A syndecan-1 expresszióváltozásai és a HPV-fertőzöttség: önálló és kölcsönható faktorok a laphámrákok prognózisában és progressziójában Doktori értekezés Dr. Máthé Miklós Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Témavezető : Prof. Dr. Kovalszky Ilona PhD DSc Hivatalos bírálók: Dr. Újpál Márta PhD, egyetemi adjunktus Dr. Sápi Zoltán PhD, főorvos Bíráló Bizottság elnöke: Prof. Dr. Sótonyi Péter, az MTA tagja Bizottság tagjai: Dr. Kiss András PhD, egyetemi adjunktus Dr. Simon Károly PhD, oszt.vez. főorvos Budapest 2006
Összefoglalás A syndecan-1 (Sdc-1) egy transzmembrán heparánszulfát proteoglikán, mely főként hámsejtek felszínén jelenik meg. A Sdc-1 molekula képes proliferációt gátló hatásokat közvetíteni, de növekedési faktorok kötésével serkentheti is a sejtosztódást. A rosszindulatú daganatsejtekben gyakran csökken a syndecan-1 expresszió, ám az őket körülvevő kötőszöveti állomány sejtjeiben a tumorsejtek induktív hatására ektópiás termelődés jelenhet meg. Immunhisztokémiai elemzést végeztünk 40 szájüregi leukoplákia, 51 primer szájrák, 35 méhnyaki in situ karcinóma, és 56 invazív méhnyakrák formalin-fixált, paraffinba ágyazott anyagán. A normál nyálkahártya reakciójához képest a Sdc-1 szintje csökkenést mutatott már a rákmegelőző elváltozásként ismert szájüregi leukopákiákon is. A Sdc-1 termelődés csökkenését észleltük 45/51 szájrákban, és az összes invazív méhnyakrák mintán. Ugyanakkor 19/51 szájrákban megjelent a tumor-indukált reakció a stróma sejtjeiben. Szájrákoknál a sejtfelszíni reakció csökkenése összefüggést mutatott a betegség klinikai progressziójával, azonban a stromális Sdc-1 reakció megjelenése jóval markánsabban (p=0,023) bizonyult kedvezőtlen prediktív faktornak. A kóros kötőszöveti reakció megjelenését észleltük a méhnyakrákokban is 26/56 esetben, azonban a betegek eddigi követése alapján még nem dönthető el, hogy mindez mennyiben befolyásolja posztoperatív progressziót és a túlélést. Fej-nyaki laphámrákok esetében sajátos molekuláris jellemzőkkel bíró alcsoportnak tartják a humán papillómavírussal (HPV-vel) asszociált daganatokat, noha a vírus kóroki szerepe a szájüreg tumorai esetén vitatott. Szájrákban szenvedő betegek mintáit párhuzamosan elemeztük polimeráz láncreakcióval és az E6 vírusfehérjére végzett immunhisztokémiával. Eredményünk szerint ugyan a HPV valóban szerepet játszhat a szájüregi laphámrákok egy részének kialakulásában, de a PCR pozitivitása gyakran csak a környező nyálkahártya fertőzöttségét mutatja, és nem utal a vírus és a daganat oki kapcsolatára. A HPV 16 PCR/IHC kettősen pozitív tumorok Sdc-1 expressziója jóval erősebb volt, mint a vírust nem hordozóké, ami támogatja azt az elképzelést, hogy a HPV-vel összefüggő fej-nyaki karcinómák külön csoportot alkotnak.
Summary Syndecan-1, a transmembrane proteoglycan may exert anti-proliferative effects, but may also promote cell growth by binding various growth factors. Malignant epithelial cells often down-regulate their own syndecan-1 production, whereas they are capable of inducing an aberrant syndecan-1 expression in stromal fibroid cells. Immunohistochemical analysis performed on 40 oral leukoplakias, 51 invasive oral squamous cell cancers and 35 in situ and 56 invasive carcinomas of uterine cervix revealed one or both of the above alterations concerning syndecan-1 expression. A decrease in syndecan-1 expression compared to normal epithelium could occasionally be detected as early as in leukoplakias, representing premalignant oral lesions. Syndecan-1 expression of tumor cells was decreased or even completely lost in 45/51 oral carcinomas and in all cervical carcinomas. Furthermore, tumor-induced stromal syndecan-1 immunoreaction appeared in 19/51 oral tumors. In the case of oral cancers the probability of postoperative progression showed some dependence on the degree of decrease in tumour cell syndecan-1 levels.based on recurrence and overall survival data, stromal syndecan-1 expression in primary oral cancers appears to be a more reliable factor of adverse prognosis.(p=0.023) We also detected the tumor-induced stromal syndecan-1 expression in the case of cancers of uterine cervix; however, the question whether the presence and extent of stromal syndecan-1 expression can be considered real risk factors of postoperative progression in these malignancies requires further clinical investigation. Numerous lines of evidence indicate that head and neck squamous cell carcinomas associated with human papillomaviruses form a special molecular subgroup. However, HPVs role in the pathogenesis of oral cavity cancers is still a matter of debate. Our aim was to analyze the presence of HR-HPVs DNA and E6 protein in oral cancers. Fifty-one oral carcinomas were assayed for HPV by PCR, and parallelly by E6 protein immunohistochemistry. Our results are consistent with the idea that a distinct subgroup of oral cancers are HR-HPV-associated, although not all PCR positivity means a real causative relationship between virus and malignancy. The syndecan-1 expression of the HPV 16 PCR/IHC positive tumours was higher than cancers lacking the virus, which support the idea, HPV-associated head and neck cancers form a distinct entity.
