I. A kapilláris elektroforézis fizikai alapjai

Átírás

1 Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészi Kémiai Intézet Műszeres gyógyszeranalízis speciálkollégium (013) Kapilláris elektroforézis a gyógyszeranalízisben I. dr. Szakács Zoltán Richter Gedeon Nyrt. Fizikai-kémiai alapok, a CE berendezés felépítése Ionok elválasztására alkalmas CE módszerek Semleges molekulák elválasztására alkalmas technikák Biopolimerek és -oligomerek elválasztására alkalmas technikák Királis analízis Kapilláris elektroforézis a gyógyszerkönyvben I. A kapilláris elektroforézis fizikai alapjai grafika: microfluidics.technion.ac.il

2 3. Elektroforézis, ionvándorlás (migráció) Anód Katód Elektroforézis: különböző ionok eltérő irányú v. sebességű elmozdulása, vándorlása (transzportja) folyadékban (vizes pufferben) elektromos tér hatására Elektromos erő gyorsítja, a közegellenállás ( súrlódás ) lassítja az iont: 0 F s =k η v U F e=q E= ze 0 l : az oldat dinamikai viszkozitása (cp: -3 Pa s) q : az ion töltése [C] v0: ion vándorlási sebessége [cm s 1] z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1,6 19 C az elemi töltés Stokes törvény (merev gömb, híg oldatban) 1 E : elektromos térerősség [V cm ] rh: az ion hidrodinamikai sugara [cm] U : elektr.potenciálkülönbség [V] H l: elektródok távolsága [cm] 0 Ellentétes irányú erők egyensúlya: q E=6π η r H v k =6π r Az ion vándorlási sebessége: 4. v 0= e0 z 1 E 6π r H η [cm s 1] Ionok abszolút elektroforetikus mozgékonysága Abszolút elektroforetikus mozgékonyság (mobilitás): v0 e z 1 μ0 = = 0 [cm V 1 s 1] E 6π r H η Az ionra jellemző, egyedi fizikai állandó (adott oldószerben és hőmérsékleten: hőmérsékletfüggése: -3% / C!!) Arányos az ion fajlagos töltésével (z / rh) Végtelen híg oldatra extrapolált érték diffúziós együtth. (Nernst-Einstein) 0 RT μ D= F z [cm s 1] [S cm mol 1] krist. r ion / Å rh / Å μ 0 / -5 cm V-1 s-1 0,76 1,0 1,38 1,45 3,40,76,3 1,88 36,5 40,1 51,9 76, 76, H Li Na K NH4 Rb Cs (C3H7)4N ion moláris fajlagos vezetése: λ 0= z F μ0 Kation Mg Ca Sr Ba Fe Cu Ag Pb 3 Al 1,5 1,67 0,7 1,00 1,18 1,35 0,61 0,73 1,15 1,19 0,54 80,6 80,1 3,8 3,45 3,08 3,08,88 4,39 55,0 61,7 61,6 66,0 56,0 55,6 64,5 7,0 63,

3 5. Az ion effektív elektroforetikus mozgékonysága A valóságban nem végtelenül híg pufferoldatban dolgozunk elektrosztatikus kcsh. ellenionok felhője (az ionatmoszféra) leárnyékolja az ion töltését, lassítja migrációját κ= ionatmoszféra sugara : F I ε RT r δ = κ 1 (ld. elektrokémia: Debye, Hückel, nsager elmélete) pl. I = 0,1 mm I = mm δ = 30 nm δ = 3 nm δ = κ 1 Effektív elektroforetikus mozgékonyság (ep vagy eff alsó indexszel is szerepel) μ= e 0 Q eff 1 6π r eff η [cm V 1 s 1] reff r : effektív ionsugár [cm] Qeff : az ion effektív töltése z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1,6 19 C az elemi töltés E : elektromos térerősség [V cm 1] U : elektr.potenciálkülönbség [V] - az ionra jellemző empirikus adat, az adott pufferoldatban mérhető mennyiség - becslésére léteznek félempirikus összefüggések (lásd fford képlet később...) 6. Az effektív mozgékonyság változtatásának alapelvei Nem hidrolizáló anionok (pl. Cl-) és kationok (pl. Na): töltés / méret arány kismértékben változtatható a puffer ionerősségével Gyenge savak anionjai (pl. acetát), gyenge bázisok kationjai (pl. ammóniumion): a pufferoldat ph-jával igen érzékenyen változtatható, akár meg is szüntethető a töltés a disszociáció gyors a migráció időskáláján, ezért a látszólagos (apparent) mozgékonyság a részecskék egyedi járulékainak átlaga (Tiselius, 1930) Komplexképzéssel az ion mérete is, töltése is jelentősen változhat, ez a folyamat általában gyors a CE időskálán (átlagolt effektív mozgékonyság) de kinetikailag inert komplexek külön zónákban vándorolnak (egymástól is elválaszthatók)

