DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Kokcidiosztatikumok vizsgálata tejben és tejtermékekben folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás technikával Nász Szilárd Témavezető: Dr. Eke Zsuzsanna egyetemi adjunktus Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémiai Tanszék Kémia Doktori Iskola vezetője: Dr. Inzelt György Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia program vezetője: Dr. Záray Gyula Budapest 2012
1. Bevezetés Napjainkban egyre gyakrabban felmerülő téma az élelmiszerek biztonsága. Sokan úgy gondolják, hogy az a rengeteg anyag, amit beletesznek biztos káros. Mások úgy vélekednek, hogy a mai élelmiszer-ellenőrző rendszereknek köszönhetően csak biztonságos termékek juthatnak el a fogyasztókhoz. A valóság valahol a kettő között helyezkedik el. Az ellenőrzéseken átesett élelmiszerek többnyire nem jelentenek veszélyforrást a fogyasztókra nézve. Az élelmiszerbiztonság fejlődésének köszönhetően, manapság már rendkívül széleskörű szabályozási és felügyeleti rendszerek működnek a lehető legjobb minőségű és hamisítatlan termékek előállítására vonatkozóan. Az élelmiszerszennyezés egyik forrása lehet, hogy állategészségügyi megfontolásból bizonyos állatok etetésére szánt takarmányok tartalmazhatnak különböző antibiotikus hatással rendelkező hatóanyagot, illetve ezek kombinációit. A takarmánygyártás során felmerülő keresztszennyezések következtében számos emberi fogyasztásra szánt állati eredetű termékben is megjelenhetnek az alkalmazott antibiotikumok maradványai. Mivel az említett termékek ilyen formában az emberi egészségre nézve veszélyt jelenthetnek, korszerű és hatékony analitikai ellenőrző módszerekre van szükség a gyógyszermaradványok minőségének és mennyiségének a megállapítására. 2. Célkitűzés Az állattartó gazdaságban jelenleg számos kokcidiosztatikum van használatban. Felhasználásuk feltételeit az Európai Unió az 1831/2003/EK rendeletben foglalta össze és rendszerezte. Segítségükkel a kokcidiózis ellen vívott harcot jóval hatékonyabbá tették. Egyre növekvő jelenlétük és az úgynevezett elkerülhetetlen átvitel ugyanakkor újabb rendelet bevezetését követelte meg. A 124/2009/EK rendeletben tizenegy, egymástól szerkezetileg nagymértékben különböző, kokcidiosztatikus hatással rendelkező vegyületre határoztak meg megengedett legnagyobb szinteket állati eredetű élelmiszerekben. E rendelet megfelelő végrehajtásának ellenőrzéséhez olyan analitikai mérőmódszerekre van szükség, amelyekkel lehetőség nyílik a hatóanyagok élelmiszerekben jelenlévő koncentrációinak feltérképezése. - 2 -
Doktori munkám céljául ennek megfelelően olyan analitikai módszer kifejlesztését tűztem ki, amellyel a különböző kémiai csoportokba tartozó kokcidiosztatikumok (halofuginon, diklazuril, nikarbazin, dekoquinát, robenidin, lazalocid, monenzin, narazin, szalinomicin, maduramicin, szemduramicin) alacsony koncentrációban is meghatározhatók tej és tejtermék mintákból. A kihívást elsősorban a szerkezeti különbségek, az összetett mátrixok és az alacsony koncentrációszintek jelentik. Terveim között szerepelt egy hatékony mintaelőkészítési módszer kialakítása, melynek segítségével a kokcidiosztatikumok akár egymás mellett meghatározhatók. Ez magában foglalta több, egyszerű és összetett mintaelőkészítési eljárás fontolóra vételét, kidolgozását és összehasonlítását. Célom volt továbbá a kromatográfiás és tömegspektrometriás műszeres paraméterek változtatásával az optimális értékek kialakítása a maximális szelektivitás és érzékenység elérése érdekében. A módszerfejlesztést követően, fontosnak véltem a kifejlesztett módszerek analitikai teljesítményjellemző paramétereinek meghatározását. Továbbá, céljaim között szerepelt még a kialakított módszerek alkalmazása egy fermentációs kísérletben, melyben megvizsgálhatom a hatóanyagok erjesztésre gyakorolt hatását, illetve az erjesztés kokcidiosztatikumokra gyakorolt hatását szennyezett nyersanyagok által készített tejtermékekben. 