TARTALOMJEGYZÉK I. Bevezetés 1 I/1. Proteoglikánok és daganatok. A syndecan-család. 1 I/1.1. Proteoglikánok szerepe a daganatokban 1 I/1.2. A syndecan család tagjai és biológiai szerepük 4 I/1.2.1. Syndecan-család 4 I/1.2.2. A glukózaminoglikán láncok, és szerepük 5 I/1.2.3. A syndecanok expressziója, és szöveti megjelenése 6 I/1.2.4. A syndecan molekulák élettani szerepe 8 I/1.2.5. Az ektodomén lehasadása (Shedding) 8 I/1.2.6. A Vázfehérje-mediált oligomerizáció 9 I/1.2.7. A syndecanok génjei 10 I/1.2.8. A syndecan-molekulák és fertőző mikroorganizmusok 11 I/1.3. A syndecan-1 molekula szerepe humán daganatokban 11 I/1.3.1. A syndecan-1 sejtfelszíni expresszió szerepe a daganatok klinikai viselkedésében 11 I/1.3.2. A stromális syndecan-1 expresszió és klinikai következményei 13 I/1.3.3. Syndecan-1 expresszió fokozódása daganatokban 14 I/2. A Humán Papillomavírus szerepe a szájüregi daganatokban 16 I/2.1. Bevezető 17 I/2.2. A humán papillómavírus (Papillomaviridae) 18 I/2.3. A papillómavírusok életciklusa 18 I/2.4. A fő transzformálvírusfehérjék, az E6 és E7 szerepe a malignus transzformációban 18 I/2.5. A vírus genomja, molekuláris életciklusa, fehérjéinek kifejeződése 21 I/2.6. A HPV terjedése, epidemiológiai jellemzői 21 I/2.7. A HPV szerepe Fej-Nyaki daganatokban 22 I/3. Célkitűzéseink 24 I
II. Anyag és módszer 25 II/1. Szövettani Minták 25 II/1.1. Szájüregi minták 25 II/1.2. Méhnyakrákos betegek anyagai 26 II.2. Vegyszerek, oldatok, pufferek 27 II/3. Vizsgálati módszerek 28 II/3.1. Immunohisztokémiai vizsgálatok 28 II/3.1.1. Immunhisztokémiai vizsgálatok kivitelezése 28 II/3.1.2. A syndecan-1 immunhisztokémiai reakciók kiértékelése 30 II/3.1.3. Immunohisztokémiai verifikációs módszerek, Envision-rendszer 31 II/3.2. Sejttenyésztés, és Immuncytokémiai módszerek a syndecan expresszió jellemzésére 31 II/3.3. ELISA vizsgálatok keringő syndecan-1 kimutatására 33 II/3.4. Fotódokumentáció 33 II/3.5. Polimeráz láncreakció (PCR) 34 II/3.5.1. DNS izolálás paraffinba ágyazott anyagból 34 II/3.5.2. Konvencionális PCR 34 II/3.5.3. Nested PCR 35 II/3.5.4. Agaróz gélelektroforézis 37 II/3.5.5. Southern blot 37 II/3.6. In situ Hibridizáció 38 II/3.6.1. In situ hibridizációs technika 38 II/3.6.2. ISH saját jelölésű próbával 38 II/3.6.3. Indirekt FISH biotinilált gyári próbával 39 II/3.7. Lézer Mikrodisszekció 39 II/3.8. DNS szekvenálás 40 III. Eredmények 42 III/1. Syndecan-1 eltérések szájrákokban 42 III/1.1. A syndecan-1 expresszió a szájüreg rákmegelöző állapotaiban: II
Szájüregi Leukoplákiák syndecan-1 reakciójának vizsgálata 42 III/1.2. A vizsgált szájüregi laphámrákok sejtfelszíni expressziójának változása 42 III/1.3. Stromális syndecan-1 expresszió klinikai vonatkozásai orális karcinómákban 43 III/1.4. Statisztikai elemzés 54 III/2. Syndecan-1 változásai a méhnyak rosszindulatú daganataiban 56 III/2.1. A sejtfelszíni reakció csökkenése in situ karcinómákon és méhnyakrákokban 56 III/2.2. Syndecan-1 megjelenése méhnyakrákok kötőszöveti állományában 56 III/2.3. Syndecan-1 ELISA vizsgálatok méhnyakrákos betegek szérumából 66 III/2.4. Kísérleti szövettenyésztési modellrendszer 66 III/3. HPV-hez kapcsolódó eredmények 71 III/3.1. A HPV genom és fehérjék jelenléte szájüregi laphámrákokban 71 III/3.2. A syndecan-1 expresszió és a HPV jelenlétének viszonya 75 III/3.3. HPV-re utaló jelek nem epiteliális szövetekben 76 IV. Megbeszélés 84 V. Megállapítások 94 Rövidítésjegyzék 96 Irodalomjegyzék 99 Publikációs jegyzék 119 III
I. BEVEZETÉS I/1. PROTEOGLIKÁNOK ÉS DAGANATOK. A SYNDECAN-CSALÁD. I/1.1. Proteoglikánok szerepe a daganatokban Tumorbiológiai kutatások hívták fel arra a tényre a figyelmet, hogy nem csak a rosszindulatú daganatok sejtei, hanem szöveti környezetük is döntő tényező a daganat és a szervezet kapcsolatában. A ráksejteknek valami módon kapcsolódniuk kell a szervezet anyagforgalmához, mozogniuk és vándorolniuk kell annak struktúrái mentén (vagy azok ellenére), továbbá el kell kerülniük a tumorellenes immunválaszt. Ez érdeklődést keltett a daganatos stróma, a benne levő mátrixfehérjék és a környező nem-tumoros sejtek szerepével kapcsolatban. A daganatban levő extracelluláris mátrix (ECM) összetétele jelentősen eltér a kiindulási normál szövetekre jellemző sejtközötti állománytól. E drámai különbség oka az, hogy a daganatban levő stróma a malignus sejtek által erősen átformált közeg (1). A klinikai tüneteket okozó rosszindulatú daganat sejtjei invázióra, illetve távoli áttétek kialakítására képesek. Mindkét folyamatban kiemelt szerepe van a daganatsejt és a mátrixfehérjék kapcsolatának. Ennek során nem csak molekuláris környezetüket alakítják át, hanem kötődhetnek olyan struktúrákhoz, amelyekhez a kiindulási szövet normál sejtjei képtelenek lennének (pl. melanómasejt a vérlemezkékre jellemző integrint fejez ki, és köti a fibrint). Citokinjeikkel a környező nem-tumoros strómasejtekre hatva serkentik egy megváltozott összetételű, az adott daganatra jellemző stróma kialakítását és az angiogenezist.(1,2,3,4,5,6,7). A proteoglikánok tipikusan a sejtfelszín és az extracelluláris mátrix fehérjéi. Jellemzőjük, hogy vázukhoz savas természetű, lineáris, szulfatált cukorláncok, az úgynevezett glukózaminoglikánok (GAG) kapcsolódnak. A poliszacharidok savas jellegét szulfát- és karboxilcsoportjaik adják. A proteoglikánok főbb csoportjaik szerint lehetnek membránfehérjék, és kis, leucinban gazdag extracelluláris proteoglikánok, mint a decorin, biglycan, illetve a más alcsoportba sorolt fibromodulin, lumican, 1
keratocan. Lehet proteoglikán intracelluláris vagy sejtfelszíni is, erre példa a serglycin (2, 4, 5). (1. táblázat) A sejtfelszíni proteoglikánok fontos képviselői a syndecan-család tagjai és a glypican-csoport proteoglikánjai. Részidős proteoglikánként a sejthártya-asszociált PGkhez sorolható a betaglycan, és a CD-44 is. (2,4,5) A proteoglikánokat sokáig főként térkitöltő molekuláknak tekintették, amelyek más mátrixelemmekkel kapcsolódva nagyobb struktúrákat építenek föl (pl. a decorin nevű proteoglikán a kollagénnel alkot komplexet). Kiderült, hogy szerepük van a szöveti ozmotikus folyamatokban, illetve az agrin nevű proteoglikán részt vesz a veseglomerulusokban zajló töltésen alapuló ionszelekcióban (2, 3). A proteoglikánok szerepét a biológiailag aktív molekulák megkötésében és tárolásában a 90-es évektől napjainkig számos eredmény tanúsítja. Kötődhet hozzájuk a bfgf, afgf, HGF, TGF-β, TNF- α, interleukinok, GM-CSF, interferon-gamma. Részt vesznek a sebgyógyulási folyamatokban, mennyiségük dinamikus változást mutat a regeneráció során. (5, 6, 7, 8, 9, 10) Megállapították azt is, hogy a daganatokban egyes proteoglikánok az adott kiindulási szövetre jellemzőtől eltérő mennyiségben lehetnek jelen. Saját kutatásainkban a syndecan-1 nevű sejtfelszíni proteoglikán szerepét vizsgáltuk szájüregi és méhnyaki daganatokban, illetve ezek előalakjaiban, majd ehhez kapcsolódó kiegészítő vizsgálatokat folytattunk. 2
