Doktori tézisek. Dr. Reiniger Lilla. Semmelweis Egyetem Patológia Tudományok Doktori Iskolája. Témavezető: Dr. Szepesi Ágota egyetemi adjunktus, PhD

Átírás

1 Az aktiváció-indukált citidin deamináz és az aberráns szomatikus hipermutáció szerepe a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformációjában Doktori tézisek Dr. Reiniger Lilla Semmelweis Egyetem Patológia Tudományok Doktori Iskolája Témavezető: Dr. Szepesi Ágota egyetemi adjunktus, PhD Hivatalos bírálók: Dr. Tarkovács Gábor egyetemi docens, PhD Dr. Kappelmayer János egyetemi docens, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Demeter Judit egyetemi tanár, az MTA tagja Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kulka Janina egyetemi docens, PhD Dr. László Terézia egyetemi adjunktus, PhD Budapest, 2007.

2 I. BEVEZETÉS A krónikus lymphocytás leukemia (CLL) egy indolens B- sejtes non-hodgkin lymphoma (NHL), amely a betegek 5-10%- ában magasabb malignitású lymphomába transzformálódhat. A transzformáció során kifejlődhet diffúz nagy B-sejtes lymphoma - másnéven Richter transzformáció (RT) -, vagy az emelkedett prolymphocyta számmal járó prolymphocytás transzformáció (PLT). A transzformációt klinikailag gyors állapotromlás jellemzi (láz, fogyás, éjszakai izzadás, nyirokcsomó megnagyobbodás, lépmegnagyobbodás), ami agresszívebb terápiát igényel (high-grade vagy ALL-es protokoll), és kimenetele kedvezőtlen. A transzformáció oka és a transzformációban szerepet játszó mechanizmusok csak kevéssé ismertek, és részben ennek a következménye, hogy nincs rá specifikus terápia és megelőzni sem lehet ezt a rossz prognózisú folyamatot. A transzformáció hátterében részben genom instabilitás állhat, erre utalnak a már leírt genetikai defektusok, mint például a 12-es kromoszóma triszómiája, deléciók és transzlokációk a 11-, 13- és 14-es kromoszómákon, bizonyos gének mutációja (pl. a p53 és p21 géneké) és mikroszatellita instabilitás. Ezek az eltérések ugyan gyakrabban fordulnak elő transzformált CLL-ekben, mégsem tehető egyikük sem elsődlegesen felelőssé a transzformáció kialakulásában. 2

3 A genom instabilitás egy legújabban azonosított formája az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM), melyet már különböző NHL típusokban leírtak, közöttük diffúz nagy B-sejtes lymphomában is. A szomatikus hipermutáció (SHM) a nyirokcsomó centrum germinatívumában zajló fiziológiás folyamat, melynek során az immunglobulin nehézlánc gének variábilis régiójában (IgV H ) pontmutációk halmozódnak fel az affinitás érés során. Az ASHM-t az SHM hibás működésének tekintik, amely az IgV H régión kívüli lokuszokat, leggyakrabban protoonkogéneket (pl. a c-myc, a Pax5, a RhoH és a Pim1 géneket) érint. Több kutatócsoport is leírta, hogy az ASHM nem érinti a CLL-t. A CLL magas malignitású lymphomába átalakult eseteiben, így RT-ben és PLT-ben viszont az ASHM-et korábban nem vizsgálták. Az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) enzimnek szerepe van a B-sejtek érésének a nyirokcsomó centrum germinatívumában zajló részében, vagyis az SHM-ben és az izotípusváltásban. Az AID erősen mutagén enzim, hatására deaminálással a citidinből uridin képződik. A deaminálás miatt a DNS-ben mismatchek keletkeznek, és ezek a mismatchek különféle javító folyamatokat aktiválnak, melyek eredménye lehet a hiba kijavítása és a DNS integritásának helyreállítása, vagy mutációk, ASHM és DNS törések alakulhatnak ki. Az AID inadekvát működése így ASHM-hez és ezen keresztül B-sejtes daganatok kifejlődéséhez vezethet. Fokozott AID expressziót 3