3. Alkalmazott módszerek 3.1 Módszerfejlesztés Mivel az Európai Unió által meghatározott koncentrációszintek meglehetősen alacsonyak és a mérni kívánt minták összetettek, a módszerfejlesztés során fontosnak tartottam az LC-MS körülmények széleskörű optimálását a maximális érzékenység és szelektivitás elérése érdekében. Mindez magában foglalta egy megfelelő detektálás és elválasztás kialakításának szükségességét. Ezért első lépésként az ideális detektálás kialakításához kiválasztottam a legjobb szelektivitást és jel intenzitást biztosító ionátmeneteket, illetve az optimális fragmentor, ütközési cella feszültségeket, valamint optimáltam az ionforrásban alkalmazott körülményeket. A megfelelő elválasztás elérése érdekében összehasonlítottam különböző állófázissal, szemcsemérettel és dimenziókkal rendelkező oszlopokat. A legjobb elválasztást egy C8-as fordított fázisú analitikai oszlop nyújtotta. - 3 -
A minták mérésére mindemellett elengedhetetlen egy megfelelő mintaelőkészítés kialakítása. Megvizsgáltam az egyszerű oldószeres extrakció, a mátrix szilárd fázisú diszperzió, illetve a szilárd fázisú extrakció alkalmazhatóságát. A kutatás során azt tapasztaltam, hogy az egyszerű oldószeres extrakció a mátrixhatásoknak köszönhetően instabillá teszi az analitikai válaszjeleket, míg a mátrix szilárd fázisú extrakció az alacsony visszanyeréseknek köszönhetően nem alkalmazható. A szilárd fázisú extrakciós eljárás vizsgálatát különböző minőségű és töltettömeggel rendelkező patronokkal végeztem el. A megfelelő mintaelőkészítést ennek köszönhetően egy oldószeres extrakciót és szilárd fázisú extrakciót alkalmazó kombinált módszerrel sikerült megvalósítanom. A módszer fejlesztése során széleskörűen tanulmányoztam a felmerülő ion szuppressziós jelenséget, melynek a mérési eredmények pontosságára gyakorolt negatív hatásait - a megfelelő mintaelőkészítés mellett - leginkább egy alkalmasan választott kalibrációs módszerrel tudtam kiküszöbölni. A kalibrációs technikák közül megvizsgáltam a standard oldatos kalibrációt, a standard addíciós eljárást, illetve a mátrixkalibrációt. Mindezek közül a mátrixkalibráció volt a legalkalmasabb a mennyiségi kiértékelésre. A mennyiségi meghatározás emellett megkövetelte több belső standard alkalmazását is. Mindezeket követően a kifejlesztett eljárásnak meghatároztam az analitikai teljesítményjellemző paramétereit úgy, mint szelektivitását, linearitását, érzékenységét, torzítatlanságát, precizitását, robusztusságát, kimutatási és meghatározási határát, CCα és CCβ értékeit, valamint egyéb analitikai jellemző paramétereit. A meghatározásokat elvégeztem tej és tejtermék minták esetén is mind a 11 célkomponenssel. Tejtermék minták esetén azonban az ionofórok közé tartozó lazalocid mérésétől el kellett tekintenem. E vegyület ugyanis a szilárd fázisú extrakció során jelentősen eltérő viselkedést mutatott a többi ionofórhoz képest. Ennek oka feltehetően, hogy míg a többi vizsgált ionofór monovalens, addig a lazalocid bivalens. A validált analitikai módszereket egy fermentációs kísérletben alkalmaztam. A kísérletben előzetesen kokcidosztatikumokkal szennyezett kiindulási anyagokból különböző erjesztési eljárásokkal joghurtot, kefirt és tejfölt állítottam elő. A kísérletben alkalmazott kontrollmintáknak és a szennyezett minták vizsgálatával arra a kérdésre kerestem a választ, hogy a kokcidiosztatikummal szennyezett tej alkalmas nyersanyaga lehet-e az savanyított tejtermékek gyártásának. - 4 -
