LÉZERES SZÓRÁSI INTERFERENCIA KONTRASZTELEMZÉSEN ALAPULÓ VÉRÁRAMLÁSMÉRŐ RENDSZER ÉPÍTÉSE

Pályamunka LÉZERES SZÓRÁSI INTERFERENCIA KONTRASZTELEMZÉSEN ALAPULÓ VÉRÁRAMLÁSMÉRŐ RENDSZER ÉPÍTÉSE Zölei Dániel (PhD hallgató) Szegedi Tudományegyetem Optikai és Kvantumelektronikai Tanszék SZEGED 2011

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék... 1 1. Bevezető... 2 2. Elméleti áttekintés... 3 3. Célkitűzés... 12 4. Kísérleti elrendezés... 13 4.1. Megvilágítás... 13 4.2. Kamera és állvány... 14 4.3. Képrögzítés... 15 4.4. Képelemzés... 16 5. Kísérleti eredmények... 17 5.1. Modellezés szintetikus mintával... 17 5.1.1. Mérések nyugvó szuszpenzión... 17 5.1.2. Mérések áramló szuszpenzión... 21 5.2. Bőrszövet vérellátásának vizsgálata... 24 5.2.1. Kísérleti elrendezés és mérések... 24 5.2.2. Eredmények... 26 5.3. Malac agyfelszínének vizsgálata... 31 5.3.1. Kísérleti elrendezés és mérések... 31 5.3.2. Eredmények... 32 6. Összefoglaló... 35 Köszönetnyilvánítás... 36 Irodalomjegyzék... 37 Melléklet... 40 1

1. Bevezető Ha egy koherens fénnyel megvilágított felületre tekintünk, akkor egy szemcsés szerkezetű interferenciaképet látunk. Ez a jelenség a szórási interferencia, melyet napjainkban számos területen alkalmaznak: találkozhatunk vele ipari és orvosi berendezésekben, mérőműszerekben, de olyan hétköznapi eszközökben is felhasználják, mint amilyen a lézeres optikai egér. Az orvostudományban a jelenség egyik alkalmazási területe a szórási interferencia kontrasztelemzésen alapuló véráramlásmérés, melynek során a vizsgált szövetet lézerfénnyel világítják meg. Mivel ekkor a fény főként a vörösvértestekről szóródik, a területet figyelő kamera fényérzékeny chipjén keletkező interferenciakép azok mozgása miatt időben változik. Ez a fluktuáció az adott expozíciós idővel készült felvételeken az interferenciakép elmosódását (a kontraszt csökkenését) okozza, melyből következtetni lehet a véráramlás sebességére. Eleinte a képkiértékelési eljárások inkább csak kvalitatívan jellemezték a véráramlásban, perfúzióban bekövetkező esetleges változásokat. Bőrszövet esetén ez különösen igaz volt, mivel a mozdulatlan szövetrészek okozta statikus szóródás jelentősen torzította a mérési eredményeket. Habár a témában Fercher és Briers 1981-es úttörő munkáját követően számos publikáció született, több mint húsz évnek kellett eltelnie ahhoz, hogy mérési pontosság növelését célzó kutatások elkezdődjenek. Mára a mérési eredmények reprodukálhatósága jelentősen javult, mégis megoldatlan maradt a statikus szóródás torzító hatásának kiküszöbölése. Emiatt a jelenleg alkalmazott, egyetlen expozíciós időt felhasználó módszerek nem teszik lehetővé a különböző személyeken, vagy egy személyen, de különböző körülmények között elvégzett mérések eredményeinek összehasonlítását. Dolgozatom témája egy olyan szórási interferencia kontrasztelemzésen alapuló mérőrendszer fejlesztése, mely több nagyságrendet átfogó expozíciós idő tartományon készült felvételek kiértékelésével lehetővé teszi a mérési pontosság jelentős növelését. Mivel egy ilyen mérőrendszer akár valós idejű mérésekre is képes, ígéretes alternatívája lehet a meglehetősen költséges és lassú pásztázó Doppleres véráramlásmérő eszközöknek. 2

2. Elméleti áttekintés Ha egy optikailag egyenetlen felültre koherens fény esik, az arról visszaszóródó fényt egy ernyővel vagy kamerával felfogva jellegzetes, szemcsés képet kapunk. Ezt a jelenséget szórási interferenciának nevezzük, a szakirodalomban az angol speckle néven találhatjuk meg. A jelenség nemcsak fény, hanem ultrahang vagy rádióhullámok használata esetén is tapasztalható. Mivel a szemcsék elrendeződése teljesen véletlenszerű, a legtöbb alkalmazás szempontjából károsnak tekinthető, hiszen rontja a jelminőséget, zajt visz a különböző rendszerekbe, így a 70-es évekig főként a kiküszöbölésére koncentráltak. Csak ezután jelentek meg olyan alkalmazások, amelyek éppen magát a szórási interferenciát használták fel [1]. Manapság számtalan területen alkalmazzák a jelenséget, többek közt sebesség- [2-4] és távolságmérésre [4, 5], felületelemzésre [6, 7], véletlenszám-generálásra [8, 9] stb. Ma már bármelyik szaküzletben vásárolhatunk lézeres optikai egeret, amely (a LED- es megvilágítást alkalmazó típusoktól eltérően) nem közvetlenül a felület elmozdulását figyeli, hanem a lézerfény által létrehozott szórási interferenciakép változásaira reagál. Az 1. ábrán egy latex mikrogömb szuszpenzióról 2 ms-os expozíciós idővel készült szórási interferenciakép látható. 1. ábra. Latex mikrogömb szuszpenzióról 2 ms-os expozíciós idővel készült szórási interferenciakép Tekintsünk egy lézerfénnyel megvilágított érdes felületet, és egy tőle bizonyos távolságra elhelyezett ernyőt. A megvilágított felület minden pontja abszorbeálja, majd reemittálja a hozzá érkező fotont, melynek iránya és polarizációja ezáltal megváltozhat. 3

Így az ernyő minden egyes pontjába a teljes megvilágított felületről érkeznek fotonok, amelyek egymással interferálva létrehozzák a szemcsés mintázatot (2.a ábra). A szemcsék mérete fordítottan arányos a megvilágított felület átmérőjével, és egyenesen arányos az ernyő és a felület távolságával, valamint függ a megvilágító fény hullámhosszától. A jelenség neve objektív speckle, mivel a fent felsoroltakon kívül más tényezők nem befolyásolják a kialakuló mintázatot. Abban az esetben, amikor a kép nem ernyőn, hanem egy optikai leképező rendszer filmjén, fotólemezén vagy chipjén keletkezik, az objektív speckle-höz hasonló mintázat jön létre, azonban a szemcsék méretét a fényelhajlás miatt az optikai elemek is befolyásolják (2.b ábra), innen ered a szubjektív speckle elnevezése. 2. ábra. Az objektív speckle esetén az ernyő minden pontjának intenzitását a teljes megvilágított felületről szóródó fotonok szuperpozíciója adja (a), a szubjektív speckle esetén a tárgysíkról szóródó fotonok leképeződnek a képsíkra (b) Az Airy-koronggal közelített szemcsék átlagos D mérete: 2,4l D, (1) a ahol l a detektor és a leképező lencse közötti távolság, a megvilágító fény hullámhossza, a pedig a lencse (vagy blende) átmérője. A jelenség akkor is fellép, ha egy megfigyelő szabad szemmel egy lézerfénnyel megvilágított szórófelületre néz. Ha a megfigyelő egy 4

