ANYAMOLEKULÁKTÓL A METABOLITIG SZINTETIKUS KANNABINOIDOK KIMUTATÁSA A SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANI INTÉZETÉBEN

Átírás

1 SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM TOX 2018 Tudományos Konferencia Magyar Toxikológusok Társasága Október , Lillafüred ANYAMOLEKULÁKTÓL A METABOLITIG SZINTETIKUS KANNABINOIDOK KIMUTATÁSA A SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANI INTÉZETÉBEN Sija Éva, 2 Berkecz Róbert, 1 Institóris László, 2 Körmöczi Tímea, 1 Kereszty Éva M. 1 SZTE Igazságügyi Orvostani Intézet 2 SZTE Orvosi Vegytani Intézet

2 Szintetikus kannabinoid történelem Szintetikus kannabinoidok megjelenése, népszerűségük drasztikus növekedése 2014 vége 2015 eleje: Rutin analitikai módszer kifejlesztés SZTE Orvosi Vegytani Intézet SOTE, Igazságügyi és Biztosítás-orvostani Intézet ISZKI OITI 2015 februárjában elindultak a rutin mérések BSZKI újabb és újabb standardak

3 Anyamolekula kimutatása Mintaelőkészítés és extrakció Acetonitriles extrakció ammónium-szulfát? ml ACN? - Hexán - Etil-acetát - Butil-acetát 400 μl puffer + enzim?? ml vizelet/vér ST mix? deuterált belső standard TOX 2015 kongresszus

4 Anyamolekula kimutatása Mintaelőkészítés és extrakció Etil-acetátos (új) 400 μl puffer + enzim 2 ml vizelet 4 ml EtOAc 60 µl 5 % ammónia 40 μl SC mix (80 ng/ml) + 2,5 μl deuterált belső standard (2 μg/ml) AB-FUBINACA D 4 Vortex 5 percet állni hagyni 8 perc centrifuga, 2500 rpm Felülúszó leszívása Bepárlás 200 μl 0,1% hangyasav 50/50 víz/acn-ben visszaoldani Agilent 1100 HPLC /Finnigan TSQ 7000, Thermo Fisher Scientific

5 Eredmények Visszanyerés vizsgálat 1,6 ng/ml SC standard keverék (vizeletminta) Barna Boglárka: Kihívások a designer drogok vizeletmintából történő kimutatásában - Tudományos Diákköri Konferencia - Marosvásárhely, 2018

6 Szintetikus kannabinoidok koncentrációja vizeletben ( ) 5F-AMB 1 eset 1,27 ng/ml MDMB-CHMICA 2 eset 0,61 4,18 ng/ml AB-CHMINACA 2 eset 0,10 0,24 ng/ml ADB-FUBINACA 19 eset 0,10 1,90 ng/ml AMB-FUBINACA 6 eset 0,11 5,49 ng/ml AB-FUBINACA 10 eset 0,15 10,0 ng/ml 5F-MDMB-PINACA 10 eset 0,07 14,4 ng/ml THC KONCENTRÁCIÓJA A VIZELETBEN? 50 vizeletmintából - 34 esetben 1 ng/ml alatt - csupán 4 esetben 5 ng/ml felett METABOLITOK KIMUTATÁSA?

7 AB-CHMINACA vizeletben...the concentrations of the metabolites M1 and M3 in urine of the abuser were found to be 52.8 ± 3.44 and 41.3 ± 5.04 ng/ml respectively. In our previous study, it was impossible to detect unchanged AB-CHMINACA from the urine specimen of the same individual. (M1): 4-hydroxycyclohexylmethyl AB-CHMINACA (M3): N-[[1-(cyclohexylmethyl)-1H-indazol-3-yl]carbonyl]-lvaline AB-CHMINACA Wurita A, Hasegawa K, Minakata K, Gonmori K, Nozawa H, Yamagishi I, Suzuki O, Watanabe K, Kanako Watanabe Identification and quantification of metabolites of AB- CHMINACA in a urine specimen of an abuser Legal Medicine 2016 March;19, M3 M1

8 MDMB-CHMICA és Freiburg Florian Franz, Verena Angerer, Bjoern Moosmann, Volker Auwärter Phase I metabolism of the highly potent synthetic cannabinoid MDMB CHMICA and detection in human urine samples Drug Test Anal May;9(5):

9 Szintetikus kannabinoidok metabolitjainak azonosítása májmikroszómából Mintaelőkészítés 2,5 µl humán májmikroszóma (50 egészséges donor) 0,5 µl szubsztrát (Szintetikus kannabinoid 1 mg/ml) 3 µl NADPH 5 µl SOD (szuperoxid-dizmutáz) 10 µl foszfát puffer (ph 7,4) 29 µl H 2 O 37 C-on 30 perces inkubáció 160 µl NH 4 OH (4:1 H 2 O:NH 4 OH (25%)) 300 µl EtOAc (etil-acetát) 5 perc vortex, 5 perc állás Centrifugálás (10 perc, rpm) Felülúszót bepároljuk Visszaoldás: 100 µl 50:50 H 2 O:ACN 0,1% FA

