ONKOHEMATOLÓGIA Klinikai laboratóriumi szempontok

Átírás

1 ONKOHEMATOLÓGIA Klinikai laboratóriumi szempontok Bödör Csaba MTA-SE Lendület Molekuláris Onkohematológia Kutatócsoport, I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Semmelweis Egyetem

2 Onkohematológia I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Diagnosztika (2001) Országos onkohematológiai központ, évente ~5000 beteg

3 Bevezetés- Hematológiai daganatok Myeloproliferative AML ALL Lymphoproliferative MYELOID LYMPHOID

4 Onkohematológiai betegségek komplex diagnosztikája Morfológia Flow citometria Citogenetika FISH Szekvenálás Q-PCR Mi a cél?? Diagnózis Prognózis Terápiás hatás felmérése Terápiás célpont

5 Alkalmazott metodikák konvencionális PCR allélspecifikus PCR multiplex PCR RQ-PCR Sanger szekvenálás NGS

6 Polimeráz láncreakció (PCR) 1983, Kary Mullis: PCR 1993, Nobel díj Tetszőleges DNS szakasz felsokszorozása Denaturáció, Anelláció, Extenzió

7 Polimeráz láncreakció (PCR) 1983, Kary Mullis: PCR 1993, Nobel díj Tetszőleges DNS szakasz felsokszorozása Denaturáció, Anelláció, Extenzió

8 Polimeráz láncreakció (PCR) 1983, Kary Mullis: PCR 1993, Nobel díj Tetszőleges DNS szakasz felsokszorozása Denaturáció, Anelláció, Extenzió

9 Polimeráz láncreakció (PCR) 1983, Kary Mullis: PCR 1993, Nobel díj Tetszőleges DNS szakasz felsokszorozása Denaturáció, Anelláció, Extenzió Exponenciális amplifikáció! (2 n )

10 Polimeráz láncreakció (PCR) A kezdetek 94 0 C 58 0 C 72 0 C

11 PCR- termékek detektálása Klasszikus gél-elektroforézis Lab-on-Chip rendszer mikrokapilláris elektroforézis Kapilláris elektroforézis

12 Allélspecifikus PCR Allélspecifikus PCR P1 P3 G/T P2 T G

13 A JAK2 story (PV, ET, MF) 2005: Párizs, Basel, Cambridge, Boston Aktiváló JAK2 V617F mutáció PV-ben, ET-ben és MF-ben James C, et al. Nature. 2005; 434:1144. Levine R, et al, Cancer Cell 2005, 7: 387. Kralovics R, et al. N Engl J Med. 2005; 352: Baxter EJ, et al. Lancet. 2005; 365: 1054.

14 Janus-2 kináz V617F mutációja N- FERM SH2 Pszeudokináz Kináz -C P P V617F mutáció (1849G>T) Konstitutív aktiváció James C, Nature 2005; 434: A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera

15 Multiplex PCR Klonalitás meghatározása Klonalitás meghatározás (B-sejtes, T-sejtes daganatok) V1 V2 Vn D 1-12 J1-4 CH 5 3 Izotípusváltás * (class * switch) * germline Ig gén 5 3 V-D-J rekombináció Minden B-sejt egyedi génkonfigurációt hordoz Óriási variabilitás (2x10 6 ), antigénfelismerő készlet, + Monoklonalitás: minden sejt ugyanazt hodozza!

16 Multiplex PCR Klonalitás meghatározása Immunglobulin génátrendeződés vizsgálata (IgH) V1 V2 Vn D 1-12 J1-4 CH 5 3 Izotípusváltás * (class switch) * * germline Ig gén 5 3 Multiplex PCR amplifikáció B-sejtes; IgV H Marker Minta + - NTC

17 Multiplex PCR Klonalitás meghatározása Immunglobulin (IgH) génátrendeződés vizsgálat V1 V2 Vn D 1-12 J1-4 CH C.B.(19477, tube A) 5 3 Izotípusváltás * (class switch)* * germline Ig gene C.B. (19557, tube A)