4 7. Az elektroforézis története dióhéjban Hittorf, Kohlrausch, Hardy: fizikai-kémiai alapok (elektrolitok vezetése, átviteli szám, mozgó határfelület) Svedberg, Tiselius: moving boundary electrophoresis of proteins Tiselius: Nobel-díj (részben az elektroforézisért) papírelektroforézis, makroméretű lap gélelektroforézis (fehérjék, nukleinsavak) Jörgenson, Lukacs Hjertén, majd Karger Terabe Hjertén Knox, Grant Watarai kapilláris zóna elektroforézis (CZE) fused silica kapilláris kapilláris gél elektroforézis (CGE) micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) kapilláris elektrokromatográfia (CEC) mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfia (MEEKC) kereskedelmi CE készülékek & újabb és újabb detektorok fejlesztése CE rohamos elterjedése, alkalmazások százai, külön folyóiratok, konferenciák kereskedelmi mikrochip CE készülékek (mikrofluidika, lab-on-a-chip ) 8. Gél lap elektroforézis (SDS-PAGE) Na-dodecil-szulfát jelenlétében poliakrilamid gél elektroforézis fehérjék preparatív (ng - g) elválasztására Denaturált fehérjét a DS anionok beburkolják (kifelé negatív töltésű polipeptidlánc), méret szerinti elválasztás a gél pórusaiban

5 9. Joule-hő, konvekció hm-törvény Joule I. törvénye: áramvezetés során hő termelődik: NR: nem redukáló, R: redukáló körülmények között térfogat: 0 80 ml felület: cm Elfo idő: 55min 3,5h 3,5h rekombináns heterodimer glikoprotein denaturálódása, bomlása Joule-hő: 150 V * 30 ma = 5 W térerősség: - 0 V cm A nem megfelelő hőelvezetés hőmérséklet- és sűrűséggradienshez, konvekcióhoz, a szétválasztott zónák elmosódásához, keveredéséhez vezethet Elektroforézis kapillárisban: hatékonyabb hődisszipáció Virtanen (1969), Everaerts (1970), Jorgenson & Lukacs (1981) üres olvasztott kvarc (bare fused silica) kapilláris fused silica térfogat: 8 l jóval nagyobb ellenállás felület: 0,4-3 cm hatékonyabb hőelvezetés Joule-hő: 30 kv * 50 A = 1,5 W térerősség: V cm Ltot = 5 0 cm poliimid bevonat (15 m) hajlékony, flexibilis 5 75 m Inner Diameter m uter Diameter jobb felület / térfogat arány nagyobb feszültség használata (kis térfogat) nagyobb térerősség gyorsabb, élesebb (nagyobb hatékonyságú) elválasztások

6 11. Töltött kapillárisfal elektroozmotikus áramlás (EF) δ=κ 1 x N Si H diffúz elektrokémiai kettősréteg: elmozdulhat ellenion konc.gradiens tömbfázisbeli értékig Gouy-Chapman réteg (külső határa a zeta-potenciál, ) az ellenionok dominálnak N Si H Stern réteg ( St): merev, erősen adszorbeált ellenionokból felületi neg. töltés ( 0): kettősréteg vastagsága (Debye-length): Helmholtz-Smoluchowski egyenlet (1903): N κ 1 3,3/ I μeo = 0 St potenciál εζ 4 πη κ x ψ=ψ St e Elektroozmózis: a diffúz réteg ellenionjai magukkal ragadják az oldat egészét (electroosmotic flow) és makroszkopikus oldatáramlást hoznak létre a kapillárisban (EF) (negatívan töltött szilikafelület esetén katódos EF) anód 1. v eo=μ eo E katód EF: dugószerű áramlási profil HPLC: nyomás hajtotta eluensáramlás detektorjel HPLC CE: elektrokinetikusan hajtott oldatáramlás CE: szűkebb zónák, éles csúcsok, ez a nagy hatékonyság egyik oka retenciós idő migrációs idő

