A modern tömegspektrometria szerepe a mikroorganizmusok azonosításában A kémiai Nobel díj és a Staphylococcus aureus Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás Műszeres mikrobiológiai vizsgálatok MALDI-TOF WESSLING Hungary Kft. Dátum
Bevezetés A 2002-ben a Kémiai Nobel díjat megosztva három kutató kapta: Kurt Wüthrich NMR kutatások a Biológiai makromolekulák térszerkezetének meghatározása John B. Fenn ESI Electrospray kidolgozása A molekulák elefántjainak reptetése Koichi Tanaka MALDI kidolgozása a Makromolekulák Lézer Deszorpciós Ionizációja
Tömegspektrometria Tömegspektrometria szerkezet kutatási módszer Elsődleges információk a molekula mérete, a molekulatömeg pontos tömegmérés elemi összetétel A vizsgálatokhoz a molekulákat gázfázisban ionizálni kell makromolekulák esetén nem egyszerű feladat - fragmentáció Tömegspektrometrométer (MS) Ionforrás gázfázisú ionok (EI, CI, ESI, MALDI...) Tömeg-analizátor ionok elválasztása tömeg/töltés (Mágneses, Iontrap/Orbitrap, Quadrupole, TOF) Detektor a szeparált ionok detektálása (Electron multiplier, Photo multiplier, Microchanel plate )
MALDI-TOF tömegspektrometria A MALDI-TOF Tömegspektrometria K.Tanaka SLD (Soft Laser Desorption) 1988 - Nagy energiájú lézer impulzusok mátrix (glicerin, fémpor) protonált kvázi molekulaionok [M+H] + F. Hillenkamp M.Karas MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) 1988 - Nagy energiájú lézer impulzusok mátrix (kis szerves molekulák) protonált kvázi molekulaionok [M+H] + - Fehérjék, proteinek, peptidek tömegspektrometriás vizsgálata TOF Time of Flight (A.E.Cameron, D.F. Eggers An Ion Velocitron, 1948) - A felgyorsított ionok repülési idejét mérjük nano szekundum pontossággal repülési idő vs. tömegszám
MALDI-TOF tömegspektrometria A mátrix szerepe a MALDI folyamatban A vizsgálandó molekulákat egy fényelnyelő mátrixba ágyazzuk be
MALDI-TOF tömegspektrometria A mátrix szerepe a MALDI folyamatban Lézer impulzusokkal gerjesztjük a mátrix molekulákat
MALDI-TOF tömegspektrometria A mátrix szerepe a MALDI folyamatban A mátrix molekulákkal együtt a vizsgálandó molekulák is gázfázisba jutnak, ionizálódnak A mátrix energia-átvivőként, transzmitterként működik: az UV lézer energiáját közvetíti a vizsgálandó molekuláknak (deszorpció - protonátadás). Lézer energia M [ i M i + H ] + Márix
MALDI-TOF tömegspektrometria Lézer: UV lézer, 60 Hz, max. 337,1 nm Mátrix: a-ciano-4-hidroxi-fahéjsav HCCA Abszorbancia maximum:332 nm Mátrix oldat: 1 mg/100 ml ACN / 5% TFA (1/1)
MALDI-TOF tömegspektrometria MALDI-TOF Tömegspektrométer
MALDI-TOF tömegspektrometria Bruker mikroflex LT MALDI-TOF tömegspektrométer Detektor mikrochanel plate Repülési cső UV Lézer MNL 100 MALDI - Ionforrás Optikai kábel
MALDI-TOF tömegspektrometria MALDI-TOF tömegszám kalibráció repülési idő vs. tömegszám Escherichia coli DH5 baktérium referencia tömegspektruma (2000 20.000 amu)
Mikroorganizmusok tények, érdekességek a mikroorganizmusok azaz a baktériumok és a penész gombák általában szabad szemmel nem láthatóak 0,2 mm 20 mm; a Földön mindenhol előfordulnak ubikviter élőlények (már találtak baktériumokat a nukleáris reaktorok hűtővízkörében is); az emberi test sejtjeinek az aránya a bennünk/rajtunk élő mikroorganizmusokhoz képest 1:10 1:100; kevesebb 0,5 %-uk ismert; többségük teljesen ártalmatlan; élelmiszeripar, biotechnológia Yellowstone Nemzeti Park Grand Prismatic Spring
Mikroorganizmusok tények, érdekességek Yellowstone Nemzeti Park - Grand Prismatic Spring
Mikroorganizmusok osztályozása Baktériumok nincs sejtmagjuk (prokarióták) méretűk 0,2 20 mm gyors reprodukció (akár 20 percenként) túlélőképesség tápanyagszegény környezetben osztályozásuk Gram festés alapján (+ / -) Streptococcus Száj flóra - fogszuvasodás Escherichia coli Vitamin előállítás A bélflóra része
Mikroorganizmusok osztályozása Gombák - fonalas gombák, élesztők van sejtmagjuk (eukarióták) méretűk 6 10 mm a sejtmag tartalmazza a genetikai anyagot egysejtű és többsejtű organizmusok a biotechnológiában fontosak erős sejtfal Penicillium Antibiotikum gyártás Sajt készítés Saccharomyces cerevisiae Alkohol előállítás Kenyérsütés Aspergillus Toxin termelés
