III. Biopolimerek és fragmenseik elválasztása

Átírás

1 Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészi Kémiai Intézet Műszeres gyógyszeranalízis speciálkollégium (2012) Kapilláris elektroforézis a gyógyszeranalízisben II. dr. Szakács Zoltán Richter Gedeon Nyrt. Fizikai-kémiai alapok, a CE berendezés felépítése Ionok elválasztására alkalmas CE módszerek Biopolimerek és fragmenseik elválasztására alkalmas technikák Semleges molekulák elválasztására is alkalmas technikák Királis analízis kapilláris elektroforézissel Kapilláris elektroforézis a gyógyszerkönyvben III. Biopolimerek és fragmenseik elválasztása

2 3. Kapilláris izoelektromos fókuszálás Capillary Isoelectric focusing (CIEF) Makromolekulák (fehérjék, huminsavak...) elválasztása izoelektromos pontjuk (pi) szerint (S. jertén, 1985) Q 1 0,5 pi 0-0,5-1 -1, p 4. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve I. Amfolit: több, különböző pk-jú csoportot tartalmazó molekula ( ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) p A B C C A C A B borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) Na kapilláris az EF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kv): p-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás anód(+) 3P p

3 5. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve I. Amfolit: több, különböző pk-jú csoportot tartalmazó molekula ( ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) p borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) Na kapilláris az EF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kv): p-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás anód(+) 3P4 A 4 3 B C p 8 kialakul a p-gradiens ( steady state ), az áram minimális értékre csökken, a mintakomponensek izoelektromos pontjuk (pi) szerint fókuszálódnak 6. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve II. 3. A p-gradiens katódos mobilizálása: a fókuszált mintazónák áthajtása a detektoron A anód(+) 3P4 4 3 A B B 5 C p 6 katód(-) 3P4+NaCl C p 3 elektroforetikus mobilizálás: pl. katód-elektrolitot ellentétes p-jú pufferre cseréljük [ ]+ c N + =[ ]+ c C [ ]+ c N + =[ ]+ c C +c 3 Cl

4 7. emoglobin-rendellenességek klinikai szűrése 25 m id borított kapilláris 2% amfolitkev. p 3-10 fókuszálás 10 kv, 5 min mobilizálás 10 kv A0: normál humán b C, G, G2: mutáns hemoglobinok Kapilláris gélelektroforézis Capillary Gel Electrophoresis (CGE) Nagymolekulák (biopolimerek) méret szerinti elválasztása Fehérjék analízise: pl. SDS-PA-CGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél gélelektroforézis) ligonukleotidok, DNS: pl. agaróz gélen és lineáris poliakrilamidon