változtatható átmérőjű résen keresztül tekint a mintára, annak beállításától függően más és más méretűek lesznek az általa látott foltok. A jelenséget a szórási interferencia képalkotásban (Laser Speckle Imaging, LSI) alkalmazzák. Ha a megvilágított felület mozog, a keletkező szórási interferenciakép időben változik. Hasonló tapasztalható akkor is, ha a megvilágított területen különálló pontok mozognak. Kis sebesség esetén a kép lassan változik, nagy sebesség esetén azonban rövid idő alatt egészen átalakul. Kamerával történő megfigyelés során ennek megfelelően kellően rövid expozíciós idő alkalmazása esetén az elmozdulás elhanyagolható és a kép állandónak tekinthető, míg hosszabb expozíciós idő esetén az időben változó interferenciakép miatt a rögzített kép elmosódottá válik és a kontrasztja lecsökken. Végtelen hosszú expozíciós idő esetén pedig a kép minden pontja azonos intenzitású lenne (ideális megvilágítást, elrendezést, optikai elemeket és szórási tulajdonságokat feltételezve). A lézeres szórási interferencia kontrasztelemzésen (Laser Speckle Contrast Analysis, LASCA) alapuló véráramlásmérés (perfúziómérés) nagy népszerűségnek örvend Fercher és Briers 1981-es tanulmányának megjelenése óta [10], melyet egyszerű alkalmazhatóságának, viszonylag kis költségének és hatékonyságának köszönhet. Biológiai szövetek esetén jellemzően vörös vagy közeli infravörös lézerfényt alkalmaznak, mivel ennek szórásáért leginkább a szövetben található vörösvértestek felelősek, emellett az ennél rövidebb hullámhosszú fénysugarak már nagyon kis mélységben teljesen elnyelődnek. A LASCA során a rögzített kép különböző területein kiszámítják a lokális kontrasztot, és ez alapján egy kontraszttérképet alkotnak. A kontraszt meghatározására a következő összefüggést alkalmazzák: σ K =, (2) I ahol I a vizsgált területen lévő pixelek átlagintenzitása, pedig a pixelek intenzitásának a szórása (standard deviation). A nagyszámú részecske által létrehozott interferenciakép véletlenszerűsége és a kontrasztszámítás statisztikus jellege miatt a rendszer zajjal terhelt. Ennek következtében a kontraszt meghatározása annál pontosabb, minél nagyobb a figyelembe vett speckle foltok száma. Kellően sok folt megfigyeléséhez nagyszámú pixel 5

értékét kell számításba venni, ami azonban a módszer laterális feloldóképességét csökkenti. A képeken elérhető kontrasztot a speckle foltok és a fényérzékeny chip pixeleinek mérete is befolyásolja. Nyilvánvaló, hogy ha egy pixelre (detektorszegmensre) egyszerre több interferencia maximum (és minimum) esik, akkor az interferenciakép valódi kontrasztját nem lehet meghatározni. Ha azonban egy folt mérete jóval nagyobb egy pixelnél, sok pixel intenzitását kell figyelembe venni a lokális kontraszt meghatározásához, ami rontja a térbeli feloldóképességet. Kirkpatrick és munkatársai kimutatták, hogy a legjobb eredmény eléréséhez a speckle foltok méretének meg kell haladnia a pixelméret kétszeresét [11]. Mivel ekkor legalább 7 7 pixelnyi területen kell meghatározni a lokális kontrasztot, a gyakorlatban kompromisszumos megoldásként az interferenciafoltok méretét akkorának választják, hogy az összemérhető legyen egy pixellel, a kontrasztelemzést pedig 5 5 pixeles területeken végzik [12]. Ennek beállítását részletesebben ismertetem a kísérleti elrendezést leíró résznél. A statisztikai zaj tovább csökkenthető több kontraszttérkép átlagolásával, azonban a módszer csak abban az esetben alkalmazható, ha a vizsgált minta nem mozdulhat el a mérés során [13] (3. ábra). 3. ábra. Malac agykérgéről készült egyetlen kontraszttérkép (a) és húsz kontraszttérkép átlaga (b) 6

A mérőrendszer beállítása során nagy figyelmet kell fordítani arra is, hogy a minta a leképező rendszer tárgysíkjában legyen, mivel ellenkező esetben a kamera egy adott pixelére nagyobb területről is érkeznek fotonok (4. ábra). 4. ábra. Helyesen (a) és helytelenül (b) beállított fókusztávolsággal készült képek alapján számított kontraszttérképek Ahhoz, hogy a számított kontraszt alapján meg lehessen határozni az áramlási sebességet, egy jól meghatározott összefüggésre van szükség a két mennyiség között. Úttörő munkájában Fercher és Briers a következő formulát vezette le [10]: K (T)= T 2 1 T 0 2 C (t)dt, (3) ahol T az expozíciós idő és Lorentz-féle sebességeloszlást feltételezve C( t) e ( t / ), ahol a szórási interferenciakép intenzitásváltozásához rendelhető autokorrelációs idő (a továbbiakban korrelációs idő néven hivatkozom rá) melynek értéke fordítottan arányos a megvilágított térfogatban mozgó szemcsék átlagos sebességével. Az arányossági tényező függ a megvilágító lézer hullámhosszától és a szóró részecskék jellemzőitől is (méret, alak, koncentráció, közeghez viszonyított törésmutató), meghatározása kísérleti úton kalibrációval vagy numerikus szimulációval történhet. A gyakorlati felhasználások során általában kerülik ezek alkalmazását, csak az inverz korrelációs idővel és ennek változásaival számolnak. Az integrálást elvégezve a következő formulához jutunk: 7

1/ 2 τ 2T K(T) = 1 exp 2. (4) T τ Később Bandyopadhyay és munkatársai kimutatták, hogy statisztikai megfontolásokból háromszöges átlagolással ki kell egészíteni a (3) formulát, bevezetve egy (1- /T) szorzótényezőt a (3) egyenletben szereplő integrálba [14]. Így: 2 τ 2T 2T K(T) = exp 1+. (5) 2 2 T τ τ 1/ 2 Ez egy szigorúan monoton csökkenő függvény, ami lehetővé teszi a korrelációs idő meghatározását: T 0 esetén K 1, míg T esetén K 0 adódik (5. ábra). 1,0 0,8 Kontraszt 0,6 0,4 0,2 0,0 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 T/ 5. ábra. A kontraszt függése az expozíciós idő és a korrelációs idő hányadosától az (5) formula alapján Valós méréseknél azonban a megvilágítás tökéletlensége, a detektor véges mérete, a többszörös szóródás és számos további nem ideális körülmény miatt a kontraszt nem éri el az 1 értéket, ezért Duncan és munkatársai bevezették a korrekciós faktort, melynek 2 értéke K valós (0) [15]. Így az (5) összefüggés a következőképpen módosul: 8

2 τ 2T 2T K(T) = exp 1 2 2 +. (6) T τ τ 1/ 2 numerikus modellezéssel történő meghatározása rendkívül nehéz feladat, ezért a valós méréseknél egy megfelelő mozdulatlan felület (pl. papír, Teflon tömb) kontrasztelemzésével szokták megállapítani a rendszerre jellemző értékét. A LASCA eljárást széles körben használják a perfúzió mérésére az agykéreg [16, 17] és a szemfenék [18-20] esetén. (Mivel a szövetekben a kapillárisok szintjén már nincs kitüntetett áramlási irány, az áramlás helyett perfúzióról beszélhetünk.) Jellemzően egyetlen expozíciós időt alkalmaznak a mérések során, és a korrekciós faktort minden mérés előtt meghatározzák. Mivel a megfigyelt szövet szórási tulajdonságai, valamint a méréshez használt eszköz paraméterei befolyásolják a szövetre jellemző aktuális (és ezáltal a mérés során kapott 1/ ) értékét, ezért az egyes esetekben kapott eredmények nem vethetők össze egymással, helyettük a véráramlásban bekövetkező relatív változásokat az 1/τ relatív változásainak feleltetik meg. A (6) összefüggésnek van még egy jelentős, különösen a bőrszövetek vizsgálata esetén jelentkező hiányossága: míg az összefüggés végtelen hosszú expozíciós idő esetére nullára csökkenő kontrasztot jósol, a gyakorlatban ez korlátozottan vagy egyáltalán nem teljesül. A mozdulatlan részekről történő fényszóródás egy állandó szórási interferencia mintázatot hozhat létre, melyhez hozzáadódik az időben változó komponens. Ez végtelen nagy expozíciós idő esetén is 0-nál lényegesen nagyobb kontrasztot eredményez, így a fent leírt módszer segítségével meghatározott relatív 1/ értékek csak egy mérési sorozaton belüli kvalitatív összehasonlításra alkalmasak. A vörösvértestek áramlási sebességének meghatározására egy másik elterjedten alkalmazott módszer a lézeres Doppler módszer. Ennek során lézerfénnyel megvilágítják a vizsgált területet, majd a visszaszóródó fény hullámhosszát az eredetivel összevetve kiszámítható annak Doppler-eltolódása és így a vörös vértestek átlagos pillanatnyi sebessége. Mivel ezzel a módszerrel eredetileg csak nagyjából 1 mm 3 -nyi térfogat figyelhető, felmerült az igény nagyobb területek mérésére is. Így született meg a pásztázó Doppler-módszer, amelynél a lézernyalábot egy pásztázó tükörrendszer segítségével irányítják a vizsgált terület különböző pontjaira [21-23]. Bár a módszer egyelőre jóval nagyobb pontosságú méréseket tesz lehetővé, mint a LASCA, óriási hátránya, hogy egy megfelelő felbontású (> 100 100 pont) kép elkészítése akár több percig is eltarthat (pl. egy 9

