Immunhisztokémia: Előhívó rendszerek, problémák és megoldások Dr. Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Budapest
Patológus Klasszikus patomorfológia Klinikai adatok Molekuláris információ
Patológus Klasszikus patomorfológia Klinikai adatok Molekuláris információ Immunhisztokémia Biomarker molekulák in situ Kimutatása
Patológus Klasszikus patomorfológia Klinikai adatok Molekuláris információ Immunhisztokémia Biomarker molekulák in situ Előfordulása Kimutatása Diagnosztikus interpretálás Megbízható-e a pozitív ill. a negatív eredmény?
Immunhisztokémia Szöveti molekulák in situ kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével
Immunhisztokémia Szöveti molekulák in situ kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével Specifikus térszerkezetbe koncentrált Kulcs a zárba illeszkedés NEM-KOVALENS Kötőerők Ionos -CH 2 -CH 2 -NH + - 3 O van der Waals -CH 2 -CH-CH 3 O Hidofób CH 3 -CH 2 -CH 2 - C-CH 2 -CH 2 - -CH 2 -OHH (+) (-) O=C-CH 2 - H - híd
Immunglobulinok IgG (7S) NH3 + V L Fab papain pepsin V H emésztés IgG1, G2 és G4 C H1 diszulfid híd Fc receptor kötés O zsanér hinge régió 2x Fab+Fc C H2 szénhidrát IgG3 Ig-ok/antitestek: IgG, IgM, (IgA, IgD, IgE) C H3 Fc COO http://pathmicro.med.sc.edu/mayer (Gene Mayer) Antigenitás: fehérjék > szénhidrátok > lipoidok, nukleinsavak
Immunglobulinok mint reagensek Antigén-determináns: (epitóp) Az antigén molekula azon szakaszai melyekhez az antitest közvetlenül kapcsolódik Fab-fragmensének hipervariábilis régiójával. Általában 8-15 aminósav (fehérje antigén), ill. oligoszacharidok (szénhidrát antigén) határoz meg egy epitópot. Stabilitás(tárolás): - Tömény antitestek, 1% BSA+0,1% Na-azid-TBS-ben 4 o C-on. hónapokig, akár évekig igen stabil. - Munkahígítások hasonló módon tartva néhány hétig, de van amelyik antitestet csak frissen hígítva használhatunk. - Érzékeny antitestek, -20 o C-on aliquot-okban (csak egyszer) Destabilizál: 1) alacsony/magas ph; 2) hő; 3) magas sókoncentráció; 4) fény
Immunhiszto-/Cytokémia Dako, 1994 Shi és mtsai, 1991 Hsu és mtsai, 1981 Köhler és Milstein, 1975 Taylor és Burns, 1974 Holgate és mtsai, 1983 ABC módszer IGSS módszer Polimer konjugátum módszer Antigénfeltárás HIER Sternberger, mtsai, 1970 Monoklonális antitestek Nakane és Pierce, 1966 Coons, 1942 FITC-anti- Pneumocuccus Indirekt immunperoxidáz PAP módszer Formol-paraffin immunhisztokémia Standardizált kit-ek Atomatizálás Specifikus/Primer antitestek: Egyre több antigénre Szintetizált oligopeptidekre 1-1 antigén számtalan epitópjára (pl. intra-, extracelluláris) Foszforilált (aktivált) enzimekre Egyre több formol-paraffinos
IMMUNHISZTOKÉMIA Összetett Szövet kimetszés Egymásra épülő, egymást befolyásoló faktorok Pre-analitika Rögzítés módja időtartama szövettípus méret Analitika Antigénfeltárás hatékonysága Reagens eszköze minőség/ módja affinitás Jelző-/előhívórendszer Diagnosztikus riport Kontrollok A reakció értékelése értelmezése Poszt-analitika Automatizálás Immunhisztokémia eredményessége (Standard kit-ek) Inkubációs idő hőmérséklet Reagenshígítás
Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó
Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál Túlrögzítés: - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! gátolt antigénkimutatás Antigénfeltáró módszerek
Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál Túlrögzítés: - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! Víztelenítés: Beágyazás: Metszés: gátolt antigénkimutatás Antigénfeltáró módszerek utolsó absz. alkohol vizes gyakoribb csere/forgás orientációs hiba blokk öntés gyűrött vagy szakadozott metszet (terítési hő - idő) Pre-analitika: Egymásra épülő, egymást befolyásoló faktorok
Rögzítés Immunhisztokémia Szövetrögzítés BLOKKMÉRET 1 h = ~1 mm Penetráció IDŐ Rögzítés = 16-24 h Ca 2+ ionok/kelátok stabilizálják Időben: Méret: <10 percen belül < 3 mm 4% formaldehid = ~ 10%-os formalin Időtartam: 16-24h Nagyméretű blokk szakszerű indítás nélkül 4 o C-on
Rögzítés Immunhisztokémia Szövetrögzítés BLOKKMÉRET 1 h = ~1 mm Penetráció IDŐ Rögzítés = 16-24 h Ca 2+ ionok/kelátok stabilizálják Időben: Méret: 10 percen belül < 3 mm 4% formaldehid = ~ 10%-os formalin Rögzítés Egymás ellen ható követelmények Struktúra Antigenitás Kompromisszum! Időtartam: 16-24h Nagyméretű blokk szakszerű indítás nélkül 4 o C-on Antigénfeltárás
Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus
Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus Terítési hőmérséket - idő! - gyűrődéstől, - szakadozástól mentes Vízfürdő ~48-50 o C - Simítás nedves szűrőpapíron át - MULTIPONT ADHÉZIÓ! - HŐAKTIVÁLÁS! 60 o C-on ~2h
Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus Terítési hőmérséket - idő! - gyűrődéstől, - szakadozástól mentes Vízfürdő ~48-50 o C Terítés vízcseppen 1-2 m, műgyanta - Simítás nedves szűrőpapíron át - MULTIPONT ADHÉZIÓ! - HŐAKTIVÁLÁS! 60 o C-on ~2h
Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés)? Trypsin 8 15 20 17 Proteáz emésztés: Rögzítés-függő Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin
Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés)? Trypsin 8 15 20 17 Proteáz emésztés: Rögzítés-függő Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin HIER Nedves hővel (HIER = heat-induced epitope retrieval )
Antigénfetárás főzéssel (HIER) Széleskörű hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása Ca 2+ eltávolítás Pan-cytokeratin: AE1/AE3 CK5, 14 (CK1, 6, 10, 16, 17?) Nincs Proteáz HIER
Antigénfetárás főzéssel (HIER) Széleskörű hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása Ca 2+ eltávolítás Pan-cytokeratin: AE1/AE3 CK5, 14 (CK1, 6, 10, 16, 17?) Nincs Proteáz HIER Puffer: Hatékonyság ~ szövetkárosítás Ca++ Ca++ Ca++ Tris-EDTA ph9 > Citrát ph6 Kálcium kelátok eltávolítása Citrát ph 6 ++ EDTA ph 6 (+) EDTA ph 8 +++ Tris/EDTA ph 9* ++++ - Morgan et al. J. Pathol. 182 233-237 1997 - *Vyberg M és Nielsen S. NORDIQC Javasolt!
