(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) Int. Cl.: C12N 9/12 ( ) C12Q 1/68 ( ) G01N 33/53 ( ) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/EP 05/55586 (30) Elsõbbségi adatok: FR (72) Feltalálók: Vainchenker, William, Paris (FR); Ugo, Valérie, Paris (FR); James, Chloé, Cenac (FR); Le Couedic, Jean-Pierre, Champs sur Marne (FR); Casadevall, Nicole, Paris (FR) (73) Jogosultak: Assistance Publique-Hopitaux de Paris, Paris (FR); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM), Paris (FR); Institut Gustave Roussy, Villejuif (FR); Université de Versailles Saint-Quentin-en Yvelines, Versailles Cedex (FR); Université Paris Sud, Orsay (FR) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Vaquez poliglobulia kóroktanában szerepet játszó jak2 mutáció azonosítása (57) Kivonat A találmány tárgyát képezi a JAK2 tirozinkináz protein V617¹es variánsa, amely variáns a Vaquez poliglobuliáért felelõs. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás eritrocitózis és trombocitózis elsõ szándékú diagnosztikájára, amely lehetõvé teszi azoknak a mioproliferatív rendellenességekhez történõ kapcsolását, valamint a JAK2 V617 variáns detektálása mioproliferatív rendellenességekben, amely lehetõvé teszi azok új nozológiai csoportba történõ besorolását, továbbá specifikus inhibitorok és sirns¹ek azonosítása. HU T2 A leírás terjedelme 42 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 A találmány tárgyát képezi a JAK2 tirozinkináz protein V617¹es variánsa, amely variáns a Vaquez poliglobuliáért felelõs. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás eritrocitózis és trombocitózis elsõ szándékú diagnosztikájára, amely lehetõvé teszi azoknak a mioproliferatív rendellenességekhez történõ kapcsolását, valamint a JAK2 V617 variáns detektálása mioproliferatív rendellenességekben, amely lehetõvé teszi azok új nozológiai csoportba történõ besorolását, továbbá specifikus inhibitorok és sirns¹ek azonosítása. A Vaquez poliglobulia (Polycythemia vera, vagy PV) krónikus mioproliferatív szindróma, amely valódi poliglobuliával és gyakran trombocitózissal és hiperleukocitózissal asszociált. A hematopoietikus õssejt szerzett, klonális betegsége. A PV hemopoietikus progenitorsejtjei eritropoietin (Epo) hiányában képesek eritroblasztkolóniákat képezni, amelyeket spontán kolóniáknak neveznek. Kimutatták, hogy a PV eritroblasztprogenitorok számos más növekedési faktorra is túlérzékenyek: interleukin-3¹ra (IL 3), granulocita makrofágstimuláló faktorra ( Granulocyte Macrophage-Stimulating Factor, GM¹CSF), õssejt faktorra ( Stem Cell Factor, SCF) és inzulinszerû növekedési faktorra ( Insuline Like Growth Factor IGF¹1). Számos munkacsoport foglalkozott a PV kórélettanával, azonban a betegség háttérben húzódó molekuláris anomáliája napjainkig nem ismert (H. Pahl, 2000). A PV progenitorok számos citokinnel szemben mutatott túlérzékenysége azon anomáliák kutatásához vezetett, amelyek a citokinreceptorok közös szignáltranszdukciós útját érintette. A PV esetében molekuláris marker létezését soha nem bizonyították, mivel azonban a PV és más mieloproliferatív szindrómák, elsõsorban az LMC, közötti hasonlóság adott, valószínûnek tûnik, hogy a Bcr-Abl által indukált molekuláris mechanizmusokhoz közel álló történések felelnek a malignus klón proliferációjáért és végsõ differenciálódásáért. Ezt a hipotézist újabban megerõsítették két ritka mieloproliferatív rendellenesség esetében, nevezetesen olyan mieloproliferatív szindrómák esetében, amelyek az FGF-receptor konstitutív aktiválását indukáló 8p11 kromoszómarégiót érintõ transzlokációval asszociáltak, valamint a hipereozinofil szindróma esetében, amelyben egy rejtett kromoszómadeléció a PDGFR - FIP1L1 kiméra gént eredményezi. Mindkét esetben a molekuláris anomáliákból erednek a konstitutív tirozinkináz aktivitású fúziós proteinek. A PV esetében nem találtak visszatérõ citogenetikai anomáliát, annak ellenére, hogy a betegek 10 15%-ában egy 20 q deléciót, és az esetek körülbelül 30%-ában 9p¹nél heterozigotizmusvesztést találtak (Kralovics, 2002). Ezek az anomáliák azonban nemspecifikusak a betegségre. Mivel a PV¹sejtek