232 174 mérési pontból álló terület vizsgálata a pásztázó Doppler-módszerrel 3,7 percig tartott [23]) és ez idő alatt az élő szövet vérellátása jelentősen megváltozhat. Mivel a pásztázási sebesség növelésére a mérési pontosság drasztikus csökkenése nélkül nincs lehetőség, az akár valós idejű megfigyeléseket jóval nagyobb térbeli felbontás mellett lehetővé tevő LASCA ígéretes alternatíva lehet. A 6. ábrán egy pásztázó Doppler rendszerrel készített felvétel látható az alany kezéről kezdeti állapotban (bal oldalt) és egy horzsolás ejtése után (jobb oldalt). A 7. ábrán hasonló körülmények között, ugyanazon alany másik kezéről egy LASCA rendszerrel készült felvételek láthatóak, amelyeken a (6) összefüggés alapján határozták meg a szövet pillanatnyi vérellátását. 6. ábra. Pásztázó Doppler rendszerrel készített kép a kézről sérülés előtt és után [23] 7. ábra. LASCA módszerrel készített kép a kézről sérülés előtt és után [23] 10

A 6. és 7. ábra köztött jól látható különbség legfőbb oka a bőrfelszín jelentős statikus szórása, amely a Doppler-rendszerrel mért értékeket nem befolyásolja, de jelentősen torzítja az egyetlen expozíciós időt alkalmazó LASCA rendszerrel kapott eredményt [23]. Meg kell említeni, hogy már léteznek olyan kísérleti stádiumban levő lézeres Dopplerrendszerek, amelyek valós idejű megfigyelést is lehetővé tesznek. Ezekben egy 10 khz feletti mintavételi sebességű kamerát használnak, és az egyes pixelek intenzitásváltozásaiból Fourier-transzformációval határozzák meg a vörösvértestek pillanatnyi sebességét [24, 25]. Bár ezen innovatív rendszerek nagy pontossággal, valós időben képesek meghatározni a vér áramlási sebességét, az alkalmazott kamerák költségei lehetetlenné teszik a módszer széleskörű elterjedését. 11

3. Célkitűzés A LASCA eljárással viszonylag egyszerűen meg lehet határozni a véráramlást agykéreg vagy szemfenék vizsgálata során. Azonban még nem dolgoztak ki olyan módszert, amelynek segítségével egymással számszerűen összehasonlítható, eszközfüggetlen eredményeket kaphatunk akkor is, ha a vizsgált szövetek jelentős statikus szórással rendelkeznek.. Kutatásom célja a LASCA alkalmazhatóságának kiterjesztése és egy olyan eszköz alapjainak a lefektetése, ami a mindennapi gyakorlatban is könnyenn használható. Célom, hogy ezzel az eszközzel lehetővé váljon a különféle összeállításokkal készült eredmények kvantitatív összehasonlítása. Ehhez első lépésként egy, a szövetek felépítését utánzó modellt kívánok elkészíteni, mellyel vizsgálható a mozdulatlan szórócentrumok hatása a kialakuló interferenciakép kontrasztjára. Ennek eredményei alapján egy olyan módosított kontraszt-expozíciós idő összefüggést kívánok felírni, mely egy megfelelő mintavételezési eljárással együtt alkalmas lehet a statikus szórás hatásainak figyelembevételére a valódi korrelációs idő meghatározása érdekében. Kísérleteim második szakaszában az általam kidolgozott módszert valós mérési körülmények között kívánom tesztelni, melyhez bőrszöveti és agykérgi perfúzió méréseket kívánok elvégezni. 12

4. Kísérleti elrendezés A kísérletekhez használt elrendezés saját építésű, jelenlegi formáját fokozatos fejlesztés és tökéletesítés során nyerte el. A rendszer vázlata a 8. ábrán látható. Az elrendezés három fő részre osztható: a megvilágító-, a leképező rendszer, valamint a vezérlést, képrögzítést és adatfeldolgozást végző számítógép. 8. ábra. A mérések során használt mérési elrendezés 4.1. Megvilágítás A vizsgált terület megvilágítását egy 130 mw teljesítményű, 660 nm hullámhosszú, vagy egy 200 mw teljesítményű, 808 nm hullámhosszú, polarizált fényű, egymódusú lézerdióda biztosította. A lézerdióda meghajtását egy Thorlabs LDC220C típusú stabilizált áramforrás látta el, kezdetben csak passzív hűtés alkalmazása mellett. Hamar nyilvánvalóvá vált, hogy csekély mértékű hőmérsékletváltozás is nem kívánt módusugrásokhoz vezet (az interferenciakép, valamint a kontraszt jelentős változását eredményezve,) lehetetlenné téve több órán keresztül tartó folyamatos mérések elvégzését, ezért a lézerdiódát egy Thorlabs LDM21 típusú Peltier-elemmel ellátott aktív hőmérsékletszabályozású foglalatba helyeztem, melynek vezérléséről egy Thorlabs TED200C típusú tápegység gondoskodott. Sajnos a megvilágítás intenzitását a módusugrások miatt nem lehetett a meghajtó áram erősségével szabályozni, a blende 13

átmérőjének átállítása pedig az interferencia foltok méretének változásához vezetne. Ezért a megvilágító fény intenzitását egy folytonosan változtatható neutrális szűrővel állítottam be a megfelelő értékre, melynek forgatásához egy léptetőmotort és egy hozzá tartozó házi készítésű vezérlőt alkalmaztam. 4.2. Kamera és állvány A mérésekhez használt elrendezés képe a 9. ábrán látható. 9. ábra. A kísérletek során használt mérési elrendezés. Balra a lézerdióda meghajtását és hőmérsékletszabályozását végző tápegységek, valamint a szűrőt forgató léptetőmotor vezérlője, középen a kamera, a lézerdióda foglalata és a neutrális szűrő a tartóállványra erősítve, jobbra pedig a mérést vezérlő számítógép látható A képek rögzítéséhez egy Pixelink PL-B771F típusú kamerát (1280 1024 pixel, monokróm, Firewire) használtam. Mivel visszaverődés során a fény polarizációs síkja nem változik meg, míg többszörös szóródás során jelentős mértékben elfordul, a kamera elé egy polarizátort helyeztem, melyet a lézerdiódából kilépő fény polarizációs síkjára merőlegesen állítottam be, így a fényérzékeny chipet a felszínről visszaverődő fény nem érhette el. A lézerdiódához képest keresztirányú polarizátor emellett csak egyetlen 14

