NOVA Lite TM SA 708330 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás A NOVA Lite TM SA egy indirekt immunofluoreszcens teszt bőr antitestek szűrésére és szemikvantitatív meghatározására humán szérumban. Az anti-nukleáris antitestek jelenléte más szerológiai vizsgálatok eredményével és a klinikai adatokkal együtt segíti az autoimmun bőrbetegségek, különösképpen a pemphigus és pemphigoid diagnózisának felállítását. A teszt összegzése és magyarázata A bőr autoantitestek fogalommal különböző autoantitesteket jelölnek, amelyek a bőr alkotórészeivel és a nyálkahártya felszínével reagálnak. Ezek az autoantitestek nagy gyakorisággal megtalálhatók az autoimmun bőrbetegségekben, különösképpen a pemphigusban és a pemphigoidban szenvedő betegekben. A bőr és a nyálkahártya intercelluláris antigénjével reagáló autoantitestek gyakorlatilag az összes aktív bullózus pemphigus esetén megtalálhatóak. 1 Ezen antitestek titere párhuzamot mutat a betegség aktivitásával, illetve a sikeres terápia során lecsökken. 2,3,4 A másik jelentős autoimmun bőrbetegség, a bullózus pemphigoid szerológiailag a bőr és a nyálkahártya bazális membrán antitesteinek jelenlétével azonosítható. A keringő bazális membrán elleni antitestek a pemphigoid betegek 70-80%-ában megtalálhatóak. 5,6,7 A betegség súlyossága és az antitest titere között pemphigoid esetén van bizonyos összefüggés, habár nem olyan feltűnő mértékű a korreláció, mint a pemphigus esetén. A betegek állapotának javulása során, mind spontán, mind kezelést követően, a bazális membrán elleni antitestek szintje lecsökken, általában a kimutathatósági határ alá. 7 A legtöbb esetben a visszaesés kísérő jelensége a bazális membrán elleni antitestek újbóli megjelenése. A bőr autoantitestek vizsgálatára a legelterjedtebb módszer az indirekt immunofluoreszencia. Szubsztrátként elterjedten használnak rágcsáló vagy főemlős bőr- illetve nyálkahártyaszövetet a kiválasztott szubsztrátnak megfelelő főemlős nyelőcső metszettel borítva. 8,9,10 A szubsztrát típusa mellett a következő tényezők alapvető fontosságúak a bőr antitest teszt kivitelezése szempontjából: 1) a szubsztrátlemez előkészítésekor használt fixáló, 2) a használt FITC jelölt konjugátum specificitása és a fluoreszcein mennyisége a fehérjéhez képest (F/P arány). Egyes fixálók, vagy azok kombinációi bizonyos bőr antigéneket tönkretesznek, emiatt használatuk kerülendő. A konjugátum F/P aránya meghatározza a specificitást és a háttérfestődés mértékét. A konjugátum specificitása alapvetően fontos. Az autoantitestek nagy többsége az IgG alosztályba tartozik. Köztudott, hogy az egészséges véradók mintáiban talált autoantitestek általában az IgM, illetve az IgA alosztályba tartoznak, az IgG alosztályba csak ritkán. 11 Ez az oka annak, hogy az IgG-specifikus konjugátumok betegség-specifikusabbak. A NOVA Lite TM SA teszt készítéséhez kiválasztott szubsztrát optimálisan fixált főemlős oesophagus metszet. A konjugátum affinitás kromatográfiával tisztított anti-humán IgG. A módszer elve Az indirekt immunofluoreszcens eljárás során a mintákat az antigén szubsztráttal inkubáljuk, majd a feleslegben maradt antitestet-mosással eltávolítjuk. Ezután a szubsztrátot specifikus fluoreszceinnel jelölt konjugátummal inkubáljuk, majd a reagens-felesleget ismét lemossuk. Fluoreszcens mikroszkóppal megtekintve az autoantitest pozitív minták almazöld fluoreszcenciát mutatnak a sejt vagy a sejtmagok azon területein, ahol az autoantitest megkötődött. 1