Mikroorganizmusok azonosítása Miért szükséges azonosítanunk őket: Klinikai diagnosztika humán gyógyászat; Élelmiszergyártás higiéniai vizsgálatok, minőségi élelmiszerek előállítása; Állatgyógyászat állategészségügy, takarmány előállítás; Tudományos kutatás biotechnológia. Az azonosítás módszerei: Biokémiai módszerek a mikroorganizmusok metabolizmusa alapján enzim reakciók segítségével Molekuláris biológiai módszerek a mikroorganizmusok genetikai anyaga alapján, DNA, rdna szekvenálás MALDI Biotyper a mikroorganizmusokban található genetikailag determinált fehérjék (elsősorban a riboszómális), illetve fehérje összetételük alapján
MALDI Biotyper az identifikálás alapja MALDI Biotyper elsősorban a riboszómális fehérjék tömegspektrum (fehérje profil) A rendszervezérlő szoftver (flexcontrol) készíti a nyers tömegspektrumot Mért spektrum Referencia spektrum Minden mikroorganizmusnak van egy rá jellemző fehérje profilja, tömegspektruma (ujj lenyomat)
MALDI Biotyper az identifikálás folyamata Egyedi telepek kiválasztása MALDI target előkészítése (direkt, extrakció) MALDI-TOF tömegspektrum készítése Adatfeldolgozás azonosítás A tenyésztési körülmények táptalaj, növekedési állapot, hőmérséklet csak kis mértékben befolyásolják a spektrum minőségét és az azonosítás eredményét.
MALDI Biotyper az identifikálás folyamata Direkt minta felvitel: -steril mintavételi eszköz, oltókacs -néhány tized milligramm biológiai anyag -közvetlenül a mintatartó-lemezre -mátrix oldat felcseppentése -szárítás Etanolos extrakció: -steril oltókacs -néhány milligramm biológiai anyag -300 ml vízben szuszpendáltatva -900 ml etanol (vortex, centrifuga) -felülúszó leöntése, szárítás -10-20 ml 70%-os hangyasav -10-20 ml acetonitril (vortex, centrifuga) -a felülúszóból 1 ml a mintatartó-lemezre -mátrix oldat felcseppentése -szárítás
MALDI Biotyper az identifikálás folyamata Az előkészített mintatartó lemez (8 sor 12 oszlop 96 pozíció) A mintatartó lemez behelyezése a MALDI-TOF készülékbe
MALDI Biotyper az identifikálás eredménye MALDI Biotyper Real Time Classification szoftver - eredmények
MALDI Biotyper az identifikálás eredménye MALDI Biotyper Real Time Classification szoftver - eredmények Nem megfelelő tömegspektrum Megfelelő tömegspektrum 2,00 > Score érték > 1,70 azonosított faj (genus) Score érték < 1,70 az azonosítás megbízhatósága nem megfelelő Score érték > 2,00 azonosított mikroorganizmus
MALDI-TOF mikrobiológiai vizsgálatok A laboratóriumban több mint 40 olyan akkreditált vizsgálatot végzünk, amelyben tenyésztéses módszereket alkalmazunk. Ezeknél a vizsgálatoknál képződik a minta, a különböző táptalajokon kinőtt tenyészetek: Mikrobaszám: MSZ EN ISO 4833-1:2014 Salmonella spp: MSZ EN ISO 6579:2006 Staphylococcus aureus: MSZ EN ISO 6888-1:2008 Bacillus cereus: MSZ EN ISO 7932:2005 Clostridium perfingens: MSZ EN ISO 7937:2005 Campylobacter spp.: MSZ EN ISO 10272-1:2006 Listeria moncytogenes: MSZ EN ISO 11290-1:1998 E.coli: MSZ ISO 16649-2:2005 Enterobacteriace : MSZ ISO 21528-2:2007 Enterococcus faecalis: DIN 10106:1991. Jelenleg ezeknél a módszereknél a megerősítő vizsgálatokkal párhuzamosan végezzük a MALDI Biotyper-rel az azonosításokat.
MALDI-TOF mikrobiológiai vizsgálatok Szalmonellafajok jelenlét kimutatására, meghatározására: az MSZ EN ISO 6579:2006 szabványos módszert - Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. Horizontális módszer a szalmonellafajok kimutatására (ISO 6579:2002)) és PCR alapú szalmonella kimutatási módszereket alkalmazzuk - BAX System PCR Assay for Salmonella (AFNOR Validation No.: QUA 18/03-11/02) - MicroSEQ Salmonella spp. Method (AFNOR Validation No.: ABI 29/02-09/10)
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra 2. nap Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5 C - 37 o C, 24±3 óra
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra 2. nap 3. nap Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5 C - 37 o C, 24±3 óra Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm) 37 o C, 24±3 óra Negatív eredmény Riport (72 óra)
MALDI-TOF mikrobiológiai vizsgálatok A Salmonella spp. pozitív megerősítő vizsgálat tenyészetei szelektív táptalajokon SHq XLD Tipikus morfológiájú telepek Tipikus morfológiájú telepek Diassalm Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás Hungalimentália - 2015.04.22-23.