polarizációs síkban engedi át a fényt, ami jótékonyan befolyásolja a kontrasztot, mivel ha minden polarizációs irányú fény bejuthatna a kamerába, az a kontraszt csökkenéséhez vezetne. A háttérvilágítás különösen 20 ms-nál hosszabb expozíciós idő esetén lerontotta a kontrasztot. Ezt nagyrészt sikerült kiküszöbölni azzal, hogy a környezeti megvilágítás csökkentése mellett a kamera objektívjére egy 600 nm feletti hullámhosszakon áteresztő szűrőt is felszereltem. Az objektív apertúrájának, és ezáltal az interferenciafoltok méretének beállításához a következő módszert alkalmaztam: a tárgysíkban egy fehér papírt helyeztem a kamera elé és a blende különböző átmérőinél megállapítottam a látótéren az 5 5-ös területeken számított lokális kontrasztok átlagát. Végül azt a blendeértéket választottam, amelyiknél a legnagyobb volt a kontraszt átlagos értéke. A rendszer rendkívül érzékeny a rezgésekre, ezért a kamerát és a megvilágító egységet egy megfelelően merev állványra rögzítettem, melyet egy rezgésmentes asztalon helyeztem el (9. ábra). 4.3. Képrögzítés A képek rögzítését egy LabVIEW környezetben fejlesztett alkalmazás végzi. A programozási feladatokat eleinte csak témavezetőm végezte, majd ezeket fokozatosan átvettem. Ahogy a program az idő előrehaladtával egyre újabb és újabb funkciókkal bővült, a szerkezetét többször át kellett strukturálni, és a felhasználói felületet is újra kellett tervezni. A program jelenleg egy főmodulból és egy kontrasztelemző modulból áll, felhasználói felülete a Melléklet M1. ábráján látható. A főmodul feladata a mérés vezérlése, így felhasználói felületén a mérés paramétereinek beállítását szolgáló elemek találhatóak. A kontrasztelemző modul a főmodul által rögzített képeken kontrasztelemzést végez és a kép fényességére illetve kontrasztjára vonatkozó statisztikákat készít. Bár ezen adatok nem elegendőek valós idejű megfigyelésekhez, a kezelő számára hasznos információkat hordoznak a rendszer beállításaival kapcsolatban. A szoftver két felvételi üzemmódot tesz lehetővé: a) egymás után több képsorozat felvétele különböző expozíciós időkkel, a neutrális szűrőt automatikusan mindig a megfelelő pozícióba állítva. b) egy képsorozat rögzítése egy tetszőlegesen beállított expozíciós idővel másodpercenként maximum 8 képet elmentve. Mivel az egyes képek rögzítése között 15

mindig ugyanannyi idő telik el, alkalmas a (több másodperc alatt végbemenő) folyamatok vizsgálatára, megfelelő szoftveres háttér esetén valós idejű megfigyelésekre is. A képek tárolására egy saját fájlformátumot definiáltam, amely tartalmazza a képadatokat és a kamera beállításait is (expozíciós idő, felbontás, gamma érték, erősítési tényező, színmélység és trigger típusa). A kontraszttérképek tárolására szintén saját fájlformátumot alkalmaztam, mely az előbb felsorolt paraméterek és a lebegőpontos kontrasztadatok mellett tartalmazta a kontrasztszámításhoz alkalmazott beállításokat (lépésköz, pixelszám) is. 4.4. Képelemzés A képelemző programot szintén témavezetőm kezdte fejleszteni, majd ezt a feladatot is fokozatosan átvettem tőle. A kutatásaim előrehaladtával ez is rengeteg fejlesztésen esett át, újabb és újabb funkciókkal bővült. Felhasználói felülete a Melléklet M2. ábráján látható. A program lehetővé teszi több száz, különböző expozíciós idővel készített kép egyszerű kezelését. Beolvassa a megjelölt fájlokat, expozíciós időkre bontva csoportosítja őket, majd a beállításoknak megfelelően elvégzi a kontrasztelemzést, és ha szükséges, az elemzés során elmenti a nyers képek kontraszttérképeit. A következő lépésben a kontraszttérképeken négy terület jelölhető ki négy kurzorpár segítségével; a program az ezen területeken található pixelek értékeit átlagolja, és hozzáadja az egyes területekhez tartozó expozíciós idő - kontraszt grafikonokhoz. Utolsó lépésként szövegfájlként el tudja menteni a grafikonokat. Az adatok további feldolgozását (függvényillesztés, ábrázolás, összesítés) Origin szoftverrel végeztem. 16

5. Kísérleti eredmények 5.1. Modellezés szintetikus mintával 5.1.1. Mérések nyugvó szuszpenzión Első kísérleteim annak vizsgálatára irányultak, hogy a statikus szóró részek milyen hatást gyakorolnak a kialakuló interferenciaképek kontrasztjára. A biológiai szövetek imitálására egy szintetikus modellt készítettem, melyben a vért valamilyen szuszpenzióval vagy emulzióval, a mozdulatlan szövetrészeket (pl. bőrfelszín) valamilyen jó fényszóró, ugyanakkor áttetsző anyaggal kívántam helyettesíteni [26]. Első lépésként egy, a kísérleti céloknak megfelelő szuszpenziós vagy emulziós oldatot kerestem. Először könnyen hozzáférhető, lehetőleg olcsó anyagokkal (montmorillonit, hintőpor, teflon por és kovasav vizes szuszpenzióival, valamint tejjel) próbálkoztam, azonban huzamosabb ideig tartó mérésekre ezek nem voltak alkalmasak, mivel gyorsan (akár néhány perc alatt) leülepedtek, csak csekély mértékben szórták vissza a fényt, vagy éppen romlandóak voltak. Végül polisztirén (latex) mikrogömb szuszpenziót szereztünk be (Duke Scientific, 600 nm és 3 m átmérő), mely már alkalmasnak bizonyult kísérleteimhez. A szuszpenziót tartalmazó 5 mm vastag küvetta megvilágított oldalának egy részét átlátszatlan fehér papírral vontam be, ez a terület referenciaként szolgált. Az ezen területről rögzített interferenciaképnek, illetve az azokból számított kontraszttérképeknek időben állandóaknak kellett lenniük, esetleges megváltozásuk a rendszer rezgésére vagy a lézernyaláb instabilitására utalt. A megvilágított oldal egy másik részére különböző áttetsző szóró rétegeket pauszpapírt, teflon fóliát (Goodfellow, 50 és 100 m vastag) ragasztottam, ez biztosította a statikus szórást. Ezen területek esetén a kamerába a szóró rétegről, illetve mivel az áttetsző volt az alatta lévő szuszpenzióról is érkeztek fotonok, és ezek együtt alakították ki a szórási interferenciaképet. A küvetta megvilágított felületének fennmaradó részét szabadon hagytam, hogy tisztán meg lehessen figyelni a szuszpenziót is. 17

A különböző rétegekkel takart felületű küvettáról 5 ms-os expozíciós idővel készült szórási interferenciakép alapján számított kontraszttérkép a 10. ábrán látható. 10. ábra. A modell mintáról 50 ms expozíciós idővel rögzített interferenciakép kontraszttérképe. Jól elkülöníthetőek a különböző rétegekkel fedett területek:1 referencia, 2 jól szóró, ugyanakkor áttetsző réteg, 3 fedetlen szuszpenzió, 4 referencia vagy más jól szóró de áttetsző réteg A mérések során 660 nm hullámhosszú lézerfénnyel világítottam meg a mintát, az expozíciós időt pedig 1 és 100 ms között változtattam. Az első mérési sorozatban a 600 nm-es mikrogömb szuszpenzió nyugalomban volt, a vér perfúzióját a mikrogömbök jelentős Brown-mozgása imitálta. Brown-mozgás során a részecskék sebessége normál eloszlású [27], azonban a vér áramlása illetve perfúziója során Lorentz-féle eloszlást lehet feltételezni. Tapasztalataim szerint igen jól lehet görbét illeszteni a Brown-mozgást végző mikrogömbök esetén ezen utóbbi eloszlást feltételező formulákkal is. A mérések eredményei jól mutatták, hogy a K(T) görbe jelentősen eltér az ideálistól: a kontraszt maximuma nem érte el az 1-et, és különböző fedőrétegek alkalmazása esetén minimális értéke meg sem közelítette a 0-t. Bár a jelenség természetéből adódó statisztikai 18

zaj miatt a kontrasztértékek az egyes expozíciós időknél nem állandóak, a kontrasztgörbék ideálistól eltérő lefutása jól látható a 11. ábrán. Mivel a görbék jelentősen eltérnek az ideálistól, azok átskálázásához két paramétert (P1 és P2) vezettem be, ahol 2 2 1 P2 P hasonló szerepet tölt be, mint a (6) összefüggésben, míg P2 a statikus szórás által okozott torzulás korrigálását szolgálja. A (3) összefüggés a paraméterekkel bővítve következő alakot ölti: T 2 2 1 2 2 K ( T) P1 C ( t) dt P2. (7) T 0 A Fercher és Briers által felírt formula a következőképpen módosul: K( T) P 2 1 2T 1 exp 2 P T 2 2 1/ 2. (8) A háromszöges átlagolással kapott (5) formula bővítésével a következő összefüggést kapjuk [28]: K( T) P 2 1 2 2T 2 2T exp 2T 1 P 2 2 1/ 2. (9) Kontraszt 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 fedetlen szuszpenzió 2 réteg pauszpapírral fedett szuszpenzió (9) összefüggés alapján illesztett görbék 1 10 100 Expozíciós idõ [ms] 11. ábra. A kontraszt függése az expozíciós időtől fedetlen és 2 réteg pauszpapírral fedett szuszpenzió esetén. Jól látható hogy a statikus szórás hatására a kontraszt minimumértéke jelentősen eltolódik 19