5 9. Kapilláris gélelektroforézis (CGE) Gél töltet a kapillárisban kusza, térhálós szerkezet, pórusokkal - kis méretű ionok (pl. pufferalkotók) zavartalanul átmennek a pórusokon - nagyobb ionok hidrodinamikai sugara összemérhető a pórusok méretével: a pórusok molekulaszűrőként viselkednek (gston-modell) méret szerinti elválasztás (oligonukleotidok) - nagyobb biopolimerek (denaturált DNS vagy fehérje) kígyózó, hüllőszerű mozgással (reptation) préselik át magukat a pórusokon méret (molekulatömeg) szerinti elválasztás - gél: antikonvektív közeg (diffúzió lecsökken) - kapillárisfal borítása (coating) EF is minimális kémiai gélek (térhálós polimerek, kémiai keresztkötésekkel, cross-links) - bele vannak polimerizálva a kapillárisba, jól definiált méretű pórusok - hőérzékeny, buborékképződés veszélye! pl. térhálósított poliakrilamid fizikai gélek (lineáris polimerek hálózata, polymer networks) - kisebb viszkozitás, bepumpálható a kapillárisba, majd eltávolítható, megújítható - pórusméret változtatható pl. a hőmérséklettel, nem hőérzékeny pl. lineáris poliakrilamid, alkilezett cellulóz, agarózgél, dextrán, polietilén-oxid, PEG 10. Kémiai gél: poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE) 2C C 2C C N2 AA (akrilamid) C C N 2C C C BIS Gél összetételének jellemzése (AA = akrilamid) T% = (AA + bis) / 100 teljes gélképző anyag tömeg%-a, 3-10 % C% = bis / (AA + bis) 100% bifunkciós akrilamid %-a, 0-5 % C% határozza meg a térhálósodás fokát, a gél keménységét C% = 0 fizikai, lineáris gél (kapillárisba pumpálható, megújítható) gyakori az elektrokinetikus injektálás kereskedelemben kapható kész, géllel töltött kapillárisok: Beckman, ABI, Bio-Rad, J&W, Supelco,... ligonukleotidok, DNS szakaszok szekvenálása: PAGE kétszálú DNS (dsdna) denaturálása: 7 M karbamid vagy formamid, hő, g-vegy. töltés/méret arány azonos, elválasztás méret szerint! nagyobb DNS-re jobb a lineáris poliakrilamid-gél vagy agarózgél (nagyobb pórusok) Fehérjék, glikoproteinek elválasztása: SDS-PAGE a (globuláris) fehérjéket denaturálni kell pl. a következő anyagokkal: nátrium-dodecil-szulfát (SDS): be is burkolja a fehérjét, mozgékonys. arányos log Mt béta-merkaptoetanol, DTT = ditiotreitol (diszulfidhidak hasítása)

6 11. umán fehérjék méret szerinti elválasztása: SDS-PAGE (A) cerebrospinális folyadék minta (B) szérumminta minta + puffer, hevítés (feh. denatur.) 120 mm Tris, p 6.6, 1% SDS, merkaptoetanol lineáris PAG kapilláris, inj. 3.4 kpa 60 sec elfo 14 kv, UV detektálás 254 nm marker fehérjék (ismert Mt): Ferguson plot G: range G (front marker, elsőként jut át) a: transthyretin c: -trace protein Alb: albumin f: 2-makroglobulin 12. b: IgG könnyű lánc d: IgG nehéz lánc e: transzferrin A. iraoka et al. J. Chromatogr. A 895 (2000) A uman Genome projekt Smith, ood: automata szekvenátor (nem kapilláris PAGE, de fluoreszc.) indul a uman Genome Project (US kormány, 3 milliárd USD) az emberi genom szekvenálása: gén, 3 billió bázispár (bp) International uman Genome Sequencing Consortium alakul 150 M$ / év (fő szponzorok: NI, Wellcome Foundation, Department of Energy) Celera Genomics (C.Venter): privát cégek is bekapcsolódtak kompetitorként Zagurski, McCormick: első Capillary Array Electrophoresis berendezés az előző ábrákon bemutatott hatékony detektálási technika (Applied Biosystem licensze: 3700 DNA Sequencer, 96 kapillárissal) első összegző publikációk (Nature, Science) a szekvenálási sebesség 10x növekedése az automatizált géllap-elfohoz képest a CAE-nek nagy szerepe volt abban, hogy a teljes emberi genom szekvenálása a tervezett helyett április 14-én elkészült! Single Nucleotide Polymorphism (SNP-k) teljes feltérképezése

7 Capillary Array Electrophoresis készülék: 384-mintás szekvenáló mikroelektroforetikus chip injektálás a kerületen, elfo során befelé haladnak a fragmensek forgó konfokális fluoreszcens szkenner detektálja a csúcsokat Dovichi, Zhang, Angew. Chem. 112 (2000)

8 IV. Semleges molekulák elválasztására is alkalmas CE technikák Micelláris elektrokinetikus kromatográfia Micellar Elektrokinetic Chromatography (MEKC) Micellar Elektrokinetic Capillary Chromatography (MECC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő micella / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján Ionok esetén vegyes mechanizmus, mozgékonyság szerinti is történik elválasztás (Terabe, 1984)