Reagensek 1. Bőr antitest lemez (főemlős nyelőcső), 8 mérőhely/lemez, deszikkánssal 2. Anti-humán IgG konjugátum (kecske), fluoreszceinnel jelölve, Evans Blue festéket és 0,09% nátrium-azidot tartalmazó pufferben, 7 ml 3. Pemphigoid pozitív minta, 1 ampulla, 0,09% nátrium-azidot és humán szérum pemphigoid elleni antitesteket tartalmazó puffer, előhígított, 0,5 ml 4. IFA negatív kontroll, 1 ampulla, 0,09% nátrium-azidot és humán szérum pemphigoid elleni antitesteket nem tartalmazó puffer, előhígított, 0,5 ml 5. PBS koncentrátum, 40x-es töménységű, 1000 ml oldat készítésére elegendő. 6. Rögzítő médium, 0,09% nátrium-azidot tartalmaz, 7 ml 7. Fedőlemezek Figyelmeztetések 1. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV,HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért a Pemphigoid pozitív és az IFA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 12 2. Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólomvagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából, öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 3. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 4. A kicseppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekhez vezethet. 3. Az IFA mérőhelyek nem tökéletes vagy hatástalan mosása magas hátteret okozhat. 4. A teszt adaptációja automatikus mintakezelő rendszerek, vagy más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja a manuális módszerhez képest. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt teljesítményét több tényezõ befolyásolhatja. Ilyen a reagensek kezdeti hőmérséklete, a használatban lévő mikroszkóp lámpájának fényereje, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás alapossága és az inkubációs idők hossza. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. Fény hatására idővel az anti-humán IgG konjugátum színe megváltozhat Ez a színváltozás azonban a teszt működését nem befolyásolja hátrányosan. 7. A protokoll szigorú betartása javasolt. 2
Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A hígított PBS puffer 2-8 C között tartva 4 hétig stabil. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérumminták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás szérumok, illetve minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után, és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 10 8 mérőhelyes SA szubsztrát lemez (8-well SA Substrate Slides) 1 7 ml FITC Anti-humán IgG konjugátum (FITC Anti-Human IgG Conjugate) 1 0,5 ml pemphigoid pozitív minta (Pemphigoid Positive) 1 0,5 ml IFA negatív kontroll (IFA Systems Negative Control) 1 25 ml PBS koncentrátum (40x) (PBS Concentrate) 1 7 ml rögzítő médium (Mounting Medium) 1 10 fedőlemez További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mikropipetták 15 1000 μl méréséhez Desztillált vagy ioncserélt víz Spriccflaskák vagy Pasteur-pipetták Nedveskamra 1 literes edény (a PBS hígításához) Coplin-festőedény Fluoreszcens mikroszkóp 495 nm-es gerjesztési és 515 nm-es emissziós szűrővel Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. A PBS koncentrátum hígítása: FONTOS: Hígítsa a PBS koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a PBS koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. A PBS puffert használja a minták hígítására és mosópufferként. A hígított puffer 2 8 C között tartva 4 hétig stabil. 3
3. A betegek mintáinak hígítása: a. Előszűrés: Hígítsa a betegek mintáit 1:10 arányban a hígított PBS pufferrel (azaz, adjon 100 μl szérumot 900 ml PBS pufferhez). b. Titrálás: Készítsen 2-szeres (vagyis felező) hígítási sort minden egyes pozitív minta eredeti, szűrés céljára készített hígításából (azaz 1:20, 1:40,... 1: 2560). A teszt kivitelezése 1. A szubsztrát lemezek előkészítése: Hagyja a lemezeket szobahőmérsékletűre melegedni, mielőtt a tasakból kiveszi. Jelölje meg ceruzával és helyezze egy alkalmas nedveskamrába. Cseppentsen egy-egy csepp (70-90 μl) hígítatlan pozitív és negatív kontrollt az 1-es illetve a 2-es mérőhelyre. A maradék helyekre tegyen egy-egy csepp (70-90 μl) hígított betegmintát. 2. A lemezek inkubálása: Inkubálja a lemezeket 25-35 percig nedveskamrában (egy zárt műanyag vagy üvegedény aljára helyezett megnedvesített papírtörlő képes fenntartani a megfelelő páratartalmat). Ne engedje a szubsztrátot kiszáradni a teszt kivitelezése közben. 