A kísérleti eredményekre a (8) és (9) összefüggéssel is illesztettem görbét. Bár az eredményként kapott korrelációs idő értéke a két görbe esetén különbözött, mindkettő jól követte a mérési pontokat. Mindemellett úgy találtam, hogy a két összefüggés alapján kapott korrelációs idő értékek csupán egy konstans szorzóval térnek el egymástól (12. ábra). 12. ábra. Az ideális esetre vonatkozó (4) és (5) összefüggések alapján 0,57 T/ és T/ szerint rajzolt kontrasztgörbék. Jól látható, hogy a görbék lefutása nagyon hasonló, a illesztési paraméter pedig csak egy konstans szorzó erejéig tér el egymástól Az 1. táblázatról leolvasható, hogy a szóró réteggel takart és a fedetlen szuszpenzión meghatározott korrelációs idők a több expozíciós időt alkalmazó módszer esetében 10%-os hibahatáron belül megegyeztek egymással, ezzel szemben a hagyományos és a - korrekciót alkalmazó, egy expozíciós időt felhasználó méréseknél kapott értékek jelentősen eltérnek egymástól. 20

Több expozíciós fedetlen -korrigált (2 ms) Klasszikus (2 ms) Fedetlen szuszpenzió 1 1 1 50 m Teflon 1,06 1,35 1,31 100 m Teflon 1,09 3,61 2,54 Pauszpapír 1,07 3,05 2,49 1. táblázat. A korrelációs idők relatív függése az alkalmazott szóróréteg függvényében 5.1.2. Mérések áramló szuszpenzión A szuszpenziót áramoltató kísérletek során a kísérleti elrendezés az előzőhöz hasonló volt. A kísérlethez 3 m átmérőjű mikrogömbökből készítettem 2% V/V koncentrációjú szuszpenziót. A gömbök nagyobb átmérője kevésbé intenzív Brown-mozgást eredményez, ami így nincs jelentős hatással az áramlásmérés eredményeire. A mintatartó ez esetben egy simára polírozott plexitömb volt, melybe több helyen, különböző átmérőjű furatok voltak, melyeken a szuszpenziót átáramoltatva méréseket végezhettem. A szuszpenzió egy, a plexitömbhöz képest fél méter magasan lévő tartályból egy, a plexitömb alatt lévő edénybe folyt, áramlási sebességét egy infúzióhoz használatos csepegtetővel szabályoztam. Ezen mérések során 50 m vastag Teflon fóliával takartam le a szuszpenzió egy részét. Egy teljes, több expozíciós időt magába foglaló képsorozat felvétele akár 1 percet is igénybe vehet, ami ugyan vetekedhet egy pásztázó Doppler-rendszer sebességével, azonban valós idejű megfigyelésekhez túl hosszú idő. Ezért egy új mérési protokollt dolgoztam ki: egy kezdeti, több expozíciós időt is felhasználó, nyugalomban levő szuszpenzión végzett mérés során meghatároztam az egyes területekre jellemző P1 és P2 értékét, majd ezeket konstansnak feltételezve egyetlen expozíciós idővel kapott adat segítségével határoztam meg a korrelációs időt különböző áramlási sebességek mellett. 21

A mérések eredményei a 13. ábrán láthatóak. Jól látható, hogy mind a fedetlen, mind pedig a Teflonnal fedett területen mért inverz korrelációs idő lineárisan (és ugyanolyan meredekséggel) függ az áramlási sebességtől. 25 fedetlen szuszpenzión mért 1/ takart szuszpenzión mért 1/ 20 1/ [1/ms] 15 10 5 m=2.43 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Áramlási sebesség (mm/s) 13. ábra. A fedetlen és 50 m teflon fóliával takart szuszpenzión mért korrelációs idők reciprokai az áramlási sebesség függvényében A két különböző szórási tulajdonsággal rendelkező területen mért korrelációs időket egymással összehasonlítva jól látható, hogy a mérések során előforduló két nagyságrendnyi tartományon ezek jól egyeznek egymással (14. ábra). 10 Teflon fóliával takart szuszpenzión mért [ms] 1 0,1 m=1 0,01 0,01 0,1 1 10 Fedetlen szuszpenzión mért [ms] 14. ábra. Az 50 m vastag teflon fóliával takart és a fedetlen szuszpenzión mért korrelációs idők 22

Ebből arra a következtetésre jutottam, hogy valós mérések esetén a P1 és P2 kezdeti meghatározása után elegendő lehet egyetlen expozíciós idő felhasználásával képeket rögzíteni, ami lehetővé teszi a bőrfelszín, vagy más statikus szórással rendelkező szövet valós idejű megfigyelését. Ugyanezt a mérési sorozatot kiértékeltem hagyományos, egyetlen expozíciós időn alapuló módszerrel is az (5) összefüggést alkalmazva, ennek eredményét láthatjuk a 15. ábrán. Bár a fedetlen szuszpenzión meghatározott korrelációs idő értékek ekkor is közelítőleg egyenes arányban változnak az áramlási sebességgel, a fedőréteggel takart szuszpenzió ettől teljesen eltérő eredményeket ad, amelyeket ráadásul befolyásol a számításhoz kiválasztott expozíciós idő értéke. Mindez az általam kidolgozott mérési eljárás létjogosultságát igazolja. 15. ábra. Egyetlen expozíciós időt felhasználó módszerrel meghatározott korrelációs idők különféle áramlási sebességek esetén. Jól látható, hogy a módszer hibás eredményt ad szóró réteg jelenlétében 23

5.2. Bőrfelszín vérellátásának vizsgálata 5.2.1. Kísérleti elrendezés és mérések A bőr vérellátásának vizsgálatára alkalmazott LASCA eljárások során jellemzően az (5) vagy (6) formula alapján határozzák meg a perfúzió mértékét, így a különböző személyeken, vagy egyetlen személyen, de eltérő körülmények között készült mérési eredmények a korábbiakban leírt okok miatt csak korlátozottan hasonlíthatók össze. A modellkísérleteim eredményei szerint az általam kidolgozott több-expozíciós módszer jól használható intenzív statikus szórással rendelkező minták áramlásváltozásainak nyomon követésére, azonban a gyakorlati alkalmazhatóságot csak valódi, megfelelő referenciával alátámasztott bőrszöveti mérésekkel lehet igazolni. A kísérletekhez használt elrendezés vázlata a 16. ábrán látható. 16. ábra. A bőr vérellátását vizsgáló összeállítás vázlata Az összeállítás hasonló a korábbi fejezetekben használtakhoz, azonban a rendszert referenciaként kiegészítettem egy kétcsatornás kontakt Doppler-rendszerrel (Periflux 4000), amellyel lehetővé vált a szöveti perfúzió megfelelő pontosságú, valós idejű mérése. A LASCA vizsgálathoz alkalmazott 808 nm-es hullámhosszú, 200 mw maximális teljesítményű lézerdióda fényével megvilágított szövet területe 1 cm 2 volt. Minden mérés 5 24