3.2 Standard anyagok A szilárd formában rendelkezésemre álló standard anyagokból (dekoquinát, diklazuril, dinitrokarbanilid (DNC), maduramicin, monenzin, narazin, robenidin, szalinomicin, szemduramicint) és belső standard anyagokból (dekoquinát-d 5, diklazuril-bisz, DNC-d 8, robenidin-d 8, nigericin) elkészítettem az 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldatokat különböző oldószerekkel. Metanolban oldottam fel hét vegyületet, név szerint szalinomicint, monenzint, szemduramicint, maduramicint, narazint és nigericint, míg további három hatóanyag (robenidin, diklazuril, dinitrokarbanilid) és három belső standard (robenidin-d 8, diklazuril-bisz, dinitrokarbanilid-d 8 ) feloldására dimetilszulfoxidot használtam. Dekoquinátot, és a hozzá tartozó belső standardet tiszta acetonitril nem oldotta, ezért 6% mennyiségű hangyasavat is hozzáadtam a törzsoldathoz a teljes oldódás érdekében. Lazalocidot és halofuginont a beszállító 100 μg/ml koncentrációjú acetonitriles oldatban bocsátotta a rendelkezésemre. A további 10 μg/ml-es és alacsonyabb koncentrációval rendelkező munkaoldatokat a megfelelő törzsoldatok összeöntésével és acetonitrillel történő hígításával készítettem. 3.3 Mintaelőkészítés Kísérleteim során igénybe vettem egy Hermile típusú (Z230A) centrifugát, egy Barkley típusú bepárló készüléket, egy szilárd fázisú extrakcióra alkalmas Supelco Visiprep típusú vákuumkádat, egy Millipore Direct Q5 típusú víztisztítót, továbbá egy Lauda típusú szabályozható vízmelegítőt. A szilárd fázisú extrakció elvégzéséhez különböző tölteteket használtam (Supleco Supel Select HLB (60 mg), Oasis HLB (60 mg), Varian Bond Elut Plexa (60 mg), Varian Bond Elut Certify II (200 mg), Agilent OPT (60 mg), Agilent C18 (ec) (200 mg), Agilent C18 (ec) (500 mg), Phenomenex Strata-X (200 mg)), míg a mátrix szilárd fázisú diszperzióra alkalmas szorbensként Isolute C18 (ec) fázist alkalmaztam. Az erjesztéshez FD-DVS XPL-1 exact Plus mezofil vaj kultúrát (termékszám: 675876), FD-DVS YC-X11 Yo-Flex termofil joghurt kultúrát (termékszám: 600870) és FD-DVS LAF-3 élesztőgombát (termékszám: 200941) használtam. A mintaelőkészítéshez és eluenskészítéshez minden esetben analitikai tisztaságú oldószert alkalmaztam (acetonitril, metanol, hexán, aceton, etil-acetát, diklórmetán, - 5 -
dimetilszulfoxid). Az eluensek és minták adalékolásához hangyasavat (98-100%), illetve analitikai tisztaságú nátrium-formiátot használtam. 3.4 LC-MS A rendelkezésemre álló Agilent 1200-as típusú nagyhatékonyságú kromatográfiás rendszert egy Agilent 6460-as típusú hármas kvadrupól tömegspektrométerrel (G6460A) kapcsoltam össze. A moduláris felépítésű kromatográfiás rendszer tartalmazott egy gázmentesítő egységet (G1379B), egy bináris pumpát (G1312A), egy automata injektort (G1367B), egy injektor termosztátot (G1330B) és egy oszloptér termosztátot (G1316A). A kapcsolt készülék online vezérlésére és a mérések által szolgáltatott nyers adatok kiértékelésére az Agilent MassHunter szoftvercsomagot használtam. 