1. táblázat: A Proteoglikánok felosztása (Kovalszky I, 1999, (1)) A Intracelluláris GAG lánc Serglycin HS/CS B Sejtfelszíni Syndecan-család Syndecan-1 Syndecan-2 Syndecan-3 Syndecan-4 Glypican-család Glypican-1,2,3 Részidős Proteoglikánok Betaglycan CD-44 HS/CS HS HS HS HS HS/CS CS C Extracelluláris Kis, leucinban gazdag Proteoglikánok Decorin Biglycan Fibromodulin CS/DS CS/DS KS Moduláris Proteoglikánok Versican Aggrecan Perlecan/Agrin CS CS/KS HS/CS HS: heparánszulfát láncok, CS: chondroitin-szulfát, DS: dermatán-szulfát, KS:keratánszulfát 3
I/1.2. A syndecan család tagjai és biológiai szerepük I/1.2.1. A syndecan-család A syndecan családba tartozó proteoglikánok az összes adherens sejtben megtalálható, evolúciósan igen konzervatív szerkezetű transzmembrán fehérjék. Felépítésük szerint egy vázfehérjéből (core protein), és ennek sejten kívüli részéhez kovalensen kapcsolódó savanyú szénhidrát polimerekből, úgynevezett glukózaminoglikánokból (GAG) állnak, mely poliszacharid láncok molekulatömege 10 és 100 kda között változik (11). A syndecan család tagjai az I. típusú transzmembrán fehérjék közé tartoznak, tehát N-terminálisuk az extracelluláris térben, míg karboxil-terminusuk a sejten belül helyezkedik el (11). (1.ábra) A molekulák három szerkezeti egységre tagolhatók: 1. egy hosszabb extracelluláris domén, melyen számos GAG-kötő konszenzusszekvencia található; 2. egy transzmembrán domén, valamint 3. egy rövidebb intracelluláris domén, mely számos fehérjével lehet interakcióban. A syndecan-molekula intracelluláris és a transzmembrán doménje evolúciósan meglehetősen konzervatív szerkezetű származástanilag messze eső csoportokban is, a Caenorhabditis-tól kezdve a rovarokon (Drosophila) át az emlősökig (11, 12, 13, 14, 15). A syndecan-1 (és syndecan-3) fehérjevázán két külön glukózaminoglikán-kötő szakasz található: az egyik az N-terminus közelében, míg a másik a sejtmembrán közelében, egy prolin-treonin gazdag régióval elválasztva (11). A syndecan-1 transzmembrán doménjára jellemző a kis oldalláncú aminosavak reguláris, ismétlődő mintázata. Sajátos tulajdonsága, hogy három glicin is van transzmembrán részben, ami meglehetősen ritka ilyen lokalizációban, mert a glicin nem hidrofób aminosav. Ennek a molekula dimerizációjában lehet szerepe. (13) A sejten belüli domén membránhoz közel eső része (C1 régió) és a C-terminális rész (C3 régió) a törzsfejlődés során különösen erősen konzervált szakaszok. A 4
konstans régiót megszakító szegmensek (V régió) viszont variábilis aminosav szekvenciát mutatnak (11, 16). A syndecan család molekuláinak foszforilációja in vivo főként a citoplazmatikus domén konzervatív szakaszának szerinjén megy végbe. (17). I/1.2.2. A glukózaminoglikán láncok, és szerepük A syndecanok funkcióiban döntő szerepük van az általuk hordozott savanyú cukorláncoknak, melyek számos biológiailag aktív molekulához kötődhetnek, így elősegítve a syndecanok ko-receptor szerepét (18, 19, 20). A syndecanok ún. full time proteoglikánok, tehát nem írtak még le glukózaminoglikán nélküli természetes syndecan molekulát (11). A megszintetizált vázfehérjére a Golgi-rendszerben kerülnek a cukorláncok. A syndecanok általában heparán-szulfát típusú GAG molekulák hordozói, azonban a syndecan-1 és a syndecan-4 esetében kondroitin-szulfát is kapcsolódhat a vázfehérjéhez, eltérő funkciókkal. A syndecan-1 membránproximális GAG-kötőhelyeit elsősorban kondroitin-szulfát, míg az N-terminushoz közeli glikozilációs pontokat főként heparánszulfát cukorláncok foglalják el (18, 19, 21, 22). A heparán-szulfát láncok ismétlődő egységeit glukuronsav és N-acetil-glukózamin alkotja, melyek között β 1-4 kötés alakul ki (18). A kondroitin-szulfát ismétlődő diszacharid egységet glukuronsav, és hozzá β 1-3 kötéssel kapcsolódó N-acetilgalaktózamin alkotja. A GAG-addíció konszenzus-szekvenciája a savas környezetben levő szerin-glicin motívum. A szénhidrát lánc egy minden syndecanban azonos tetraszacharid kapcsoló régióhoz csatlakozik, és felillesztését a kulcsfontosságú alfa-n-acetil-glukózaminiltranszferáz enzim katalizálja (19). Az ezt követő nem minden diszacharid-alegységet érintő posztpolimerizációs módosító lépések során (epimerizáció, szulfatálás) alakul ki a glukózaminoglikán lánc végleges szerkezete. Úgy tűnik, hogy a cukorláncok eltérő mintázatai különböző ligandaffinitást eredményeznek. Erre utal a tény, hogy különböző sejttípusokra eltérő GAG struktúrák jellemzők, s ezek a különbségek a sejttípusok közötti funkcionális 5
eltéréseket tükrözik. Pl. az egyrétegű hámok syndecan-1 molekulája hosszabb és erősebben módosított GAG láncokat hordoz, mint a többrétegű hámok sejtjeinek syndecan-1-e (19). I/1.2.3. A syndecanok szöveti megjelenése A syndecanok kifejeződése mind fejlődési fázis-, mind szövetspecifikus lehet. Expressziójuknak úgy a fokozódása, mint az eltűnése jelentős sejtmorfológiai változásokkal függ össze (23, 24). A 33 kda molekulasúlyú syndecan-1 (más néven CD-138) főként az epitéliális sejtekre jellemző molekula,( 1,2 ábra) amely megjelenik a laphámsejtek teljes felszínén, de az endotél és a simaizomsejt is kifejezi. A B-lymphocyták érése során, a csontvelői naiv pre-b sejteken, de a plazmasejteken is expresszálódik. Más mesenchymalis eredetű sejtek is kifejezik az embrionális fejlődés folyamán, amelyekben vélhetően az epitélium és a mezenchima közti kölcsönhatások résztvevője. A köb-és hengerhámsejteken (pl. az emlő duktális sejtjei) megjelenése csak a bazolaterális membránra jellemző. Ha olyan syndecan-1 génkonstrukcióval transzfektáltak Madin-Darby kutyavese sejteket, amelyből hiányzott a C-terminális 12 aminosav, a molekula a vad típussal ellentétben nem csak a bazolaterális, hanem az apikális membránon is megjelent. A syndecan-1 expresszió Schwann-sejtekben megnövelte a sejtek szétterülését és a mikrofilamentum-képződést, ami a citoszekeletonnal való kapcsolataira utal (11, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30). A syndecan-2 (fibroglycan, 23 kda) főként fibroblasztokra jellemző proteoglikán. (30) A syndecan-3 (N-syndecan, 43 kda) kizárólag idegsejtekben fejeződik ki, mind a perifériás, mind a központi idegrendszerben. Emlősöknél a syndecan-3 expressziója összhangban van a központi idegrendszer oligodendrocytáinak differenciációs periódusaival, és a velőshüvely képződésével. (30, 31). A syndecan-4 (ryudocan, 22 kda) a syndecan család legáltalánosabban előforduló tagja, a fokális adhéziók területén található meg (30, 32, 33, 34). 6