sorozatból állt, ezek mindegyikének rögzítése során 1, 2, 5, 10, 20, 50 és 100 ms-os expozíciós időkkel vettem fel 25-25 képet. A referenciamérés optimális módja az lett volna, ha ugyanazon terület szimultán mérését megvalósíthattam volna a speckle és a Doppler rendszerrel, azonban ez csak egy számomra hozzáférhetetlen pásztázó vagy kamerás Doppler készülékkel lett volna lehetséges. Az általam használt Doppler-rendszer szondái hozzávetőleg 1 mm 3 térfogatban képesek a véráramlást figyelni, így rendkívül érzékenyek a mozgatásra, a mérés során nem távolíthattam el őket, így azokat a speckle rendszerrel vizsgált terület közelében rögzítettem úgy, hogy a lehető legkisebb távolságra legyenek attól. Az eszköz három mennyiség: a CMBC (Concentration of Moving red Blood Cells, a Doppler-spektrum nulladik momentuma, a térfogatban mozgó vörös vértestek számával és ezáltal sűrűségével függ össze), a PU (Perfusion Unit, a Doppler-spektrum első momentuma) és a Velocity (a CMBC és a PU hányadosa, a térfogatban mozgó vörös vértestek átlagos sebességével arányos) mérését tette lehetővé. Úgy tapasztaltam, hogy a speckle rendszer által mért 1/ értékek a PU-tal változtak arányosan, így ezekre a mennyiségekre a továbbiakban SCPU (Speckle Contrast Perfusion Unit) és LDPU (Laser Doppler Perfusion Unit) néven fogok hivatkozni. A méréseket az alkar bőrfelületén végeztem, minden esetben olyan területet választottam ki a mérésekhez, amelyet a nagyobb látható erek elkerültek. A felvételek kiértékelése során három módszer alkalmazhatóságát hasonlítottam össze: i) Hagyományos egy expozíciós időt alkalmazó mérés (az (5) formula alapján), ennek során 10 ms-os expozíciós idővel történt a képek rögzítése. ii) Egy expozíciós időt alkalmazó mérés -korrekcióval (a (6) formula alapján), ekkor szintén 10 ms-os expozíciós időt alkalmaztam. Újabban a kereskedelemben kapható LASCA készülékek ezt a kiértékelési módszert alkalmazzák. Ezen rendszereket minden mérés előtt úgy kalibrálják, hogy egy fehér papírt vagy teflontömböt helyeznek a mintatartóra, és az ezen meghatározott kontraszt értékére állítják be -t. iii) Az általam kidolgozott több expozíciós időt felhasználó mérés és a (9) formulát felhasználó függvényillesztés. Minden mérés 3 részből állt: Először nyugalmi állapotban végeztem egy mérést, majd egy vérnyomásmérő mandzsettáját az alany felkarjára helyezve a szisztolés nyomásnál 30-35 Hgmm-rel magasabb nyomást létrehozva jelentősen lelassítottam a véráramlást az alkarban (okklúzió). Miután a Doppler-rendszer által mutatott áramlási sebesség állandósult, újabb 25

mérést végeztem. Végül megszüntettem az elszorítást (reperfúzió), és az alkar vérellátásának stabilizálódása után elvégeztem a harmadik mérést is. Két személyen összesen 20 teljes mérést végeztem, azonban ezek egy része használhatatlannak bizonyult. Ennek oka lehetett a speckle rendszerrel vizsgált terület és a Doppler-szondák távolsága, az egyes területek eltérő reakciója az okklúzióra és a reperfúzióra, vagy nem látható nagyobb erek jelenléte. A Doppler- és a speckle rendszer által mért eredmények igen erősen változtak alanyról alanyra, illetve akkor is, amikor egy alany esetén egymástól nem túl messze lévő területeket vizsgáltam, ezért a tényleges értékek helyett relatív értékekkel dolgoztam úgy, hogy minden mérés során a nyugalmi állapotban meghatározott értéket 100%-nak feleltettem meg, és az elszorított illetve ismét felengedett állapotban számított értékeket ehhez viszonyítottam. A relatív változás nyomonkövetése általánosan alkalmazott módszer klinikai vizsgálatoknál és orvosi célú kutatásoknál is. 5.2.2. Eredmények A 17. ábra az i), ii) és iii) módszerrel végzett függvényillesztéseket mutatja egy mérési adatsor esetén úgy, hogy az i) és ii) módszerrel a 10 ms-os expozíciós idővel rögzített képeken számított kontrasztértékekre illesztettem. Kontraszt 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Kontraszt Hagyományos egyexpozíciós (10ms) -korrekciót alkalmazó egyexpozíciós (10ms) Többexpozíciós 1 10 100 Expozíciós idõ [ms] 17. ábra. Az i), ii) és iii) módszerrel valós adatsorra illesztett görbék. Jól látható, hogy csak a több expozíciós időt alkalmazó módszerrel lehet a mérés bizonytalanságán belül illeszteni 26

Az egyes expozíciós időkhöz tartozó kontrasztértékek a vizsgált hozzávetőleg 2 2 mmes területen számított lokális kontrasztértékek átlagolásával lettek meghatározva. A kontrasztértékek szórása egyrészt a szórási interferenciakép és a lokális kontrasztértékek természetes fluktuációjának, másrészt a bőrfelület véletlenszerű mozgásának is köszönhető. Jól látható, hogy a hagyományos, egyetlen expozíciós időt felhasználó kiértékelés mennyire félrevezető lehet: a 10 ms-os expozíciós időt kivéve (hiszen erre történt az illesztés) jelentősen eltér az illesztett görbe lefutása a valós mérési pontoktól. A -korrekciót alkalmazó módszer jobb illeszkedést biztosít, azonban csak a több expozíciós időt felhasználó módszer képes a mérés bizonytalanságán belül görbét illeszteni a mérési pontokra. A 18. ábra az i), ii) és iii) módszerrel meghatározott relatív áramlási sebesség értékeket mutatja a Doppler rendszer által mért relatív perfúziós egység függvényében. Az áttekinthetőség javításáért mindegyik ábrán szerepel az m=1 meredekségű egyenes. 1,4 1,2 a 1,4 1,2 b Relatív SCPU 1,0 0,8 0,6 0,4 m=0.407 Relatív SCPU 1,0 0,8 0,6 0,4 m=0.709 0,2 m=1 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Relatív LDPU 0,2 m=1 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Relatív LDPU 1,4 1,2 c Relatív SCPU 1,0 0,8 0,6 0,4 m=0.847 0,2 m=1 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Relatív LDPU 18. ábra. A hagyományos egy expozíciós időt (a), a -korrigált egy expozíciós időt (b) és a több expozíciós időt (c) alkalmazó módszer által számított relatív perfúziós értékek a Doppler rendszer által mért adatok függvényében. 27

A nagy szórás legfőképp annak köszönhető, hogy a Doppler-szondák a speckle rendszer által megvilágított területtől több cm távolságra voltak elhelyezve. Ennek ellenére világosan látszik, hogy bár mindhárom módszer az elszorításkor felül-, míg a reperfúzió során alulbecsüli a Doppler rendszer által mutatott relatív változást, ezen eltérések mértéke nagyban függ az alkalmazott kiértékelési módszertől. Ez a tendencia nagyon erősen jellemző a hagyományos egy expozíciós időt alkalmazó módszerre (20.a ábra). Jobb eredményt adott a -korrekciót is alkalmazó egy expozíciós időt használó módszer (20.b ábra), azonban a Doppler-rendszer által mért relatív értékekkel a legjobb egyezést a több expozíciós időt felhasználó mérés eredményei mutatták. A 19. ábra azt mutatja, hogy az egyes speckle módszerek által mért perfúzió változás átlagosan mennyire volt összhangban a Doppler-redszer által mért változásokkal, valamint leolvasható az egyes értékek szórása is. Ez a grafikon is jól mutatja, hogy a több expozíciós időt alkalmazó módszer lényegesen megbízhatóbb eredményeket ad a többinél: az általa mutatott változások átlagosan csupán közel 15%-kal térnek el a Doppler-rendszer által mértektől. A nagy szórás legfőképpen abból adódhat, hogy a két rendszerrel különböző területeken történt a mérés, és ezen területek nem pontosan azonos választ adtak elszorítás és reperfúzió során. SCPU változás / LDPU változás 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0.847 0.709 0.407 Hagyományos -korrigált Több exp. idõ LASCA módszer 19. ábra. A speckle módszerek által a Doppler rendszerhez képest a különféle stimulusok esetén mutatott változások nagysága 28

Megvizsgáltam azt is, hogy a modellkísérletek eredményeihez hasonlóan egy kezdeti több expozíciós időt magába foglaló mérés során a P1 és P2 paraméter értékét meghatározva kalibrálható-e a rendszer úgy, hogy utána egyetlen expozíciós időt felhasználva folyamatosan mérni a szövet vérellátását. A 20. ábrán a különféle stimulusok során az áramlás stabilizálódása után felvett kontrasztgörbék láthatóak. Szembetűnő, hogy az egyes görbék esetén eltérnek a rövid expozíciós időre vonatkozó K(0) és a hosszú expozíciós időre vonatkozó K( ) kontrasztértékek, melyek meghatározzák a P1 és P2 értékét. Feltételezhetően ez annak köszönhető, hogy a stimulusok során a szövet általában megduzzad, megváltozik a vér koncentrációja és ezáltal az interferenciakép kialakulásához hozzájáruló dinamikus és statikus rész aránya. Sajnos ez lehetetlenné teszi a fent említett kombinált, kalibrációt is alkalmazó módszer alkalmazását. Emellett nyilvánvalóvá vált, hogy -korrekciós módszer nagyobb hibája részben annak köszönhető, hogy a kalibrálás során papírra, teflon tömbre meghatározott K(0) kontraszt nem azonos a szöveti K(0) kontraszttal, ami még ráadásul a perfúzió pillanatnyi mértékétől is függést mutat. Kontraszt 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 Alapállapot Elszorítás Reperfúzió 1 10 100 Expozíciós idõ [ms] 20. ábra. A különböző stimulusok során felvett kontrasztértékekre illesztett kontrasztgörbék. Jól látható, hogy a P1 és P2 paraméterek a három görbe esetén számottevő mértékben eltérnek egymástól 29