Epo-tól függetlenek, vizsgálták az Epo-receptor (R¹Epo) anyagcsereútját. Mindenekelõtt a receptor strukturális és funkcionális értelemben normális [Hess és munkatársai (1994); Le Couedic és munkatársai (1996); Means és munkatársai (1989)]. Az SHP¹1 foszfatáz, amely az R¹Epo és a JAK2 defoszforilezését végzi az Epo általi stimuláció befejeztével, normálisan expresszálódik RNS és fehérje szintjén [Andersson és munkatársai (1997); Asimakopoulos és munkatársai (1997)]. Az R¹Epo szignalizációban a reakcióút késõi szakaszán a STAT5 abnormális aktiválódását vizsgálták PV¹ben szenvedõ betegek polinukleáris (PNN) sejtjeiben anélkül, hogy anomáliát találtak volna. Ugyanakkor a STAT3 konstitutív foszforilezése volt bizonyítható 4 PV¹beteg PNN-sejtjeiben, 14 vizsgált PV esetbõl [Roder, 2001]. Végül immunhisztokémiai és áramlásos citometriás eljárásokkal vizsgálták [Silva és munkatársai, (1998)] a bcl¹xl antiapoptotikus protein expresszálódását, amely a STAT5 transzkripciós céltáblája. Kimutatták, hogy a bcl¹xl a PV eritroblasztokban hiperexpresszálódott, és elsõsorban érettebb stádiumban, ahol ez a protein normál esetben már nem expresszálódik. A Vaquez poliglobulia esetében a diagnosztika fõ kritériumai napjainkban klinikaiak [PVSG kritériumok; Pearson, (2201)]. A biológiai diagnosztika lényegében azon alapul, hogy eritroid progenitor kultúrákat indítanak Epo jelenléte nélkül (endogén kolóniák detektálása). Mivel ez a vizsgálat szakértelmet és jelentõs asszisztensi idõráfordítást igényel, a vizsgálat nem minden centrumban áll rendelkezésre, és csak akkor megbízható, ha gyakorlott laboratóriumban végzik. Ezen túlmenõen a megfelelõ érzékenységhez az szükséges, hogy a betegtõl velõsejteket vegyenek, ami a betegnek kényelmetlenséget okoz. Kivonásos hibridizációs eljárások alkalmazásával egy német munkacsoport olyan gént klónozott, amely PV¹betegek PNN-sejtjeiben hiperexpresszálódik, és amelyet PRV-1-nek ( Polycythemia Rubra Vera 1 ) neveztek. A PRV¹1 az upar felszíni receptorok szupercsaládjába tartozik. A PRV-1¹et kódoló mrns hiperexpresszálódása könnyen detektálható PV polinukleáris sejtekben valós idejû RT¹PCR eljárással, és a betegség újonnan felfedezett markerének számít, amelynek nincs kórélettani szerepe. Újabb szakirodalmi helyek azonban rámutatnak, hogy sem erõs érzékenységet, sem erõs specificitást nem mutat. Spivak J. L. és munkatársai [ Chronique myeloproliferative disorders Hematology 200, 20 (2003)] ismertetnek bizonyos PV markereket. Az NBI/CD177 neutrofil-antigén mrns¹e fokozottan expresszálódik PV¹betegek granulocitáiban. Ez a marker egyáltalán nem tûnik megbízhatónak PV detektálására, bizonyos betegek nem mutatják ezt a fokozott expressziót, vagy a fokozott expresszió megfigyelhetõ olyan egyénekben, akik más mieloproliferatív szindrómában szenvednek, mint a Vaquez poliglobulia. A trombopoietin-receptor (Mp1) csökkent expresszálódása a vérlemezkéken szintén egy lelet PV esetében. Bár ez az anomália dominál PV esetében, az más mieloproliferatív szindrómákban is észlelhetõ. Ráadásul nehezen végezhetõ vizsgálat, amely csak specializált laboratóriumokban végezhetõ. Ennek megfelelõen a technika állása szerint nincs olyan eljárás, amellyel a PV megbízhatóan diagnosztizálható. Ráadásul az alkalmazható néhány kezelés nemspecifikus. A kezelési módszerek vérlebocsátásra szorítkoznak a hematokrit normálértéken tar- 2

3 1 HU T tása céljából, vagy citotoxikus ágensek vagy IFN adására. A találmány szerint nemcsak egy olyan mutációt fedeztünk fel a JAK2 génben, amely a vizsgált betegek 90%-ában megtalálható, hanem azt is megállapítottuk, hogy ez a mutáció a felelõs ezen tirozinkináz konstitutív aktiválásáért, és kimutattuk, hogy annak gátlása lehetõvé teszi a PV¹eritroblasztok spontán proliferációjának és differenciálódásának a blokkolását. A JAK2 szekvenciáját a Database Uniprot ismerteti Q506Q0 szám alatt. JAK2¹n belüli mutációkat a találmány benyújtását követõen, egy év múlva ismertettek James Chloe és munkatársai [Nature 434, (7037) 1144] és Baxter és munkatársai [Lancet 365, (9464) 1054]. A JAK2 a Janus kinázok ( JAKs ) családjába tartozik, amely számos, citoplazmán