QUANTA Lite TM SLA 708775 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

QUANTA Lite TM SLA 708775 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM SLA (szolubilis májantigén) egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA), amely a humán szérumban lévő SLA elleni IgG osztályú antitestek félkvantitatív kimutatására szolgál. Ezeknek az antitesteknek a jelenléte a klinikai eredményekkel és más laboratóriumi tesztekkel együtt felhasználható azon állapotok diagnosztizálására, melyek emelkedett SLA szintekkel járnak, mint például az autoimmun hepatitisz. A teszt összegzése és magyarázata Az autoimmun hepatitisz (AIH) egy krónikus, progresszív, heterogén gyulladásos májbetegség, melynek etiológiája nem ismert. 1-6 Diagnosztizálása gyakran nehéz, mivel az AIH nak nincs külön tesztje, valamint a fellépő tünetek igen változatosak lehetnek. 1-6 Diagnózisához szükség van a klinikai, laboratóriumi és hisztológiai leletek értékelésére, valamint az egyéb krónikus hepatitiszek lehetőségének kizárására. 1-6 A diagnózis különösen nehéz kriptogén hepatitisz besorolású betegek esetén, azaz akiknek nem meghatározott krónikus hepatitiszük van, vírus ellenes antitestek nélkül, valamint, nem megszokott autoimmun-marker profilt mutatnak. 1-2 Az AIH korai diagnózisa és az immunszpresszív kezelés elengedhetetlen a súlyos májkárosodás megelőzése érdekében. Sajnos a diagnosztikai bizonyosság hiánya a diagnózis felállításakor késedelmes kezeléshez és a betegség további progressziójához vezet. 7-8 Az AIH betegek, a jelenlévő specifikus antitestek alapján, rendszerint két csoportra oszthatók. 1-6,9,10 Az 1-es típusú AIH (szokták még klasszikus, aktív krónikus, lupoid, plazma sejt, autoimmun krónikus aktív hepatitiszként is említeni) az AIH leggyakoribb típusa. Az AIH-1-t anti-nukleáris, anti-simaizom ASMA (aktin és nem aktin összetevők ellen is), és perinukleáris anti-neutrofil citoplazmikus antitestek jellemzik. 1,4,6 Az AIH-2-t elsődlegesen a citokróm P4502D6 és az anti-máj citoszol antigén (LC-1) 4,6,11 elleni máj/vese mikroszóma (LKM-1) antitestek jellemzik. Az AIH-1 betegek LKM-1 és LC-1 antitestek tekintetében negatívak. A szolubilis májantigén (SLA) elleni antitesteket 1987-ben azonosították 23 HbsAg negatív, ANA negatív, LKM-1 negatív, krónikus hepatitisz betegben. 12 Néhány AIH betegben egyéb citoszólikus szolubilis májfehérjéket, név szerint máj-pankreász antigént (LP) is találtak. 12 Ma már tudott, hogy az SLA és az LP antitestek ugyanazt a cél-antigént ismerik fel. 13 Az SLA egy kb. 50 kda molekulasúlyú fehérje, ami a szelenocisztein metabolizmusában résztvevő UGA-szuppresszor trns-asszociált proteinnel 99%-os homológiát mutat. 14-15 Habár az anti-sla reaktivitás fő célpontjaiként a cytokeratin 8-at, a cytokeratin 18- at és a glutation S-transzferázt azonosították, további vizsgálatok ezt nem támasztották alá. 14,16-19 Annak ellenére, hogy az AIH betegek csupán 12-30%-ában találhatóak SLA antitestek, az SLA antitestek jelenléte csaknem 100%-an specifikus az AIH-ra. 8,10,14,19-20 Becslések alapján az AIH betegek 70-80%-ának van ANA és/vagy ASMA és néhány százalékuknak anti- LKM-1 antitestjeik. Az AIH klinikai jeleivel bíró betegek mintegy 10-30% nem mutat szignifikáns titereket ezen markerek elleni antitestekre. 1,2,7,12 Jelenleg, ezen betegek esetén csak a gyulladáscsökkentő kezelésre adott terápiás válasz jelzi az AIH meglétét. 1,2 A kriptogenikus hepatitiszban szenvedő betegek 14-20%-ában találhatók SLA antitestek. 13,19,20 Tehát az SLA tesztelése segítséget nyújthat az AIH diagnózisának felállításában, és segít csökkenteni a betegség azon progresszióját, amit a késedelmes kezelés okoz. Az AIH pontos felismerése alapvetően fontos, mivel az AIH, illetve a vírusos hepatitisz kezelése drámaian különböző. AIH elleni immunszupresszió alkalmazása káros lehet vírusos fertőzés esetén, interferonos kezelés pedig az AIH állapot rosszabbodását okozhatja. 21 A harmadik típusú AIH elnevezés, amely eredetileg az SLA antitestek jelenlétére utalt, használatát mérlegelték, ám az valószínűleg felesleges. 4,6,9,19 Az SLA antitestekre pozitív betegek a nem SLA pozitív AIH-1 betegekkel a legtöbb klinikai, hisztológiai, laboratóriumi jegyeiket figyelembe véve azonosnak tűnnek. 9,10,19 Az SLA pozitív betegek azonban HLA DR3 társulást mutatnak és a kortikoszteroid kezelés megvonása után hajlamosak a visszaesésre. 