9 17. Micelláris elektrokinetikai kromatográfia (MEKC, MECC) 1 k' μ ep + μ 1+k ' 1+k ' mc ez a tag csak ionokra! elválasztás: injektálás: k : kapacitás faktor (micella oldatfázis megoszlás) detektor μ tot =μeo + EF teo detektorjel MEKC elúciós ablak tmc MEKC retenciós idő 18. Retenciós indexek a hidrofobicitás jellemzésére teo MEKC elúciós ablak tm tmc MEKC kapacitás faktor (Terabe, 1984) ionokra (Vindevogel, Sandra, 1990) tm teo n szolubilizált teo.(1 tm / tmc ) nvízben V k ' Pm/w víz Pm/w Vmono/mic ( ctenzid CMC ) Vmicella k' Normált retenciós faktor k" k' tm tion tion.(1 tm / tmc ) fázistartózkodási idők (taq, tmic) micelláris megoszlás: tm teo (0 < k < 1) tm taq tmic teo (1 k " ) tmck " tmc teo Idei M, Győrffy E, Kiss E, Őrfi L, et al. Electrophoresis 1999, 20, Dobos Zs, Kiss E, allgas B, Kéri Gy, Idei M Electrophoresis 2005, 26, tprop,mic = t mic tm

10 A MEKC-ben leggyakrabban anionos tenzidek 19. tenzid CMC [mm] aggr. szám anionos: Na dodecil-szulfát, SDS: C3(C2)11S3 8,2 62 nátrium tetradecil-szulfát 2,1 62 N-lauroil-N-metil- -alaninát (ALE) 9,8 lítium-perfluorooktánszulfonát (LIPFS) 6,7 epesavsók: R1 nátrium-kolát (SC) R2 20. R C2C2C -dezoxikolát (SDC) -taurokolát (TC) -taurodezoxikolát R3 C2C2C C2C2CNC2C2S3 C2C2CNC2C2S A MEKC-ben gyakran használt egyéb pszeudofázisok tenzid CMC [mm] aggr. szám kationos: dodecil-trimetil-ammónium-bromid (DTAB) nemionos: tetradecil-trimetil-ammónium-bromid (TTAB) 3,6 hexadecil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB) ,1 40 polioxoetilén(23)-dodecil éter (Brij 35) polioxoetilén(20)-szorbinát monooleát (Tween 80) 0,01 polioxoetilén(20)-szorbinát monolaurát (Tween 20) 0,059 oktilglükozid dodecil- -D-maltozid 0,16 TRITN X-100 0,24 140

11 21. Gyakran használt micella-markerek teljesen szolubilizált festékmolekula a micellákkal együtt vándorol tmc meghatározása 22. A felbontás optimálásának lehetőségei 1 t eo /t mc N α 1 k ' R s= 4 α 1+k ' 1 (t eo /t mc )k ' ha tmc, szelektivitás: α= k'1 k'2 1 visszakapjuk a PLC-re érvényes felbontás képletét ptimálási lehetőségek: Micellák típusa és koncentrációja (MEKC elúciós ablak) Puffer típusa, koncentrációja és p-ja Szerves módosító használata (Me, ACN, ipr) Vegyes micellák használata Micellák + királis szelektorok (ciklodextrinek) használata Kapillárisfal borítása, más hőmérséklet vagy feszültség használata