3. A lemezek mosása: Az inkubáció után spriccflaska vagy Pasteur pipetta segítségével óvatosan mossa le a szérumot a lemezről hígított PBS pufferrel. Úgy irányítsa a lemezt és a PBS puffer folyadéksugarat, hogy minimális legyen a minták mosással okozott átszennyeződése az egyes mérőhelyek között. Ne irányítsa a folyadéksugarat közvetlenül a szubsztrátra, mert az könnyen megsérülhet. Ha szükséges, helyezze a lemezeket további 5 percre hígított PBS pufferbe egy Coplin-festőedényben. 4. A fluoreszcens konjugátum felvitele: Rázza le a fölösleges PBS puffert a lemezről. Tegye vissza a lemezt a nedveskamrába és azonnal fedje be minden egyes mérőhely tartalmát egy-egy csepp fluoreszcens konjugátummal. Inkubálja a lemezeket újabb 25-35 percig. 5. A lemezek mosása: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Fedés fedőlemezzel: A fedőlemezek elhelyezésének technikája laboratóriumonként változó; de javasoljuk az alábbi eljárást: a. Helyezzen egy fedőlemezt egy papírtörlőre. b. Vigyen fel rögzítő médiumot folyamatos vonalban a fedőlemez alsó szélére. c. Rázza le a PBS felesleget, és érintse a tárgylemez alsó szélét a fedőlemez széléhez. Óvatosan süllyessze a tárgylemezt a fedőlemezre úgy, hogy a rögzítő médium a lemez felső éle felé tudjon folyni, levegőbuborékok vagy zárvány képződése nélkül. Minőség-ellenőrzés A pemphigoid pozitív mintát és az IFA negatív kontrollt is fel kell tenni minden egyes lemezre, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és -70 C alatt történő tárolásával. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit valósnak tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a teszt eredményeit érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. 1. A pemphigoid pozitív mintának > 3+ értékűnek kell lennie. 2. Az IFA negatív kontrollnak negatív eredményt kell adnia. 4
Az eredmények értelmezése Negatív reakció. Egy mintát akkor tekintünk negatívnak, ha az intercelluláris területek, a bazális membrán zóna vagy egyéb struktúrák specifikus festődése azonos vagy kisebb mértékű, mint a negatív kontrollé. A minták különböző fokú háttérfestődést mutathatnak a heterofil antitestek miatt, vagy a reticulin antitestek, anti-nukleáris, anti-endomysialis vagy az anti-simaizom antitestek egyéb specifikus reakciói miatt. Pozitív reakció intercelluláris és bazális membrán antitestekre. Egy minta akkor tekinthető pozitívnak, ha a nyelőcső-nyálkahártya intercelluláris vagy bazális membrán területének specifikus festődése figyelhető meg. A fluoreszcencia mértékét vagy intenzitását a következő kritériumok alapján határozza meg: 4+ Ragyogó almazöld fluoreszcencia 3+ Fényes almazöld fluoreszcencia 2+ Világosan megkülönböztethető pozitív fluoreszcencia 1+ A leggyengébb specifikus fluoreszcencia, ami még lehetővé teszi az intercellularis vagy bazális membrán terület festődésének egyértelmű megkülönböztetését a háttér-fluoreszcenciától. A módszer korlátai 1. A bőr autoantitestek jelenléte bizonyos autoimmun bullózus bőrbetegségekre utal, de kórmeghatározásnak nem szabad tekinteni. Az autoantitest eredményt más szerológiai vagy biopszia vizsgálatok eredményével és a beteg átfogó klinikai kórtörténetével együtt kell értékelni. 2. A bőr autoantitesteken kívül egyéb autoantitestek is képesek az oesophagus szubsztráttal reagálni. Ezek közé tartozik az anti-nukleáris (ANA), az anti-mitokondriális (AMA), az anti-simaizom és az anti-vázizom autoantitestek. Ezeknek az antitesteknek a jelenlétét figyelembe kell venni, jelenlétüket meg kell erősíteni, illetve egy másik jóváhagyott szubsztráton titrálni kell. 3. Figyelembe kell venni azt is, hogy egyes égési sérültek, a szövetkárosodás másodlagos betegségeként gyengén reaktív antitesteket termelnek, melyek szintén az intercelluláris területhez kötődnek. Ezek, az úgynevezett pemphigus-szerű" antitestek a nyálkahártya gyenge és egyenetlen festődését eredményezik, ideiglenesek és a beteg bőrével in vivo nem reagálnak. 