1. ábra: a syndecan-családba tartozó proteoglikánok molekuláris szerkezete. A sejten kívüli domén hordozza a glukózaminoglikán láncokat, mellyek heparinkötő növekedési faktorok forgalmát szabályozzák. A citoplazmatikus domének igen ősi strukturát őriztek meg az evolúció során. 7
I/1.2.4. A syndecan molekulák élettani szerepe A syndecan-család tagjai elsősorban más receptorok ligandkötését segítő (koreceptor) molekulák. Extracelluláris doménjuk heparán-szulfát láncaival hozzájárulnak növekedési faktorok (pl. bfgf, HGF) megkötéséhez, továbbá a mátrix adhéziós fehérjéihez (pl. fibronektin) kötődve növelik a sejt-extracelluláris mátrix kapcsolatok erősségét (11, 12, 35, 36, 37, 38, 39, 40). A citoplazmatikus doménnak fontos szerepe lehet az aktin-filamentális rendszer kialakításában, a citoszkeletális szerveződésben. A fehérje-kölcsönhatásokat vizsgáló élesztő két-hibrid módszerrel számos PDZ domén fehérjét azonosítottak mint a citoplazmatikus domén partnerét. Ilyen a syntenin, a synbindin, a synectin és a kalcium/kalmodulin-dependens szerin protein-kináz (CASK) is. Mind a négy syndecanban megvan C-terminus közeli motívum, mely a II. típusú PDZ fehérjéket köti. Így a syndecanok transzmembrán receptorokhoz és ioncsatornákhoz kötődve azokat koncentrálják és működésüket befolyásolják, részt vesznek a citoszkeletális szerveződés kialakításában, interakcióban számos sejtadhéziós komponenssel (41). A syndecanok a lipoproteinek anyagcseréjében is szerepet játszanak (42). I/1.2.5. Az ektodomén lehasadása (shedding) A membránfehérjékre jellemző, hogy eltávolításukat endocitózist követő lizoszomális lebontás biztosítja. Egy részüknél, így a syndecan család tagjai esetén egy másik jelenséget is megfigyeltek, az ún. shedding -et ( vedlést ). Ennek pontos biológiai szerepe még nem feltárt (30, 43). A shedding során az extracelluláris domén proteáz-mediált módon levágódik a plazmamembránról; ebben főként a matrilysin nevű mátrix metalloproteáz (az MMP-7) játszik szerepet, de más proteázok (plasmin, thrombin) is fokozzák a syndecansheddinget (44, 45, 46). A lehasadt ektodomén bekerülhet a keringésbe, sejtkultúrák esetében kimutatható a tenyésztéshez használt médiumból. A lehasadás fokozását több receptorcsalád serkentése is ki tudja váltani, így egyes tirozin-kináz aktivitású receptoroké és G-fehérjéhez kapcsolt receptoroké. 8
Az EGF család tagjai fokozzák a sheddinget, egyes eredmények szerint a MAP kináz útvonalon. Fokozzák a külső domén levágódását egyes citokinek és kemotaktikus peptidek. A celluláris stressz szintén serkenti a shedding jelenségét. Ugyancsak fokozza a syndecan-vedlést számos bakteriális faktor; ez fölveti annak lehetőségét, hogy a sejten kívüli rész lehasadásának szerepe lehet a mikroorganizmus és a gazdaszervezet közti kölcsönhatásokban. A levált ektodomén nagy mennyisége mutatható ki szeptikus sokk esetén is. Egyes eredmények szerint tüdőgyulladásban kemotaktikus attraktánsként hathat a granulocytákra (47, 48). A keringő syndecan-1 szintjének emelkedését detektálták tüdőrákos betegekben (49, 50, 51, 52) és a gége és garat rákjainál is (53). Erős shedding-agonistáknak bizonyultak a forbol-észter vegyületek (pl. PMA), melyek közvetve, a protein kináz C aktivációján keresztül a syndecan intracelluláris doménjain elhelyezkedő konzervált tirozinok foszforilációját okozzák. A folyamat hidroxamát metalloproteáz-inhibitorokra érzékenynek bizonyult. Vizsgálták az összefüggést a shedding és a TIMP család tagjai között is. Úgy tűnik, a TIMP-3 képes gátolni a syndecan-1 és syndecan-4 PMA-indukálta sheddingjét, a TIMP-1 és a TIMP-2 azonban nem. (54, 55). I/1.2.6. A vázfehérje oligomerizációja A syndecan család tagjainak core proteinjai képesek oligomerizációra. Az így alkotott komplex stabil, detergenseknek ellenáll. Mivel a receptor kinázok, az adhéziós molekulák, valamint a nem-katalitikus receptorok esetében a dimerizáció jól ismert aktivációs mechanizmus, fölmerül, hogy esetleg hasonló szerepet tölthet be a syndecanok működésében is (18, 56). A patkány syndecan-3 molekulával végzett kísérletek szerint a transzmembrán domén szükséges a dimerizációhoz, ez azonban önmagában még nem elégséges: az extracelluláris domén sejtfelszínhez közeli utolsó motívuma is szükséges hozzá. Ez a motívum nem hasad le a shedding során. Elképzelhető, hogy az oligomerizáció a sejten belüli doménok közvetítésével fejti ki hatását, akár az extracelluláris domén vedlése után is (56). 9
A transzmembrán doménok oligomerizációs képességében lényegesek lehetnek egyes korábban említett molekuláris sajátosságaik (kis oldalláncú aminosavak, és a három glicin molekula jelenléte). Ennek bizonyítására a syndecan-3 transzmembrán domén glicinjeit leucinra cserélték: ez meggátolta a dimerek kialakulását, feltehetően sztérikus okokból. Hasonlóképpen, ha a kritikus helyen levő négy extracelluláris membránproximális aminosav közül a bázikusak helyére alanint illesztettek be, az jelentősen gátolta a dimerizációt (15, 56). A jelenlegi elképzelések szerint a syndecan vázfehérjék oligomerizációja a transzmembrán doménok közti hidrofób kölcsönhatások mellett az ektodoménhoz közelebb eső aminosavak kisebb és terjedelmesebb oldalláncai közti intermolekuláris kölcsönhatások révén jön létre, amelyeket még a külső domén sejtfelszíni végére eső motívumok közti elektrosztatikus kölcsönhatások is stabilizálnak. I/1.2.7. A syndecanok génjei A humán syndecan család minden egyes tagjának génje eltérő kromoszómán lokalizálódik. Úgy tűnik, filogenetikailag a syndecan 1 és 3, illetve a syndecan 2 és 4 állnak közelebb egymáshoz (14). Az exonok és intronok szerkezete alapján föltételezik, hogy egy ősi gén duplikációjával keletkezhettek. Génjeik öt exonból és négy intronból állnak. Az 1. exon kódolja az 5 nem-transzlálódó régiót és a szignálpeptidet, a 2-es exon az N-terminus felé eső GAG kötőhelyeket. A 3. exon az ektodomén spacer régióját, a 4-es exon pedig a membránproximális GAG-kötő részt kódolja, és 10 bázispárnyi részt a transzmembrán doménből, végül az 5-ös exon a maradék transzmembrán részt és a sejten belüli domént, valamint a 3 nem-átíródó régiót (14). A syndecan-1 gén lokalizációja 2p24.1. A syndecan2 géné 8q22-q23 szakasz. A syndecan-3 molekula génje az 1pter-p22.3, a syndecan-4 é 20q12 helyen helyezkedik el. 10