7 13. Az EF sebességének szabályozása a puffer ph-jával Si H a zeta-potenciál ph-függő: Si H pka ~ 3-5 eo [-5 cm V 1 s 1] v eo=μ eo E 60 fused silica veo = mm s nl min 1 40 pyrex (egy adott kapillárisban) 30 0 teflon veo = 0, mm s 1 50 nl min ph 14. Az EF szabályozásának további lehetőségei v eo=μ eo E= εζ E 4 πη Változó Eredmény Megjegyzés Elektr. térerősség EF arányosan változik Joule-hőfejl. megnőhet Puffer ionerőssége (koncentrációja) Növelésével csökken a zeta-potenciál és az EF Növelésével nő az áramerősség és a Joule-hő Szerves oldószerkomponens Csökkenti a zeta-potenciált és az EF-et Komplex hatása van Tenzid hozzáadása Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób vagy ionos kcsh.-sal Anionos tenzid: EF nő Kationos tenzid: EF csökken szelektivitás! Semleges hidrofil polimer hozzáadása Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób kölcsönhatással Felületi töltés árnyékolásával csökkenti EF-et, növeli a viszkozitást Semleges polimer hozzáadása Növeli a viszkozitást a kapillárisfalnál pl. polivinilalkohol Kovalens borítás A kapillárisfal kémiai bevonata Sokféle lehetőség, stabilitás? Hőmérséklet Viszkozitás érzékenyen változik -3% / C Könnyű kontrollálni

8 15. A kapilláris elektroforézis (CE) készülék felépítése, működése detektor termosztát egység kapilláris Pt-Ir elektród /- 30 kv minta nagyfeszültségű tápegység Pt-Ir elektród 0V kimeneti (outlet) puffer bemeneti (inlet) puffer Kereskedelmi CE készülékek

9 17. A CE általános jellemzői miniatürizált ( microscale ) elválasztástechnika, anyagtakarékos! vizes pufferoldatok (környezetbarát), UV átlátszóság (190- nm: érzékenység!) nincs külön detektorcella, on-column detektálás (kivétel: kapcsolt technikák) HPLC-nél több paraméter, gyorsabb, flexibilisebb módszerfejlesztés gyors analízis (mikrochipen még gyorsabb), kitűnő elválasztás nagyfokú automatizáltság, sorozatanalízisek lehetősége ugyanazon a készüléken több elválasztási módszer megvalósítható: töltettel, hordozóval segített töltetlen kapillárisban CZE CITP ionok elválasztására MEKC CD-EKC CIEF CGE biomakromolekulák, oligomerjeik elválasztására MEEKC CEC semleges molekulák elválasztására II. Ionok elválasztására alkalmas módszerek

10 19. Kapilláris zóna elektroforézis Capillary Zone Electrophoresis (CZE) Kationok és anionok elválasztása effektív mozgékonyságuk különbsége alapján (semleges molekulák elválasztására nem alkalmas) a legtöbb ionra: μ <μeo grafika: Agilent 0. detektorjel Kationok és anionok teljes mozgékonysága: elektroforetikus EF szuperpozíciója elektroferogram electroosmotic hold-up time : teo tm : az ion migrációs ideje v tot =v ep v eo =Leff /t m v eo= Leff /t eo E=U / L tot μeo = v eo E = idő Leff Ltot μ tot =μ μ eo= t eo U Leff L tot Ut m Leff Ltot Ut eo az ion (kísérleti) elektroforetikus mozgékonysága: Leff: kapillárishossz injektálástól a detektorig [cm] Ltot: kapilláris teljes hossza = elektródok távolsága [cm] μ= L eff L tot U ( 1 1 t m t eo ) [cm V s ] IUPAC terminológia: Pure Appl. Chem. 004, 76:

11 1. Mintadugó injektálása a kapillárisba - alapelvek Hidrodinamikus inj. p Vákuum inj. vagy p minta kimeneti puffer Gravitációs inj. ( siphoning ) minta h kimeneti puffer Elektrokinetikus inj. - U minta. kimeneti puffer Hidrodinamikus injektálás p minta injektált mintatérfogat: p nyomáskülönbség [Pa] t injektálás ideje [s] Hagen-Poiseuille egyenlet: 3 π d 4 V inj = Δp t 18 Ltot η d Ltot [ml] kapilláris belső átmérője [cm] kapilláris teljes hossza [cm] minta viszkozitása [cp = 3 Pa s] a leggyakrabban használt injektálási mód, a minta ionjaira nem diszkriminatív kapilláris gélelektroforézisben és mikrochipen nem használható pl. egy d = 75 m, Ltot = 80 cm kapilláris teljes térfogata: hidrodinamikus injektálás 30 mbar s az injektált mintadugó hossza: 3,5 l 33 nl 16 mm (%) 3-4%-nál hosszabb mintadugó injektálása már csúcsdiszperziót okozhat: inj 33 nl injektálás 1 mm oldatból: 33 pmol ha Mt = 0: 3,3 ng