18 Multiplex PCR Klonalitás meghatározása T-sejt receptor (TCR) génátrendeződés vizsgálat KA, 18129, TCR B KA, 19178, TCR B

19 Multiplex PCR Klonalitás meghatározása van Dongen et al., Leukemia, 2003, 17, Valójában sokkal bonyolultabb a helyzet... Érzékenység Negatív eredmény Pozitív eredmény Reprodukálhatóság

20 Valós-idejű (real-time PCR) megjelenése Konvencionális PCR 1996: TaqMan alapú Valós idejű PCR Klasszikus PCR Végpont detektálás Real-Time PCR Exponenciális fázis Előnyök: kvantitatív, szenzitivitás, specificitás, reprodukálhatóság

21 Valós-idejű PCR alkalmazása Fúziós transzkriptumok mennyiségi kimutatása Krónikus myeloid leukémia BCR-ABL, t(9;22) Akut lymphoid leukémia MLL-AF4, t(4;11) TEL-AML1, t(12;21) Akut myeloid leukémia PML-RARa, t(15;17) AML-ETO1, t(8;21) CBFB-MYH11 inv(16) E2A-PBX-1, t(1;19) Gyerekkori T-ALL SIL-TAL1, microdel 1p32

22 PML-RARa fúziós transzkriptum - t(15;17)(q22;21) típus PML (15q22) RARa (17q21) bcr % bcr % bcr % APL többségében (M3 AML) Kedvező prognózis ATRA kezelés

23 KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA (Citogenetika)

24 CITOGENETIKA Citogenetika A KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA Kariotipizálás ( sávozás ) Giemsa festés (G sávozás) Specifikus mintázat Kariotípus 46, XY

25 CITOGENETIKA A KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA Citogenetika A kromoszómák felépítése 2n=46, (46, XX; 46, XY) Centromer, telomerek Karok, régiók Metacentrikus Szubmetacentrikus Acrocentrikus

26 CITOGENETIKA A KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA Kromoszóma eltérések Számbeli változások - Poliploidia - Aneuploidia (monoszómia, triszómia) Szerkezeti változások - Transzlokáció - Deléció - Amplifikáció - Inverzió - Izokromoszóma - Gyűrűkromoszóma

27 CITOGENETIKA A KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA Számbeli kromoszóma eltérések POLIPLOIDIA (3n, 4n, ) ANEUPLOIDIA (Monoszómia, Triszómia) Monoszómia Triszómia

28 46,XY, +8, t(9;22), iso(17q)

29 46,XX,t(9;15;22)

30 CITOGENETIKA A KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA Citogenetika FISH FISH (fluoreszcens in situ hibridizáció) - Specifikus próbák - Nem szükséges osztódó sejt Metafázis és Interfázis FISH

31 CITOGENETIKA A KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA FISH - példák t(15;17), PML-RARA fúziós gén normál 15q22 (PML) 17q21 (RARA) PML/RARA fusion Fúziós próba PML/RARA t(15;17)

32 CITOGENETIKA A KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA FISH - példák MLL-? Fúziós gén? normál 11q23 (MLL) Split próba MLL split Acute myeloid leukaemia

33 Krónikus Myeloid Leukémia - Történeti Áttekintés Philadelphia kromoszóma t(9;22) transzlokáció BCR-ABL1 fúziós gén B. Druker STI 517 Imatinib (Glivec) ABL1 KD mutációk Dasatinib (Sprycel) Nilotinib (Tasigna) 3. generációs szerek 2G-TKI elsővonalban Követés Citogenetika Génexpresszió Mutációk TKI kezelés elhagyása NGS diagnosztika

34 A CML MOLEKULÁRIS MONITOROZÁSA Fúziós gén Fúziós transzkriptum Philadelphia kromoszóma t(9;22) bcr abl Citogenetika FISH BCR-ABL1 RQ-PCR

