Korszerű identifikálási módszerek a mikrobiológiai gyakorlatban Mráz Balázs 1, Zoller Linda 1, Fodor Andrea 1, Szántó-Egész Réka 2, Tabajdiné Pintér Veronika 1 1 Wessling Hungary Kft. Mikrobiológiai Laboratórium FoodMicro 2 Biomi Kft.
Van-e benne...? Mennyi van benne? Salmonella Campylobacter Listeria monocytogenes Escherichia coli O157:H7 Enterobacteriaceae Escherichia coli Mezofil aerob mikroba Brochotrix thermosphacta Pseudompnas sp. Bacillus subtilis Tejsavbaktériumok Lactobacillus sp. Bifidobacterium sp. Élesztőgombák Hungalimentaria - 2011 2
Jelenlét kimutatás Szelektív/differenciáló tápközegek Műszeres vizsgálatok (PCR, VIDAS) Hungalimentaria - 2011 3
Hagyományos azonosítási módszerek, lépések Tiszta tenyészet készítése Mikroszkópos vizsgálat (sejtforma, mozgás) Gram-festés Biokémiai vizsgálatok Hungalimentaria - 2011 4
Kereskedelmi biokémiai tesztek Enterotube II (Enterobacteriaceae) ~80 baktérium Oxi/Ferm Tube II ~70 baktérium Oxidáz próba Pozitív Negatív Oxi/Ferm Tube II Anaerob glükóz hasznosítás Enterotube II Aerob glükóz hasznosítás Pozitív Negatív Pozitív Negatív Aeromonas spp., Plesiomonas shigelloides, Vibrio spp. Achromobacter spp., Alcaligenes spp., Bordetella bronchiseptica, Moraxella spp., Pasteurella spp. Enterobacteriaceae Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia Hungalimentaria - 2011 5
Kereskedelmi biokémiai tesztek BBL Crystal (GramPositive, E/NF, RG+, Anaerobe) ~450 mikroba API teszt ~600 mikroba Értékelés: pozitív/negatív,? Hungalimentaria - 2011 6
Genom szintű azonosítási módszerek, lépések Tiszta tenyészet készítése 24-72 óra (Gram-festés) DNS alapú technikák Szekvenálás ~5-9,5 óra Ribotipizálás ~8 óra Hungalimentaria - 2011 7
Szekvenálás I. A DNS-t alkotó bázisok sorrendjének meghatározása a 16S rdns 500-700bp hosszúságú szakaszán PCR (1.): 1200 1500 bp DNS fragment felsokszorozása Jelölő PCR (2.): ddntp beépítése Kapilláris gélelelektroforézissel történő szétválasztás Hungalimentaria - 2011 8
Szekvenálás II. Fluoreszcensz jel detektálása Összehasonlítás adatbázissal bázispár elhelyezkedés, hibák (N) helyzete/száma BLAST, RDP ingyenes MicroSeq library gyártói adatbázis ~2000 mikroba Hungalimentaria - 2011 9
Ribotipizálás I. Southern-blotting alapú molekuláris ujjlenyomat vizsgálata DNS emésztése restrikciós enzimekkel (EcoRI, PvuII) Fragmentek elválasztása gélelektroforézissel Fragmentek membránra vitele és rögzítése DNS jelölése Detektálás Adatbázisban szereplő mintázatokkal történő összehasonlítás ~1400 mikroba, ~7000 mintázat Akár törzs szintű meghatározás is lehetséges! Hungalimentaria - 2011 10
RiboPrinter Mintaelőkészítés ~30 perc/8 minta Teljesen automatizált folyamat Eredmény: 8 óra múlva Folyamatos üzemeltetés mellett egy munkanap alatt 32 minta futtatható. Hungalimentaria - 2011 11
Ribotipizálás elve I. Próba Törzs #1 Próba Törzs #2 Hungalimentaria - 2011 12
Növekvő fragment méret Mikrobiológiai Laboratórium - FoodMicro Ribotipizálás elve II. Törzs #1 Törzs #2 B D C B } D C Konzervatív fragmentek A E A E } Eltérés Azonos 16S szekvencia, eltérő RiboPrint TM mintázat Hungalimentaria - 2011 13
Adatbázis A folyamat végén a rendszer automatikusan létrehozza a RiboPrint TM mintázatot Konzervatív régió Az adatbázis folyamatosan frissül (ATTC, DSMZ, Riken) Felhasználás során automatikusan bővül+önállóan bővíthető Hungalimentaria - 2011 14
Másodlagos csoportosítás RiboCsoport Amennyiben a hasonlóság >90% Forrás Mikroba azonosítása Hungalimentaria - 2011 15
Másodlagos csoportosítás RiboCsoport Amennyiben a hasonlóság >90% Az adatbázisban nem szereplő mikrobák is besorolhatók. Forrás Mikroba azonosítása Hungalimentaria - 2011 16
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!