4 különböző típusú lymphomákban leírtak. Az egyes munkacsoportok az AID expressziót különböző mértékűnek találták CLL-ben. Albesiano és mtsai határhigításos módszerrel bebizonyították, hogy a CLL-es tumorsejt populációban az AID expresszió heterogén és csak a sejtek egy kis része expresszál AID-et. Ugyanakkor a CLL magas malignitású lymphomába transzformálódott eseteinél (RT, PLT) az AID expressziójára vonatkozó adat az irodalomban nem található. Összesítve elmondható, hogy az AID inadekvát aktivitása összefügghet az ASHM-mel, amely különféle B-sejtes lymphomák patogenezisében vesz részt. Az AID és az ASHM szerepét korábban nem vizsgálták a CLL Richter és prolymphocytás transzformációjában. 4

5 II. CÉLKITŰZÉSEK Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziójának vizsgálata krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben. Az aberráns szomatikus hipermutáció vizsgálata a c-myc, Pax-5 és RhoH protoonkogénekben a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben. Az IgVH gének mutációs státuszának feltérképezése és azok összevetése a c-myc, Pax-5 és RhoH protoonkogének mutációs státuszával a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben. 5

6 III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Tanulmányunkban 29 krónikus lymphocytás leukaemiás beteg perifériás vér (PV) mintáját vagy frissen fagyasztott nyirokcsomó biopsziás mintáját használtuk. Valamennyi minta diagnózisát az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben állították fel a World Health Organization (WHO) lymphoid szövetek daganatos megbetegedéseinek klasszifikációjára vonatkozó kritériumainak megfelelően, hisztopatológiai és immunfenotípus vizsgálatok alapján. A CLL-es betegek közül 8 eset a betegség klinikai lefolyása alatt nem transzformálódott (1-8. esetek). 13 esetben Richter transzformáció (9-21. esetek), míg 8 esetben prolymphocytás transzformáció ( esetek) fejlődött ki. Az RT-s betegek közül 7 esetben (9-15. esetek) a CLL-es és a DLBL-es minta is elérhető volt a vizsgálatokra. Ezekben az esetekben a CLL és a hozzátartozó DLBL minták egyforma IgVH génátrendeződést mutattak, igazolva ezzel a tumor minták azonos klonális eredetét. A vizsgált mintákban a malignus sejtek aránya több mint 90 % volt. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziójának vizsgálatát kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval végeztük el összesen 12 CLL-es (1-12. esetek), 13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s mintában ( esetek). A vizsgálathoz kontrollként 8 egészséges önkéntes PV-ének mononukleáris sejtjeit és 2 humán reaktív nyirokcsomó 6

7 lézermikrodisszekcióval szeparált (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) CG B-sejtjeit használtuk. A vizsgálathoz első lépésként a tumorszövetből RNS-t izoláltunk klasszikus módszerrel (Trizol - Invitrogen, Carlsbad, CA, USA - reagens alkalmazásával), majd ebből reverz transzkripcióval (High Capacity cdna Archive Kit - Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) cdns-t készítettünk. Ezután következett a valós idejű PCR amplifikáció az ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) készülék segítségével. A nyert adatok kiértékelése a Sequence Detection Software version 1.3 (Applied Biosystems) program segítségével történt. Az AID mrns expressziós értékeket statisztikai szempontból a Student-féle kétszélű heteroszcedasztikus t-próba segítségével analizáltuk. Az IgVH, c-myc (exon 1 és exon 2), Pax-5 és RhoH gének mutációs státuszát direkt szekvenálással vizsgáltuk meg 12 CLL-es (1-12. esetek), 13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s ( esetek) mintában. A vizsgálatokhoz először a szövetmintákból genomikus DNS-t izoláltunk hagyományos kisózásos módszerrel, telített NaCl felhasználásával, majd az általunk vizsgálni kívánt génrégiókra specifikus oligonukleotidok segítségével PCR amplifikációt végeztünk. A PCR termékek tisztítása (Montage PCR Filter Device kit - Millipore, Billerica, USA) és a szekvenáló reakció (Big Dye Terminator 3.1 kit - Applied Biosystems) után egy újabb 7