I/1.2.8. A syndecan-molekulák és fertőző mikroorganizmusok A syndecan család tagjai a sejtek felületén nagy mennyiségben jelen levő, az evolúció során korán megjelent fehérjék, így baktériumok (pl. Pseudomonas, Staphylococcus, Porphyromonas) kötőhelyeként szolgálhatnak. Vírusreceptorok is lehetnek: a syndecanokhoz kötődhet a HIV, és a hámeredetű daganatok kialakulásában fontos szerepet betöltő Humán Papillómavirusok is (57, 58, 59, 60, 61). A baktériumok elleni védekezésben is szerepük lehet a syndecanoknak. Elképzelhető, hogy a Toll-like receptor (TLR)-defensin rendszerrel is kapcsolatban állnak. E tény figyelembe vételével különösen érdekesek lehetnek a shedding hatásai a mikróba-gazdaszervezet viszonyra, s ez további kutatások szükségességét veti fel e témában (62, 63). I/1/3. A syndecan-1 molekula szerepe humán daganatokban A syndecan-1 molekula daganatbiológiai szerepét vizsgálták talán legtöbbet a syndecan család tagjai közül. A szakirodalom főként kétféle kifejeződési eltérés szerepével foglalkozik: a sejtfelszíni syndecan-1 reakció csökkenésével, és a syndecan-1 expresszió kóros stromális megjelenésével. Az emlő és a pankreász daganatainál az expresszió fokozódását is leírták. I/1.3.1. A syndecan-1 sejtfelszíni expresszió szerepe a daganatok klinikai viselkedésében A sejtfelszíni syndecan-1 változásait és klinikai hatásait számos eltérő eredetű emberi daganatban vizsgálták, bár a jelenség prognosztikus jelentősége nem mindig egyértelmű (64). A sejtfelszíni syndecan-1 kifejeződésének csökkenése általában dedifferenciációs jel. 11
A syndecan-1 ektodomén csonkolt változata, mely a minican fantázianevet kapta, jelentősen gátolta az S 115 (egér emlőkarcinóma) sejtek osztódását, mégpedig a RAS/ERK szignálúton keresztül. A kísérletből a kutatócsoport azt a következtetést vonta le, hogy a syndecan-1 ektodomén gátló hatásokat közvetít (65, 66). Az újabb kutatások fényében azonban valószínűbb, hogy inkább kompetitív jelenségről volt szó: a médiumba nagy tömegben került ektodomén lekötötte a szolubilis növekedési faktorokat, és így vezetett gátláshoz. Ugyanis az ektodoménnak kizárólag proliferációgátlást tulajdonító szemlélet alapján nehéz megmagyarázni, hogy a kóros stromális megjelenés miért jár rosszabb prognózissal az emberi daganatokban. Továbbá emlőrákok esetén nem igazolódtak a syndecan-1 csökkenés prognózist rontó hatásai. Több daganattípusban, így laphámrákokban az expresszió csökkenése mrns szinten következik be, mert e daganatokban nem csak a syndecan-1 fehérje, de a hírvivő RNS mennyiségében is csökkenést észleltek. Úgy tűnik, hogy hámsejtekben ez párhuzamos lehet az E-cadherin csökkenésével is (19, 64, 67, 68, 70). A tumorsejtek syndecan-1 expressziójának a kiindulási szövethez viszonyított visszaesését figyelték meg agresszív basaliomáknál (71). Leírták a jelenséget vastagbélrákokban is, ahol a kedvezőtlen klinikai lefolyás jeleként értékelték (72, 73). A bőr laphámrákjainak progressziójában az invazívvá válás fontos lépésének gondolják a sejtfelszíni syndecan-1 kifejeződésének csökkenését (74). Mesotheliomáknál viszont a syndecan-1 expressziója az epitéliális irányú differenciáció jele (75). A nem-hámeredetű daganatok közül a B-sejtes lymphomáknál, elsősorban a myeloma multiplex, de más monoklonális gammopátiák diagnosztikájában is fontos a syndecan-1 sejtfelszíni és szérum szintje (shedding!). A syndecan-1 egyéb B-sejtes folyamatokban is szerepet játszhat ( 76, 77, 78). A nem-kissejtes tüdőrákban a sejtfelszíni a syndecan-1 expresszió csökkenése kedvezőtlen prognózissal járt. (79, 80). Májrákok immunhisztokémiai vizsgálata során a sejtfelszíni reakció csökkenése, mely a nem-cirrhotikus alapon megjelenő daganatok sajátja, szintén prognosztikus tényezőnek bizonyult (81, 82). Leírták, hogy a syndecan-1 sejtfelszíni csökkenése párhuzamos a sejtek atípiájával, a magok polimorfiájával veserákban (83), valamint hogy a syndecan-1 prognosztikus tényező endometriális karcinómában (82) és nasopharyngealis karcinómában is (85). 12
Az eddigi tanulmányok szerint a sejtfelszíni syndecan-1 szint csökkenése a tumor mélyebb invazív frontján hasznos prognosztikai marker lehet a szájüregi laphámrákok esetében. Japán kutatócsoportok szerint az erős vagy közepes syndecan-1 expressziót mutató nyelvrákos betegek túlélése szignifikánsan kedvezőbb volt, mint akiknél a syndecan-1 kifejeződés gyenge volt, vagy eltűnt (86-91). A méhnyaki laphámrákoknál azonban nem sikerült hasonlóan meggyőző összefüggést találni a syndecan-1 expresszió és a kórlefolyás között. Inki et al. szerint a syndecan-1 expresszió csökken a cervikális intraepitéliális neoplázia (CIN) fokozatai között a CIN I-től a CIN III felé haladva, miközben az immunreakciót adó sejtek zónája kiszélesedik a normál méhnyaki hámhoz képest (92, 93). Rintala és munkatársai 7 évvel ezelőtti vizsgálatukban 124 méhnyakrákban szenvedő, közöttük 102 laphámrákos beteg mintáját elemezték a syndecan-1 jelenléte szempontjából, és ezt vetették össze a túlélési paraméterekkel. A Turkui Egyetem 1970-1988 közti méhnyakrákos betegeit vizsgálták archivált mintákon, az extracelluláris domén elleni B-B4 antitestet használva. Eredményük szerint a syndecan-1 expresszió csökkenése valóban párhuzamos a szövettani grade-del (amely faktornak méhnyakrákokon ismert módon nincs klinikai jelentősége), de nem mutatott összefüggést a klinikai stádiummal és a betegségmentes túléléssel (94, 95). Hasonló módon egy japán tanulmány 81 méhnyakrák elemzése után nem talált összefüggést a syndecan-1 mrns szintjének csökkenése és a betegek további sorsa között, azonban a syndecan-1 csökkenés össszefügött a nyirokcsomómetasztázisok létével. Fölvetésük szerint a csökkent syndecan-1 szint előnyt hordozhat a metasztatizálási folyamat során a daganatsejt számára (68). I/1/3/2. A stromális syndecan-1 expresszió és klinikai következményei Emberi daganatok közül először duktális emlőrákokban írták le, hogy a syndecan-1 expressziója megjelenik a kötőszöveti sejteken. Kiderült, hogy ez emlőrákban kedvezőtlen klinikai lefolyással, a tumorspecifikus halálozás emelkedett kockázatával jár (96-103). A kötőszöveti syndecan-1 immunreakció gyomorrákoknál szintén rossz 13