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra 2. nap 3. nap Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5 C - 37 o C, 24±3 óra Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm) 37 o C, 24±3 óra Negatív eredmény Riport (72 óra) 4. nap Gyanús telepek átoltása TGE, 37 o C, 24±3 óra
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra 2. nap 3. nap Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5 C - 37 o C, 24±3 óra Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm) 37 o C, 24±3 óra Negatív eredmény Riport (72 óra) 4. nap Gyanús telepek átoltása TGE, 37 o C, 24±3 óra 5. nap Biokémiai reakciók, szerológiai vizsgálatok 37 o C, 24±3 óra Pozitív megerősített eredmény Riport (120 óra)
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra PCR alapú módszerek 3 9 óra Negatív eredmény Riport (24 óra) 2. nap 3. nap Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5 C - 37 o C, 24±3 óra Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm) 37 o C, 24±3 óra Pozitív PCR eredmény Negatív eredmény Riport (72 óra) 4. nap Gyanús telepek átoltása TGE, 37 o C, 24±3 óra 5. nap Biokémiai reakciók, szerológiai vizsgálatok 37 o C, 24±3 óra Pozitív megerősített eredmény Riport (120 óra)
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra PCR alapú módszerek 3 9 óra Negatív eredmény Riport (24 óra) 2. nap 3. nap Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5 C - 37 o C, 24±3 óra Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm) 37 o C, 24±3 óra Pozitív PCR eredmény MALDI Biotyper MALDI-TOF (30 perc) Negatív eredmény Riport (72 óra) Pozitív/negatív megerősített eredmény Riport (72 óra) 4. nap Gyanús telepek átoltása TGE, 37 o C, 24±3 óra 5. nap Biokémiai reakciók, szerológiai vizsgálatok 37 o C, 24±3 óra Pozitív megerősített eredmény Riport (120 óra)
Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml 1. nap Elődúsítás, BPW, 37 o C, 18 ±2 óra PCR alapú módszerek 3 9 óra Negatív eredmény Riport (24 óra) Szelektív dúsítás, 2. nap Pozitív PCR eredmény (RVS, MKTTn) 41,5 C - 37 o C, 24±3 óra 3. nap Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm, SHq) 37 o C, 24±3 óra MagneBeads MALDI Biotyper MALDI-TOF (30 perc) Negatív eredmény Riport (72 óra) Pozitív/negatív megerősített eredmény Riport (72 óra) 4. nap Gyanús telepek átoltása TGE, 37 o C, 24±3 óra 5. nap Biokémiai reakciók, szerológiai vizsgálatok 37 o C, 24±3 óra Pozitív megerősített eredmény Riport (120 óra)
MALDI-TOF mikrobiológiai vizsgálatok Salmonella spp. kimutatása MALDI Biotyper módszerrel, validálási eredmények - Referencia módszer MSZ EN ISO 6579:2006 - >200 szelektív táptalajról készült tenyészetek vizsgálata - ebből >150 Salmonella spp. pozitív - Relatív pontosság (AC) = 100% - Relatív specifikusság (SP) = 100% - Relatív érzékenység (SE) = 100% - Fals pozitív arány (FA) = 0% - Fals negatív arány (FN) = 0% - Eredmény táptalaj-független (SHq, XLD, TGE) - Eredmény 30 perc alatt kész!!!
MALDI-TOF mikrobiológiai vizsgálatok MALDI Biotyper - MALDI-TOF azonosítás Minimális minta-előkészítési igény; Gyors és pontos analízis, nagy mintaszám (96 minta/40 perc); Alacsony költségek; Atípusos telepek, kísérő bióta analízis ( sreen módszer); Robusztus módszer táptalaj független; Spektrum analízis szerotipizálás antibiotikum rezisztencia előrejelzése; Jelenleg 5627 species, 388 genus tartalmaz a könyvtár (fejlesztés); 2014-ben >4000 telep azonosítás, 2015 I. negyedévben >2000 telep azonosítása.
Köszönet nyilvánítás! - Wessling Hungary Kft. Mikrobiológiai Laboratórium dolgozóinak; - Mikrobiológia értékelő részleg dolgozóinak: Borókay Zsuzsanna klasszikus mikrobiológiai részlegvezető; Pocklán Edit műszeres mikrobiológiai részleg vezető; Tóth Ildikó mikrobiológus mérnök.
Köszönöm a figyelmet! www.wessling.hu WESSLING Hungary Kft. 1047 Budapest, Fóti út 56. Tel: 06 1 872 3600 Fax: 06-1-435-0100 E-mail: info@wessling.hu Lovász Csaba MALDI-TOF lovasz.csaba@wessling.hu