QUANTA Lite TM GPA (Gyomor Parietalis Sejt Antitest) 708765 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

QUANTA Lite TM GPA (Gyomor Parietalis Sejt Antitest) 708765 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM GPA (Gyomor Parietalis Sejt Antitest) kit egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a gyomor parietalis sejt (H+/K+) ATPase ellenes, IgG osztályba tartozó antitestek szemikvantitatív kimutatására humán szérumban. A gyomor parietalis sejt (H+/K+) ATPase ellenes antitesteknek a jelenléte felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtt kiegészítő adatként a gyomor parietalis sejt (H+/K+) ATPase ellenes antitestek emelkedett szintjével járó állapotok, például az anaemia perniciosa diagnosztikája során. A teszt összegzése és magyarázata Az anaemia perniciosa egy krónikus betegség, az A típusú (autoimmun) krónikus atrophiás gastritis végső stádiuma. Az A típusú krónikus atrophiás gastritis a gyomor fundusát és a testét érinti, míg a B típusú (nem autoimmun) kórkép a gyomor fundusán és corpusán kívül az antrumot is megbetegíti. Az A típus anaemia perniciosaval jár együtt, a B típus pedig a H. pylori fertőzéssel. 1-3 Miközben az A típusú krónikus atrophiás gastritis gyomor atrophia kifejlődése irányába progrediál, a gyomor parietalis sejtjei amelyek az intinsic faktort és a sósavat termelik, elpusztulnak, és így az intrinsic faktor és a sósav termelése megszűnik. Az intrinsic faktor feltétlenül szükséges a B 12 vitaminnak a bélből történő felszívódásához és ennek hiányában B 12 vitamin deficiencia és megaloblastos anaemia alakul ki. Az anaemia perniciosa kezdete tipikusan lassú, a folyamat progressioja az atrophiás gastritistől a gyomor atrophiáig és a klinikai anaemia kialakulásáig 20-30 évig is eltart. A diagnózis felállítása idején a betegek életkori medián értéke 60 év. Habár a betegség többnyire nem kerül felismerésre mielőtt az anaemia vagy más tünetek súlyosabbá válnak, a háttérben lévő gyomorléziók évekkel az anaemia kialakulása előtt felfedezhetők 3,4. Az anaemia perniciosa betegekben nagyobb gyakorisággal fordulnak elő más autoimmun kórképek, többek között az autoimmun thyreoiditis (Hashimoto thyreoiditis), 1-es típusú diabetes, Addison betegség, Graves betegség és myasthenia gravis. Az anaemia perniciosa betegekről leírták, hogy esetükben 3x nagyobb a kockázata gyomor carcinoma, és 13x nagyobb a kockázata a gyomor carcinoid tumor kialakulásának. 5 A gyomor parietalis sejtek ellen termelődött autoantitestek megtalálhatók az anaemia perniciosa betegek megközelítőleg 90%-ában, és körülbelül 30%-ban a betegek elsőfokú rokonaiban is. 1-3 A gyomor parietalis sejt antitestek (GPA) kimutatása általában indirekt immunfluorescens (IFA) eljárással történik, rágcsálók gyomor mucosájából készült szövettani metszeteken. 2 A gyomor parietalis sejt antitestek egy membránhoz kötött antigén ellen irányulnak, a gyomor parietális sejtjeinek secretoros canaliculusaiban és tubulovesiculumaiban. 6 A GPA antigén targetjét sikerült azonosítani, ez a gyomor H+/K+ ATPase (gyomor proton pumpa), ami felelős a gyomor lumenének acidifikációjáért. 7-11 A GPA a H+/K+ ATPase α és β alegységéhez egyaránt kötődik. 9 A GPA prevalenciája az életkorral nő, megtalálták a 30-39 év közötti normál populáció 2.5%-ában és 9.6%-ában egy olyan populációnak, amelynek tagjai a nyolcvanas éveikben jártak. 3 Egy friss tanulmány beszámol arról, hogy a GPA és a szövődött atrophiás gastritis nagyobb prevalenciája figyelhető meg 1-es típusú diabetesben, és határozottan javasolja, hogy az anaemiás és/vagy gyomorpanaszokkal rendelkező diabeteses betegeket vizsgálni kell GPA-ra. 12 A GPA nagyobb koncentrációi figyelhetők meg pajzsmirigy betegségben, vashiányos anaemiában, alopecia areata és vitiligo eseteiben. 13,14 A GPA kimutatása IFA módszerrel munkaigényes, az eredmények szubjektív interpretációjához nagy gyakorlattal rendelkező személyzetre van szükség, a módszer ki van téve az IFA lemezek készítéséhez felhasznált szövetmetszetek minőségében és reprodukálhatóságában fellelhető változásoknak. Amikor felismerték, hogy a gyomor H+/K+ ATPase α és β alegységei a gyomor parietalis sejt autoantitestek fő molekuláris targetjei, érzékeny és specifikus ELISA módszereket lehetett kidolgozni a GPA antitestek detektálására. 15 Az ELISA módszerek használata elérhetővé teszi a standardizált, reprodukálható és objektív GPA teszt eredményeket. A módszer elve Sertés gyomor mucosából izolált és tisztított H+/K+ ATPase antigént kötöttek polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához olyan körülmények között, ami képes az antigén natív állapotát megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő H+/K+ ATPase antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG 1

felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított H+/K+ ATPase antigénnel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán H+/K+ ATPase antigén ellenes antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. GPA ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum H+/K+ ATPase ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. GPA ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum H+/K+ ATPase ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kék színűre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a GPA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a GPA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 16 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 2

5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 GPA ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL GPA ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL GPA ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll) előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HS HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 3

2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a GPA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a GPA ELISA erősen pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. 4. A GPA antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított GPA ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a GPA ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon 200-300µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A GPA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a GPA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a GPA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a GPA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. 4

a. Az előhígított GPA ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított GPA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított GPA ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A GPA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint 0.25. d. Az ELISA negatív kontroll és a GPA ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. A GPA ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. 17 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása meghatározható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk a GPA ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk a GPA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység mérőszámával. Minta OD Minta eredménye = x GPA ELISA mérs. Pozitív Kontroll (egység) GPA ELISA mérs. Pozitív Kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A minta besorolása lehet negatív, kétes (átmeneti), vagy pozitív (H+/K+ ATPase ellenes IgG antitest detektálható) az alábbi táblázat szerint: Egység Negatív 0.0 20.0 Kétes 20.1 24.9 Pozitív 25 A kétes eredményt adó mintákkal a tesztet az eredmény közlése előtt meg kell ismételni. 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában H+/K+ ATPase antitestek vannak, és felveti az anaemia perniciosa vagy hasonló betegség fennállásának lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs H+/K+ ATPase antitestje, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 3. Az olyan minta, amelyikben a GPA meghatározás kétes eredményt adott, nem alkalmas az antitest státusz megítélésére. Amennyiben a megismételt vizsgálat eredménye is kétes, az eredményt kétesként kell interpretálni és/vagy egy újabb vérmintát kell venni a betegtől. 4. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM GPA ELISA kit használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott GPA eredmények ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nemspecifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Egy negatív gyomor parietalis sejt antitest eredmény nem zárja ki az anaemia perniciosa lehetőségét. 3. Egy negatív GPA eredmény nem zárja ki a GPA meglétét, lehetséges, hogy az antitest 5