12 3. Kvantitatív analízis belső standard módszerrel CZE-ben a zónák különböző sebességgel haladnak át a detektoron csúcsterület normálása: A = A / tm a nanoliteres hidrodinamikai injektálás ismételhetősége a kapilláris elektroforézis módszerek validálásának egyik gyenge pontja belső standard (IS) hozzáadásával kiküszöbölhető kalibráló oldatokra mért adatpontok A x / A IS 0 80 ismeretlen mintára kapott relatív csúcsterület és koncentráció leolvasása koncentrációx 4. Elektrokinetikus injektálás injektált x anyagmennyisége: nx = d: kapilláris belső átmérője [cm] U: injektálási feszültség [V] eo: EF mozgékonyság a pufferben [cm/vs] BGE: a puffer vezetőképessége [S/cm] κ d π Ut ( μ eo BGE μ x ) c x 4L tot κ minta kimeneti puffer [mmol] Ltot: kapilláris teljes hossza [cm] t: injektálás ideje [s] x: x effektív mozgékonysága [cm/vs] minta: a minta vezetőképessége [S/cm] cx : x koncentrációja a mintában [mol/dm3] igen érzékeny injektálási mód (field-amplification, ld. sample stacking) kapilláris gélelektroforézisben ez az általános mátrix torzítás ( minta) diszkriminatív injektálás (minden ionra más) nehéz a kvantifikálás (speciális külső v. belső standard kell) Külső standard módszer nyomanalízisre híg mintákból: A Gáspár, L Gábor, J. Chromat. A 005, 91, Univerzális belső standard kalibrálás: A Gáspár, E Dudás, J. Chromat. A 006, 11,

13 5. A legfontosabb CE detektorok Detektálási Kimutatási határ módszer koncentráció (mol / dm ) ! kromofór csoport kell (>190 nm) vagy származékképzés DAD: korlátozott szerkezeti info ! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés ! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés - drága ! elektroaktív csoport kell! speciális hardver, kapilláris kell univerzális! speciális hardver, kapilláris kell - Fluoreszcencia - Lézer-indukált fluorszcencia (LIF) Amperometria - - Indirekt UV, fluoreszcencia, amperometria Kapcsolt technikák Előnyök / hátrányok abszolút (mol) -5 UV-látható fényelnyelés -7 - Vezetőképesség -0x rosszabb, mint a direkt univerzális (hyphenated techniques) Tömegspektrometria (ESI-MS) Mágneses magrez. spektroszkópia (NMR) 6. Kimutatási határ kb univerzális n szerkezeti információt nyújt (MS ) - drága, problematikus legrészletesebb szerkezeti info - csak CH csoportokról - drága, keresked.nem elérhető Megoldások az UV-érzékenység növelésére UV-detektor érzékenységi korlátja: optikai úthossz = kapilláris átmérője = 5-75 m megnövelt úthosszú kapillárisok (Agilent), minimális csúcsdiszperzió buborékcella 3-5 érzékenység Z-cella 8 - érzékenység képek forrása: Agilent CE brosúrák

14 7. A CE nagy felbontása nagy hatékonyságán alapul Ürescső CE (Free Solution CE, pen Tubular CE) esetén a van Deemter egyenletben: B HETP= A C u u A=0 mert nincs töltet, amelyben többféle útvonalon (multiple path) vándorolna az elválasztandó komponens C=0 mert nincs állófázis, amelybe fázistranszfer történhetne B>0 elvileg a hosszirányú (longitudinális) diffúzió a csúcsszélesedés (diszperzió) egyetlen forrása az EF éles, dugószerű profilja is alig szélesíti a csúcsokat σ tot a gyakorlatban számos tényező ronthatja a hatékonyságot: σ tot =σ long.diff σ inj σ temp σ wall-ads σ det σ EMD... EMD: electromigration dispersion (puffer ko-ion vezetőképessége...) 8. detektorjel Az elválasztás analitikai paraméterei σ w1/ wa wb ta tb w 4 a (Gauss) csúcs std.deviációja: σ= longitudinális diffúzió dominál: σ tot σ long. diff = Dt=D elméleti tányérszám: felbontás: N= Rs= L eff σ tot = idő Leff Ltot ( μ eo μ )U ( μ μ eo )ULeff t =5. 54 DL tot w1 / ( t B t A ) Δμ N Δμ = w A wb 4 ( μ μeo ) μ μ eo > 5 is lehet!