prognózissal társul (85). Egy igen érdekes vizsgálat eredménye szerint a syndecan-1 molekulát kifejező stromasejtek miofibroblaszt jelleget mutatnak (104). A strómális expresszió jelenségét megfigyelték a pajzsmirigy, a petefészek és a prosztata rákjaiban is (100, 101). A hasnyálmirigy adenokarcinómáiban szintén leírták, mint a kedvezőtlen kórlefolyás jelét rezekábilis daganatok esetén (104). Kísérleti modellben vizsgálták, hogy valóban a tumor serkenti a syndecan-1 termelődését, s ez visszahat-e az adott daganatsejtekre. Kokultúrás rendszerben Maeda és társai duktális emlőrákvonalat és fibroblasztokat tenyésztettek együtt. A syndecan-1- et egyébként nem kifejező fibroblaszt sejtek syndecan-1 expresszióval reagáltak a ráksejtek faktoraira, tehát abnormális helyen és nagyobb mennyiségben jelent meg a proteoglikán. Megfigyelték, hogy ez pozitív visszacsatolást jelentett az emlőráksejteknek, mert gyorsította proliferációjukat, és serkentette az angiogenezist is (105). Fölmerül ezek után a kérdés, hogy mi magyarázhatja a daganatok gyorsult növekedését, amelyre mind az in vitro kísérlet, mind számos klinikai eredmény utal. Elképzelések szerint a daganatos klón számára azért jelenthet mikroevolúciós előnyt, ha a környező strómasejteket serkenti, és azok kifejezik ezt az egyébként csak éretlen mezenchimális sejtekre jellemző proteoglikánt, mert a syndecan-1 heparán-szulfát glukózaminoglikán láncai jelentős mennyiségű növekedési faktort kötnek le a daganatsejt közvetlen szomszédságában (105). Fej-nyaki daganatoknál eddig egyetlen tanulmány foglalkozott a syndecan-1 stromális megjelenésével. A jelenséget meglehetősen gyakorinak írta le (85%-a a vizsgált daganatoknak), de nem találta prognosztikailag értékelhető faktornak (108). 14
I/1/3/3. Syndecan-1 expresszió fokozódása daganatokban Duktális emlőrákok esetén jóval összetettebb a sejtfelszíni syndecan-1 eltérések szerepe, mint a laphámrákoknál, ugyanis a fokozott syndecan-1 expresszió kedvezőtlen klinikai prediktív faktornak bizonyult (97, 107, 108). Az emlő duktális sejtjei esetében a syndecan-1 a bazolaterális membránrészen fejeződik ki, és ebben a lokalizációban fontos szerepet tölt be a sejt morfológiájának fenttartásában. (24) További magyarázat lehet, hogy duktális karcinóma vonalaknál a syndecan-1 mint heparánszulfátproteoglikán az α v β 3 -integrin fontos koreceptora (36). Mivel a syndecan-1 segíti az α v β 3 - integrin ligandkötését, s ez fontos túlélési jel a daganatsejtnek, a sejtfelszíni syndecan-1 elvesztése nem jelent egyértelmű előnyt a ráksejtnek, sőt ellenkezőleg: éppen a syndecan-1 megtartása vagy akár fokozott expressziója előnyös a számára (36, 109, 110) Valóban, egy vizsgálatban a magasabb syndecan-1 expressziót mutató emlődaganatok az alkalmazott kemoterápiára kevésbé mutattak regressziót (111). Valószínűleg e tényezők magyarázzák a más daganatokhoz képest fordított klinikai összefüggést az emlőrákoknál. A duktális karcinóma mellett még a pankreász daganatainál írták le, hogy a syndecan-1 magasabb expressziója rosszabb prognózist jelent, de egy másik kutatócsoport ezzel ellentétes véleményre jutott. (112, 104). 15
I/2. A HUMÁN PAPILLOMAVÍRUS SZEREPE A SZÁJÜREGI DAGANATOKBAN I/2.1. Bevezető A fej-nyaki daganatok legfontosabb kockázati tényezői világszerte a dohányzás és az alkoholfogyasztás, továbbá szerepet tulajdonítanak a rossz szájhigiénének is. Egyes földrajzi régiókban speciális addiktológiai okok is fölmerülnek (pl. a Dél-Ázsiában, maláj nyelvű országokban elterjedt bételrágás, Jemenben a katcserje levele stb.) (113). Rous 1911-ben csirkékkel végzett kísérletsorozata vetette föl először, hogy fertőző ágensek is okozhatnak daganatot. Azóta több emberi rosszindulatú daganat, pl. a méhnyakrák, a Kaposi-szarkóma esetében igazolódott bizonyos vírusok kóroki szerepe. A hepatitisz B és C vírusokkal erősen átfertőzött trópusi övezetekben, pl. Mozambik, a primer hepatocelluláris karcinóma a leggyakoribb rosszindulatú daganatok közé tartozik, s ezzel előkelő helyet foglal el a vezető halálokok között. (Ennek persze alimentáris oka is van, az aflatoxin B1.) Becslések szerint az emberi daganatok mintegy 15%-a tulajdonítható valamilyen vírusfertőzés következményének. Az utóbbi két évtizedben egyre nagyobb figyelem fordul a humán papillómavírusok járványtani szerepére. Epidemiológiai vizsgálatok szerint a HPV fertőzés nagyobb kockázatot jelent a méhnyakrák kialakulásában, mint a dohányzás a tüdőrák létrejöttében (114). A fej-nyaki elváltozások egy részében is fontos kockázati tényezőnek tartják a papillómavírusokat (115). I/2.2. A humán papillómavírus család (Papillomaviridae) A HPV az egyik legismertebb onkogén DNS víruscsalád. Ubikviter kórokozó, melynek csaknem 100 típusa különböztethető meg az E6, E7 és L1 ORF-ek szekvenciája alapján (116). Prevalenciájuk magas, egyes becslések szerint a szexuálisan 16
aktív fiatal nők fertőzöttségi aránya 20-40 %. A papillomavírusok önálló rendszertani kategóriát képeznek, mióta a vírustaxonómusok felismerték, hogy a korábbi ún. Papova (Papillóma-Polióma-Vakuolizáló vírus) csoporton belül a papillóma- és a poliómavírusok nagyobb filogenetikai távolságot mutatnak, mint korábban hitték. A különböző vírustípusok eltérő transzformáló képességgel bírnak. Azokat a HPV típusokat, amelyek jelenléte mellett magas a malignus transzformáció kialakulásának kockázata, az ún. high risk (HR-HPV) csoportba sorolják. A high risk csoportba 2004 óta 15 típus tartozik: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 és 82. A high risk HPV típusok olyan onkoproteineket termelnek, melyek kötődnek a p53-hoz, vagy a prb-hoz. A fertőzött sejtek immortalizációjához elég az E6 és E7 fehérjét kódoló DNS fragment integrációja. A különböző HPV típusok elterjedése jelentős és etnikai földrajzi különbségeket mutat. A HPV típusok közül az egyik legnagyobb csoportot a főként nyálkahártyafertőzéseket okozó HPV típusok alkotják, melyek leginkább az anogenitális régióban fordulnak elő. Legismertebb közülük a HPV 16, amely a méhnyakrákok többségénél kóroki szerepet játszik (117). A HPV az eddigi szakirodalom szerint hámsejteket fertőz, epiteliotróp. A vírusfertőzés különböző jó- és rosszindulatú elváltozásokat okozhat. (117). Egyes adatok szerint további ráktípusokban lehet szerepe, pl. nyelőcsőrák, (118), és talán a húgyhólyag tranzicionális sejtes karcinómáinak (TCC) kialakulásában is (119). A vírus rákkeltő hatását, és annak pontos mechanizmusát eddig méhnyakrákokon tanulmányozták a legrészletesebben. A rákot megelőző hámelváltozásokban a HPVgenom episzómák (extrakromoszomális genetikai elemek) formájában található, invazív méhnyakrákokban viszont nagy gyakorisággal beépül a gazdasejt DNS-ébe. Minden jel szerint az integrálódás kulcsfontosságú hámsejtek malignus transzformációjában. A növekvő DNS-instabilitás további genetikai károsodásnak nyit utat. A HPV esetében mindezidáig nem sikerült kitüntetett integrációs helyet kimutatni. Méhnyaki hámon igen hosszú idő telhet el a fertőzéstől kezdve az intraepitéliális neoplázia megjelenéséig, majd az in situ karcinóma, végül az invazív tumor kifejlődéséig. Ez akár 20-30 év is lehet (117). 17