35 A MOLEKULÁRIS MONITOROZÁS EVOLÚCIÓJA ( ) CITOGENETIKA BCR-ABL1 RQ-PCR

36 A MOLEKULÁRIS MONITOROZÁS EVOLÚCIÓJA ( ) CITOGENETIKA BCR-ABL1 RQ-PCR

37 A MOLEKULÁRIS MONITOROZÁS EVOLÚCIÓJA ( ) CITOGENETIKA BCR-ABL1 RQ-PCR

38 ELNET 2013 AJÁNLÁS RQ-PCR elterjedése/ 2G-TKI elsővonalbeli alkalmazása, Molekuláris válasz egyenrangú szerepe Válasz kategóriák BCR-ABL1 IS (IS: nemzetközi skála) alapján Komplett molekuláris válasz helyett MR4.0, MR4.5, MR5.0 Mérföldkövek a másodvonalbeli terápia értékelésére Baccarani et al, Blood 2013.

39 CML: ÚJ ELNET AJÁNLÁS (2013) Baccarani et al, Blood 2013.

40 MOLEKULÁRIS MONITOROZÁS - Mit, mikor? RQ-PCR: 3 havonta MMR után 6 havonta

41 Terápiás hatás felmérése BCR-ABL fúziós transzkriptum és ABL kináz domén mutációk Valós-idejű PCR Direkt szekvenálás BCR (22q11) ABL (9q34) M351T

42 Optimális Molekuláris Válasz RQ-PCR: 3 havonta MMR után 6 havonta O W F

43 Rezisztencia mutációk az ABL kináz doménben Gatekeeper (Kapuőrző) mutáció : T 315 I (315 Thr > Ile) Aminosav 3 betűs kód 1 betűs kód Alanine Ala A Arginine Arg R Asparagine Asn N Aspartic acid Asp D Cysteine Cys C Glutamic Acid Glu E Glutamine Gln Q Glycine Gly G Histidine His H Isoleucine Ile I Leucine Leu L Lysine Lys K Methionine Met M Phenylalanine Phe F Proline Pro P Serine Ser S Threonine Thr T Tryptophan Trp W Tyrosine Tyr Y Valine Val V Threonin (T) Izoleucin (I)

44 BCR-ABL1/ABL1 % MOLEKULÁRIS MONITOROZÁS: ELNET 2013 BCR-ABL1 <10% BCR-ABL1 <1% BCR-ABL1 <0.1% 3. hónap 6. hónap 12. hónap 1000 BCR-ABL1 expresszió ,1 0,01 0, Hónapok Marin et al, JCO 2011

45 BCR-ABL1/ABL1 % MOLEKULÁRIS MONITOROZÁS: ELNET 2013 BCR-ABL1 <10% BCR-ABL1 <1% BCR-ABL1 <0.1% 3. hónap 6. hónap 12. hónap BCR-ABL1 expresszió EMR ,1 better outcome, deeper response 0,01 0,001 EMR : early molecular response DMR : deep molecular response DMR (MR4.0 ) Hónapok Hanfstein, Leukemia 2012; Marin, Blood 2012; Jain, Blood 2013; Hughes, Blood 2014; Jabbour, Blood 2014

46 Költségek TKI terápia Monitorozás 2-5% (!)

47 Molekuláris Diagnosztika Onkohematológia Jelenlegi stratégia

48 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Király Péter Marosvári Dóra Bárányné Pallag Adrienne Gulácsi Edina Nagy Veronika Gángó Ambrus Kiss Richárd Boha Zsófi Dénes Kitti Fesüs Viki Rupnik Zsuzsi Rácz Réka Matolcsy András Csomor Judit Csernus Balázs Mózes Réka Rajnai Hajnalka Szepesi Ágota Timár Botond Barts and the London School of Medicine & Dentistry University of Arizona Cancer Centre University of Barcelona British Columbia Cancer Centre, Vancouver National Cancer Institute, Bethesda University of Nebraska Medical Centre Norwegian Radium Hospital, Oslo Oregon Health & Science University University of Würzburg