15 9. A ph-függő átlagos töltés kiszámítása (disszociáció) I. Q 0 Q zha xha z A xa -0, -0,4 pka -0,6 Q -0,8 0 pk a ph 1 pk a ph ph Ka [ A ][H ] [ HA] xa [A ] 1 [HA] [ A ] 1 pk ph 1 HA móltört 0,8 0,6 A CH pka 0,4 0, xha [HA] pk ph [HA] [ A ] 1 pk ph ph Gyenge savak vagy bázisok elválasztása CZE-vel a gyógyszermolekulák legalább 80%-ában van ionizálható funkciós csoport => megfelelő ph-jú pufferben disszociált, ionos állapotba kell hozni őket! gyenge bázisok elválasztásakor savas pufferben kapunk kationokat: pl mm foszfát alapú puffer, ph -3 gyenge savak elválasztására lúgos puffert érdemes választani: pl. 15 mm NaB47 * H, ph 9- dinamikus komplexképzés vicinális diolokkal, pl. szénhidrátokkal: ha a disszociált ionok töltésszáma azonos is, különböző méretük alapján mozgékonyságuk (töltés / méret) különböző, így elválaszhatók CZE-vel...

16 Karbonsav izotopológok elválasztása Q 0 CH pka 4, ,5 pka 4,199 CH r = Ka / Ka = 1,0 Q ( r 1)[ H ]K a1/ Q ([ H ] K a )3 / Rs -1,7 3,7 4,7 5,7 ph ph(optimum) = pka log = 3,90 Rs maximuma: puffer: 50 mm acetát, 0,1% Hidroxipropilcellulóz (EF elnyomás), elfo 40 kv 87% 0 cm 115 cm 6,0 A det: 67% Leff 50 cm Ltot 75 cm i,5 A 91% 150 cm 165 cm 4, A 50 m ID FS kapillárisok Leff Ltot Rs S Terabe, et al., Anal. Chem. 1988, 66, Q A ph-függő átlagos töltés kiszámítása (disszociáció) II. 1,0 pk1 0,5 0,0 pi izoelektromos pont NH3-0,5 C pk H -1,0 pk3-1,5 H -, ph 1,0 móltört 0,8 0,6 pk1 pk pk3 0,4 0, 0, ph

17 33. Effektív mozgékonyságra (töltés/méret arányra) vonatkozó néhány félempirikus modell Adott vegyületcsaládra, adott körülmények (puffer, hőmérséklet) között érvényesek! fford: peptidek papír-zónaelektroforézissel mért mozgékonyságai alapján - a hidratált peptidek modellje: azonos sűrűségű merev gömbök - a súrlódási ellenállás a molekula kör keresztmetszetével arányos V Q M 4 3 /3 R R M 1/ 3 A R M becsült k1 / 3 3 M becsült k Compton: becsült k Cifuentes, Poppe: k M 1/ 3 Q k3 M / 3 ln(1 kq ) M 0, 411 Review: S Mittelmayr, A Guttman, Trends Anal Chem 008, 7, Miller (gyógyszermolekulákra, egyéb aromás szerves ionokra) anionok: becsült 0,1853 Q kationok: n 0, 49 becsült 0,3888 Q M 0,633 J M Miller, et al. Electrophoresis 00, 3, Az optimális puffer ph megválasztása a pka ismeretében H3N pka HS H becsült /M μapp =Q 1,94 8,60,8 Cys 0,0 0 4,19 BzH -0,0 S μ becsült PTS eff, MES -0,04 H H3C fford-képlet a mozgékonyság becslésére 0,04 H / 3 <0 H NH -0,06-0, Elektromigrációs diszperzió EMD!! ph PTS Cys 15 mm HCl BzH PTS Cys ph 8,3 puffer: 40 mm TRIS és 15 mm sav 15 mm MES S N H 11 μ becsült eff, Cl BzH 1 H H