12 23. Anabolikus szteroidok MEKC elválasztása 3C C3 1 5 C3 3 6 C 3 C3 3 C 7 C3 C3 C3 C 3 C3 C 3 C3 2 C3 C3 50 m ID kapilláris, 65 (50) cm BGE: 60 mm borát, 30 mm foszforsav, 20 mm SDS, 10% 1-propanol referencia minta: 50 g ml-1 (0,2 mm) szteroid BGE-ben EK injektálás 11 kv, 4 s elfo: +27 kv, 25 C, UV detektálás 245 nm WC Lin, CC Sue, C Kuei, Chromatographia 1999, 49, Doxorubicin + metabolitjai egyetlen sejtből: MEKC + LIF A: egyetlen sejtből, B: sejtszuszpenzió extraktumból NS-1 sejtek inkubációja: 25 M DX, 8 h, majd mosás EPES/mannitol pufferrel 20 m ID 39,5 cm kapillárisba mikroszkóp alatt az 5 ml sejtszuszpenzióból egyetlen sejtet felszippantunk (gravitációs injektálás, 114 cm, 1 sec, <0,1 nl), pufferben sejt lízis 30 BGE: 10 mm borát, 10 mm SDS (p 9,3) elfo: 400 V cm-1, detektálás: LIF Ar-ion lézer 488 nm gerj, 635 ± 28 nm bandpass detektálás DX kalibráció: 0,1 10 nm lineáris, LD: 61 ± 13 zmol (36600 molekula) átlagosan 9,5 fmol DX / sejt, metabolit: 0,03-1 amol/sejt (<0,1%: lassú metabol. vagy efflux?) AB Anderson, J Gergen, EA Arriaga, J Chromatogr. B 2002, 769,

13 Mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfia (MEEKC) (Watarai, 1991) Semleges molekulák (ionok) elválasztása eltérő olaj / víz megoszlásuk (+ionmozgékonyságuk )alapján oktán vízben + SDS: tejszerű emulzió tenzidbevonata van a cseppeknek (10 um) + egyenesláncú alkohol (co-surfactant): feltisztul!! átlátszó, TD stabil, olaj a vízben mikroemulzió határfelületi feszültség közel zérus, viszkozitása alig nagyobb egy vizes pufferénál mintaelőkészítési előny: krémek, olajok közvetlen szolubilizálása a tenzid határozza meg a csepp töltését, hangolható (kationos, ikerionos is van) pozitív analitokkal a megoszlás mellett felületi ionpárképzés is lehetséges flexibilisebb (?) a MEKC-nél, szélesebb lipofilitás-tartományban használható, hatékonyabb fázistranszfer, nagyobb elúciós ablak (pl. oktanofenon a marker) 26. Fólsav validált MEEKC mérése vitamintablettában fólsav (B11 vitamin) belső standard: niacin (B3 vitamin) mikroemulzió: 0,5% etilacetát; 0,6% SDS; 1,2% butanol; 15% 2-propanol; 82,7% 10 mm borátpuffer (p 9,2) kalibr. görbe fólsavra: ug/ml, LQ 9 ug/ml, LD 3 ug/ml 20 tabletta porítása, bemérése, jelre töltése a B3 törzsoldattal, szonikálás, szűrés alikvot további 10x hígítása a B3 törzsoldattal, szonikálás hidr.injektálás 40,2 (30) cm 75 um ID kapillárisba, +28 kv, 25 C, UV det. 214 nm MS Aurora-Prado, CA Silva, MFM Tavares, KD Altria, J Chromat A 2004, 1051,

14 Kapilláris elektrokromatográfia Capillary Elektrochromatography (CEC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő állófázis / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján (mint az RP-PLC-ben) Ionok esetén vegyes mechanizmus, mert mozgékonyság szerinti elválasztás is történik ( PLC + CZE ) Jorgenson, Lukacs: 10 m DS fázis 170 m kapillárisban Tsuda: coated open tubular cap Knox, Grant: CEC gyakorlati megvalósítása Smith, Evans: gyógyszermolekulák CEC elválasztása (DS tölteten) 28. Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) PLC hatékonyságának növelése: részecskeméret csökkentése m alá egyre nagyobb oszlopellenállás, egyre nagyobb nyomás kell! hidraulikus áramlási profil: parabolikus, csúcsdiszperzióhoz vezet nyomás helyett EF hajtsa a folyadékot: - elérhető a PLC-ben megszokott sebesség (0.5-3 mm/s) - dugószerű áramlási profil: nagyobb hatékonyság - részecskeméret elvileg m alá is csökkenthető Elválasztás elve: semleges molekulák álló/mozgófázis közti megoszlása Az EF szerepe a töltet részecskéinek felületén is kialakul elektromos kettősréteg elég közeli részecskék kettősrétegei átfednek, EF megszűnhet! Stern-Gouy-Chapman modell: egyre kisebb részecskék esetén egyre nagyobb pufferkoncentráció kell (10 mm-ig), hogy vékonyabb kettősréteg legyen, az elmélet szerint 0,4 um-ig le lehet menni a részecskeátmérővel pressurized CEC (pcec) = PEC (pszeudo-elektrokromatográfia): EF mellett nyomáskülönbség (pumpa) is hajtja az eluenst (inletben p) (Verheij, ugener; Tsuda, 1987)