22 Az AIH különböző formáit, amelyekben a betegek az AIH, valamint primer biliaris cirrhosis (PBC) vagy primer szklerotizáló cholangitis (PSC) jellegzetes tüntetit mutatják, gyakran átfedő szindrómáknak nevezik. Ezen szindrómák az autoimmun cholangitis-szel (AIC) együtt, amely kifejezést a PBC-szerű hisztopatológiai jegyekkel, de anti-mitokondriális antitest (AMA) hiánnyal jellemzett kondíciók leírására javaosltak 1-3,5, diagnosztikai és kezelési problémaként jelentkezhetnek. A módszer elve A részben tisztított, teljes méretű rekombináns humán SLA antigént a polisztirol mikrotiter lemez celláihoz kötik olyan körülmények között, amelyek az antigént natív formában megőrzik. Az előzetesen hígított kontroll mintákat és a betegek hígított szérummintáit a különbözõ cellákba adagolják, lehetővé téve bármely jelenlévő SLA autoantitest immobilizált antigénhez kötõdését. A nem kötődött mintát lemossák és mindegyik cellához enzimjelölt anti-humán IgG konjugátumot adnak. Egy második inkubáció lehetővé teszi, hogy az enzimjelölt anti-humán IgG minden olyan, a beteg mintájából származó antitesthez hozzákötődjön, amely korábban a cellához kötődött. Az összes megkötetlen enzimjelölt antihumán IgG lemosása után a megmaradó enzimaktivitást kromogén szubsztrát hozzáadásával, és a kialakuló szín intenzitásának mérésével határozzák meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a betegminták celláiban kialakult szín intenzitását mérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. 1

Reagensek 1. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez, részlegesen tisztított rekombináns humán SLA antigén (12-1 x 8 cella) tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA negatív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, rekombináns humán SLA elleni antitestek nélkül, előhígítva, 1,2 ml. 3. SLA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint rekombináns humán SLA elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml. 4. SLA ELISA erősen pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint rekombináns humán SLA elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml. 5. HRP mintahígító, 1 üveg rózsaszín, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot, Tween 20-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 50 ml. 6. HRP mosókoncentrátum, 1 üveg, 40-szeres koncentrátum - vöröses színű, tartalmaz: Trispufferolt sóoldatot és Tween 20-at, 25 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók. 7. HRP IgG konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kékes színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10 ml. 8. TMB kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10 ml. 9. HRP stop oldat, 0,344 M kénsav, 1 üveg színtelen, 10 ml. Figyelmeztetések 1. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0,02% kloramfenikol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért az SLA ELISA mérsékelten pozitív, az SLA ELISA erősen pozitív és az ELISA negatíve kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 23 3. Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicseppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekhez vezethet. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA cellákból nem megfelelõ pontosságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. A teszt adaptációja automatikus mintakezelő rendszerek, vagy más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja a manuális módszerhez képest. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt teljesítményét több tényezõ befolyásolhatja. Ilyen a reagensek kezdeti hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványok az ELISA lemez celláiból történő eltávolításának alapossága, a kiértékeléshez használt fotométer, illetve az inkubációs idők hossza. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. A protokoll szigorú betartása javasolt. 7. A mikrotiter csöveket és deszikkánst tartalmazó, visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt pontosságának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak ugyanazon csövének bizonyos idõ elteltével két- vagy többszöri használata, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása, az ilyen problémák megelőzése érdekében. 2