koncentrációja nem éri el a pozitivitás küszöbét. 4. Egy pozitív teszt eredmény csupán a H+/K+ ATPase ellenes antitest jelenlétére utal, és nem feltétlenül jelenti autoimmun vagy más betegség fennállását. 5. Az assay működését gyermekgyógyászati mintákkal nem vizsgálták. 6. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 7. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Várható értékek A QUANTA Lite GPA ELISA teszt alkalmasságát a H+/K+ ATPase antitestek detektálására egy kereskedelmi forgalomban lévő H+/K+ ATPase ELISA kittel történt összehasonlítás segítségével határozták meg. Az eredmények összehasonlítása megtörtént a QUANTA Lite TM GPA ELISA és egy egér vese/gyomor lemezen végzett indirekt immunfluorescens assay végrehajtása után is. A GPA prevalenciája egészséges normál populációban az életkorral nő, a harmadik évtizedben észlelhető megközelítőleg 2.5%-tól a nyolcadik évtizedre eléri a 9.6%-ot. A GPA gyakorisága általában nagyobb nőkben, mint férfiakban. Az 55 év alatti férfiak 5.5%-a volt GPA pozitív, szemben a nők között észlelt 14.7%-kal. Az 55 év feletti korcsoportban a férfiak 9.2%-a és a nők 22.3%-a volt GPA pozitív 4. Referencia tartomány Tünetmentes, egészséges személyektől származó 210 összegyűjtött mintát teszteltek a QUANTA Lite TM GPA ELISA kittel. A vizsgált személyek életkora 17-77 (medián 32) év volt. A 210 vizsgált mintából 154 (73.3%) származott férfiaktól, és 56 (26.7%) nőktől. Az átlagos érték 7.3 egység volt, az értékek 1.3 és 84.1 egység között voltak. A 7 GPA pozitív mintából 2 lett GPA IFA pozitív. Miután kizárták a 4 kétes eredményt, a specificitás 96.6% (199/206) lett. Relatív szenzitivitás és specificitás Anaemia perniciosa betegektől származó 20 mintát vizsgáltak a Quanta Lite TM GPA ELISA kittel és egy ismert GPA ELISA kittel. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja. Az egér vese/gyomor lemezen végzett IFA eredményeivel történt összehasonlítás eredménye a 2. táblázatban látható. A 3. táblázat mutatja a Quanta Lite TM GPA ELISA és az ismert GPA ELISA kit eredményeinek összehasonlítását egy 41 mintából álló panelen. 1. Táblázat: QUANTA Lite TM GPA (Gyomor Parietalis Antitest) és az ismert GPA ELISA eredményei Anaemia Perniciosa betegek mintáiban QUANTA Lite GPA ELISA EREDMÉNYEK Kétes (0) Neg (5) Ismert GPA ELISA N=20 Poz (15) Pozitív Poz (14) 14 0 0 Kétes Kétes (5) 1 0 4 Negatív Neg (1) 0 0 1 Egyezés (a kétes eredmények kizárása után): 100% (15/15) 2. Táblázat: QUANTA Lite TM GPA ELISA és GPA (Egér vese/gyomor) IFA eredmények anaemia perniciosa betegek mintáin QUANTA Lite GPA ELISA EREDMÉNYEK Kétes (0) Neg (5) GPA IFA N= 20 Poz (15) Pozitív Poz (15) 15 0 0 Kétes Kétes (0) 0 0 0 Negatív Neg (5) 0 0 5 Egyezés : 100% (20/20) 3. Táblázat: QUANTA Lite TM GPA (Gyomor Parietalis Antitest) és az ismert GPA ELISA eredményei a GPA vizsgálatra érkezett mintákban QUANTA Lite GPA ELISA EREDMÉNYEK Ismert GPA ELISA N=41 Poz (19) Pozitív Poz (22) 17 2 3 Kétes Kétes (0) 0 0 0 Negatív Neg (19) 2 0 17 Egyezés (a kétes eredmények kizárása után): 89.7% (35/39) Kétes (2) Neg (20) 6