15 29. CEC oszlop készítése a részecskék felületén is kialakul elektromos kettősréteg töltöttek frit kell a kapilláris végére a töltet kiáramlásának megakadályozására: - szilikakapilláris végének szinterelésével (huzalon áramot átvezetve, 450 C) - kálium-szilikát és formamid in situ polimerizálása - a töltet anyagának szinterelésével oszlop töltése állófázissal: - zagy (slurry) : állófázis szuszpendálva a mozgófázisban, kapillárisba töltés, majd a mozgófázis kimosása vízzel mm vastag kapillárist száraz állófázissal töltenek, majd géppel kihúzzák - szilikagél töltött, elektrokinetikusan be lehet vinni - újabban: monolith column (continuous bed column) kémiailag belepolimerizálják az állófázist, nem kell frit (kb től) buborékképződés megakadályozása: kis túlnyomás a pufferedényekben grafika: P CE Partner 30. asznált állófázisok C18 oktadecilszilán (DS), 3 m - erősen bázisos anyagok esetén szilika hatás - mixed-mode: pl. C6/SCX (kationcserélő szulfonátcsoport ugyanazon a szemcsén) szilikafalhoz kémiailag kötött C8 szilikafalhoz kémiailag kötött alfa-savas glikoprotein (AGP) királis elválasztásra Mozgófázis választása adott p-jú puffer víz/acetonitril (vagy víz/metanol) oldószerelegyben %ACN-el nő (!) az EF ikerionos (Good-típusú) puffer előnyös 1-5 mm (hő- és buborékfejlődés kivédésére) pl. 5 mm SDS: ionpárképző és hatékony buborék-gátló (fel.fesz. csökken a szilárd/folyadék fázishatáron)

16 31. Gyógyszeralapanyag (API) gyártási példa: Ibuprofen szennyezésprofilja pcec-val fused silica kapilláris (33 cm, 24.5 cm, i.d. 100 um), töltet: Lichrosphre 100 RP-18 (5 um) mobil fázis: 10 : 40 : 50 arányban: mm hangyasav/ammónia, p 2,5 - víz - acetonitril 0,5 mg/ml metanolos minta, injektálás 12 bar 24 sec elektrokromatográfia: 25 kv és 12 bar lineáris tartomány: 0,05-0,15 mg/ml, 1% szennyezők kvantitatív mérése Quaglia, et al. Il Farmaco 55 (2003) V. Királis analízis kapilláris elektroforézissel

17 33. Királis elválasztások alapfogalmak Kiralitás (IUPAC): egy merev objektumnak az a geometriai tulajdonsága, hogy tükörképével nem hozható fedésbe. Míg diasztereomerek kromatográfiás vagy migrációs tulajdonságai (elvileg) különbözőek, az R/S enantiomereké akirális környezetben azonosak. Indirekt királis elválasztás: elválasztás előtti származékképzés királis reagenssel (C) diasztereomer-képzés R + C R C S + C S C Direkt királis elválasztás: egy királis szelektorral diasztereomer-komplex dinamikus (tranziens) képződése az elválasztás során R + C R C S + C S C [ R ] [S] ee 100% Enantiomer felesleg: [R ] [S] [R] AR A 100% 100% R 100% Enantiomer szennyezés: eir [ R ] [S] AR AS AS A királis kapilláris elektroforézis alapjai 34. hárompontos illeszkedés, enantiomerek szupramolekuláris felismerése Gassman, et al. (1985) alkalmazta először A legtöbb CE módban megvalósítható a királis elválasztás: CZE, ITP, MEKC: pszeudofázis a futtatópufferben oldjuk fel a királis szelektort kapilláris elektrokinetikai kromatográfia (Terabe) előnyök ( PLC): anyagtakarékos, flexibilis, gyorsabb módszerfejlesztés hátrányok: preparatív királis elválasztás nehézkes semleges királis szelektor (CZE, ITP) töltött királis szelektor: kapilláris elektrokinetikai kromatográfia, EKC (Terabe) királis micellák: királis MEKC CGE: gélbe belekevert / belepolimerizált királis szelektor CEC: állófázisba belekevert / belepolimerizált királis szelektor