9. Az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt a HRP konjugátum kémiailag szennyeződhet. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítőszerek, alkohol vagy detergensek maradványai - bizonyos idő után - a HRP konjugátum lebomlását okozzák. Kémiai tisztítószerek/fertőtlenítőszerek használata után a készülékeket és az eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csövek a deszikkánssal együtt a fóliatasakot biztonságosan lezárva 2-8 C között tárolandók. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig stabil. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérumminták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósítóanyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A minták többszöri lefagyasztásátfelengedését kerülni kell. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 SLA ELISA mikrotiter lemez (SLA ELISA microwell plate), (12-1 x 8 cella) tartókerettel 1 1,2 ml előhígított ELISA negatív kontroll (ELISA Negative Control) 1 1,2 ml előhígított SLA ELISA mérsékelten pozitív kontroll (SLA ELISA Low Positive) 1 1,2 ml előhígított SLA ELISA erősen pozitív kontroll (SLA ELISA High Positive) 1 50 ml HRP mintahígító (HRP Sample Diluent) 1 25 ml HRP mosókoncentrátum (HRP Wash Concentrate), 40-szeres koncentráció 1 10 ml HRP IgG konjugátum (HRP IgG Conjugate), (kecske), anti-humán IgG 1 10 ml TMB kromogén (TMB Chromogen) 1 10 ml HRP stop oldat (HRP Stop Solution) 0,344 M kénsav További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500 µl méréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4 ml térfogattal Desztillált vagy ioncserélt víz 1 l-es edény az HRP mosókoncentrátum hígításához Olyan mikrotiter lemez leolvasó, ami képes OD mérésre, 450 nm-en (illetve 620 nm-en a két hullámhosszon történő méréshez) Módszer Mielőtt hozzákezd 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosókoncentrátumot 1:40 arányban úgy, hogy a HRP mosókoncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. Ha nem egyszerre kerül a teljes lemez felhasználásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó cellánként adjon 2,0 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez. A hígított puffer 2 8 C között tárolva 1 hétig stabil. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást, a következő módon: adjon 5 µl mintát 500 µl HRP mintahígítóhoz. A hígított mintákat az elkészítésüket követő 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA az SLA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, az SLA ELISA erősen pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 4. Az SLA antitestek jelenlétének vagy hiányának tetszõleges egységekben való meghatározásához használjon mindhárom kontroll méréséhez két-két cellát, és minden betegminta méréséhez egy vagy két cellát. A betegmintákból párhuzamos minták (duplikátumok) meghatározását javasoljuk. A teszt kivitelezése 1. A TESZT MEGKEZDÉSE ELŐTT VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBAHŐMÉRSÉKLETET (20-26 C). Helyezze a szükséges számú cellát/csövet a keretbe. A fel nem használt csöveket haladéktalanul tegye vissza a deszikkánst tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a cellák minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 3

2. Pipettázzon 100-100 µl-t az előhígított SLA ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, az SLA ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított betegmintákból a cellákba. Fedje be és 30 percig szobahőmérsékleten inkubálja a lemezeket, egy vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta adagolása után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes cella tartalmát. Adjon 200-300 µl hígított HRP mosó puffert minden egyes cellához, majd ezt is szívassa le. Ismételje meg ezt az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen, finoman ütögetve tökéletesen távolítsa el az utolsó mosás után visszamaradt folyadékot. Nagyon fontos, hogy a cellák minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. Leszíváskor a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet tartsa be. 4. Minden egyes cellához adjon 100 µl HRP IgG konjugátumot. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között, és a helyes laboratóriumi eljárásoknak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a mérés elvégzéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a cellákat 30 percig úgy, mint a második lépésben. 5. Mosás: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Adjon 100 µl TMB kromogént minden egyes cellába és inkubálja sötét helyen, 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100 µl HRP stop oldatot minden egyes cellába. A HRP stop oldat adagolásakor ugyanazt az idõzítést és sorrendet tartsa, amit a TMB kromogén esetében alkalmazott. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, hogy a cellák tartalma alaposan összekeveredjen. 