18 35. Elektromigrációs diszperzió (EMD) mintazóna a puffernél: jobban vezet azonos vezetőképességű kisebb vezetőkép. térerősség a mintadugóban katód(-) detektor fronting tailing koncentr.profil a mintadugóban (elektroferogramon ellentétes irányú torzulás) kapilláris EF injektálás idő az elektroferogramon A puffer ko-ionjának effektív mozgékonysága közelítse a mérendő ionokét, különben azok csúcsalakja háromszög alakú torzulást szenved (minél jobban összemérhető a minta koncentrációja a pufferével, annál inkább jelentkezik ez a torzítás) A CE-ben leggyakrabban használt pufferkomponensek N H H NH -Ala:,4 H CHES: 9,55 TRIS: 8,08 HN H3B3: 9,3 NH4: 9,5 HP4-: 7,1 MES: 6, -Ala: 3,43 H3P4:,16 Ecetsav: 4,76 pka HEPES: 7, S H NH H H S N NH - S - Good típusú (biológiai) pufferek: kisebb vezetőképesség, de UV-elnyelés nm-ig! ph

19 37. Fémionok elválasztása (CZE, indirekt detektálás) K Na Cd Li PbLa3 Sr Ca Mn CoZn Pr3 Gd3 3 Ba Mg Ni Ho3 Sm Nd3 Lu3... Yb3 Tm3 BGE: 15 mm tejsav 8 mm 4-metilbenzilamin ph 4,5 5% metanol Y Shi, JS Fritz, J Chromatogr. 1993, 640, Mozgékony anionok elválasztása, az EF szerepe bemeneti puffer (inlet) anód e tot kimeneti puffer (outlet) katód EF injektálás helye detektor szokásos polaritás: a kapillárisfal negatív töltésű (disszociált SiH-csoportok), az elektroozmózist (EF) pozitív ionok hajtják (katódos EF) EF sebessége (mozgékonysága, ): v EF =μef E> 0 anion saját (elektroforetikus) sebessége: v e= μe E<0 anion bruttó sebessége: v tot =v EF v e =( μef μe ) E probléma kisméretű, mozgékony anionoknál ha e EF az anion nem a detektor felé vándorol, nem is halad át a detektoron! μ >μ grafika: HP CE Partner

20 39. Mozgékony anionok elválasztása, az EF megfordítása bemeneti puffer (inlet) anód e tot kimeneti puffer (outlet) katód EF injektálás helye detektor a megoldás: az EF-et el kell nyomni (kapillárisfal borítása, coating) és polaritáscsere bemeneti puffer (inlet) katód kimeneti puffer (outlet) anód eff tot injektálás helye detektor vagy az EF-et meg kell fordítani (kapillárisfal borítása kationos tenziddel, CMC alatt!), ekkor az EF és az anion sebessége összeadódik, így az anion áthalad a detektoron: bemeneti puffer (inlet) katód eff EF injektálás helye grafika: HP CE Partner tot detektor kimeneti puffer (outlet) anód 40. Foszfonát hatóanyagok CZE gyors elválasztása indirekt UV detektálással BGE: 30 mm benzoesav 5 mm szalicilsav (TRIS ph 3,8 beállításához) (állandó UV háttérelnyelés ph puffer) 0,5 mm cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB, az EF megfordítására) - H3C Br H3C N CH3 CH3-30 kv, 30 C, indirekt UV 0 nm B Prutthiwanasan, L Suntornsuk J Sep Sci 0, 33, 8-34.

21 41. Induktív csatolású plazma ICP-MS és csatolása CE-hez ICP: atmoszférikus nyomású argon plazma ( K) a bevezetett mintát elpárologtatja, atomizálja és ionizálja ICP-MS: ionoptika vezeti át az ionokat a tömegspektrométerben nagyvákuumába előnye: alkalmas több elem egyidejű mérésére, széles linearitási tartományban egy lehetséges csatolás (interfész) kapilláris elektroforézishez: 4. Citosztatikum célbajuttató rendszer: PEGilált liposzóma TTTN Nguyen, J stergaard, S Stürup, B Gammelgaard, Anal Bioanal Chem 01, 40,

22 43. xaliplatin mérése liposzómás formulációból CZE-ICP-MS-sel kapilláris: 50 cm, 50 um ID BGE: mm HEPES (ph 7,5), 5 mm NaCl, 1 mm SDS minta: liposzóma törzsoldat hígítva BGE-vel: 4 mg/ml liposzóma, 1,3 mg/ml oxaliplatin hidrodin. inj. után 30 kv elfo, 5 ºC 1-jódbután: EF marker 50 ug/l In a make-up oldatba (porlasztási fluktuációk miatti intenzitásváltozások korrigálására) oxaliplatinra LD: 59 ng/ml TTTN Nguyen, J stergaard, S Stürup, B Gammelgaard, Anal Bioanal Chem 01, 40, Hatóanyag felszabadulás in vitro monitorozása (CZE-ICP-MS) liposzómák szonikálása: kb. 89% oxaliplatin szabadul fel ( perc alatt), utána sem több szabad oxaliplatin oxaliplatin bomlásterméke liposzómák inkubálása: mm HEPES pufferben (ph 7,5), 41 ºC-on, foszfolipáz A enzim (3,5 um) jelenlétében (5 mm CaCl aktiválja) és anélkül TTTN Nguyen, J stergaard, S Stürup, B Gammelgaard, Anal Bioanal Chem 01, 40,

23 45. Enzimek CZE elválasztása borított falú kapillárisban bare (uncoated) fused silica = borítatlan falú szilika kapillárisban: borított falú kapillárisban: dinamikus: ikerionos puffer H-alkil-cellulóz... statikus: atenolol Nemvizes kapilláris elektroforézis (NACE): -blokkolók elválasztása metanolban metabolitja 46. teflon 0,5 ml szűrt humán vizeletminta, SPE (asis HLB) dúsítás, BGE: 40 mm AcH/NaAc (pk 9,7); ph 8,9 MeH lemosás, bepárlás 58,5 (Ld=50) cm FS kapilláris (50 m) std.minta: g/ml -blokkolók MeH-ban minta: 0,5 ml metanolban elfo: 30 kv ( A), UV detektálás 00 nm spike: 0 g/ml atenolol standard H Sirén, R Kuldvee, T Karla, T Ekström, ML Riekkola, J Chromat A 005, 68,

24 47. Minta injektálása hígított pufferből (sample stacking) pufferrel készült minta hígított pufferrel készült minta U U minta detektor E ki minta detektor ki E komponensek feldúsulnak a mintadugó határán! R ellenállású oldaton eső feszültség (i = const., hm-törvény): U R i térerősség (V/cm): 48. E du dx a mintadugóban nagyobb az ellenállás nagyobb feszültség és térerősség nagyobb sebességre gyorsul v E a mintakomponensek felhalmozódnak a zóna elején (stacking), önélesítő hatás A sample stacking zónaélesítő hatása inj.minta foszfáttartalma: 5 mm 15 mm mm 5 mm kísérleti elektroferogramok egy pozitív töltésű peptid dúsítására BGE: 30 mm nátrium-foszfát, ph 7.0 akár 00 dúsítás is elérhető (Zhang, et al. Anal. Chem. 1996, 68, 53-53)

25 49. Imatinib koncentrálása (hosszú inj. sample stacking) CZE előtt (5) cm FS kapilláris (50 μm) Érzékenységnövelés eszközei: BGE: mm NaHP4 (ph,0) 5 mm HP-β-CD Field Amplified Sample Stacking: a törzsoldatokat nem hígított pufferrel, hanem 0,5 mm-os sósavas metanollal híg. 1 mg-os minta törzsoldatok: metanol/0,1 M HCl (6/4)-ban Nagytérfogatú elektrokinetikus inj.: 15 kv x 60 sec elfo: 0 kv ( μa), UV 67 nm linearitás: 5-50 ng / ml J Li, Y Huang, L Huang, L Ye, Z Zhou, G Xiang, L Xu, J Pharm Biomed Anal 01, 70, inj.molekulák száma: LIF: meg lehet-e pillantani egyedi molekulákat? 15 B-fikoeritrin: fluoreszcens festék 30 -mw zöld 543,5 nm HeNe lézer fénye mikroszkóppal 30 m foltra fókuszálva 0 m-re a kapilláris kimeneti végétől, 60 mikroszkóp-objektív gyűjti a fluoreszcens jelet 300 egyre hígabb festékoldatok EK injektálása: 1 kv, 5 sec kb. 000 molekula alatt a csúcs migrációs ideje, félértékszélessége elmosódottá válik sztochasztikus fluktuációk, molecular shot noise az analitikai kémiai detektálás végső határa (50 zmol) DY Chen, NJ Dovichi, Anal. Chem. 1996, 68,

26 51. CZE összefoglalás: a futtatópuffer (BGE) szerepe Megfelelő pufferkapacitás (> mm / ph) biztosítása: pka 1,5 < ph < pka 1,5 megfelelő koncentráció Koncentráció (tipikusan 5-50 mm): megfelelő vezetőképesség (az áramvezetés a BGE feladata!), de még nem túl nagy Joule-hő ionerősség: -50 mm forrás: Gerd Vanhoenacker, Direkt UV detektálás esetén a puffer lehetőleg ne abszorbeáljon (akár 190- nm!) Indirekt UV detektálás esetén abszorbeáló komponens is kell CE-MS esetén illékony puffer kell (ecetsav, hangyasav, ammóniumsók...) Szelektivitás növelése: EF elnyomás: szerves módosító (oldószer: MeH, ACN, iprh...) szelektív komplexképző királis szelektor... hidrofil polimer (pl. hidroxietil-cellulóz) vagy kationos tenzid (konc.<cmc) 0,05% polivinil-alkohol: viszkozitást növeli Kapilláris izotachoforézis Capillary Isotachophoresis (CITP) Kationok vagy anionok elválasztása effektív mozgékonyságuk különbsége alapján (semleges molekulák elválasztására nem alkalmas) azonos sebességgel haladó zónák, ITP-vonat