8 tisztítási lépéssel (DyeEx Spin 2.0 kittel - Qiagen, USA) készítettük elő a mintákat a kapilláris elektroforézisre, amely az ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) genetikai analizátor segítségével történt. A c-myc, Pax-5 és RhoH gének szekvenciáit az NCBI (National Centre for Biotechnology Information) GenBank adatbázisban található, egészséges donoroktól származó referencia szekvenciákhoz hasonlítottuk. A kapott IgVH gén szekvenciákat az IMGT/V-QUEST (International ImMunoGeneTics Information System, program segítségével hasonlítottuk az egészséges donoroktól származó germline IgVH gén szekvenciákhoz. 8

9 IV. EREDMÉNYEK 1. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval A vártnak megfelelően az AID mrns expressziós szintek a CG-kben magasak, míg az egészséges önkéntesek PV-ében alacsonyak voltak. Habár látszólag van különbség az egészséges önkéntesek PV-ében és a CLL-es esetekben kapott AID mrns expressziós értékek között, a Student-féle kétszélű t-próba eredménye alapján ez a különbség nem szignifikáns (p= ). A transzformálódó és a nem transzformálódó CLL-es esetek AID mrns expressziós szintjei között nem volt különbség (p= ). Az AID mrns expressziós értékek szignifikánsan magasabbak voltak az RT-s (p= ) és a PLT-s (p= ) esetekben a CLL-es esetek expressziós értékeihez viszonyítva. Annál a 4 esetnél (9-12. esetek), amelyeknél a transzformáció előtti CLL-es és a transzformáció utáni RT-s minta is elérhető volt qrt-pcr vizsgálatra, az RT-s mintákban az AID mrns expressziós szintek szor magasabbak voltak a CLL-es mintákban mért értékekhez képest. A de novo DLBL-es és az RT-s mintákban az AID mrns expressziós értékek nem mutattak különbséget (p=0,16). 9

10 2. A c-myc, a Pax-5 és a RhoH gének szekvencia vizsgálata A 15 CLL-es mintában összesen 4 mutációt detektáltunk, amelyek közül 3 a nem-transzformálódó (3., 4. és 6. esetek) és 1 a transzformálódó (14. eset) esetekben volt. A 13 RT-s mintában összesen 32 és a 8 PLT-s mintában összesen 16 mutációt találtunk. Minden mutáció szubsztitúciónak bizonyult egy mutációt kivéve, ami inzerció volt. A megfigyelt 51 szubsztitúció közül 23 tranzíciót és 28 transzverziót találtunk. A tranzíció-transzverzió arány a CLL-ekben 1.0, az RT-kben 0.6 és a PLT-kben 1.5 volt. A nukleotid cserék mintázata a G+C/A+T arányra vonatkozóan 1.0 volt a CLL-ekben, 1.54 az RT-kben és 2.0 a PLT-kben. Az RGYW motívum érintettsége a CLL-ek 25 %-ában, az RT-k 38 %-ában és a PLT-k 19 %-ában volt megfigyelhető. A transzformált esetek átlagos mutációs frekvenciája a 4 vizsgált gén régióra vonatkozóan a 0.04/ /100 bázispár tartományba esett. A CLL-es esetekben csak a c-myc gén, de az RT-s és a PLT-s esetekben mind a 3 vizsgált gén hordozott mutációt. A mutált gének száma a CLL-es esetekben 0 és 1, az RT-s és PLT-s esetekben 1 és 3 közé esett. 7 esetben (9-15. esetek) a transzformáció előtti CLL-es és a transzformáció utáni RT-s minta is elérhető volt mutációs analízisre. Ebben a csoportban csak egyetlen CLL-es minta (14. eset) hordozott egy szubsztitúciót (4552 A>G), amit 10