belüli tirozinkinázt foglal magában: JAK1, JAK2, JAK3, és TYK2. A JAK-proteinek számos olyan membrán-receptor intracelluláris szignálozásában vesznek részt, amelyeknek önmagukban nincs tirozinkináz aktivitásuk, mint például a citokinreceptorok szupercsaládjának néhány tagja, és elsõsorban az Epo-receptor (R¹Epo). A JAK2¹t egy 23 exont tartalmazó gén kódolja. A komplementer DNS mérete 3500 bázispár, és egy 1132 aminosavból álló proteint kódol (130 kd) (1. ábra). Szekvenálással és PCR-eljárással egy klonális, szerzett pontmutációt azonosítottunk a JAK2 12¹es exonjában, amely a PV¹betegek körülbelül 90%-ában jelen volt. A 617¹es GTC kodon, amely szokásosan valint (V) kódol, TTC ¹re mutált, amely fenil-alanint (F) kódol. Ez a V617F mutáció nem volt megtalálható 25 vizsgált kontrollban vagy másodlagos poliglobuliás betegben. Másrészt viszont a mutáció megtalálható az esszenciális thrombocitopéniában szenvedõ betegek 40%-ában, valamint mielofibrózisos betegek 50%-ában, ami arra utal, hogy ez a mutáció mintegy egy új mieloproliferatív szindróma keretét definiálja, hasonlóan ahhoz, ahogy a Bcr-Abl a krónikus mieloid leukémiát definiálja. Azt vizsgálandó, hogy a találmány szerinti JAK2 V617F variáns hatékonyan detektálható¹e hematológiai diagnosztikai laboratóriumokban elterjedten alkalmazott eszközökkel, mieloproliferatív rendellenesség gyanúját mutató betegekbõl származó, 119 mintát vizsgáltunk meg. Kimutattuk, hogy a JAK2 V617F hatékonyan detektálható a LightCycler és TaqMan eljárásokkal, ez utóbbiak valamivel érzékenyebbek, mint a szekvenálás. Ezt követõen felbecsültük a JAK2 V617F detektálási értékét elsõ szándékú diagnosztikai tesztként 88 olyan beteg esetében, akik 51%-nál magasabb hematokritértéket mutattak, és kimutattuk, hogy a mutáció a WHO (R=0,879) és a PVSG (R=0,717) kritériumai szerint megfelel a PV diagnózisnak, eritrocitózis vonatkozásában 100%¹os pozitív predikciós értékkel. Ezen tények alapján, azt javasoljuk, hogy a JAK2 V617F granulocitákban történõ detektálását mérlegelni kell elsõ szándékú diagnosztikai tesztként eritrocitózisban szenvedõ betegekben, ezáltal elkerülve a vörösvértestek tömegének a mérését, csontvelõ leszívását és az endogén eritroid kolóniák képzõdésének a vizsgálatát. Ez a detektálás elsõ szándékú diagnosztikaként kiterjeszthetõ továbbá minden mieloproliferatív szindrómára vagy azok gyanújára. Ez a detektálás különösen fontos krónikus thrombocitózisoknál, amelyek esetében a mieloproliferatív szindróma megerõsítésére nem létezik biztos biológiai teszt. Fontos vizsgálat lehet továbbá mielofibrózisok diagnosztikájában, valamint bizonytalan kóroktanú trombózisokkal asszociált klinikai képek esetében. Ennek megfelelõen a találmány elsõként nyújt diagnosztikai eszközt és nyit utat PV, valamint az ezen mutációval asszociált mieloproliferatív szindrómák célzott kezeléséhez. Még elõnyösebben, elsõ szándékú diagnosztikai vizsgálatként javasoljuk a JAK2 V617F mutáció detektálását eritrocitózis esetében, amellyel a betegek többségénél, valamint krónikus thrombocitózis esetekben, elkerülhetõ a vörösvértestek tömegének és az endogén eritroid sejtek (EEC) mennyiségi meghatározása és csontvelõ leszívása, ami lehetõvé teszi hosszadalmas etiológiai kutatás mellõzését. A találmány ismertetése Ennek megfelelõen a találmány egy elsõ szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi izolált JAK2 protein (Janus kináz 2), elõnyösen a Homo sapiens Janus kináz 2 protein (NCBI hozzáférési száma NM_004972; GI: ), amely a 617¹es aminosavban mutációt tartalmaz (a cdns 617¹es kodonja, ATG-tõl kiindulva), még elõnyösebben, a V617F mutáció, amelyet JAK2 V617F variánsnak neveztünk, és amelyet az 1. azonosító számú szekvencia mutat be: 1. azonosító számú szekvencia (V617F Homo sapiens Janus kináz 2 vagy JAK2 V617F) MGMACLTMTEMEGTSTSSIYQNGDISGNANSMK- QIDPVLQVYLYHSLGKSEAD YLTFPSGEYVAEEICIAASKACGITPVYHNMFALMSE- TERIWYPPNHVFHIDEST RHNVLYRIRFYFPRWYCSGSNRAYRHGISR- GAEAPLLDDFVMSYLFAQWRHDF VHGWIKVPVTHETQEECLGMAVLDMMRIA- KENDQTPLAIYNSISYKTFLPKCIR AKIQDYHILTRKRIRYRFRRFIQQFSQCKATARNLKL- KYLINLETLQSAFYTEKF EVKEPGSGPSGEEIFATIIITGNGGIQWSRGKHKE- SETLTEQDLQLYCDFPNIIDVS IKQANQEGSNESRVVTIHKQDGKNLEIELSSL- REALSFVSLIDGYYRLTADAHHY LCKEVAPPAVLENIQSNCHGPISMDFAISKLK- KAGNQTGLYVLRCSPKDFNKYF LTFAVERENVIEYKHCLITKNENEEYNLS- GTKKNFSSLKDLLNCYQMETVRSDN IIFQFTKCCPPKPKDKSNLLVFRTNGVSDVPTSPTLQ RPTHMNQMVFHKIRNEDL IFNESLGQGTFTKIFKGVRREVGDYGQLHE- TEVLLKVLDKAHRNYSESFFEAAS MMSKLSHKHLVLNYGVCF 617 CGDENILV- QEFVKFGSLDTYLKKNKNCINILWK LEVAKQLAWAMHFLEENTLIHGNVCAKNILLI- REEDRKTGNPPFIKLSDPGISIT VLPKDILQERIPWVPPECIENPKNLNLATD- KWSFGTTLWEICSGGDKPLSALDSQ 3