3.5 A kialakított módszerek A tej mintákból 2 ml-t, míg a tejtermék mintából 2 g-ot üres centrifuga csőbe helyeztem és hozzáadtam 50 µl mennyiségű belső standard oldatot, illetve - szükség esetén - a standard oldat megfelelő mennyiségét. A mintát vortex keverő használatával 30 másodpercig homogenizáltam. Ezt követően 2 ml térfogatú acetonitrilt pipettáztam a centrifuga csőbe és vortex keverővel újra 30 másodpercig kevertettem, majd 15 percig 3000 rpm-es fordulatszámon centrifugáltam a mintát. Az így kapott mintákból tej minták esetén 3 ml, tejtermékek esetén 2,5 ml felülúszót átpipettáztam egy tiszta centrifuga csőbe. Ezeket 6 ml vízzel homogenizáltam. Az Oasis HLB (60 mg) típusú SPE tölteteket 3 ml acetonitrillel, illetve 3 ml vízzel kondícionáltam, majd lassan felvittem a patronra a vízzel higított oldatot. A töltetet 3 ml nagytisztaságú vízzel mostam, és 15 perc alatt szobahőmérsékleten, levegő folyamatos átáramoltatásával kiszárítottam. Elúciós oldószernek 3 ml acetonitrilt alkalmaztam. Az így kapott eluátumot szobahőmérsékleten, N 2 gáz segítségével szárazra pároltam. A maradék visszaoldását 500 µl 1:1 arányú acetonitril/vízzel hajtottam végre és végül injektáltam a LC-MS berendezésbe. A műszeres körülmények az 1-es és 2-es táblázatban találhatók összefoglalva. - 6 -
1. Táblázat: Az optimált kromatográfiás körülmények Analitikai oszlop Agilent Eclipse XDB C8 (3 150 mm, 3,5 μm) Előtét oszlop Zorbax Eclipse Plus C8 (2,1 12.5 mm, 5 μm) Eluens A: water (0,1 % HCOOH); B: acetonitrile (0,1 % HCOOH) Áramlási sebesség 0,5 ml/min Oszlop termosztált hőmérséklet 30 C Injektor hőmérséklet 4 C Injektálási térfogat 30 μl Gradiens program Idő (perc) B % 1 5 4 95 15 95 Idő ablakok helye Idő ablak Idő (perc) Dwell time (ms) 1. 0-6,3 50 2. 6,3-7,1 50 3. 7,1-15 25 2. Táblázat: Az optimált MRM paraméterek Vegyület neve Szülőion Leányion(ok) Fragmentor Ütközési (V) energia (ev) Dekoquinát 418,1 372,1 / 204,0 180 20 / 45 Diklazuril 406,8 335,9 80 15 404,8 333,9 80 15 4,4 -dinitrokarbanilid 301,0 137,0 / 107,7 80 10 / 45 Halofuginon 415,9 138,0 / 121,0 120 15 / 30 Lazalocid 613,2 577,2 / 377,2 140 35 / 40 Maduramicin 939,5 895,5 / 877,5 220 55 / 30 Monenzin 693,3 675,3 / 461,1 160 40 / 60 Narazin 787,4 531,2 / 431,2 200 50 /60 Robenidin 333,9 155,0 / 138,0 100 20 / 25 Szalinomicin 773,4 531,1 / 431,1 240 55 / 50 Szemduramicin 895,4 851,4 /833,4 160 35 /35 Dekoquinát-d 5 (ISTD) 423,1 377,1 / 205,0 160 25 /45 Diklazuril-bisz (ISTD) 420,8 349,8 80 20 418,8 347,9 80 20 DNC-d 8 (ISTD) 309,0 141,1 / 111,1 80 10 / 45 Nigericin (ISTD) 747,4 703,3 / 501,2 200 60 / 60 Robenidin-d 8 (ISTD) 342,0 159,0 / 142,0 100 20 / 25-7 -
4. Validálási eredmények A validálás során adalékolt és kokcidiosztatikumokat nem tartalmazó tej és tejtermék minták alkalmazásával bizonyítottam a kidolgozott módszerek megfelelő mértékű szelektivitását. A módszerek minden vizsgált vegyületre lineárisnak bizonyultak a megengedett legnagyobb szint (ML) felétől az ötszöröséig tartó tartományban. A torzítatlanság három különböző napon végzett mérések alapján tej minták esetén 77,1% és 118,2% között, tejtermék minták esetén 82,5% és 129,9% között volt. A relatív standard deviációk az ML koncentrációnál ugyancsak a három különböző napon végzett mérések alapján lazalocidot leszámítva tej minták esetén 3,5% és 32,7% közé, tejtermékek esetén 6,2% és 34,5% közé estek. Az LOQ a legtöbb esetben jóval az ML szint alattinak bizonyult. 