11 a hozzátartozó RT-s mintában is kimutattunk. Ez az RT-s minta egy addícionális mutációt is szerzett. Az összes többi RT-s minta is 1-4 mutációt hordozott. 3. Az IgVH gének szekvencia vizsgálata Az eseteket 2 csoportra osztottuk az alapján, hogy mekkora a nukleotid eltérések száma a germline génekhez képest. Mutálatlanok azok a minták, amelyekben az adott szekvencia legalább 98 %-os homológiát mutatott a VH gének konszenzus szekvenciájával (1., 3., 7., és esetek). Mutáltnak tekintettük azokat a mintákat, amelyek esetében a VH gének konszenzus szekvenciájával való egyezés kisebb, mint 98 % (2., 4., 5. és 8. esetek). A kontroll CLL csoportban, ahol a CLL-ek nem transzformálódtak magasabb malignitású lymphomába, 4 mutált és 3 mutálatlan eset volt. Minden transzformálódó CLL-es, RT-s és PLT-s eset a mutálatlan csoportba tartozott. Az IgVH gének szekvencia analízisével bebizonyosodott az is, hogy minden CLL-RT mintapárban (9-15. esetek) azonos az IgVH gén, vagyis a betegségek klonális eredete azonos. 11

12 V. MEGBESZÉLÉS Jelen tanulmányban az aktiváció-indukált citidin deamináznak és az aberráns szomatikus hipermutációnak a CLL Richter és prolymphocytás transzformációjának kifejlődésében betöltött szerepét vizsgáltuk. A vizsgálathoz az AID RT-PCR-rel történő analízisét és a c-myc, a Pax-5 és a RhoH gének mutációs státuszának analízisét végeztük el transzformáció nélküli CLL-es, RT-s és PLT-s esetekben. Eredményeink arra utalnak, hogy a magas AID mrns expresszió és az ASHM összefügghet a CLL-es betegek Richter és prolymphocytás transzformációjával. Korábbi közleményekkel összhangban, a tanulmányunkban megvizsgált minden CLL-es mintában detektálható volt az AID mrns expressziója. Az expressziós értékek jóval a normál CG B-sejtek expressziós szintjei alatt maradtak. A transzformációt nem mutató és a végül magasabb malignitású lymphomába transzformálódó CLL-es esetek az AID-et azonos mértékben expresszálták. Érdekes módon az RT-s és a PLT-s esetekben is szignifikánsan magasabb volt az AID mrns expresszió a CLL-ek expressziójához viszonyítva, ezek az expressziós szintek elérték a de novo DLBL-ek AID mrns expressziós szintjét. A transzformációval összefüggő AID expresszió emelkedés annál a 4 esetnél is kimutatható volt, ahol az azonos klonalitású CLL és transzformált DLBL minták is elérhetők voltak expressziós vizsgálatra. Ezekben az esetekben 12

13 a CLL-ek AID mrns expressziója szorosára emelkedett a transzformált sejtekben. Habár az AID expresszió az egészséges CG B-sejtekre korlátozódik és az AID konstitutív expressziója elsősorban a CG eredetű lymphomákat jellemzi, eredményeink azt bizonyítják, hogy az AID expresszió szignifikánsan megemelkedhet a daganatos B-sejt populáció klonális fejlődése során is, ami a CLL magasabb malignitású transzformációjához vezethet. A DLBL-ek egy részében az ASHM gyakori előfordulását írták le, ugyanakkor az indolens lymphomákban beleértve a CLL-t az ASHM ritkán figyelhető meg. Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy a CLL Richter és prolymphocytás transzformációja összefüggést mutat-e az ASHM aktiválódásával, megvizsgáltuk a c-myc, a Pax-5 és a RhoH gének mutációs státuszát transzformáció nélküli és RT-s vagy PLT-s CLL-es esetekben. A korábbi közleményeknek megfelelően a CLL-es mintákban alacsony mutációs frekvenciát detektáltunk a c-myc, a Pax-5 és a RhoH génekben, támogatva ezzel azokat az eredményeket, miszerint az ASHM nem játszik szerepet a CLL kialakulásában, még azokban az esetekben sem, amik később agresszívebb betegségbe transzformálódnak. A de novo DLBL-es esetekhez hasonlóan a c-myc, a Pax-5 és a RhoH gének az RT-s és a PLT-s esetekben több mutációt hordoztak. A meghatározott mutációs frekvencia, a nukleotid szubsztitúciók G+C/A+T túlsúlya és az RGYW motívum 13