Bár egy több sorozatból álló, az összes eddig alkalmazott expozíciós időt felhasználó mérés elkészítése fél percet is igénybe vehet, csupán 3 expozíciós idővel (pl. 1, 10, 100 ms) rögzítve 20-20 képet ez az idő jelentősen csökkenthető. A folyamatos mérés során időről időre ezt a rutinmérést elvégezve lehetőség nyílhat akár valós idejű megfigyelésekre is. Ezen módszer gyakorlati tesztelését a közeljövőben tervezem elvégezni. 30

5.3. Mérések agyfelszínen 5.3.1. Kísérleti elrendezés és mérések A bőrszöveten mért eredmények bizonyították módszerem alkalmasságát. A továbbiakban az Élettan Tanszékkel együttműködésben malacok agyfelszínén is teszteltem a több expozíciós időt magába foglaló mérési módszert. Megvizsgáltam, milyen mértékben térnek el az általa és a -korrekciót alkalmazó, valamint a hagyományos, egyetlen expozíciós időt felhasználó módszer által adott eredmények egymástól, mennyire lehet indokolt a nyilvánvalóan bonyolultabb mérés alkalmazása hasonló körülmények között. Sajnos ebben az esetben nem volt lehetőség szimultán Doppleres referenciamérések elvégzésére. A kísérleti alanyok 1 naposak voltak, és tömegük 2,5 és 3,5 kg között változott. A mesterséges kómában levő állatok agykérgét egy, a koponyán elhelyezett ablakon keresztül lehetett vizsgálni. Ahhoz, hogy különböző vérellátottsági állapotokban tudjak mérni, a malacokat különböző stimulusoknak tették ki, melyek a következők voltak: - 5 és 10% koncentrációjú CO2 gázt tartalmazó levegőt lélegzett a malac, - 2,1% koncentrációjú H2 gázt tartalmazó levegőt lélegzett a malac, - 1 és 10 mol bradykinint tartalmazó mesterséges agy-gerincvelői folyadékot juttattak az agyfelszínre, - 100 mmol NMDA tartalmú mesterséges agy-gerincvelői juttattak az agyfelszínre. Az NMDA és a bradykinin két különböző hatásmechanizmussal rendelkező lokálisan ható értágító, a magas CO2 koncentráció hatására pedig intenzívebbé válik a szövetek vérellátása és kitágulnak az erek. A H2 élettani hatása egyelőre nem teljesen tisztázott. A mérések a következőképpen folytak: először nyugalmi állapotban a korábban is alkalmazott expozíciós időkkel (1-100 ms) rögzítettem egy képsorozatot, majd valamelyik stimulus alkalmazása során a gyorsabb változások nyomon követése érdekében 2 ms-os expozíciós idővel folyamatosan, másodpercenként 4 interferenciaképet rögzítettem. A perfúzió stabilizálása után újból egy teljes, több expozíciós időt magába foglaló sorozatot vettem fel. A stimulus megszüntetésekor és a stabil állapot beállása után is hasonlóan jártam el. Ezután kis szünetet tartva a procedúrát ugyanígy ismételtük meg a többi stimulus esetében is. 31

5.3.2. Eredmények Dolgozatomnak nem célja a stimulusok élettani hatásainak elemzése, ezért kizárólag az egy és több expozíciós időt felhasználó mérési módszerekkel kapott mérési eredményeket vetem össze. A képek kiértékelése során a parenhima (látható ereket nem tartalmazó agyszövet) vérellátását, valamint az artériákban áramló vér sebességét vizsgáltam a különböző hatások során. A 21. ábrán két kijelölt terület látható az egyik malac esetén. 21. ábra. A vizsgált területek az agyfelszínről készült kotraszttérképen: sárga parenhima, piros artéria A 22. ábra az egy expozíciós mérések eredményeit (inverz korrelációs idő) veti össze a több expozíciós mérésekével. Jól látható, hogy amíg 2 ms-os expozíciós idő esetén a mért inverz korrelációs idők jó összhangban vannak, addig 20 ms esetén a -korrekciót alkalmazó módszer alulbecsüli az áramlási sebességet, ráadásul intenzív áramlás esetén (a bekarikázott területen) telítést is mutat. 32

Egy expozíciós idõvel meghatározott 1/ [1/ms] 10 1 Parenhima, 2 ms Parenhima, 20 ms Artéria, 2 ms Artéria, 20 ms m=1 1 10 Több expozíciós idõvel meghatározott 1/ [1/ms] 22. ábra. A 2 és 20 ms-os expozíciós időt alkalmazó mérések eredményei a több expozíciós időt alkalmazók eredményeinek függvényében. A 20 ms-os expozíciós időt felhasználó mérés alulbecsüli az áramlási sebességet, sőt nagyobb sebességeknél telítést is mutat (karikázott terület), míg a rövidebb expozíciós idő alkalmazásával ezek a hibák kiküszöbölhetők Mivel a gyakorlatban nem az abszolút inverz korrelációs időkkel, hanem azoknak egy kezdeti értékhez viszonyított változásával számolnak, ezt is összehasonlítottam a különböző kiértékelési módszerekre úgy, hogy az egyes expozíciós idők és szövettípusok esetén meghatároztam a relatív eredményekre illeszthető egyenesek meredekségét (2. táblázat). 2 ms 20 ms Parenhima 1,09 1,04 Artéria 1,05 0,93 2. táblázat. Az egy expozíciós időt alkalmazó mérések által a több expozíciós időt felhasználó módszerhez képest mutatott relatív változások Ebből jól látható, hogy a 2 ms-os mérések 9 és 5%-kal túlbecsülik az áramlást a parenhima és az artéria esetén, a 20 ms-os mérés pedig a parenhimára 4%-kal túlbecsült 33

eredményt ad, viszont az artéria esetén 7%-kal alacsonyabb értékeket mutat a több expozíciós időt felhasználó méréshez képest, mindemellett telítést mutat intenzívebb áramlás esetén. A mérések alapján megállapítható, hogy az agyfelszínen történő vizsgálatok során a szövet vérellátása és az erekben áramló vér áramlási sebessége kellő pontossággal meghatározható -korrekció és egyetlen, 1-5 ms-os expozíciós idő alkalmazásával, ami szükségtelenné teszi a jóval bonyolultabb, több expozíció időt magába foglaló mérések használatát. Figyelemre méltó azonban, hogy a kísérleti illetve kereskedelmi forgalomban is hozzáférhető összeállítások többségében alkalmazott, 10 ms-nál hosszabb expozíciós idő az erek esetén hamis eredményt adhat. Ezeket a méréseket korábban egy, a bőr esetén alkalmazottal azonos Dopplerrendszerrel (de természetesen másmilyen szondákkal) lehetett kivitelezni. A szondák végeit ekkor vagy a koponyán elhelyezett ablakon, vagy a koponyán fúrt lyukakon keresztül juttatták el az agyfelszíntől hozzávetőleg 1 mm távolságra. Mivel az agyfelszín kismértékben elmozdult a különféle stimulusok során, a Doppler-rendszer sok esetben hamis eredményt szolgáltatott. Torzulást okozhatott az is, hogy nem minden esetben volt egyértelmű, hogy a szondák végei a parenhima vagy egy ér felett vannak-e. Méréseimből egyértelműen kitűnik, hogy az agyfelszín vérellátásának megfigyelése esetén az általam fejlesztett rendszer lényegesen pontosabb eredményeket tud nyújtani, mint egy hagyományos Doppler-rendszer. 34