8. Olvassa le minden egyes cella abszorbancia (OD) értékét 450 nm-en, a reakció leállítását követő egy órán belül. Ha bikromatikus mérést kíván végezni, referencia hullámhossznak használja a 620 nm-t. Minőség-ellenőrzés 1. Futassa együtt az SLA ELISA mérsékelten pozitív, a SLA ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontrollt minden egyes betegminta sorozattal annak ellenőrzésére, hogy az összes reagens, és az eljárás végrehajtása is megfelelõen mûködik. 2. Ne feledje, hogy mivel az SLA ELISA mérsékelten pozitív, az SLA ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontroll is elõhígított, ezért egyikük sem kontrollálja a minta hígításával kapcsolatos lépéseket. 3. Kiegészítő kontrollok is használhatók a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelő módon. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérumminták szétosztásával, és -20 C alatt történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit valósnak tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított SLA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell legyen, mint az előhígított SLA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, ami nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított SLA ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1,0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0,2-nél. c. Az SLA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy nagyobbnak kell lennie, mint 0,25. d. Az ELISA negatív kontroll és az SLA ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek alapvetõ hibájának jelzésére szolgál. Az SLA ELISA erősen pozitív kontroll nem garantálja a precizitást a teszt diagnosztikai küszöbértékének közelében. e. A felhasználó az adott minõség-ellenõrzési eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A -ban találhat. 24 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg az egyes párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja az SLA ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Majd az így kapott eredményt megszorozza az SLA ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén feltüntetett egységek számával. Minta OD Minta értéke = x SLA ELISA mérsékelten pozitív (egységek) SLA ELISA mérsékelten pozitív OD (egységek) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának hígítási sorát kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a minta antitest titerértékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. 4

Az eredmények értelmezése Az ELISA teszt a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, valamint képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alább mutatott értékek csak javaslatok. Minden egyes laboratóriumnak meg kell határoznia a saját referencia tartományait, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a saját eljárásaiknak megfelelően. A mintákat negatívként, (negatív SLA elleni IgG antitestre), nem egyértelműként, vagy pozitívként (SLA elleni IgG antitestet detektáltak) értékelik az alábbi táblázat szerint. Negatív Nem egyértelmű Pozitív 0,0 20,0 egység 20,1 24,9 egység 25 egység Az eredmények közlése előtt a nem egyértelmű mintákat újra kell tesztelni. 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában SLA IgG antitestek vannak és felveti az autoimmun hepatitisz fennállásának lehetőségét. 2. Azok a minták, melyekben az SLA IgG antitest koncentráció nem egyértelmű, alkalmatlanok az antitest státusz megállapítására. Ha az eredmény ismételt vizsgálattal is a kétes tartományba esik, az eredményt kétesként jelentjük, és/vagy a vizsgálatot frissen vett mintából megismételjük. 3. A negatív eredmény azt jelzi, hogy nincs jelen SLA elleni IgG antitest, vagy a teszt kimutatási határa alatt van. 4. A mikrotiter lemez leolvasó mérési tartománya feletti OD értéket adó mintákról úgy kell jelenteni, hogy a mérhető legmagasabb OD értéknél nagyobb értéket el kell osztani a mérsékelten pozitív kontroll OD-jának 25-szörösével, vagy egy számítható érték érdekében a mintát hígítani kell, majd újra mérni. A teszt a 9 és 125 egység közötti tartományban megközelítőleg lineáris. 5. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredményeket az INOVA QUANTA Lite TM SLA ELISA használatával kaptuk. Más gyártók tesztjével kapott SLA értékek ettől eltérőek lehetnek, ezek fel nem cserélhetőek. A közölt IgG érték mennyisége nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Egy negatív SLA eredmény nem zárja ki az autoimmun hepatitisz lehetőségét. 