4 1 HU T2 2 RKLQFYEDRHQLPAPKWAELANLINNCM- DYEPDFRPSFRAIIRDLNSLFTPDYE LLTENDMLPNMRIGALGFSGAFEDRDPTQ- FEERHLKFLQQLGKGNFGSVEMCR YDPLQDNTGEVVAVKKLQHSTEEHLRDFE- REIEILKSLQHDNIVKYKGVCYSAG RRNLKLIMEYLPYGSLRDYLQKHKERIDHIKLLQYTS- QICKGMEYLGTKRYIHR DLATRNILVENENRVKIGDFGLTKVLPQDKEYYKV- KEPGESPIFWYAPESLTES KFSVASDVWSFGVVLYELFTYIEKSKSPPAEFMR- MIGNDKQGQMIVFHLIELLK NNGRLPRPDGCPDEIYMIMTECWNNNVNQRP- SFRDLALRVDQIRDNMAG A találmány tárgyát képezik továbbá ezen protein ekvivalensei, amelyek a 617¹es pozícióban mutációt tartalmaznak más emlõsökben, például JAK2 V617F patkányban (NM_031514), sertésben, egérben (NM_008413) és más emlõsökben, továbbá az 1. azonosító számú szekvencia szerinti olyan variánsok, amelyek tartalmaznak egy vagy több olyan módosulást, amelyek nem befolyásolják a variáns 3D szerkezetét és aktivitását. A találmány tárgyát képezi továbbá az 1. azonosító számú szekvencia szerinti proteint kódoló, elõnyösen a 2. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvencia (a humáneredetû JAK2 gént kódoló szekvencia, amely gén a 617¹es kodonban GTC helyett TTC¹t tartalmaz; g/t mutáció, a transzdukció kezdetét jelzõ ATGtõl számított 1849¹es pozícióban, és amelyet a továbbiakban G1849T-nek nevezünk). Ez a szekvencia elõfordulhat vírus- vagy plazmidvektorban, vagy csupasz DNS-ben, bármely, emlõssejtekben hatékony promoter irányítása alatt. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezik továbbá JAK2 V617F proteint expresszáló vektorok. A találmány szerinti vektorok lehetnek klónozóés/vagy expressziós vektorok, és alkalmazhatók gazdasejtek, elsõsorban emlõssejtek, elõnyösen humáneredetû CD34+ progenitorsejtek transzfektálására, kivéve a humáneredetû embrionális sejtvonalakat vagy humáneredetû csírasejteket A PV és más mieloproliferatív szindrómák embertõl különbözõ, transzgenikus állatmodellje A találmány tárgyát képezi továbbá JAK2 V617F proteint expresszáló, embertõl különbözõ, transzgenikus állat. Elõnyösen ez az állat lehet egér vagy patkány. Modellként alkalmazható, transzgenikus patkányok vagy egerek szakember által szokásosan alkalmazott bármely eljárással elõállíthatók, elsõsorban egy Knockin (adott szekvencia célzott inszertálása) homológ rekombinációval, vagy irányított rekombinációval, a Cre- LoxP vagy FLP-FRT rendszereket alkalmazva ES¹sejtekben. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti transzgenikus sejtet úgy állítjuk elõ, hogy a JAK2 G1849T variánst génes módszerrel, azaz célzott génbevitellel bejuttatjuk ( gene targeting ) a gazdasejtgenomjának egy vagy több szekvenciájába. Pontosabban, a transzgént homológ rekombinációval inszertáljuk a gazdasejtgenomjában található homológ szekvenciáknál. Mivel transzgenikus sejtet kívánunk elõállítani abból a célból, hogy transzgenikus állatot kapjunk, a gazdasejt elõnyösen nem humáneredetû, embrionális sejtvonal (ES sejt) (Thompson és munkatársai, 1989). A génes célbajuttatás egy kromoszóma-lokusz exogén DNS-sel történõ, irányított módosítása homológ rekombináció révén, amely DNSszekvenciahomológiát mutat a megcélzott endogén szekvenciával. A génes célbajuttatásnak különbözõ típusai különböztethetõk meg. A leírásban a génes célbajuttatás kifejezést elsõsorban arra alkalmazzuk, hogy a vad típusú JAK2-gént JAK2 G1849T variánssal, vagy bármely más, genetikailag hasonló variánssal helyettesítsük. Ebben az esetben, a génes célbajuttatást Knock-in (K¹in) eljárásnak nevezzük. Más megoldás szerint, génes célbajuttatást alkalmazhatunk a vad JAK2-gén expresszálódásának a csökkentésére vagy megszüntetésére, majd a JAK2 variáns génjének a bevitelére. Ezt Knock-Out (KO) génes célbajuttatásnak nevezik (lásd Bolkey és munkatársai, 1989). A