vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.6 1 2.6.17. IMMUNGLOBULIN ANTIKOMPLEMENT- AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA Az immunglobulin antikomplement-aktivitásának (ACA) méréséhez meghatározott mennyiségű vizsgálati anyagot (10 mg immunglobulint) meghatározott mennyiségű tengerimalackomplementtel (20 CH 50 ) inkubálunk és a megmaradt komplement-aktivitást titráljuk. Az antikomplement-aktivitás a megkötött komplementnek a 100%-nak tekintett komplementkontrollhoz viszonyított, százalékban kifejezett aránya. A komplement-aktivitás (CH 50 ) hemolitikus egysége az a komplement mennyiség, amely az adott kísérleti körülmények között 5. 10 8 optimálisan szenzibilizált vörösvértestből 2,5. 10 8 számúnak a hemolízisét eredményezi. Magnézium-kalcium alapoldat. 1,103 g R kalcium-kloridot és 5,083 g R magnézium-kloridot R vízben 25 ml-re oldunk. Barbitál-tompító alapoldat. 207,5 g R nátrium-kloridot és 25,48 g R barbitál-nátriumot 4000 ml R vízben oldunk és az oldat ph-ját 1 M sósavval 7,3-s értékre állítjuk be. Az oldathoz 12,5 ml magnézium-kalcium alapoldatot elegyítünk és R vízzel 5000 ml-re hígítjuk. Membránszűrőn (pórusméret 0,22 μm) megszűrjük. 4 C-on, üvegedényekben tároljuk. Zselatin oldat. 12,5 g R zselatint kb. 800 ml R vízben oldunk és az oldatot forrásban lévő vízfürdőben felmelegítjük. Ezután 20 C-ra lehűtjük és R vízzel 10 literre hígítjuk. Membránszűrőn (névleges pórusméret 0,22 μm) megszűrjük. 4 C-on tároljuk. Kizárólag tiszta oldatok használhatók. Citrát oldat. 8,0 g R trinátrium-citrátot, 4,2 g R nátrium-kloridot és 20,5 g R glükózt 750 ml R vízben oldunk. Az oldat ph-ját R citromsav 100 g/l töménységű oldatával 6,1 értékre beállítjuk és térfogatát R vízzel 1000 ml-re egészítjük ki. Zselatin-barbitál tompítóoldat. 4 térfogat zselatin oldatot 1 térfogat barbitál-tompító alapoldattal elegyítünk. Szükség esetén az oldat ph-ját 1 M nátrium-hidroxid oldattal vagy 1 M sósavval 7,3 értékre beállítjuk. 4 C-on tároljuk. Az oldatot naponta frissen készítjük. Stabilizált birkavér. 1 térfogat birkavért 1 térfogat citrát oldatban felfogunk és elkeverünk. 4 C-on tároljuk legalább 7, de legfeljebb 28 napig. (Stabilizált birkavér és birka-vörösvérsejt a kereskedelemből beszerezhető.) Hemolizin. Nyulakból nyert birka-vörösvérsejt elleni antiszérum. (Ilyen antiszérum a kereskedelemből beszerezhető.) Tengerimalac-komplement. Legalább tíz tengerimalac véréből készített szérumot egyesítünk. A szérumot a megalvadt vérből kb. 4 C-os hőmérsékleten, centrifugálással különítjük el. Az egyesített szérumot kis részletekben, 70 C alatt tároljuk. VIZSGÁLAT Standardizált, 5%-os birka-vörösvérsejt szuszpenzió készítése. Megfelelő térfogatú, stabilizált birkavérből centrifugálással elkülönítjük a vörösvérsejteket. Legalább háromszor mossuk zselatin-barbitál tompítóoldattal, majd ugyanezen oldattal készítjük el belőle az 5% V/V-os szuszpenziót. A szuszpenzió vérsejtkoncentrációját a következőképpen mérjük: a szuszpenzió 0,2 ml-ét 2,8 ml R vízhez adjuk és a hemolizált oldatot 5 percig 1000 g-vel centrifugáljuk; a vérsejtkoncentráció akkor megfelelő, ha a felülúszó folyadék 541 nm-en mért
vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.6 2 abszorbanciája (2.2.25) 0,62±0,01. A vérsejtkoncentráció zselatin-barbitál tompítóoldat hozzáadásával a következő képlet alapján korrigálható: V f Vi A = 0,62 V f = a végső, korrigált térfogat, V i = a kiindulási térfogat, A = az eredeti szuszpenzió abszorbanciája 541 nm-en. A standardizált szuszpenzió milliliterenként kb. 1. 10 9 vértestet tartalmaz. A hemolizin titrálása A 2.6.17.-1. táblázat alapján elkészítjük a hemolizin-hígításokat. A kívánt hemolizinhígítás Zselatin-barbitáltompítóoldat térfogat (ml) 2.6.17.-1. táblázat A készítéshez felhasználandó hígítás (1/...) Hemolizin térfogat (ml) 7,5 0,65 nem hígított 0,1 10 0,90 nem hígított 0,1 75 1,80 7,5 0,2 100 1,80 10 0,2 150 1,00 75 1,0 200 1,00 100 1,0 300 1,00 150 1,0 400 1,00 200 1,0 600 1,00 300 1,0 800 1,00 400 1,0 1200 1,00 600 1,0 1600 1,00 800 1,0 2400 1,00 1200 1,0 3200 1,00 1600 1,0 4800 1,00 2400 1,0 * az elegy 1,0 ml-ét elöntjük. A hemolizin hígítási sorozatot tartalmazó kémcsövek mindegyikéhez, kezdve az 1/75 arányú hígítástól, 1,0 ml 5%-os birka-vörösvérsejt szuszpenziót keverünk. A keverékeket 30 percig 37 C-on inkubáljuk.
vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.6 3 Az inkubált keverékek mindegyikéből 0,2 ml-t újabb kémcsövekbe mérünk, majd mindegyikhez hozzáadunk 1,10 ml zselatin-barbitál tompítóoldatot és 0,2 ml hígított tengerimalackomplementet (pl. 1/150). Párhuzamosan két sorozatot készítünk. A nem-hemolizált vérsejt-kontrollhoz 3 kémcsövet készítünk elő: mindháromba 1,4 ml zselatinbarbitál tompítóoldatot és 0,1 ml 5%-os birka-vörösvérsejt szuszpenziót mérünk. A teljesen hemolizált kontrollhoz szintén 3 kémcsövet készítünk elő: mindháromba 1,4 ml R vizet és 0,1 ml 5 %-os birka-vörösvérsejt szuszpenziót mérünk. Az összes kémcsövet 37 C-on 60 percig inkubáljuk, majd 1000 g-vel 5 percig centrifugáljuk. A felülúszó folyadékok abszorbanciáját 541 nm-en mérjük (2.2.25). A hemolízis százalékos mértékét az alábbi képlet alapján minden egyes kémcsőre kiszámoljuk: Aa A1 100 A A b 1 A a = a hemolizin-hígításokat tartalmazó kémcsövek tartalmának abszorbanciája, A b = a 3 teljesen hemolizált kontroll oldat átlagos abszorbanciája, A 1 = a 3 nem-hemolizált vérsejt-kontroll átlagos abszorbanciája. Lineáris beosztású milliméter-papíron az ordinátán ábrázoljuk a hemolízis százalékos mértékét a hemolizin-hígítás reciprokának függvényében, mely utóbbit az abszcisszára visszük fel. A görbéből meghatározzuk az optimális hemolizin-hígítást. Kiválasztjuk azt a hígítást, amelynél a hemolizin mennyiségének további növelése már nem befolyásolja észrevehetően a hemolízis mértékét. Ezt a hígítást nevezzük 1 minimális hemolitikus egységnek (1 MHE) 1,0 ml-ben. A szenzibilizált birka-vörösvérsejtek készítéséhez használt optimálisan hemolizáló hemolizinhígítás ml-enként 2 MHE-t tartalmaz. A hemolizin-titrálás csak abban az esetben értékelhető, ha a hemolízis maximális mértéke 50 70%. Amennyiben a hemolízis maximális mértéke ezen a tartományon kívül esik, a titrálást kisebb vagy nagyobb mértékben hígított komplement-oldattal meg kell ismételni. Optimálisan szenzibilizált birka-vörösvérsejtek (hemolitikus rendszer) készítése Milliliterenként 2 MHE-t tartalmazó, hígított hemolizinből megfelelő térfogatú mennyiséget készítünk. Azonos térfogatú standardizált 5%-os birka-vörösvérsejt-szuszpenziót is készítünk. A hemolizin-hígítást a standardizált vörösvérsejt-szuszpenzióhoz keverjük. A keveréket 37 C-on 15 percig inkubáljuk. 2 8 C-on tároljuk és 6 órán belül használjuk fel. A komplement titrálása Megfelelő komplement-hígítást (pl. 1:250) készítünk zselatin-barbitál tompítóoldattal és a 2.6.17.-2. táblázat szerint járunk el. Két párhuzamos titrálást végzünk.
vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.6 4 2.6.17.-2. táblázat Kémcső jelzése A hígított (pl. 1:250) komplement térfogata ml-ben A zselatin-barbitáltompítóoldat térfogata ml-ben 1 0,1 1,2 2 0,2 1,1 3 0,3 1,0 4 0,4 0,9 5 0,5 0,8 6 0,6 0,7 7 0,7 0,6 8 0,8 0,5 9 0,9 0,4 10 1,0 0,3 11 1,1 0,2 12 1,2 0,1 Nem-hemolizált kontroll (három kémcső) 1,3 Teljesen hemolizált kontroll (három kémcső) 1,3 ml víz Mindegyik kémcsőbe 0,2 ml szenzibilizált birka-vörösvérsejtet mérünk, alaposan elkeverjük és 37 C-on 60 percig inkubáljuk. Ezután a kémcsöveket jeges vízben lehűtjük és 1000 g-vel 5 percig centrifugáljuk. A felülúszó folyadék abszorbanciáját 541 nm-en mérjük (2.2.25) és az alábbi összefüggés segítségével kiszámoljuk a hemolízis mértékét (Y): A A c b A1 A 1 A c = az 1. 12. jelzésű kémcsövek tartalmának abszorbanciája, A b A 1 = a teljesen hemolizált kontroll-oldatok átlagos abszorbanciája, = a nem-hemolizált vérsejt-kontrollok átlagos abszorbanciája. Kettős logaritmusos milliméter-papíron az abszcisszára az Y/(1 Y) értékeket visszük fel, az ordinátára pedig a hígított komplement mennyiségét milliliterben. Megrajzoljuk a kapott pontokhoz legjobban illeszkedő egyenest és leolvassuk az Y/(1 Y)=1,0 értéknek megfelelő ordináta-értéket, hogy megkapjuk az 50 %-os hemolízishez tartozó komplement térfogatát. Az alábbi kifejezés alapján kiszámoljuk a hemolitikus egységekben (CH 50 /ml) kifejezett aktivitást: Cd 5C a Cd = a komplement-hígítás reciproka,
vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.6 5 Ca = az 50%-os hemolízist eredményező hígított komplement térfogata ml-ben, 5 = szorzótényező, a vörösvértestek számának figyelembe vételére. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az összefüggés a 15%-os és a 85%-os hemolízis közötti szakaszon egyenest ad, melynek meredeksége 0,15 0,40, kedvező esetben 0,18 0,30. Az antikomplement-aktivitás vizsgálata A megtitrált tengerimalac-komplementet zselatin-barbitál tompítóoldattal hígítva 100 CH 50 /ml aktivitású komplement-hígítást készítünk. A vizsgálandó immunglobulintól és a validálási adatoktól függően a vizsgálandó immunglobulin ph-ját szükség esetén 7 értékre beállítjuk. Az 50 mg/ml töménységű immunglobulin-készítmények vizsgálatához a következő inkubációs keverékeket készítjük: 2.6.17.-3. táblázat Vizsgálandó immunglobulin Komplement-kontroll (két párhuzamos) Immunglobulin (50 mg/ml) 0,2 ml Zselatin-barbitál tompítóoldat 0,6 ml 0,8 ml Komplement 0,2 ml 0,2 ml Elvégezzük a vizsgálandó immunglobulin vizsgálatát és BRP humán immunglobulin felhasználásával ACA-negatív és ACA-pozitív kontrollokat készítünk a referenciakészítmény kísérőiratában leírtak szerint. Ha az immunglobulin-koncentráció eltér az 50 mg/ml értéktől, akkor a mintából és a zselatin-barbitál tompítóoldatból kisebb vagy nagyobb mennyiségeket használunk; pl. egy 30 mg/ml koncentrációjú immunglobulin-készítményből 0,33 ml-es részletet veszünk és ehhez 0,47 ml zselatin-barbitál tompítóoldatot adunk, hogy az össztérfogat 0,8 ml legyen. A kémcsöveket lezárjuk és 37 C-on 60 percig inkubáljuk. Ezután az inkubációs keverékek mindegyikéből 0,2 ml-t 9,8 ml zselatin-barbitál tompítóoldathoz elegyítünk, hogy a komplementet felhígítsuk. Az előzőekben leírtak szerint mindegyik kémcső esetében elvégezzük a komplement-titrálást a szabadon maradt komplement-aktivitás meghatározása céljából (lásd a 2.6.17.-2. táblázatot). A vizsgált készítmény antikomplement-aktivitását a 100%-osnak tekintett komplement-kontrollhoz képest az alábbi összefüggés segítségével számoljuk ki: a b 100 a a = a komplement-kontroll komplement-aktivitásainak (CH 50 /ml) középértéke, b = a vizsgált minta komplement-aktivitása (CH 50 /ml). A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha mind az ACA-negatív, mind az ACA-pozitív kontroll antikomplement-aktivitása a referenciakészítmény kísérőiratában feltüntetett határértékek közé esik, a komplement-kontroll átlagos komplement-aktivitása (a) 80 CH 50 /ml és 120 CH 50 /ml közé esik.