10 LC-MS/MS mérés paraméterei Waters Acquity I-Class UPLC Phenomenex Kinetex C18 oszlop (150 x 2,1 mm, 2,6 μm) Phenomenex C18 előtét oszlop (4 x 2 mm, 5 μm) A eluens: 0,1 % FA H 2 O-ben B eluens: 0,1 % FA ACN-ben Oszlop termosztát: 50 C Áramlási sebesség: 0,4 ml/min Grádiens program: 0-30 min % B Injektálási térfogat: 10 µl Thermo Scientific Q Exactive Plus Orbitrap tömegspektrométer (átfogó, célzott) Positív mód, HESI-II forrás Kapilláris hőmérséklet: 250 C, spray feszültség: 3,5 kv S-lencse RF szintje 50, porlasztó gáz áramlás 50, kúpgáz áramlás 3 és segédgáz áramlás 13 Mérési tömegtartomány: 66, m/z, felbontás (MS), (PRM) AGC beállítások: 3 x 10 6 töltés (MS), 2 x 10 5 töltés (PRM), izolaciós ablak: 2 m/z Maximális injektálási idő: 100 ms (MS), 100 ms (PRM) Ütközési energia: 15, 25, 55 ev (PRM)

11 ADB-FUBINACA (I) egyik leggyakoribb SC-ja Metabolizmusa jól ismert már az irodalomból Haláleset: 23 éves férfi Toxikológiai vizsgálat eredménye: 285 ng/ml N-etil-hexedron (vér) ADB-FUBINACA nem volt kimutatható, de a metabolit analízis megerősítette az ADB- FUBINACA fogyasztást

12 ADB-FUBINACA (II) egyik leggyakoribb SC-ja ADB-FUBINACA fogyasztás a börtönben (?) 34 éves fogvatartott férfi Előző nap eltávozáson volt otthonában Másnap reggel a börtönben munkafelvétel előtt rosszul lett Rutin toxikológiai analízis: ADB FUBINACA (Vér: 9,8 ng/ml, Vizelet: 0,13 ng/ml) Drogfogyasztás otthon/börtönben/body packing? Metabolit vizsgálat - vérben nem volt metabolit (reggeli) - vizeletben igen (esti)

13 CUMYL-PEGACLONE 2017-ben megjelent SC Mogler L, Wilde M, Huppertz LM, Weinfurtner G, Franz F, Auwärter V. Phase I metabolism of the recently emerged synthetic cannabinoid CUMYL-PEGACLONE and detection in human urine samples. Drug Test Anal May;10(5): in vivo metabolit

14 CUMYL-PEGACLONE 2017-ben megjelent SC Májmikroszóma ionkromatogramja M45 M51 CUMYL-PEGACLONE M9 M41 M19 M M53 M46 M43 M44 M52 M25 14 M40 M2 M3 M4 M M M12 M13 M M M21M22 M23 M24 M27 M28 M26 M29M30 M32 M33 M34 M M15 M16 M M8 Abszolút intenzitás M47 M48 M49 M M17 M M18 M M M39 M M37 M Retenciós idő (perc) Humán vizelet ionkromatogramja M M16 M U CUMYL-PEGACLONE M39 17 U5 M Retenciós idő (perc) M53 U4 16 M40 M42 M43 U6 U7 U8 U46 U9 M47 M49 U10 M M M7 M8 M9 M M12 M11 M13 M15 M18 U3 M23 M24 M27 M30 M31 M33 M34 M M25 M14 M M M19 M Közel 50 metabolit meghatározása M51 M U1 M1 Abszolút intenzitás Biotranszformációk: anya molekula dealkilált forma mono-hidroxilált + dealkilált forma karboxilált forma mono-hodroxilált + dehidrogenált forma mono-hidroxilált forma mono-hidroxilált + karbonilált forma di-hidroxilált forma Csúcsterület arány 1:400 26

15 További célok II. fázisú konjugációs metabolitok azonosítása (humán májsejt (HepG2), patkány májperfúziós vizsgálat (puffer gőztérben)) Lehetőségek in vivo in vitro humán vizelet humán vér állatkísérletek májmikroszóma májsejt májperfúziós vizsgálatok Klinikai és rendőrségi minták Fázis I. Fázis I. és II. Fázis I és II.

16 TOVÁBBI CÉLLJAINK II. fázisú konjugációs metabolitok meghatározása (májsejtes és májperfúziós vizsgálatokkal) További szintetikus kannabinodok metabolizmusának tanulmányozása Az anyavegyület kimutatása sokszor csupán pár órán keresztül lehetséges - Alkalmas a metabolit a fogyasztás igazolására, előszűrésre Metabolitok rutinanalízisbe történő beépítése MDMB-FUBINACA ADB-FUBINACA

17 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET! A kutatás az EFOP pályázat keretén belül valósult meg.