDK1- ciklinb aktív separase felaprított cohesinek

45 Összefoglalva: a sejtciklust ciklinek, kinázok, foszfatázok és ubikvitin ligázok összjátéka irá ítja A sejt iklus eg es résztvevői: - a következő stádiu ot irányító komplexet aktiválják. Ciklinjének szintézisét serkentik, és hozzájárulnak a komplex CDK-jának aktiválásához (pl. gátlófehérje inaktiválásával). Ez nem igaz az APC-re, mert ez leállít minden ciklin-aktivitást a sejt G1-ben marad mindaddig, míg osztódásra jelet nem kap, és új ciklin nem szintetizálódik - sokszor saját aktivitásukat is serkentik (pozitív visszacsatolás) - az előző stádiu komplexét inaktiválják, ubikvitin ligázok bontják az előző ciklint, gátlófehérjék aktiválódnak (ez egyfajta negatív visszacsatolás is!)

46 Hányszor osztódhat egy sejt? A sejtciklus beindításához (a G1- át e ethez szükséges té ezők: - növekedési, osztódási faktorok - hordozófelületre ki tudjanak tapadni (de a sejt-sejt kapcsolatok kialakulása gátol!) - eg szövete elül a szövetféleség érete is li itáló té ező pl. áj Egy sejtféleség osztódási potenciálja - azaz, hogy hány cikluson tud keresztülmenni - fajra jelle ző, ge etikailag sza ál ozott érték. - A ciklizálóképesség elvesztése: celluláris öregedés. A jelenség oka: a kromoszómák fokozatos rövidülése a replikáció során.

47 Miért rövidül a telomer? A repliká ió ter észeté ől adódóan mindig RNS-pri errel kezdődik a másolás. Az új DNS- olekula frisse szi tetizálódott 5 legvégé az RN -primer lebomlik, de a helyébe nem szintetizálódik DNS.

48 Miért rövidül a telomer? A B A B 1 A 1 B A 1 B 2 és fehérjekötőhely Replikáció 1 A primer degradálódik Replikáció 2 A primer degradálódik telomer Primer (RNS) A 2 B 1 A kötőhely elveszett

49 Van megoldás a sejtöregedéssel szemben? Igen, vannak halhatatlan sejtjeink! A telomer rövidülése ellen hat a telomeráz enzim, amely normális esetben a szomatikus sejtek többségében nem vagy alig expresszálódik. Az őssejtek e (vagy más néven törzssejtekben) viszont aktív! (Dyskeratosis congenita: az egyik kópia telomeráz-gén mutációja miatt kevésbé hatékony a telomerek hosszának biztosítása. Egy idő után abbamarad az őssejtek osztódása, a következmény so tvelőhiá, ájzsugorodás, őrkárosodás.)

50 sejtosztódás a telomer hossza A legtöbb sejt osztódási képessége nem végtelen (a sejtvonal korlátozott szá ú ele ől áll telomeráz aktiváció sejtöregedés (celluláris szeneszcencia) telomeráz Miért halhatatlanok az őssejtek?

51 A telomeráz űködése Kapcsolódik a telomeráz A telomeráz az RNS te plát alapjá a irányban meghosszabbítja a DNS fonalat A megrövidült 5 vég A telomeráz A telomeráz saját templát RNS-e A telomeráz DNS-t szintetizál A DNS polimeráz az új 5 véget RNS pri ertől indulva kiegészíti AACCCCAAC DNS polimeráz késő le o ló RNS-primer A templátként szolgáló régi DN -szál végé ek eghossza ításával lehetővé válik, hog az új 5 vég is hossza leg e