I/2.3. A papillómavírusok életciklusa A papillómavírusok hámsejteket fertőznek, életciklusuk azokkal szinkron: termelődésük a hámsejtek differenciációjához kötődik. Úgy tűnik, a HPV sejtbe jutásáért felelős sejtfelszíni receptorok között lehet heparánszulfát proteoglikán (59, 60, 61), nagy eséllyel éppen a syndecan-molekula; továbbá valószínűleg szükséges az integrin α6/β4 (120). A klatrin-dependens endocitózist gátló klórpromazinnal a fertőzés magakadályozható, mivel a lefűződő endoszómákat klatrinburok veszi körül (121). Fertőzés után a vírusgenom episzóma formájában van jelen a sejtmagban, sejtenként mintegy 50-100 kópiában. Egy HPV-fertőzött sejt osztódása után mindkét leánysejt tartalmazza a vírus DNS-ét, ami a sejtciklus S-fázisában együtt replikálódik a gazdasejt örökítőanyagával. Ezek a sejtek tovább osztódva rezervoárként szolgálnak a vírus számára. A hámfelszín felé vándoroló, és differenciálódó hámsejtekben a HPV örökítő anyaga az újonnan összeszerelődő kapszidokba csomagolódik. A virionok a leváló hámsejtekkel válnak szabaddá, és fertőzhetnek meg újabb sejteket (122). I/2.4. A fő transzformáló vírusfehérjék, az E6 és E7 szerepe a malignus transzformációban Az E6 és E7 fehérjék tehetők felelőssé a fertőzött sejtek malignus átalakulásáért. Bár külön-külön is képesek humán sejtek immortalizációjára, együttműködve fejtik ki funkciójukat, egymás hatását erősítve. Az E6 fehérje a G1/S, G2/M átmenet ellenőrzésééért felelős p53 fehérjéhez kötődik, így az nem tudja kifejteni proapoptotikus hatását. Emellett gátolja az apoptózist Bak fehérje hatásának felfüggesztésével is. Miközben megakadályozza a programozott sejthalált, aktiválja a telomerázt és a Src kinázokat. Míg az E6 fehérje interferál azokkal a mechanizmusokkal, melyek gátolnák a sérült genommal rendelkező sejtek 18
továbblépését a sejtciklusban, az E7 protein aktiválja a ciklin A-t és E-t, valamint ezzel párhuzamosan gátolja a p21 (Waf1) és p27 (Kip1) ciklin-dependens kináz inhibitorok működését, ezáltal S fázisba kényszeríti a gazdasejtet. A transzformáló vírushérjék együttműködése úgy vezet a fertőzött sejt gyorsult proliferációjához, hogy közben a genom épségét ellenőrző mechanizmusok is kiesnek.(2. ábra) (117). 19
2. ábra: a magas kockázatú HPV vírusok két fő transzformáló fehérjéje, az E6 és E7 közösen, egymást erősítve vesz részt a tumorok kialakulásában. Harald zur Hausen cikke nyomán, ( ) 20
I/2.5. A vírus genomja, molekuláris életciklusa, és fehérjéinek kifejeződése A papillómavírus partikulumok mintegy 55 nm átmérőjűek. Az ikozaéderes szimmetriájú, 72 kapszomerből álló fehérjeburkon belül helyezkedik el a mintegy 7200-8000 bázispár méretű cirkuláris, kettősszálú DNS-genom, melyhez hisztonszerű fehérjék kapcsolódnak (123, 124). A DNS-molekulának csak az egyik szálán történik transzkripció, és 8-10 ORF-et tartalmaz. A HPV genomban három fő régiót különíthetünk el: a long control régiót (LCR), ami a vírus-dns kb. 10 %-át teszi ki, valamint a korai (early-e) és a késői (late-l) gének régióját (125). Az L1 ORF kódolja az 55 kda molekulatömegű, erősen konzervált fő kapszidfehérjét. A víruskapszid járulékos strukturális komponense a kevésbé konzervatív L2 fehérje, amely 75 kda molekulatömegű. A korai gének termékei olyan szabályozófehérjék, amelyek a vírusgenom fennmaradásáért, replikációjáért és a litikus ciklusának aktivációjáért felelősek. A korai és a késői gének leolvasási iránya nem teszi lehetővé, hogy a replikáció és a kapszidgének átírása egyszerre történjék (125). I/2.6. A HPV terjedése, epidemiológiai jellemzői A vírus az anogenitális régióban főként nemi érintkezés útján terjed (Sexually Transmitted Disease STD) (126). A HPV terjedését a sérült hámfelszín segíti elő legjobban (127). Feltételezhetően orogenitális kontaktus által is juthatnak fertőző HPV típusok a szájüregi régióba. Itt a nyállal történő terjedés lehetősége sem kizárt (128). A bőr - főleg sérült hám - fertőzése papillómavírussal szennyezett anyagok, eszközök érintésével valósul meg (129). A fertőzés rendszerint szemölcs, vagy nyálkahártya-papillóma alakjában jelenhet meg (130, 131). A fertőzések többsége abortív, vagy spontán gyógyul, azonban ez igen lassú folyamat. A vírusok és a fertőzés klinikai tünetei 1-3 év alatt tűnnek el teljesen. A fertőzött személyek legfeljebb 10 %-ában perzisztál a vírus; ez az érték a magas kockázatú vírustípusok - főként a HPV 16 - esetében 30% felett is lehet (132). Az immunrendszer csak lassan tudja eliminálni a papillómavírussal fertőzött sejteket, és pont a magas rizikócsoportba tartozó vírusok ellen tud kevésbé hatékonyan 21
fellépni. Az immunrendszer defektusai elnyújtják a HPV fertőzések idejét (133, 134, 135). A papillómavírusok nem pusztítják el a vírusfertőzött sejteket, így az immunrendszer aktivációja gyenge, ráadásul a papillómavírusok serkentik gátló citokinek, pl. az IL-4, IL-10 termelődését (136). Már az 1990-es évek elején felmerült a transzverzális terjedés lehetősége is, mely szerint a papillómavírusok perinatális úton kerülnek át a vírushordozó anyáról az újszülöttre (137). Egyes eredmények szerint a per viam naturalem szülés során az újszülött a fertőzés nagy kockázatának van kitéve. Még fontosabb eredmény, mely szerint elképzelhető, hogy az újszülött fertőzött hámsejtjeiben évtizedeken át klinikai következmények nélkül jelen lehet a vírus (138). Az Országos Epidemiológiai Központ virológusai, Csire Márta és munkatársai vetették fel először, hogy az újszülöttek papillómavírussal való fertőződése a fentiektől eltérő útvonalon, a placentán keresztül is bekövetkezhet (139). A magzatvízből szintén detektálható a vírus jelenléte. Leírták továbbá, hogy a HPV képes replikálódni a trofoblasztokban (140). I/2. 7. A Humán papillómavírus a fej-nyaki daganatokban Mikroszkópos morfológiai és immunhisztokémiai vizsgálatok alapján már 1983- ban fölmerült, hogy a HR-HPV típusok etiológiai faktorok lehetnek a szájüregi laphámrákok kialakulásában (141). Azonban az eddigi eredmények ellentmondásosak, és értékelésük is vitatott. A HPV 16-ot az irodalomban fellelhető különböző tanulmányok szerint a száj- és garatüregi rákok 20-90%-ában azonosították; a jelentős szóráshoz bizonyára a különböző mintavételi technikák, illetve az eltérő érzékenységű vizsgálati módszerek is hozzájárultak. A szájrákokban a leggyakrabban előforduló HPV típusok a HPV 16 és a 18, melyek aránya messze meghaladja a többi típusét (115, 141). A HPV-asszociált daganat gyakoribbnak bizonyult nőkben, továbbá magyarázatot adott a karcinóma kialakulásáról az olyan betegek többségénél, akiknek anamnézisében sem alkohol, sem dohányzás nem szerepelt, noha a fej-nyaki daganatok gyakran összefüggnek e tényezőkkel (115, 141, 142). 22