6. Összefoglaló Méréseim célja egy, a gyakorlatban is használható szórási interferencia kontrasztelemzésén alapuló véráramlásmérő eszköz összeállítása volt. Első lépésben mikrogömb szuszpenzió és különböző szórási tulajdonságokkal rendelkező rétegek segítségével egy szövetmodellt építettem. Széles expozíciós idő tartományon rögzített interferenciaképek felhasználásával és egy módosított kontraszt-expozíciós idő összefüggést leíró egyenlet segítségével sikerült jelentősen csökkenteni a statikus szóróelemek okozta torzulást. Második lépésben egy referenciamérésre alkalmas Dopplerrendszer segítségével valódi, élő bőrszöveten teszteltem és bizonyítottam az általam kidolgozott eljárás alkalmazhatóságát. Malacok agyfelszíni vérellátásában különböző stimulusok hatására bekövetkező változásokat vizsgálva összehasonlítottam a különböző kontrasztelemző eljárások által kapott eredményeket. Kísérleteim során megállapítottam, hogy a jelenleg alkalmazott kontrasztelemzéses eljárásokhoz képest a mérési módszerem különösen bőrszövet esetén jelentős előrelépést jelent a mérési pontosság növekedése terén. Használatával lehetőséget nyílhat eszközbeállítástól független, egymással összehasonlítható kvantitatív mérések elvégzésére. 35

Köszönetnyilvánítás Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Smausz Kolumbán Tominak a munkám során nyújtott segítséget és szakmai útmutatást. Köszönet illeti Dr. Hopp Bélát, az Ablációs Laboratórium vezetőjét a kutatásom megvalósításában nyújtott támogatásáért és hasznos tanácsaiért. Köszönettel tartozom Dr. Domoki Ferencnek, Oláh Orsolyának, és Tóth-Szűki Valériának, az SZTE Élettani Intézet munkatársainak a malacokon végzett mérések, valamint Doppler-rendszer használata során nyújtott segítségükért. Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozunk Bari Ferenc professzor úrnak az Orvosi Fizikai és Orvosi Informatikai Intézet vezetőjének, hogy felhívta figyelmünket ezen ígéretes kutatási témára. A kutatás megvalósulásához az anyagi hátteret az OTKA F67816, K67818 és CNK78549 kutatási pályázatok biztosították. 36

Irodalomjegyzék [1] R. Jones & C. Wykes: Holographic and speckle Interferometry, Second Edition, Cambridge University Press (1989) [2] B. Ruth: Velocity measurement by the laser speckle method using optical fibres, Opt. Laser Technol. 19(2), 83-90 (1987) [3] K. Iwata, T. Hakoshima, and R. Nagata: Measurement of flow velocity distribution by multiple-exposure speckle photography, Opt. Commun. 25(3), 311-314 (1978) [4] M. Giglio, S. Musazzi, and U. Perini: Distance measurement from a moving object based on speckle velocity detection, Appl. Opt. 20(5), 721-722 (1981) [5] D. V. Semenov, I. S. Sidorov, E. Nippolainen, and A. A. Kamshilin: Speckle-based sensor system for real-time distance and thickness monitoring of fast moving objects, Meas. Sci. Technol. 21(4), (2010) [6] M. Shiraishi and K. Sato: Possibility of Large Roughness Measurement by Laser Speckle, Transactions of the ASME 113, 476 (1991) [7] D. Léger, E. Mathieu, and J. C. Perrin: Optical Surface Roughness Determination Using Speckle Correlation Technique, Appl. Opt. 14(4), 872-877 (1975) [8] J. Marron, A. J. Martino, and G. M. Morris: Generation of random arrays using clipped laser speckle, Appl. Opt. 25(1), 26-30 (1986) [9] P. Lalanne, H. Richard, J.C. Rodier, P. Chavel, J. Taboury, K. Madani, P. Garda, and F. Devos: 2-D generation of random numbers by multimode fiber speckle for silicon arrays of processing elements, Opt. Commun. 76(5-6), 387-394 (1990) [10] A. F. Fercher and J. D. Briers: Flow visualization by means of single-exposure speckle photography, Opt. Commun. 37(5), 326 330 (1981) [11] S. J. Kirkpatrick, D. D. Duncan, and E. M. Wells-Gray: Detrimental effects of speckle-pixel size matching in laser speckle contrast imaging, Opt. Lett. 33(24), 2886 2888 (2008) [12] J. D. Briers and S. Webster: Laser speckle contrast analysis (LASCA): a nonscanning, full-field technique for monitoring capillary blood flow, J. Biomed. Opt. 1(2), 174 179 (1996) [13] A. C. Völker, P. Zakharov, B. Weber, A. Buck, and F. Scheffold: Laser speckle imaging with an active noise reduction scheme, Opt. Express 13(24), 9782 9787 (2005) 37

[14] R. Bandyopadhyay, A. S. Gittings, S. S. Suh, P. K. Dixon, and D. J. Durian: Specklevisibility spectroscopy: a tool to study time-varying dynamics, Rev. Sci. Instrum. 76, 093110 (2005) [15] D. D. Duncan, S. J. Kirkpatrick, and R. K. Wang: Statistics of local speckle contrast, J. Opt. Soc. Am. A 25(1), 9 15 (2008) [16] A. K. Dunn, A. Devor, H. Bolay, M. L. Andermann, M. A. Moskowitz, A. M. Dale, and D. A. Boas: Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation, Opt. Lett. 28(1), 28 30 (2003) [17] A. Kharlamov, B. R. Brown, K. A. Easley, and S. C. Jones: Heterogeneous response of cerebral blood flow to hypotension demonstrated by laser speckle imaging flowmetry in rats, Neurosci. Lett. Suppl. 368(2), 151 156 (2004) [18] J. D. Briers and A. D. Fercher: Retinal blood-flow visualization by means of laser speckle photography, Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 22(2), 255-259 (1982) [19] Y. Aizu, K. Ogino, T. Sugita, T. Yamamoto, N. Takai, and T. Asakura: Evaluation of blood flow at ocular fundus by using laser speckle, Appl. Opt. 31(16), 3020 3029 (1992) [20] M. Nagahara, Y. Tamaki, M. Araie, and H. Fujii: Real-timeblood velocity measurements in human retinal vein using the laser speckle phenomenon, Jpn. J. Ophthalmol. 43(3), 186 195 (1999) [21] J. D. Briers: Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging, Physiol. Meas. 22(4), (2001) [22] K. R. Forrester, I. C. Stewart, I. J. Tulip, C. Leonard, and R. C. Bray: Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue, Med. Biol. Eng. Comput., 40(6),687-697 (2002) [23] C. J. Stewart, R. Frank, K. R. Forrester, J. Tulip, R. Lindsay, and R. C. Bray: A comparison of two laser-based methods for determination of burn scar perfusion: Laser Doppler versus laser speckle imaging, Burns 31(6), 744 752 (2005) [24] M. Leutenegger, E. Martin-Williams, P. Harbi, T. Thacher, W. Raffoul, M. André, A. Lopez, P. Lasser, and T. Lasser: Real-time full field laser Doppler imaging, Biomed. Opt. Express 2(6), 1470-1477 (2011) [25] Al. Serov, B. Steinacher, and T. Lasser: Full-field laser Doppler perfusion imaging and monitoring with an intelligent CMOS camera, Opt. Expr. 13(10), 3681-3689 (2005) 38

[26] T. Smausz, D. Zölei, and B. Hopp Determination of Real Correlation Time and Calibration in Laser Speckle Contrast Analysis, Book of abstracts of 16th Int. Conf. on Advanced Laser Technologies 2008, ISBN 978-963-06-5737-2, LaserSkill Ltd. (2008) [27] G. E. Uhlenbeck and L. S. Ornstein: On the Theory of the Brownian Motion, Phys. Rev. 36(5), 823 841 (1930) [28] T. Smausz, D. Zölei, and B. Hopp: Real correlation time measurement in laser speckle contrast analysis using wide exposure time range images, Appl. Opt. 48(9), 1425-1429 (2009) 39

Melléklet M1. ábra. A képrögzítő program felhasználói felülete. Felül a főmodul, alul a kontrasztelemző modul, a háttérben pedig a kamera által rögzített kép látható. 40

41 M2. ábra. A képeket elemző program felhasználói felülete.