18 35. Királis szelektorok és elválasztható vegyületcsaládok I. királis szelektor enantiomerelválasztást mutató vegyületcsalád natív ciklodextrinek: -CD alig szubsztituált aromás gyűrű -CD diszubsztituált aromás gyűrű -CD többszörösen szubsztituált / anellált aromás gyűrű(k) semleges, DM- -CD a -CD-nél általánosabban használható módosított TM- -CD a -CD-nél általánosabban használható ciklodextrinek: P- -CD aromás gyűrű és hidroxilcsoport a királis szénatomon anionos CD-származékok: CM- -CD, S- -CD, SBE- CD semleges vagy kationos vegyületek (aromás gyűrű!) kationos CD-származékok: QA- -CD semleges vagy anionos vegyületek M Blanco, I Valverde, Trends Anal. Chem. 2003, 22, Királis szelektorok és jellemző vegyületcsaládok II. királis szelektor enantiomerelválasztást mutató vegyületcsalád királis koronaéterek primer aminok, ammóniumsók királis tenzidek: merev, anellált gyűrűs vegyületek (szteroidok epesavak enantiomerjei, epimerjei) makrociklusos antibiotikumok - Anzamicinek semleges vagy kationos (amincsoportok!) - Glikopeptidek anion/karboxil/amid és aromás gyűrű a királis szénatom közelében lineáris poliszacharidok: heparán-szulfonátok heterociklusos N és még egy ionizálható N ligandumcsere-komplexek aminosavak, amino-alkoholok és hidroxisavak királis ionpárképzők M Blanco, I Valverde, Trends Anal. Chem. 2003, 22,

19 37. Izoproterenol enantiomerek CZE elválasztása (semleges ciklodextrinekkel) * natív CD RS hidroxipropil- béta-ciklodextrin dimetil- trimetilkét CD keveréke ( duál CD rendszer ) 50 mm foszfát/tea puffer, p = 3,0, 30 kv Godel, R Weinberger, P Application Note, 1995, E. 38. Tropánvázas alkaloidok királis CZE elválasztása szulfatált -CD-vel 55 mm foszfát (p 7), 2,9 mm S- -CD 50 m i.d. kapilláris (48,5 cm / 40 cm) inj. 16 nl minta (0.1 mg/ml) elfo 20 kv, 20 C UV detektálás 195 nm alkaloid analízis szemcseppből és növényi gyökérkivonatból (0.1 mg/ml) mintaelőkészítés: szuperkritikus fluid extrakció (C2 + 20% Me) során kisebb racemizáció, mint szilárd/folyadék extrakció (C3Cl / Me / N3) során L Mateus, S Cherkaoui, P Christen, JL Veuthy, J. Chromat. A 2000, 868,

20 39. Tramadol és humán fázis I metabolitjai (mind királis) korábbi bioanalitika: PLC-UV, PLC-ampero királis: PLC királis állófázissal CZE-UV problémái: érzékenység... => MS detektálás? Mt: királis CD-CZE előzmény: anionos CD, foszfátpuffer (p 3), egyik sem MS-kompatibilis... Megoldások: BGE: 40 mm ammónium-acetát, p ,5 mg/ml SBE-bCD partial filling: csak hosszának 90%-ig van anionos CD a kapillárisban és visszafelé migrál ESI polivinilalkohol bevonatú kapilláris,cze: 25 kv,20 C kvadrupól MS: ESI+ ionizáció (M+ molekulaionok), Single Ion Monitoring (SIM) S Rudaz, S Cherkaoui, P Dayer, S Fanali, JL Veuthey J Chromatogr A 2000, 868, Tramadol és metabolitjai: CD-CZE-ESI-MS (SIM) mind 100 ng/ml Reconstructed Ion Chromatogram Single Ion Monitoring S Rudaz, S Cherkaoui, P Dayer, S Fanali, JL Veuthey J Chromatogr A 2000, 868,