13,14,15 4. Mivel a nyelőcső-nyálkahártya tartalmazhat bizonyos vércsoport specifikus anyagokat, az anti-a illetve anti-b vércsoport-antitestek reagálhatnak az oesophagus-szal. 16 Egyes betegek esetében a reaktivitás mintázata hasonlatos lehet a pemphigus intercelluláris autoantitestek esetén megfigyelt mintázathoz (habár a vércsoport antitestek csak az oesophagus metszetek izomzatában lévő hajszálereket festik meg). A vércsoport antitest a vércsoport antigénnel reagálva kicsapódhat. 17 5. Változatos külső tényezők befolyásolják a teszt érzékenységét, többek között az értékeléshez használt fluoreszcens mikroszkóp típusa, az izzó ereje és életkora, az alkalmazott nagyítás, a szűrőrendszer és a vizsgálatot végző személy. 6. Ha az 515 nm-es band pass szűrő helyett 515 nm-es barrier szűrőt használ, a festődésben nagyobb arányban találkozhat műtermékkel. 7. A lemezek jelölésére kizárólag ceruzát használjon. Bármilyen más íróeszköz használata festődési hibát, műterméket okozhat. 8. A lemezek mosására használt Coplin-festőedényeknek valamennyi festékmaradványtól mentesnek kell lenniük. A festékmaradványt tartalmazó Coplin-festőedények használata festődési műterméket okozhat. 5
9. Ezen teszt eredményeit a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 10. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő mátrixok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek NOVA Lite TM SA szubsztrát használatával vizsgáltak pemphigus és pemphigoid bőrbetegségben szenvedő betegeket, valamint 100 random kiválasztott véradót. Az eredmények az alábbiakban láthatók: Pozitív minták száma Betegcsoport Mintaszám: Intercelluláris Bazálmembrán terület Pemphigus 24 20 0 Pemphigoid 18 0 12 Normális 100 0 0 6
Hivatkozások 1. Chorzelski TP, Beutner EH, Jablonska S: "The Role and Nature of Autoimmunity of Pemphigus" in Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp. 183-229, 1979. 2. Chorzelski TP, von Weiss JF, Lever WF: Clinical significance of autoantibodies in pemphigus. Arch. Dermatol.: 93:570, 1966. 3. Jablonska S, et.al.: Pathogenesis of pemphigus erythematosus. Arch. Dermatol. Res. 258:135, 1977. 4. Peck SM, et.al.: Studies in Bullous diseases. Arch. Dermatol. 103:141, 1971. 5. Jordon RE, et.al.: Basement zone antibodies in bullous pemphigoid. JAMA 200:751, 1967. 6. Person JR, Rogers RS: Bullous and cicatricial pemphigoid. Mayo Clin. Proc. 52:54,1977. 7. Chorzelski TP, Jablonska S, Beutner EH: "Pemphigoid" in Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp. 243-255, 1979. 8. Sabolinski ML, et.al.: Substrate specificity of anti-ephithelial antibodies of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceous sera in immunofluorescence tests on monkey and guinea pig esophagus sections. J. Invest. Dermatol. 88:545, 1987. 9. O'Loughlin S, Goldman GC, Provost TT: Fate of pemphigus antibody following successful therapy. Preliminary evaluation of pemphigus antibody determination to regulate therapy. Arch. Dermatol. 114:1769, 1978. 10. Feibeleman C, Stolzner G, Provost TT: Pemphigus vulgaris. Superiority of monkey esophagus in the determination of pemphigus antibody. Arch. Dermatol. 117:561, 1981. 11. Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta. Path. Microbiol. Scand. 84:215-220, 1976. 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007 13. Ablin RJ, et.al.: Pemphigus-like antibodies in patients with skinburns. Vox Sang 16:73, 1969. 14. Quismorio FP, Bland SL, Friou GJ: Autoimmunity in thermal injury: Occurrence of rheumatoid factors, antinuclear antibodies and antiepithelial antibodies. Clin. Exp. Immunol. 8:701, 1971. 15. Trifthauser C, et.al.: Fluorescent antibody studies of pemphigus-like antibodies in burn sera. Ann. NY Acad. Sci. 177:227, 1971. 16. Szulman AE: The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp. Medicine 115:977, 1962. 17. Beutner EH, et. al.: "Defined immunofluorescence-basic concepts and their application to clinical immunodermatology." Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp. 29-75, 1979. 7
A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628330HUN January 2009 Revision 0 8