Kereszt-reaktivitás vizsgálata Autoimmun vagy fertőzéses betegség vagy más kóros állapotok - H. pylori (7), thyroid peroxidase (5), thyroid-m (5), thyroid-t (4), beta-2 glycoprotein (5), LKM-1 (5), autoimmun hepatitis, 1-es típus (14), mitochondrium M2 (4) - miatt ellenanyag pozitív páciensektől származó szérumokat teszteltek kereszt-reaktivitásra a QUANTA Lite TM GPA ELISA kittel. Egy H.pylori és 2 TPO pozitív minta volt pozitív a QUANTA Lite TM GPA ELISA módszerrel. Ez a 3 minta IFA eljárással is GPA pozitív lett. Precizitás és reprodukálhatóság A QUANTA Lite TM GPA ELISA intra-assay reprodukálhatóságát 6 mintának mintánként összesen 9- szer végzett analízisével vizsgálták. A 4. táblázatban összefoglalt eredmények az intra-assay precizitást mutatják. 4. Táblázat: A QUANTA Lite TM GPA ELISA intra-assay teljesítménye A minta B minta C minta D minta E minta F minta Átlag egység 40.7 93.4 35.4 58.3 47.0 10.5 SD 2.3 5.7 3.2 5.4 5.1 0.7 CV % 5.6 6.1 9.0 9.2 10.8 6.9 Az inter-assay teljesítményt 5 mintának naponta kétszer, két-két párhuzamos méréssel, 3 napon keresztül végzett analízisével határozták meg. 5. Táblázat: A QUANTA Lite TM GPA ELISA inter-assay teljesítménye 1 minta 2 minta 3 minta 4 minta 5 minta Átlag egység 32.7 95.2 11.4 32.9 5.9 SD 1.61 2.25 0.37 1.77 0.42 CV % 4.9 2.4 3.2 5.4 7.1 Hivatkozások 1. Gleeson PA and B-H Toh. Molecular Targets in Pernicious Anemia. Immunology Today 12(7): 233-238, 1991. 2. Gleeson PA, Van Driel IR and B-H Toh. Parietal Cell Antibodies. In: Autoantibodies. Peter JB and Y Shoenfeld, eds., Elsevier Science B.V. pp 600-606, 1996. 3. Toh B-H, Van Driel IR and PA Gleeson. Pernicious Anemia. N. Eng. J. Med. 37(20): 1441-1448, 1997. 4. Lee GR. Pernicious Anemia and other causes of vitamin B12 (cobalamin) deficiency. In: Wintrobe s Clinical Hematology, 10 th ed, Williams & Wilkins, pp 941-964, 1999. 5. Hsing AW, Hansson L-E, McLaughlin JK, et al. Pernicious anemia and subsequent cancer: a population-based cohort study. Cancer 71:745-750, 1993. 6. Hoedemaeker PJ and S Ito. Ultrastructural localization of gastric parietal cell antigen with peroxidasecoupled antibody. Lab. Invest. 22:184-188, 1970. 7. Burman P, Mardh S, Norberg L and FA Karlsson. Parietal cell antibodies in pernicious anemia inhibit H+/K+ -adenosine triphosphatase, the proton pump of the stomach. Gastroenterol. 96:1434-1438,1989. 8. Toh B-H, Gleeson PA, Simpson RJ, et al. The 60- to 90 kda parietal cell autoantigen associated with autoimmune gastritis is a β subunit of the gastric H+/K+ ATPase (proton pump). PNAS 87:6418-6422, 1990. 9. Callagham JM, Khan MA, Alderuccio F, Van Driel IR, Gleeson PA and B-H Toh. α and β subunits of the gastric H+/K+ ATPase are concordantly targeted by parietal cell autoantibodies associated with autoimmune gastritis. Autoimmun. 16:289-295, 1993. 10. Ma JY, Borch K and S Mardh. Human gastric H,K-adenosine triphosphatase β-subunit is a major autoantigen in atrophic corpus gastritis. Expression of the recombinant human glycoprotein in insect cells. Scand. J. Gastroenterol. 29:790-794, 1994. 11. Claeys D, Galler G, Appelmelk BJ, Negrini R and T Kirchner. The gastric H+/K+-ATPase is a major autoantigen in chronic Helicobacter pylori gastritis with body mucosa atrophy. Gastroenterol. 115:340-347, 1998. 12. DeBlock CRM, DeLeeuw IH, Van Gaal LF and the Belgian Diabetes Registry. High prevalence of manifestations of gastric autoimmunity in parietal cell antibody-positive type 1 (insulin-dependent) diabetic patients. J. Clin. Endocrin. Metab. 84(1):4062-4067, 1999. 13. Mandry, RC, Ortiz LJ, Lugo-Somolinos A and JL Sanchez. Organ-specific autoantibodies in Vitiligo patients and their relatives. Int. J. Dermatol. 35(1): 118-121, 1996. 14. Kumar B, Sharma VK and S Sehgal. Anti-smooth muscle and anti-parietal cell antibodies in Indians with alopecia areata. Int. J. Dermatol. 34(8): 542-545, 1995. 15. Chuang JS, Callagham JM, Gleeson PA and B-H Toh. Diagnostic ELISA for parietal cell autoantibody using tomato lectin-purified gastric H+/K+-ATPase (proton pump). Autoimmun. 12:1-7, 1992. 16. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 17. National Committee for Clinical Laboratory Standards,1991. Internal Quality Control: Principles and Definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6). 7

A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628765HUN May 2007 Revision HUN0 8