találmány szerinti sejtre jellemzõ, hogy a transzgén stabil módon integrálódik a sejtgenomjába, és hogy annak expresszálódását endogén génregulációs elemek szabályozzák. Stabil módon történõ integrálódás alatt azt értjük, hogy a transzgént a találmány szerinti sejtgenomjába inszertáljuk. Ezt követõen, az így inszertált transzgén a sejt utódaiba jut át. A transzgént integrálhatjuk a JAK2 endogén célgéntõl 3 vagy 5 ¹irányban, vagy a közepébe. Kívánt esetben, egy vagy több, pozitív vagy negatív szelekciós gént alkalmazhatunk. Alkalmazhatunk továbbá a cél-lokusszal homológiát mutató DNS-régiókat, elõnyösen kettõt, a riportergén mindkét végén, vagy a teljes inszertálandó szekvencia mindkét végén elhelyezve. A leírásban homológ DNS-régiók kifejezés alatt két olyan DNS-szekvenciát értünk, amelyekben optimális elrendezõdést és összehasonlítást követõen, a nukleotidok rendszerint körülbelül 90 95%¹a, elõnyösen legalább 98 99,5%¹a identikus. A szekvenciák összehasonlításához az optimális elrendezés elvégezhetõ Smith és Waterman lokális homológia algoritmusával (1981), Neddleman és Wunsch lokális homológia algoritmusával (1970), Pearson és Lipman hasonlóságkeresõ eljárásával (1988) vagy ezeket az algoritmusokat alkalmazó informatikai programokkal (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA és TFAS- TA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, USA). Bár akár 14 bázispárból (bp) álló, 100%¹os homológia elég ahhoz, hogy homológ rekombinációt érjünk el baktériumokban és emlõssejtekben, elõnyösebbek a hosszabb szekvenciahomológiát mutató szakaszok (általában ezek a szakaszok legalább 2000 bp, elõnyösen legalább 5000 bp méretûek, minden egyes homológ szekvencia esetében). Elõnyösen a JAK2 variánst olyan elemek csoportjába inszertáljuk, amelyek biztosítják az endogén típusú regulációt, azaz olyan csoportba, amely az endogén JAK-génnek legalább a promoterét, regulálószekvenciáit (enhanszereket, szájlenszereket, inzulátorokat) és terminálószignálját tartalmazza. 4

5 1 HU T2 2 A találmány egyik közelebbi megvalósítási módja szerint a JAK2 G1849T transzgén tartalmaz legalább kódolószekvenciát, pozitív szelekciós kazettát, amelyet keretezhetnek vagy nem keretezhetnek rekombinázok mûködésére specifikus helyek, például egy Lox/Neo- TK/Lox kazetta vagy lox/neo/lox vagy FRT/Neo- TK/FRT vagy FRT/Neo/FRT kazetta szintén jelen lehet az említett szekvencia 5 pozíciójában, és azzal jellemezve, hogy DTA és/vagy TK¹gént vagy géneket tartalmazó, negatív szelekciós kazetta van jelen a transzgén legalább egyik végén. A találmány szerinti transzgént elõnyösen közvetlenül olyan exogén DNS-bõl származtatjuk, amely természetes körülmények között állati sejtekben jelen van. Ez a natív formájú DNSszekvenciát módosítható a klónozáshoz szükséges restrikciós helyek inszertálásával és/vagy helyspecifikus rekombinációs helyek inszertálásával (lox és flp szekvenciák). Ebbõl a célból, a JAK2 G1849T variánst klónozhatjuk klónozóvektorba, hogy biztosítsuk propagálódását a gazdasejtben és/vagy kívánt esetben expressziós vektorba, hogy biztosítsuk a transzgén expresszálódását. A találmány szerinti klónozó- és/vagy expressziós vektor elõállítására alkalmas, rekombináns DNS-eljárások szakember számára jól ismertek. Standard eljárásokat alkalmaznak klónozáshoz, DNS izolálásához, amplifikáláshoz és tisztításhoz; DNS-ligázt, DNS-polimerázt és restrikciós endonukleázokat alkalmazó enzimatikus reakciókat a gyártó utasításai szerint alkalmazzák. Ezeket és más eljárásokat általában Sambrook és munkatársai (1989) szerint végzik. A vektorok közé tartoznak plazmidok, kozmidok, bakteriofágok, retrovírusok és más, állati eredetû vírusok, mesterséges kromoszómák, mint például YAC, BAC, HAC és más analóg vektorok. A találmány szerinti transzgenikus sejtek elõállítására alkalmas eljárásokat ismertettek Gordon és munkatársai (1989). Emlõssejtek transzfektálására alkalmas eljárásokat foglaltak össze Keon és munkatársai (1990). A találmány szerinti transzgén, linearizált vektorba foglaltan vagy anélkül, vagy vektor fragmenseként, standardeljárásokkal vihetõ be gazdasejtbe, például a magba történõ mikroinjektálással (US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), kalcium-foszfát precipitációs transzfektálási eljárással, lipofektálással, elektroporálással (Lo, 1983), termikus sokkal, kation polimerekkel történõ transzformálással (PEG, polibren, DEAE-dextrán, és hasonlók), vagy vírussal történõ infektálással (Van der Putten és munkatársai, 1985). Amikor a sejtek a transzgénnel transzformálódtak, azok tenyészthetõk in vitro, vagy alkalmazhatók transzgenikus, embertõl különbözõ állatok elõállítására. A transzformálást követõen a sejteket tápközegrétegre és/vagy egy megfelelõ tápközegbe oltjuk. A konstrukciót tartalmazó sejtek szelektív tápközeg alkalmazásával detektálhatók. Miután a kolóniákat megfelelõ ideig növekedni hagytuk, azokat összegyûjtjük, majd vizsgálattal meghatározzuk, hogy történt¹e homológ rekombinációs esemény és/vagy a konstrukció integrálódása Hogy kiszûrjük a homológ rekombináción átesett klónokat, a homológ rekombinációs vektorba pozitív és negatív markereket, más néven szelekciós géneket inszertálhatunk. Különbözõ rendszereket ismertettek a homológ rekombinációs eseményen átesett sejtek szelekciójára (összefoglalásért lásd az US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást). A találmány szerinti, fent említett pozitív szelekciós gén elõnyösen az antibiotikumrezisztencia-gének közül választott. Alkalmas antibiotikumok, anélkül hogy igényünket azokra korlátoznánk, a neomicin, tetraciklin, ampicillin, kanamicin, fleomicin, bleomicin, higromicin, klór-amfenikol, karbenicillin, geneticin és puromicin. Ezen antibiotikumoknak megfelelõ rezisztenciagének szakember által jól ismertek; példaként, a neomicinrezisztencia-gén rezisztenssé teszi a sejteket a tápközegben levõ G418 antibiotikum ellen. Pozitív szelekciós génként választható továbbá a HisD génje, amelynek megfelelõ szelekciós ágens a hisztidinol. Pozitív szelekciós génként választható továbbá a guanin-foszforibozil-transzferáz (GpT) génje, amelynek megfelelõ szelekciós ágens a xantin. Pozitív szelekciós génként választható továbbá a hipoxantin-foszforibozil-transzferáz (HPRT) génje, amelynek megfelelõ szelekciós ágens a hipoxantin. A homológ rekombinációs esemény azonosítására alkalmazott szelekciós marker vagy markerek a késõbbiekben befolyásolhatják a génexpresszálódást, és szükség esetén eltávolíthatók olyan, helyspecifikus rekombinázok alkalmazásával, mint például a Lox helyekre specifikus Cre rekombináz (Sauer, 1994; Rajewsky és munkatársai, 1996; Sauer, 1998) vagy az FRT helyekre specifikus FLP rekombináz (Kilby és munkatársai, 1993). A pozitív kolóniák, azaz amelyek olyan sejteket tartalmaznak, amelyekben legalább egy homológ rekombinációs esemény történt, southern blotting vizsgálattal vagy PCR-eljárással azonosíthatók. Az izolált sejtekben vagy a találmány szerinti transzgenikus állatokban a transzgénnek megfelelõ mrns expresszálódásának a szintje Northern blotting vizsgálattal, in situ hibridizációs vizsgálattal és RT¹PCR eljárással egyaránt meghatározható. A transzgént expresszáló állati sejtek vagy szövetek azonosíthatók továbbá a riporterprotein ellen irányuló ellenanyagok alkalmazásával. A pozitív sejtek ezt követõen alkalmazhatók embrión történõ manipulálásokra és elsõsorban a homológ rekombinációval módosított sejtek blasztocisztákba történõ injektálására. Egerek vonatkozásában, a blasztocisztákat 4 6 hetes, szuperovulált nõstényekbõl nyertük ki. A sejteket tripszinnel kezeltük, majd a módosított sejteket egy blasztociszta csírahólyagüregébe injektáltuk. Az injektálást követõen, a blasztocisztákat álvemhes nõstények méhszarvába vittük be. Hagytuk, hogy a nõstény egerek kihordják vemhességüket, és a világra jött utódokat vizsgáltuk a konstrukciót tartalmazó mutáns sejtek jelenlétére. Az újszülött embriók sejtjei és blasztociszta-sejtek vagy ES¹sejtek közötti, fenotípusbeli eltérés vizsgálata lehetõvé tette a kiméra újszülöttek azonosítását. A kiméra embriókat ezt követõen ivarérett 5

