Autoan'testek vizsgáló módszerei, HLA 'pizálás Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE- ÁOK
Természetes autoan'testek Pathológiás autoan'testek
Természetes autoan'testek IgM Alacsony affinitás Alacsony szérum cc. (ng/ml) PolireakMv CD5 + B1 sejtek
Természetes autoan'testek által felismert an'gének ( immunológiai( homunculus ) Heatshock hsp65, hsp70, hsp90, ubiquitin proteins Enzymes aldolase, citockro m c, SOD, NAPDH Cell membrane!2-microglobulin, spectrin, components acetylch olin receptor Cytoplasmic actin, myosin, tubulin, myoglobin, components myelin basic protein Nuclear DNS, histones components Plasma proteins albumin, IgG, trans ferrin Cytokines, IL-1, TNF, IFN, ins ulin, hormones thyreoglobin
Pathológiás autoan'testek IgG, IgA v. IgM Nagy affinitás Magas szérum cc.. (mg/ml) B2 sejtek
Autoimmun betegségek Szisztémás: SLE, RA, Sjögren- sy., dermatomyosi's, polymyosi's Szerv specifikus: IDDM, Addison- kór Hashimoto- thyroidi's Graves- betegség, Myasthenia gravis
Az autoan'testek kimutatására használt fõbb módszerek Screening tesztek: Direkt immunfluoreszcencia a betegből vec szövetmintán Indirekt immunfluoreszcencia: humán Hep- 2 sejcenyészeten vagy álla' eredetű szövetmintán Az autoan'test specifikus mintázatot ad egy- egy szöveten, vagy sejten belül (nukleáris, nukleoláris, centromer, citoplazma'kus, mitokondriális stb mintázat) (képek: h+p://www.labodia.com/en/ana/atlas/anaatlascyto2.htm) An'gén specifikus vizsgálatok: A screening teszt eredménye és a klinikai kép alapján an'gén specifikus ELISA, Western blot, vagy radiális immundiffúzió módszerével.
Indirekt immunfluoreszcencia Homogén magfestődés (dsdna, Hep2 sejtek) Nukleoláris festődés (SSA, Hep2 sejtek)
Indirekt immunfluoreszcencia Pajzsmirigy TPO (Pajzsmirigy szöveten) Mitokondriális festődés (vese szöveten)
Systemás betegséget jelző autoan'test (AAT) panelek An'- nukleáris AAT (ANA): - kecősszálú DNS - ANA screen (Hep- 2 extractum) - ENA- 6 család - Centromer (Cenp- B) An'- neutrofil citoplazma AAT: - MPO (myeloperoxidase) (ANCA) - PR3 (proteinase3) Foszfolipid syndroma: - cardiolipin, - b2- glycoprotein- 1 - foszfa'dil szerin, - proteins, proteinc, - prothrombin elleni AAT
Szervspecifikus autoan'testek Pajzsmirigy elleni AAT: - thyreoglobulin, TPO Coeliakiát jelző AAT: - szöve' transzglutamináz (ttg), gliadin, endomysium, desmin, simaizom Diabetes mellitus AAT: glutamic acid decarboxylase (GAD), thyrosine phosphatase (IA2) Primer biliaris cirrhosis: an'- mitochondriális AAT Goodpasture syndroma: GBM elleni AAT
ELISA elve: minden an'gén specifikus AAT mérése A B C D E F G H Blank 3 11 19 Cal.1 4 12 20 Cal.2 5 13 Cal.3 6 14 Cal.4 7 15 + ctrl 8 16 -- ctrl 9 17 külön kit- ben 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Se.1 10 18 89. - + Y Y Y Y 1. AnNgénnel fede+ ELISA lemez 2. Szérum minta 100x hígításban 3. ann- humán IgG / IgM - HRPO 4. Szinreakció mérése
HLA 'pizálás
MHC-I. és II. szerkezete
Öröklődés Poligénes Polimorf Kodomináns
Humán 6- os kromoszóma rövid karja HLA gének szerkezete D B C A HLA- DP HLA- DQ HLA- DR Complement 2 Complement 4 TNF LT HLA- B HLA- C HLA- A
HLA gének terméke kodominánsan expresszálódik Apai 6- os kromoszóma HLA- DP HLA- DQ HLA- DR HLA- B HLA- C HLA- A a b a β2 mikrogl. MHC II MHC I 15- ös kromoszóma HLA- DP HLA- DQ HLA- DR HLA- B HLA- C HLA- A Anyai 6- os kromoszóma
A HLA 'pizálás felhasználása HLA polimorfizmus variánsok (allompusok) meghatározása. Transzplantáció esetén donor- recipiens hisztokompa'bilitási viszonyainak egyeztetése. Hisztokompa'bilitási an'génekkel szembeni szenzi'záció fokának nyomon követése. Autoimmun betegségekre predisponáló haplompusok kimutatása.
HLA Mpusok, HLA iden'kus donor szelekció 1960- as évek: szerológiai módszerek szeroipusok 1980- as évek: genenkai módszerek kezdete 1990- es évekre az összes I osztályú HLA gént megszekvenálták 6 / 6 anngén egyezése A, B, DRB1 10 / 10 anngén egyezése A, B, C, DRB1, DQB1 10 / 10 allél egyezése A, B, C, DRB1, DQB1 12 / 12 allél egyezése A, B, C, DRB1, DQB1, DPB1
HLA 'pizálás 1. Szerológiai módszerek Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki) 'pizáló savók + lymphocyták Panel reakmv an'test (HLA szenzi'záció fokának meghatározása) Keresztreakció (donor sejtjei + recipiens savó)
Szerológiai módszerek 1.- Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki( Terasaki)
HLA 'pizálás 2. Kevert lymphocyta kultúra (MLC) (csak II. osztályú an'gének)
HLA 'pizálás 3. molekuláris biológiai módszerek 1. Restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) 2. Szekvencia specifikus oligonukleo'd szonda (PCR- SSOP) 3. Szekvencia specifikus primerek alkalmazása PCR vizsgálathoz 4. Szekvencia alapú 'pizálás (SBT)
RFLP 1.
RFLP 2.
SSOP
Szekvencia specifikus primerek alkalmazása PCR vizsgálathoz (HLA- DR csoportok meghatározása PCR módszerrel) 1-12. reakciók 13-24. reakciók A piros vonal alak PCR termékek specifikusak, fele+e belső kontrollok láthatók. A 24. reakció negatív kontroll. Az 1.és 18-21. reakciók poziivak. A mintázat megfelel HLA- DRB3, HLA- DRB1*01 és HLA- DRB1*14 csoportnak.
HLA és betegség asszociációk HLA- DQ2, HLA- DQ8 lisztérzékenység (coeliákia, glutén szenziiv enteropáthia) Típusos tes+artás Bechterew kórban. Forrás: edoc.hu- berlin.de Limfocitákkal infiltrált vékonybél, Ellapult bolyhok HLA- B27 Bechterew kór (spondylins ankylopoenca)
HLA és betegség asszociációk I. Mpusú diabetes mellitus HLA- DR3- DQ2 3x- os kockázat HLA- DR4- DQ8 10x- es kockázat DR3 / DR4 heterozygota 25x- es kockázat Vércukor- szint ellenőrzés HLA- DQ6.2 védelem (0,1x- es kockázat) Az ősi A1- B8- DR3- DQ2 haploipus a vártnál (0,9%) sokkal gyakoribb (7,1%), noha autoimmun betegségekkel asszociált (pl. coeliakia, myasthenia, 1. ipusú diabetes, Addison, Sjogren )