2. Egy negatív SLA antitest eredmény nem zárja ki az SLA antitestek jelenlétének lehetőségét, mivel lehetséges, hogy az antitest koncentrációja a teszt kimutatási küszöbértéke alatt van. 3. A pozitív eredmény mindössze a humán rekombináns SLA elleni antitest jelenlétét jelzi és nem feltétlenül jelent 2-es típusú autoimmun hepatitiszt. 4. Az autoimmun hepatitisz diagnózisához a beteg demográfiai jellemzőinek, klinikai tüneteinek és más diagnosztika vizsgálatainak összegzése szükséges. 5. Az irodalom azt sugallja, hogy az anti-sla antitestek nem jellemzőek az AIH-2-re. 10 Habár az alább található Specifikus működési jellemzők fejezetben bemutatott három AIH-2 minta negatív volt, ez a mintaszám nem elég nagy ahhoz, hogy jelen tanulmány validálhassa az AIH-2 minták SLA antitest-hiányát. 6. Ezen teszt eredményeit a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 7. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő mátrixok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek Az AIH átlagos éves gyakorisága a nyugat-európai és az észak-amerikai (kaukázusi/europid) populációban, a becslések szerint 1,9 eset 100 000 lakosonként, Japánban pedig 0,08-0,015 eset 100 000 lakosonként. 25,27 Az előfordulást a norvégiai populáció 16,9/100 000-es aránya alapján becsülték. 26 A betegség jellemzően nők esetében fordul elő, a nő-férfi arány 4:1-hez. Kiugró előfordulás tapasztalható 15 és 30 év között, bár valamennyi korcsoportban megtalálható. 1-5 Referencia tartomány SLA antitest kimutatás céljából QUANTA Lite TM SLA ELISA teszten vizsgáltak egy 131 tünetmentes, egészséges személyekből összeállított panelt. A panel 91 férfiből és 40 nőből állt. A nő és férfi átlagéletkorok tekintetében nem volt különbség. Az életkor tartomány 5 és 69 év között volt (a medián 33 volt). A teszt specificitása a vizsgált panel esetében 100% (131/131) volt. Ezen populáció átlag értéke 2,0 egység, a legmagasabb érték pedig 5,8 egység volt. Specifikus működési jellemzők AIH és májbetegek AIH-ban és más májbetegséggel rendelkező betegek mintáit vizsgálták, QUANTA Lite TM SLA ELISA tesztet használva, házon belül és külső vizsgálóhelyeken. A betegek életkora 13 és 82 év között volt, a férfi-nő arány megközelítőleg 3,5 volt. A különböző panelek eredményeinek összefoglalását a következő táblázat tartalmazza. 5

Klinikai csoport n= SLA+ % SLA+ AIH-1 289 34 11,8 AIH-1/PBC (primer biliaris cirrhosis ) átfedés 20 11 55 AIH-2 3 0 0 Kriptogén hepatitisz 9 4 44,4 Autoimmun cholangitis 8 1 12,5 AIH-1/PSC 4 1 25 Gyógyszer indukált AIH 2 0 0 Primer biliaris cirrhosis 15 0 0 Primer szklerotizáló cholangitis (PSC) 7 0 0 PBC/PSC 19 0 0 Egyéb nem-vírusos májbetegség 10 0 0 Hepatitisz B vírus (B,C vagy D) 8 0 0 Hepatitisz C vírus 37 0 0 Hepatitisz C/D 1 0 0 AIH-1 kizárólagos szenzitivás: 34/289 = 11,8% AIH és AIH variánsok szenzitivitása (átfedések): 51/330 = 15,4% Specifitás (nem AIH májbetegség): 73/73 = 100% Specificitás (normál egészséges, nem AIH májbeteg): 204/204 = 100% Kereszt-reaktivitási vizsgálat A kereszt-reaktivitás tekintetében 70, különböző autoimmun vagy fertőző betegségben szenvedő beteg mintáját vizsgálták QUANTA Lite TM SLA ELISA teszttel. A tesztelt szérumok csoportjai, illetve azok mintaszámai a következők voltak: Humán herpeszvírus 6 (10), Rickettsia (6), Cytomegalovírus (10), glomerularis bazalmembrán (3), antinukleáris antitest (3), szisztémás lupus erythematosus (3), mitochondria (3), Gyomor parietális sejt (3), LKM-1 (3), cytokeratin 8 vagy 18 (26). SLA antitestek szempontjából egyik minta sem volt pozitív. Pontosság és reprodukálhatóság A QUANTA Lite TM SLA ELISA intra-assay teljesítményét 6 minta, egyenként 7-szeri ismételt tesztelésével értékelték ki. A kapott eredmények az alábbi táblázatban láthatók. A QUANTA Lite TM SLA ELISA intra-assay teljesítménye minta A minta B minta C minta D minta E minta F középérték 72,6 46,2 27,6 13,5 9,7 2,0 SD 1,4 1,9 1,4 0,4 0,2 0,1 CV% 1,9 4,1 5,2 2,8 2,2 7,2 Az inter-assay eltérés vizsgálata során egy 5 mintát tartalmazó egység, két párhuzamos mérésben naponta két alkalommal, 3 napon keresztül volt tesztelve. Az eredmények összefoglalása az alábbi táblázatban látható. A QUANTA Lite TM SLA ELISA inter-assay teljesítménye minta A minta B minta C minta D minta E középérték 78,5 48,5 29,0 13,6 9,5 SD 1,8 1,1 0,9 0,5 0,4 CV% 1,9 4,1 5,2 2,8 2,2 Hivatkozások 1. Krawitt EL. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1996;334(14):897-903. 2. Krawitt EL. Can you recognize autoimmune hepatitis? Postgrad Med. 1998;104(2):145-149, 152. 