6 1 HU T2 2 korig felneveltük. Kimérák alatt, vagy kiméra, embertõl különbözõ állatok alatt olyan állatokat értünk, amelyek sejtjeinek csak egy szubpopulációja tartalmaz módosított genomot. A módosított gént vagy géneket hordozó kiméra állatokat általában egymás között, vagy vad típusú, embertõl különbözõ állattal keresztezik abból a célból, hogy heterozigóta vagy homozigóta utódokat kapjanak. A heterozigóta hímeket és nõstényeket ezt követõen keresztezik, hogy homozigóta állatokat állítsanak elõ. Amennyiben másként nem jelöljük, a találmány szerinti, embertõl különbözõ transzgenikus állatok csíravonalsejtjei a nukleotidszekvencia stabil változásait hordozzák. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány szerinti, embertõl különbözõ transzgenikus sejt sejtmagdonorként alkalmazható sejtmag transzferjéhez, vagyis nukleáris transzferhez. Nukleáris transzfer alatt azt értjük, hogy felnõtt vagy magzat gerinces élõ donor sejtjébõl átvisszük a sejtmagot azonos, vagy eltérõ, embertõl különbözõ faj, sejtmagjától megfosztott gazdasejtjének a citoplazmájába. Az átvitt sejtmag át van programozva, hogy klónozott embriók fejlõdését irányítsa, amelyek átvihetõk dajka-anyákba magzatok és újszülöttek kihordása céljából, vagy alkalmazhatók a belsõ sejttömeg sejtjeinek az elõállítására tenyészetekben. Különbözõ magklónozási eljárások alkalmazhatók; ezek közül a korlátozás szándéka nélkül idézünk nemzetközi közzétételi iratokat, amelyeknek tárgyát ilyen eljárások képezik: WO 95/17500, WO 97/07668, WO 97/07669, WO 98/30683, WO 99/01163 és WO 99/37143 számú nemzetközi közzétételi iratok. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi transzgenikus állat, amely a JAK2 V617F proteint kódoló rekombináns szekvenciát tartalmazza. Ezek az állatok lehetnek homozigóták vagy heterozigóták (JAK2 V617F/JAK2 V617F vagy JAK2 V617F/JAK2). Ezek az állatok elsõsorban a Vaquez poliglobuliát reprodukálják, valamint a JAK2 V617F által indukált minden mieloproliferatív szindrómát. Ennek megfelelõen ezek az állatok lehetõvé teszik a tirozinkináz funkcionális inhibitorainak a szûrését, elõnyösen a JAK2 V617F specifikus inhibitorainak a szûrését. Más megoldás szerint, JAK2 V617F variánst expresszálni képes vírusvektor (retrovírus vagy lentivírus vagy hasonlók) injektálható nem humán hematopoietikus õssejtekbe, nem humán progenitorsejtekbe vagy nem humán ES¹sejtekbe Vaquez poliglobulia és más mieloproliferatív szindrómák modelljének a létrehozása céljából. Diagnosztikai eszközök Egy harmadik szempont szerint a találmány tárgyát képezik diagnosztikai eljárások, amelyek lehetõvé teszik a JAK2 V617F mutáció jelenlétének vagy hiányának a detektálását olyan emlõsökben, amelyek mioproliferatív szindrómában szenvednek vagy annak gyanúját mutatják, elõnyösen olyan betegekben, akik poliglobuliát mutatnak és akikrõl gyanítjuk, hogy Vaquez poliglobulia, thrombocitaemia és/vagy mielofibrózis tüneteit mutatják. Ebben a tekintetben a találmány tárgyát képezik primerek és próbák, amelyekkel a fentebb ismertetett, azonosító számú szekvencia szerinti mutáció jelenléte vagy hiánya detektálható. Még elõnyösebben a találmány tárgyát képezi izolált nukleinsav, amely a 12¹es exon 10, 12, 15, 20, 30, 40 vagy 50 egymást követõ nukleotidját (például vagy nukleotidját) tartalmazza, vagy a t 1849 ¹es mutált nukleotidot tartalmazó alábbi 3. vagy 4. azonosító számú szekvencia nukleotidját tartalmazzák. 3. azonosító számú szekvencia ctcatatgaaccaaatggtgtttcacaaaatcagaaatgaagatttgatatt taatgaaagccttggccaaggca cttttacaaag atttttaaaggcgtacgaagagaagtaggagactacggtcaactgcatg aaacagaagttcttttaaaagttctg gataaagcac acagaaactattcagagtctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagc tttctcacaagcatttggttttaa attatggagtatg tt 1849 tctgtggagacgagaatattctggttcaggagtttgtaaaatttggat cactagatacatatctgaaaaa gaataaaaatt gtataaatatattatggaaacttgaagttgctaaacagttggcatgggccat gcattttctagaagaaaacaccc ttattcatggga atgtatgtgccaaaaatattctgcttatcagagaagaagacaggaagac aggaaatcctcctttcatcaaactta gtgatcctgg cattagtattacagttttgccaaaggacattcttcaggag Az aláhúzott szekvencia példaként jelöl ki 5 ¹ vagy 3 ¹irányban levõ olyan szakaszokat, amelyek lehetõvé teszik az 1849¹es pozícióban található mutációra specifikus próbák és primerek megtervezését (4. azonosító számú szekvencia). Példák különbözõ, a