Vimentin Tonzilla Flex nincs feltárás Flex feltárás után
Immunhisztokémia Antigénfetárás beállítása Sorozatmetszetek napi reprezentatív/túlrögzített anyagból Vimentin (V9): - HIER sorozat eltérő időkkel - Standard immunhisztokémia Elvárás: Minden lymphocyta pozitív! 30 citrát ph6,0 40 citrát ph6,0 elégtelen optimális HIER hatékonyság = hőmennyiség (idő+hőmérséklet) + puffer/ph
Antigénfeltárás (Hígítás!) Jelentősége Normál citrát, ph 6.0 Erős citrát, ph 6,0 Normál Tris-EDTA, ph9,0 HER2 2+ emlőrák
HÍGÍTÁS - primer antitest (detektáló rendszer) Optimális hígítás: Maximális jel/háttér arány Jó FP FN
Primer Antitest Specificitás - Érzékenység Melanoma markerek HMB-45 S-100 Érzékenység: Az adott entitás hány %-ában pozitív Specificitás/Szelektivitás: Az adott entitáson kívül nem vagy csak kismértékben fordul elő Tyrosinase Melan-A
Epitóp specificitás - érzékenység EGFR: intra-, extracleluláris
Optimalizás Immunhisztokémia Primer antitest Inkubáció Antigénfeltárás Detektáló rendszer
Immunhisztokémia Detektáló rendszer Típusa (biotin v. polimer) Érzékenysége Stabilitása Gazdaságossága Kiegészítők (Kit) - reprodukálhatóság - érzékenység - háttércsökkentés - takarékosság
ABC módszer - Hsu és mtsai, 1981 (Strept)Avidin-Biotin peroxidáz (ABC) komplex Biotin (H vitamin) Primer antitest Biotinnal jelölt kapcsoló antitest (Strept)avidin PO, AP enzim FITC, TRITC Au kolloid
Jelző/Detektáló rendszer ABC módszer pcd3 1:200 Citrát ph6 Tris-EDTA ph9
Jelző/Detektáló rendszer ABC módszer pcd3 1:200 Citrát ph6 Tris-EDTA ph9 Hatékony HIER (Tris-EDTA; EDTA stb ) Endogén biotin! Metabolikusan erősen aktív sejtekben: FALS POZITIVITÁS! máj, vese, mellékvese, emlő gasztointesztinális hám
Polimer konjugátum EnVision TM + módszer (Dako) BIOTIN-MENTES! EnVision Flex 3. generációs 2 lépcsős polimer: Primer egér antitest Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO -DAB/H 2 O 2 ~10 perc
Detektáló rendszer Standardizált kit-ek Polimer-enzim-antitest BIOTIN-MENTES! EnVision Flex Mini High ph K8023 Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO EnVision FLEX Endogén peroxidáz blokkoló Foszfát pufferelt H2O2+NaN3+detergens EnVision FLEX /HRP Dextrán-PO és kecske anti-nyúl, -egér IgG; BSA, azid EnVision FLEX DAB+ Kromogén 3,3 -diaminobenzidin HCl4 szerves oldószerben EnVision FLEX Subsztrát puffer Pufferelt hidrogén peroxid oldat tartósítva. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) Tris/EDTA buffer, ph 9-es puffer. 3-in-1 módszer EnVision FLEX Mosó puffer (20x) TBS + detergens, Tween 20, ph 7.6 - előmelegítés 65 o C-ra, - paraffin metszet 20 97 o C - lehülés 65 o C-ra
Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! 3-lépéses módszer 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) Egér IgG 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum
Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! 3-lépéses módszer Nyúl anti-egér IgG Egér IgG 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum
Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! Anti-egér 3-lépéses módszer Anti-nyúl Nyúl anti-egér IgG Egér IgG 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum 3-5 x érzékenyebb! Mint a 2 lépéses
Antigénfeltárás Jelzőrendszer mérete ABC komplex Anti-IgG-PO Penetráció
Antigénfeltárás Jelzőrendszer mérete Polimer-konjugátum ABC komplex Anti-IgG-PO Penetráció Nagyobb méret hosszabb antigénfeltárás!
CD3 Ig szupercsalád Legkorábban megjelenő T-sejt marker (ALL) Dako-Flex Dako Flex+ ABC 1:200 1:400 1:200
EGFR Óriássejtes csonttumor (GCTB) ABC- endogén biotin Dako-Flex
HER2 3+ emlőrák Dako Flex + ABC Dako-Flex Polimer
HER2 1+ emlőrák Polimer 1 ABC Dako-Flex Polimer 2
HER2 3+ emlőrák Flex feltáró-deparaffinálás után
Kollagén XVII Melanoma Flex feltáró-dep. után Polimer
Immunhisztokémia Inkubációs idő Szobahő 120 Szobahő 30 EGFR Oesophagus SSC