21 40. Tramadol és metabolitjai: CD-CZE-ESI-MS (SIM) mind 100 ng/ml Reconstructed Ion Chromatogram Single Ion Monitoring S Rudaz, S Cherkaoui, P Dayer, S Fanali, JL Veuthey J Chromatogr A 2000, 868, Az enantiomer migrációs sorrend szerepe Az aszimmetrikusan torzult csúcsalak (fronting / tailing) gyakoribb a CE-ben, pl. elektromigrációs diszperzió miatt K R [C] ( R RC ) ( K R KS ) 1 [C] ( K R KS ) K R KS [C]2 a migrációs sorrend megváltoztatása - KR és KS relatív nagysága (CD szubszt.fok) - [C] változtatása - R változtatása a p-val - EF változtatása, illetve ellentétes polaritás - ellentétes szelektivitású szelektor hozzáadása - akirális micellák vagy szerves oldószer

22 42. Példák a migrációs sorrend egyszerű változtatására binaftil-foszfát enantiomerek p-függő migrációja ofloxacin kombinált ligandumcserés (L-Phe-Zn) és zárványképzésen alapuló királis elválasztása oriami, et al. J. Chromat. A 1997, 760, 235. VI. Kapilláris elektroforézis a gyógyszerkönyvben Az European Pharmacopoeia 7.1 CE tárgyú cikkelyei I. Kapilláris elektroforézis fejezet: - általános bevezető után CZE, CGE, cief és MEKC módszerek elve, - kvantifikálás normált csúcsterületek alapján, - rendszeralkalmasság: N, Rs, As (csúcsszimmetria) - (normált) csúcsterületek és (relatív) migrációs idők reprodukálhatósága Levocabastin Cl: rokon szennyezők és epimer elv. - BGE: p 9,0 Na-borát, SDS, P-béta-CD, 10% izopropanol - MEKC fokozatosan növekvő áramprogrammal, 50 C-on, 60 perc Galantamin Br: szintetikus változatára királis CZE módszer - BGE: Na2P4 és alfa-ciklodextrin, CZE: 15 kv (35'), 214 nm S-(-)-Ropivacaine Cl: enantiomertisztaság CD-CZE-vel - BGE: p 3,0 foszfát+trietanolamin, DIMEB CD - CZE: 375 V/cm (30 perc), 206 nm - limit: max. 0,5% engedélyezett a disztomerből

23 44. Az European Pharmacopoeia 7.1 CE tárgyú cikkelyei II. Glutation (GS) mellett GSSG, dipeptidek, Cys - BGE: p 1,8 foszfát - CZE: 20 kv, 45 perc, 200 nm Aprotinin (58 aminosav, 3 diszulfidhíd) peptid szennyezői (dez-ala, -dez-gly) - BGE: p 3 foszfát - CZE: 25 C-on 200 V/cm 30 percig, 214 nm) Eritropoietin (165 aminosav, 2 diszulfidhíd, 31 kda) izoformákra terület% limit - sótalanítás után a minták 4 C-on analízis előtt! - BGE: p 5,5: Na-acetát; tricin; NaCl; putrescin 2,5 mm; urea 7 M - CZE: 30 C-on 143 V/cm 80 percig, 214 nm [továbbfejlesztés: CZE-TF-MS, BGE: p 2,6: ecetsav + 20% metanol: 135 izoforma, 44 glikoforma, a stabilabb pegilált változatok is...] Szomatropin (191 aminosav, 2 diszulfidhíd, 22 kda) dezamidált töltésvariánsok vizsg. - a minták 4 C-on analízis előtt! - BGE: p 6,0 ammónium-hidrogénfoszfát - CZE: 30 C-on 217 V/cm 80 percig, 200 nm Intakt glikoproteinek glikánmintázatának vizsgálata: - általánosan CE, SDS-PAGE vagy IEF módszert ajánl (MS, SEC mellett) 45. Miért nem használják szélesebb körben a hatóságok? (pedig a gyógyszerkincs 90%-a ionizálható...) Érzékenységi problémák UV detektálás: kis injektált térfogat, rövid optikai úthossz... Buborékcellánál az on-line előkoncentrálás x hatékonyabb lehet (Field-amplified SS, Large Volume SS, MEKC sweeping...) MS full-scan: nem sokkal jobb az UV-nál, Single Ion Mode: LQ < 0,1% Érzékenyebb detektorok: LIF, vezetőképesség (C4D), amperometria... Validálási problémák ma már nemigen vannak! (intercompany cross-validations...) migrációk idők és felbontás LC-hez hasonló reprodukálhatósága: a kapillárisfal állapota a döntő! (mosási protokollok, dinamikus borítás, hőmérsékletkontroll) injektálás reprodukálhatósága: belső std., relatív területek More expertise needed... U olzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27,