5. Az értekezés tudományos eredményei, tézispontjai Műszeres paraméterek Az általam kidolgozott LC-MS módszerrel lehetőség nyílik a 124/2009/EK rendeletben felsorolt tizenegy, egymástól szerkezetileg nagymértékben különböző, kokcidiosztatikus hatással rendelkező vegyület egymás melletti meghatározására. Mintaelőkészítés Tej minták esetén az egyszerű oldószeres extrakciós eljárás nem biztosít megfelelően tiszta analitikai mintát, a mátrix szilárd fázisú diszperziós technika pedig alacsony visszanyerési hatékonysága miatt nem alkalmazható a vizsgált kokcidiosztatikumok LC-MS technikával történő meghatározásához. Az általam kidolgozott, oldószeres extrakciót és szilárd fázisú extrakciót alkalmazó kombinált mintaelőkészítési módszer segítségével tejből, illetve erjesztett tejtermékekből minőségi és mennyiségi LC-MS mérésre alkalmas analitikai minták kaphatók. A mintaelőkészítés során a lazalocid a többi ionofórhoz képest számottevően eltérő viselkedést mutat. E tekintetben a kritikus lépésnek a szilárd fázisú extrakció tekinthető. A jelenség feltételezhető oka, hogy a vizsgált ionofórok közül egyedül a lazalocid bivalens. - 8 -
Mennyiségi meghatározás A lehető legjobb precizitás izotópjelzett belső standardek alkalmazásával érhető el. Tekintettel azonban ezek árára és a beszerzési nehézségekre, ésszerű kompromisszumot jelenthet az ionofórok esetén a nigericin, diklazuril esetés a diklazuril-bisz és halofuginon esetén a robenidin-d 8 alkalmazása. A mennyiségi kiértékelést lehetővé tevő torzítatlanság és precizitás eléréséhez elengedhetetlen a mátrixkalibráció alkalmazása. A tejre és a tejtermékekre külön mátrixkalibrációk felvételére van szükség. Ugyanakkor a mintaszám csökkentése érdekében elfogadható kompromisszumot jelent a tejföl és kefir minták kiértékelését is joghurt mintával készült kalibráció alapján végezni. Validálás Validálási eredményeim alapján az általam kidolgozott módszerek az Európai Unió előírásainak megfelelően a lazalocid kivételével alkalmasak a 124/2009/EK rendeletben megadott kokcidiosztatikumok mennyiségi meghatározására tejből, illetve savanyított tejtermékekből. A lazalocidra tej minták esetén tájékoztató jellegű adatot kaphatunk, kimutatása esetén azonban további megerősítő, mennyiségi meghatározást lehetővé tévő mérési módszer alkalmazása szükséges. Savanyított tejtermékek A kokcidiosztatikumokkal szennyezett nyers tej illetve tejszín nem hasznosítható savanyított tejtermékek előállításához. Bár a vizsgált vegyületek ugyan viszonylag magas (100 ng/ml) koncentrációban sem akadályozták az erjesztési folyamatot, sajnos az erjesztés során koncentrációjuk nem csökken. - 9 -
6. A témában megjelent tudományos közlemények 6.1 Cikkek: Development and validation of a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric method for determination of eleven coccidiostats in milk Szilárd Nász, Lajos Debreczeni, Tamás Rikker, Zsuzsanna Eke Food Chemistry, Volume 133, Issue 2, Pages 536-543 (2012) Impact factor: 3.655 Determination of coccidiostats in milk products by LC MS and its application to a fermentation experiment Szilárd Nász, Etelka M. Károlyné, Tamás Rikker, Zsuzsanna Eke Chromatographia, Volume 75, Numbers 11-12, Pages 645-653 (2012) Impact factor: 1.195 6.2 Előadások: Determination of coccidiostats in milk and milk products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry Szilárd Nász CEEPUS 11 th International Symposium and Summer School on Bioanalysis Graz, Austria (2011) Method development for determination of anticoccidial drugs in milk Szilárd Nász CEEPUS 10 th International Symposium and Summer School on Bioanalysis Zagreb, Croatia (2010) 6.3 Poszterek: Determination of coccidiostats in fermented milk products Szilárd Nász, Zsuzsanna Eke HPLC2011 Budapest, Hungary (2011) Determination of coccidiostats in milk by LC-MS/MS Szilárd Nász, Zsuzsanna Eke 28 th International Symposium on Chromatography Valencia, Spain (2010) - 10 -