Immunhisztokémia Mosó puffer ph-ja CK 20 vastagbélrák TBS ph 7,4
Immunhisztokémia Mosó puffer ph-ja CK 20 vastagbélrák TBS ph 8,0 TBS ph 7,4
Immunhisztokémia Jellemző hibák -Technológiai CD79a HIER CD3 Széli intenzitás különbség Kiszáradási gyűrű Drasztikus antigénfeltárás alulrögzültség
Immunhisztokémia Jellemző hibák -Technológiai CD79a HIER CD3 Széli intenzitás különbség Kiszáradási gyűrű Drasztikus antigénfeltárás alulrögzültség Sejtbiológiai megfeleltetés Szubcelluláris lokalizáció TdT CD20 CD30 ALK-1
Immunhisztokémia Kontrollok Antigén kimerítés (negatív) Alacsony antigénszint (pozitív) Endogén beépített pozitív kontroll ER
Immunhisztokémia Kontrollok Antigén kimerítés (negatív) Alacsony antigénszint (pozitív) Endogén beépített pozitív kontroll Univerzális multikontroll ER Tonsilla, pancreas, máj, appendix Túlrögzült > 48-72 h
Automatizálás STANDARDIZÁLÁS Pre-analitika (?) - rögzítést nem! Analitika - teljes Poszt-analitika (-/+) - támogathat (képanalízis)
Automatizált immunfestés előnyei Az inkubáció/mosás/előhívás kontrollja - standard körülményei: - NINCS: kávé/ebéd szünet, szabadság, csúszás - az eredmények reprodukálhatósága jelentősen javul Immunigények és a munkaerő ritkán van szinkronban - a vizsgálat átfutási ideje csökken és egyenletesebbé válik Érzékeny és standardizált jelző és előhívó rendszer - rövid inkubációk, az automata naponta többször indítható Az asszisztensek tapasztalatbeli különbségei kevésbé dominálnak - javulhat a hatékonyság, a minőség és a megbízhatóság is Automatizálással a munkaerő ~30-40 %-a felszabadítható - javul a munkaerő kihasználtsága egyéb fontos teendők
Az immunhisztokémiai asszisztensek fontos kiegészítő tevékenységei Új antitestek tesztelése Pozitív kontrollok regisztrálása, metszése Új módszerek, antigénfeltáró pufferek tesztelése A reakciók eredményének technikai monitorozása (belső minőségbiztosítás) Részvétel külső minőségbiztosításban A reagensek és módszerek gondozása (standard protokollok) Kutatási célú reakciók Tanácsadás, asszisztens oktatás Adminisztráció: ISO, immunkérések, TB elszámolás stb.
Automatizált kettős jelölés EnVision Doublestain System K5361 1. 2. PO/DAB AP/F-Red Ig könnyűlánc Ig könnyűlánc
Polimer-enzim detektálók Kettős jelölés CD1a - CD68 Reaktív nyirokcsomó
Az immunhisztokémia minőségbiztosítása TECHNOLÓGIAI KÜLSŐ BELSŐ ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS Standard protokoll követése Szövetfeldolgozási és festési lépések monitorozása Festett metszetek ellenőrzése Kontroll festések ellenőrzése Hibás minták kigyűjtése Hiba meghatározása Hiba javítása A folyamat rögzítése
Az immunhisztokémia minőségbiztosítása TECHNOLÓGIAI KÜLSŐ BELSŐ ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS Standard protokoll követése Szövetfeldolgozási és festési lépések monitorozása Festett metszetek ellenőrzése Kontroll festések ellenőrzése Hibás minták kigyűjtése Hiba meghatározása Hiba javítása A folyamat rögzítése Technikai kontrollok ellenőrzése Sejt-/patobiológiai korreláció Endogén pozitív kontrollok Panel részeként a kizáró reakciók megfelelősége Egyezés, eltérés okainak elemzése, javítása
Immunhisztokémia Alapszabályok ELŐHÍVÁS standard DAB kit (esetenként AEC vagy VIP) KONTROLLOK (endogén +kontroll; multiszövet kontroll) Gazdaságosság (érzékeny módszer >Ab hígítás) Automatizálás (a standardizálás preferált módja) Finomhangolás (minden új primer Ab titrálás; tárolás!) Biotin-mentes DETEKTÁLÓ (Jelerősített, 3 lépéses) ELŐHÍVÁS standard DAB kit (esetenként AEC vagy VIP) KONTROLLOK (endogén +kontroll; multiszövet kontroll) Gazdaságosság (érzékeny módszer >Ab hígítás) Automatizálás (a standardizálás preferált módja) Finomhangolás (minden új primer Ab titrálás; tárolás!)
Köszönet Parsch Edit Dr. Zsákovics Ivett Tamási Anna Kiss Renáta