A vírus integrációját a gazdasejtek genomjába a szájüregi rákok esetében is a vizsgált minták közel felében bizonyítani tudták. A vírusintegrációt a szájüregi karcinogenezisben korai eseménynek tartják, és a rákmegelőző állapotok malignussá alakulásában tartják kulcsfontosságúnak (115, 143). Egy másik kutatócsoport viszont ezt cáfolva az integrációt igen ritka eseménynek találta (144). Klinikai vizsgálatok azt az eredményt hozták, hogy a HPV jelenléte a fej-nyaki rákokban kifejezetten jó prognosztikai faktor a más eredetű karcinómákhoz képest, ami a HPV-asszociált karcinogenezisnek a más etiológiájú rákokétól eltérő molekuláris mechanizmusára utalhat (115, 145). Széleskörű, kiterjedt vizsgálatok szerint a HPVasszociált fej-nyaki daganatok egy sajátos, külön entitást alkotnak, melyet kedvezőbb prognózis jellemez, és a tumorok gyakran bazaloid morfológiájúak. Mindazonáltal jelenleg is kétes, hogy a szájüreg rosszindulatú laphámdaganataiban a papillómavírusok valóban kóroki tényezők-e; és ha azok, a HPV-asszociált fej-nyaki daganatok valószínűleg akkor is más mechanizmusok útján alakulnak ki, mint azt a HPV-kapcsolt anogenitális karcinómák, például a méhnyakrák esetében megismertük. A legtöbb eddigi vizsgálat szerint a HPV kópiaszáma szájüregi laphámrákokban alacsony. A HPV DNS jelenlétét különálló fókuszokban lokalizálták különböző in situ vizsgálómódszerekkel. Ebből a daganat nem-klonális jellegére lehetne következtetni, amely azonban további kérdéseket vet fel. A HPV replikációja általában csak néhány fertőzött sejtre korlátozódik (145, 147). Számos olyan adat merült föl, amely szerint a szájüregben tranziens ágensként is megjelenhetnek a humán papillómavírusok magas rizikójú változatai. Egy tanulmány egyenesen az alkalmazott PCR technikák túlérzékenységét okolja azért, amiért a HPV-t összefüggésbe hozták a szájrákkal (146). Néhány kutatócsoport szerint a vírus inkább bystander, mint patogén tényező a szájüregi daganatokban (147). Összefoglalva: A méhnyaki daganatok mellett még a fej-nyaki laphámrákok az a tumoros csoport, ahol összefüggést találtak a vírus jelenléte és a daganatok kialakulása között. Azonban a HPV etiológiai szerepe korántsem olyan meggyőző, mint a cervixtumorok esetében. 23
I/3. CÉLKITŰZÉSEINK Vizsgálataink során tisztázni akartuk a sejtfelszíni syndecan-1 csökkenésének klinikai szerepét az általunk követett betegek szájüregi és méhnyaki laphámrákjaiban. Kísérleteink során mi is találkoztunk a kötőszöveti syndecan-1 expresszió jelenségével, e szempontot is bevontuk klinikopatológiai tanulmányunkba, és más tényezőkkel együtt vizsgáltuk hatását a betegek későbbi sorsára. Ugyancsak terveztük a HPV-fertőzés és a syndecan-1 expresszió esetleges összefüggésének elemzését fej-nyaki daganatokon. A HPV vírusreceptoraiként heparánszulfát proteoglikánok is szerepelnek, ezért feltételeztük, hogy a syndecan is betölthet ilyen szerepet (ez azóta igazolódni látszik). Továbbá, miután mind a megtartott sejtfelszíni syndecan-1 reakciót, mind a HPV genom jelenlétét kedvezőbb prognózis jeleként írták le, azt feltételeztük, hogy a HPV-asszociált tumorok, melyek amúgy is eltérő molekuláris jellemzőkkel bírnak a vírus DNS-t nem-hordozó fej-nyaki daganatoktól, syndecan-1 expressziójuk szerint is elkülönülő csoportot alkotnak. Mindeközben azonban egy jóval alapvetőbb problémával szembesültünk: kiderült, hogy a HPV-asszociált szájrák fogalma ha egyáltalán létezik ilyen entitás koránt sem egyértelmű. Világossá vált a PCR technikák elégtelensége a szájrák és a papillómavírus kapcsolatának elemzésében. Ezért vírusfehérjék kimutatásán alapuló módszereket, és in situ hibridizációs technikákat alkalmaztunk, melyek során új eredményekre jutottunk. 24
II. ANYAG, MÓDSZER II/1. SZÖVETTANI MINTÁK II/1.1. Szájüregi minták A Szájsebészeti és Fogászati Klinika 91 betegének műtéti anyagából származó formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövettani mintáját dolgoztuk fel. A szövettani kiértékelést a Klinika saját szövettani laboratóriuma végezte, melyet Prof. Dr. Suba Zsuzsanna vezet. A betegek közül 40 szájüregi leukoplákiában, a további 51 pedig szájüregi laphámrákban szenvedett. A szájrákos páciensek daganatai mind primer tumorok voltak, a recidív vagy áttéti daganatokat kizártuk a vizsgálatból. Az elemzett primer szájrákok anatómiai lokalizációjuk szerint az alábbi módon oszlottak meg: 41 volt nyelv- vagy nyelvgyöki rák; öt betegnek volt gingivakarcinómája; 1-1 betegnek volt retromolaris, bucca-, vagy tonsillatumora; 2 betegnél pedig maxillakarcinóma volt az alapbetegség. Arra törekedtünk, hogy a lehető leginkább homogén betegcsoporton végezzük el a klinikai paraméterek statisztikai értékelését. Ezért az 51 esetből csak a (T2) méretű nyelv-/nyelvgyöki rákban szenvedő pácienseket vettük figyelembe; további kiválasztási szempont volt, hogy a malignóma ne lépje át a középvonalat. A betegek a Szájsebészeti és Fogászati Klinika kezelése alatt álltak, műtét előtti keringési paramétereik, respiratorikus és vesefunkcióik kielégítőek voltak, vérképzési paramétereik normális értékeket mutattak. A vizsgált esetek II-IV. stádiumúak voltak (T2N0M0 - T2N2M0 ).. Amelyik páciens nem felelt meg a megadott patológiai vagy belgyógyászati feltételeknek, kizártuk a statisztikai elemzésből. Bár mind az 51 primer szájüregi laphámrákban szenvedő beteg mintáját fölhasználtuk a syndecan-1 expressziós eltérések jellemzéséhez, azonban klinikai összefüggéseket csak az e körültekintő szempontok alapján kiválasztott, 39 fős csoporton írtunk le. A betegek közül 29 férfi és 10 nőbeteg volt, átlagéletkoruk 53,1 év (39-68 év ). A kiválasztott betegek terápiás protokollja homogénnak volt tekinthető. A neoadjuváns 25