24 46. Kapilláris elektroforézis és a kromatográfiák... rtogonális elválasztástechnikák megbízhatóbb szennyezésprofil, ha eltérő elvű módszerekkel is vizsgáljuk CE-n belül is vannak ortogonális technikák (CZE vs. MEKC...) pl. gentamicin több vegyület keveréke, PLC + pulzus amperometriához képest on-line származékképzés PA-val és MEKC elválasztás: hatékonyabb, gyorsabb fluorokinolonokra viszont a PLC-UV is 0,1%-ra érzékeny vs. CZE-LIF... Királis analízis, enantiomertisztaság vizsgálata gyógyszerkönyv: még mindig polarimetria, királis oszlopú PLC... a CE-t sokkal szélesebb körben kellene használni! validálás: izomertiszta vs. random szubsztituált ciklodextrinek (sarzsonként eltérő szelektivitás, felbontás?) U olzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27, Bacitracin analízise kétféle technikával 47. EP MEKC bacitracin A U olzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27,

25 48. Levodopa mellett D-DPA - validált CD-CZE módszer EP: PLC módszer: akirális RP-18 állófázis, mozgófázis: réz-acetát és N,N-dimetil-L-Phe metanol-vízben Rs > 5, érzékenység: D-DPA > 0,5% CD-CZE módszer (oogmartens, 2002) továbbfejlesztése és teljes validálása: L-DPA 31 (22,5) cm 50 um ID kapilláris BGE: 20 mm Na-foszfát, p 2,5 10 mm szulfatált béta-cd D-DPA 0,1% CZE: -15 kv (82 ua), 200 nm minden minta 0,1 M Cl-ben készült D-DPA LD: 0,015%, LQ: 0,04% linearitás: 0,04-0,6% D (+1 mg/ml L) D-DPA 0,5% repeatability (intraday, interday prec.) rel.migr.idő < 0,9 RSD% csúcsterület-arány: < 4 RSD% robustness: BGE conc, temp, voltage => Rs relatív változása <10% U olzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27, Mikrochip elfo, lab-on-a-chip, micro-tas, mikrofluidika fotolitográfiásan gyártott lapkák - üveg, fused silica - poli(dimetil)sziloxán, PMMA EK injektálás, detektálás: LIF, MS, amperometria néhány cm migrációs úthossz sec-időskálára rövidült analízis előkoncentrálás, reakció is lehetséges lab-on-a-chip 1-puffer, 2-minta, 3-minta waste, 5-elválasztás, 4-waste biokémiai, orvosdiagnosztikai alkalmazások! GlucoWatch(R) bőrön át

26 Összefoglalás: CE - jolly joker technika (nemcsak) ionokra egy platform, számos elválasztási mechanizmus a gyógyszeranalízisben még (mindig) nem elég elterjedt, pedig... A Espada, M Molina-Martin DDT 2012