14 érintettsége is hasonlóak voltak ahhoz, amit korábban ASHMként írtak le. A c-myc, Pax-5 és RhoH gének transzformált CLL-ekben leírt mutációi arra engednek következtetni, hogy a transzformáció során az ASHM aktiválódik, de annak a lehetőségét sem lehet kizárni, hogy az ASHM a transzformáció után alakul ki a már transzformálódott magas malignitású lymphoma sejtekben. Azon 7 eset közül, amelyeknél a CLL-es és az azonos klonalitású RT-s minta is elérhető volt mutáció analízisre csak 1 CLL-ben volt 1 mutáció, ami a betegség transzformált stádiumában is megfigyelhető volt. E mutáción felül az RT-ben 1 újabb mutációt is detektáltunk, ami alapján feltételezhető, hogy az ASHM hozzájárult a transzformáció folyamatához. Ráadásul a transzformált CLL-es esetekben hiányzik a mutációk ongoing jellege, ami arra enged következtetni, hogy az ASHM számára csak egy rövid időszak állt rendelkezésre talán éppen a transzformáció kifejlődésekor és a mutációs mechanizmus a betegség transzformálódott stádiumában már inaktív volt. Kutatócsoportunk egy korábbi közleményével összhangban a transzformálódó CLL-ek, a transzformált RT-k és PLT-k IgVH génjei mutálatlanok voltak. Az IgVH gén szomatikus mutációs mechanizmusa tehát nem aktiválódott a CLL-ek magasabb malignitású lymphomába történő transzformációja során sem. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az SHM fiziológiás folyamata és az ASHM nem feltétlenül 14

15 összekapcsolt események és az ASHM az Ig gének mutációitól függetlenül is fennálhat. Habár ez a tanulmány azt feltételezi, hogy az AID expresszió és az ASHM között van összefüggés a CLL magasabb malignitású lymphomába történő transzformációja során, mégis nehéz megállapítani, hogy melyik esemény indítja el a transzformációt, mivel a transzformációval kapcsolatos aktivitásuk időpontját nem lehet könnyen meghatározni. Összességében elmondható, hogy tanulmányunk újabb bizonyítékot nyújt arra, hogy az AID expresszió és az ASHM előfordulhatnak együtt, és feltételezi, hogy szerepük lehet a CLL magasabb malignitású lymphomába RT, PLT történő transzformációjában. 15

16 VI. KÖVETKEZTETÉSEK Az aktiváció-indukált citidin deamináz mrns expressziója szignifikánsan magasabb a Richter és prolymphocytás transzformált esetekben a krónikus lymphocytás leukaemiás esetekhez viszonyítva. Az aberráns szomatikus hipermutáció aktív a Richter és prolymphocytás transzformált esetekben, míg a krónikus lymphocytás leukaemiás esetekben nem. Az IgVH gének mutációs státusza nem mutat összefüggést az aberráns szomatikus hipermutációval. Az aktiváció-indukált citidin deamináz expressziója és az aberráns szomatikus hipermutáció összefüggenek a krónikus lymphocytás leukaemia magasabb malignitású lymphomába történő transzformációjával. 16

17 VII. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában: L Reiniger, Cs Bödör, Á Bognár, Zs Balogh, J Csomor, Á Szepesi, L Kopper, A Matolcsy: Richter s and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mrna expression of activation-induced cytidine deaminase and aberrant somatic hypermutation. Leukemia 20: , IF: Cs Bödör, Á Bognár, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper, A Matolcsy: Aberrant somatic hypermutation and expression of activation-induced cytidine deaminase mrna in mediastinal large B-cell lymphoma. British Journal of Haematology 129: , IF: Az értekezés témáján túl: Á Bognár, B Csernus, Cs Bödör, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper, A Matolcsy: Clonal Selection in the bone marrow infiltration of follicular lymphoma. Leukemia 19: , IF: Rajnai H, Bödör Cs, Reiniger L, Timár B, Csernus B, Szepesi Á, Csomor J és Matolcsy A: Új lehetőség a chronicus myeloproliferatív betegségek diagnosztikájában a JAK2 mutáció kimutatása. Orvosi Hetilap, elfogadva Idézhető absztraktok Cs Bödör, Á Bognár, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper, A Matolcsy: Aberrant somatic Hypermutation and expression of activation-induced cytidine deaminase, RNA in mediastinal large B-cell lymphoma (abstract). Annals of Oncology 16 (Suppl.5): 144, IF: 4,335 17