27 53. A kapilláris izotachoforézis (CITP) elve I. a be- és kimeneti puffer más összetételű! az áram bekapcsolásának pillanatában: ABC BAC CAB T egy későbbi időpillanatban: B T C B A BA C BA L minta detektor ki E E L: vezető ion (leading ion) minta detektor ki feltétel a mozgékonyságokra: T C B A L A, B, C: elválasztandó komponensek emiatt a zónák ellenállása: T: záró ion (terminating ion) 54. L RT RC RB RA RL A kapilláris izotachoforézis (CITP) elve II. a be- és kimeneti puffer más összetételű! az áram bekapcsolásának pillanatában: T ABC BAC CAB minta E egy még későbbi időpillanatban: T L detektor ki minta C B A C B A C B A L detektor E azonos sebességgel haladó zónák: v T ET C EC... L EL zónaélesítő hatás a mozgó határfelületnél (moving boundary) ki

28 55. A kapilláris izotachoforézis (CITP) gyakorlata (193. J. Kendall: ritkaföldfémionok és savanionok elválasztása) Kezdetben m Teflon kapillárisokban kapillárisban: Everaerts, majd Bocek, Prusik, Kasicka makroméretű ITP: LKB Tachophor, Shimadzu IP-1B, Spisska Nova Ves EF-et előnyös visszaszorítani (antikonvektív közeg), pl. 0.1% hidroxipropilcellulóz pufferrendszer (L, T) választása (ph, koncentráció, adalék, pl. Brij35) kationos ITP anionos ITP leading ion (L) K, NH4, Na pl. Cl terminating ion (T) H (gyenge savból!) pl. 4-nitrofenolát, MES, H ellenion pl. acetát, MES, pl. -alanin, His, kreatinin,... ph olyan, hogy a mintakomponseknek legyen töltése gyakran állandó áramerősséggel végezzük az analízist detektálás: kvantitatív munkához a zóna elejét és végét detektálni kell konduktivitás, UV, MS, NMR! alkalmazások - kis ionerősségű, híg minták koncentrálása (több 0 nl injektálható) - akár 0 koncentrálás is elérhető (ITP előkoncentrálás után CZE elválasztás) - nagy csúcskapacitás, mikropreparatív eljárások 56. Kationos CITP: ritkaföldfém-ionok elválasztása HIBA: -hidroxiizovajsav leading kation: ammónium Terminating: H (karnitin) - H3C CH3 N i = 40 A = const. H univerzális detektálás: a zónák vezetőképesség-arányát méri RE E x L L EL X x E : térerősség az adott zónában : adott zóna fajlagos vezetése : adott zónát alkotó ion (effektív) mozgékonysága Q. Mao, T. Hirokawa, et al. J. Chromatogr. A 80 (1998) 03- CH3

29 57. Fluorokinolonok (SPE) ITP-CZE-UV analízise sertés plazmamintákból L: mm NaHP4, 5 mm NaCl, ph 9,0 30% hosszú mintadugó hidrodin. injektálása EF - kv, 50 mbar (1 min) T: mm NH-CH-CH-C- Na, ph 9,0 ITP alatt L-nél gyorsabb és T-nél lassabb ionok (semlegesek és kationok is) elhagyják a kapillárist, a biológiai mátrix zavarása csökken! - kv (3 min) L választása CZE futtatópuffernek előnyös kritikus a CZE-re átkapcsolás időzítése! amikor az áram 90% a tiszta L kapillárishoz képest EF 15 kv CZE, 8 mg/l ITP-CZE, 0, mg/l ciprofloxacin, enrofloxacin és flumequine linearitás: 0,1-1,5 mg/l, LD 0,05 mg/l csúcsterület: 0,6-,9 RSD% belső standard: lomefloxacin visszanyerések: >90% ITP: 40x koncentrálás M Hernández, C Aguilar, F Borrull, M Calull J Chomat B 00, 77,