3. Alvarez F, Berg PA, Bianchi FB, et al. International Autoimmune Hepatitis Group Report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(5):929-938. 4. Obermayer-Straub P, Strassburg CP, Manns MP. Autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;32(1 Suppl):181-197. 5. Manns MP, Strassburg CP. Autoimmune hepatitis: clinical challenges. Gastroenterology. 2001;120(6):1502-1517. 6. Czaja AJ, Homburger HA. Autoantibodies in liver disease. Gastroenterology. 2001;120(1):239-249. 7. Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1995 Oct 12;333(15):1004-1005. 8. Kanzler S, Weidemann C, Gerken G, Lohr HF, Galle PR, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Clinical significance of autoantibodies to soluble liver antigen in autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(4):635-640. 9. McFarlane IG. The relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut. 1998;42:599-602. 10. Ballot E, Homberg JC, Johanet C. Antibodies to soluble liver antigen: an additional marker in type 1 auto-immune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2):208-215. 6

11. Lapierre P, Hajoui O, Homberg JC, Alvarez F. Formiminotransferase cyclodeaminase is an organ-specific autoantigen recognized by sera of patients with autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1999 Mar;116(3):643-649. 12. Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, Staritz M, Meyer zum Buschenfelde KH. Characterization of a new subgroup of autoimmune chronic active hepatitis by autoantibodies against a soluble liver antigen. Lancet. 1987;1:292-294. 13. Stechemesser E, Klein R, Berg PA. Characterization and clinical relevance of liver-pancreas antibodies in autoimmune hepatitis. Hepatology. 1993;18(1):1-9. 14. Wies I, Brunner S, Henninger J, Herkel J, Kanzler S, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Identification of target antigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis. Lancet. 2000 29;355(9214):1510-1515. 15. Costa M, Rodriguez-Sanchez JL, Czaja AJ, Gelpi C. Isolation and characterization of cdna encoding the antigenic protein of the human trnp(ser)sec complex recognized by autoantibodies from patients with type-1 autoimmune hepatitis. Clin Exp Immunol. 2000;121(2):364-374. 16. Wachter B, Kyriatsoulis A, Lohse AW, Gerken G, Meyer zum Buschenfelde KH, Manns MP. Characterization of liver cytokeratin as a major target antigen of anti-sla antibodies. J Hepatol. 1990;11(2):232-239. 17. Wesierska-Gadek J, Grimm R, Hitchman E, Penner E. Members of the glutathione S-transferase gene family are antigens in autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998 Feb;114(2):329-335. 18. Klein R, Berg PA. Glutathione S-transferase as a major autoantigen in anti-sla-positive autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998;116(4):1015-1016. 19. Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen: specific marker of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2):326-328. 20. Czaja AJ, Carpenter HA, Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen, P450IID6, and mitochondrial complexes in chronic hepatitis. Gastroenterology. 1993;105(5):1522-1528. 21. Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H, Manns MP. Epitope mapping of cytochrome P4502D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alpha-interferon treatment. J. Hepatol. 1999;30(3):366-375. 22. Czaja AJ, Donaldson PT, Lohse AW. Antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas and HLA risk factors for type 1 autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol. 2002;97:413-419. 23. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 24. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1991. Internal quality control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol.11(6). 25. Nishioka M, Morshed SA, Parveen S, Kono K, Matsuoka H, Manns MP. Antibodies to P450IID6, SLA, PDH-E2 and BCKD-E2 in Japanese patients with chronic hepatitis. J Gastroenterol Hepatol. 1997;12(12):862-868. 26. Boberg KM, Aadland E, Jahnsen J, Raknerud N, Stiris M, Bell H. Incidence and prevalence of primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, and autoimmune hepatitis in a Norwegian population. Scand J Gastroenterol. 1998;33(1):99-103. 27. Jacobson DL, Gange SJ, Rose NR, Graham NM. Epidemiology and estimated population burden of selected autoimmune diseases in the United States. Clin Immunol Immunopathol. 1997; 84(3):223-243. 7

A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628775HUN January 2009 Revision 0 8