18 Dr Mózes Miklós, Dr Gerő Domokos, Reiniger Lilla, Rosivall László: Relaxin transzgenikus egértörzs létrehozása és karakterizálása. Hypertonia és Nephrologia, 2001; (5) S4: (152) 18

19 VIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom Szüleimnek, akiknek szeretetteljes és türelmes gondoskodása végigkísérte és támogatta munkámat, és köszönettel tartozom az egész családomnak (a legkisebbtől a legnagyobbig), amiért olyan fészket szőttek, amiben az örömök és a nehézségek megélése is megosztható. Köszönöm Dr. Kopper László Professzor Úrnak, hogy befogadott az intézetbe, amellyel szakmai haladásomat támogatta, és köszönöm a bíztató és értékes szakmai és baráti beszélgetéseket. Köszönöm Dr. Matolcsy András Professzor Úrnak, hogy a laborjában dolgozhattam és hogy szakmai tanácsaival ellátott, munkámat mindvégig segítette. Köszönettel tartozom Dr. Szepesi Ágotának, témavezetőmnek, a szakmai segítségért. Köszönöm Dr. Csomor Juditnak, hogy délutántól estig gyakran segített abban, hogy vidáman teljen a munkával töltött idő. Köszönöm a baráti és szakmai beszélgetéseket. Köszönettel tartozom Prof. Kovalszky Ilonának és Dr. Sebestyén Annának, hogy dolgozhattam a laborjukban. Köszönöm az értékes szakmai támogatást. Köszönettel tartozom Laczik Cecíliának és Szilágyi Ilonának, hogy bármikor segítségért fordulhattam hozzájuk. Köszönettel tartozom közvetlen munkatársaimnak és barátaimnak Dr. Bognár Ágnesnek, Bödör Csabának, Dr. Timár Botondnak és Dr. Csernus Balázsnak az együtt eltöltött munka- és szabadidőért és az önzetlen szakmai segítségért. Köszönöm Bárányné Pallag Adriennenek és Lengyel Anikónak a labormunkában nyújtott segítséget. Külön köszönettel tartozom Dr. Diczházi Csabának, aki az éjszakákba és hétvégékbe nyúló munkáim során segített tartani bennem a lelket - beszélgetésekkel és kávéval. Köszönettel tartozom Dr. Hajdu Melindának, Dr. Füle Tibornak, Szarvas Tibornak, Dr. Barna Gábornak, Tátrai Péternek, Budai Bernadettnek, Bedi Katának, Kovács Anitának, Kánya Melindának és Cserneki Marinak a munkámhoz kapott segítségért. Köszönöm, hogy segítettek a baráti és vidám hangulat megteremtésében a házon belül és azon kívül is: László Viktória, Dr. Fónyad László, Imre Gergő, Balogh Zsófia, Deák Linda, Muhari Orsolya, Szabó Orsi, Szabó Ildikó, Csizmadia Annamária, Rajnai Hajnalka, Angster Christine, Baghy Kornélia, Péterfia Bálint. Köszönöm Dr Mózes Miklósnak, hogy segített megszeretnem a kutatómunkát, és hogy laborjában elsajátíthattam a molekuláris biológiai módszerek egy részét. Köszönettel tartozom - nem utolsósorban - barátaimnak, a két Zsófimnak, Petinek, Nórcsinak, Zsuzsának és Zolinak a lelkesítésért és türelemért. 19