találmány szerinti, elõnyös primerekre és próbákra DNS¹en, PCR-primerek: JAK2EXON12-PCRF SZENSZ 5 ¹GGGTTTCCTCA- GAACGTTGA¹3 ( ) (5. azonosító számú szekvencia) JAK2EXON12-PCRR ANTISZENSZ 5 ¹TTGCTTTC- CTTTTTCACAAGA¹3 ( ) (6. azonosító számú szekvencia) DNS¹en, szekvenáló primerek: JAK2EXON12SEQF SZENSZ 5 ¹CAGAACGTT- GATGGCAGTTG¹3 ( ) (7. azonosító számú szekvencia) JAK2EXON12SEQR ANTISZENSZ 5 ¹TGAATAGTCC- TACAGTGTTTTCAGTTT¹3 (8. azonosító számú szekvencia) cdns¹en, PCR és szekvenáló primerek: SZENSZ 5 ¹CAACCTCAGTGGGACAAAGAA¹3 ( ) (9. azonosító számú szekvencia) ANTISZENSZ 5 ¹GCAGAATATTTTTGGCACATACA¹3 ( ) (10. azonosító számú szekvencia) SNPS próbák és mutáció, valamint sirns detektálása ( ): TTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGA- GAATATTC (11. azonosító számú szekvencia) 6

7 1 HU T2 2 Genotipizálás Light Cycler eljárással (PNN DNS vagy csontvelõi DNS) Oligo S (szensz) GGCAGAGAGAATTTTCTGAAC (15. azonosító számú szekvencia) Oligo R (antiszensz) GCTTTCCTTTTTCACAAGATA (16. azonosító számú szekvencia) Szenzor vt GTCTCCACAGACACATACTCCATAA 3 FL (17. azonosító számú szekvencia) Horgony JAK2 5 ¹LC Red640Red640AAAACCAAATG- CTTGTGAGAAAGCT 3 ¹PH (18. azonosító számú szekvencia) Genotipizálás Light Cycler készüléken (például vérlemezke cdns¹en) cjak2f GCACACAGAAACTATTCAGAGTC (19. azonosító számú szekvencia) cjak2s AGCAGCAAGTATGATGAGC (20. azonosító számú szekvencia) cjak2a CTAGTGATCCAAATTTTACAAACT (21. azonosító számú szekvencia) cjak2r GTTTAGCAACTTCAAGTTTCC (22. azonosító számú szekvencia) Szenzor vt GTCTCCACAGACACATACTCCA- TAA3 ¹FL (23. azonosító számú szekvencia) Horgony JAK2 5 ¹LC Red640AAAACCAAATGCTTGT- GAGAAAGCT3 ¹PH (24. azonosító számú szekvencia) Genotipizálás TaqMan eljárással (például csontvelõ mononukleáris sejtek DNS¹én) Allél és egyszálú DNS kimutatása specifikus fluoreszcens próbák alkalmazásával. PCR-reakció Szensz primer szekvencia: AAGCTTTCTCACAAG- CATTTGGTTT (25. azonosító számú szekvencia) Antiszensz primer szekvencia: AGAAAGGCATTA- GAAAGCCTGTAGTT (26. azonosító számú szekvencia) Riporter 1. szekvencia (VIC): TCTCCACAGACACA- TAC (27. azonosító számú szekvencia) Riporter 2. szekvencia (FAM): TCCACAGAAACATAC (28. azonosító számú szekvencia) Egy további nézõpontból a találmány tárgyát képezi in vitro és ex vivo diagnosztikai eljárás, amellyel a JAK2 V617F mutáció jelenléte vagy hiánya detektálható adott mintában. Tesztek a találmány szerinti nukleinsavakkal A találmány egyik megvalósítási módja szerint a G1849T variáns (amely megfelel a JAK2 V617F mutációnak) a JAK2 gén nukleinsavmolekulájának a vizsgálatával detektálható. A leírásban a nukleinsav kifejezés alatt mrns¹t, genomiális DNS¹t vagy mrns-bõl származtatott cdns¹t értünk. A G1849T variáns nukleinsav jelenléte vagy hiánya detektálható szekvenálással, amplifikálással és/vagy a fent ismertetett bármely specifikus próbával vagy specifikus primerekkel történõ hibridizálással: a 3. vagy 4. azonosító számú szekvencia szerinti, és az azonosító számú szekvenciák szerinti, vagy a azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciákból származtatott szekvenciákkal Ennek megfelelõen a találmánnyal ex vivo vagy in vitro eljárásra teszünk javaslatot a JAK2 G1849T variáns jelenlétének vagy hiányának a detektálására olyan beteg mintájából, aki PV¹ben szenved vagy hajlamos arra, hogy szervezetében PV, vagy bármely más mieloproliferatív szindróma, például eritrocitózis, thrombocitaemia és mielofibrózis alakuljon ki, és amely eljárás az alábbiakat tartalmazza: a JAK2-gén G1849T variánsa jelenlétének vagy hiányának a detektálását a beteg nukleinsavmintájában, azzal jellemezve, hogy a G1849T variáns jelenléte PV¹re vagy bármely más, mieloproliferatív szindrómára utal. A nukleinsavminta bármely sejtforrásból vagy szöveti biopsziából származhat. A sejteknek haemopoietikus eredetûnek kell lenniük, és levehetõk keringõ vérbõl, haemopoietikus szövetbõl vagy bármely, vérsejteket tartalmazó testfolyadékból. A DNS a technika állása szerinti bármely eljárással extrahálható, például Sambrook és munkatársai (1989) által ismertetett eljárásokkal. RNS szintén izolálható, például biopsziával kapott szövetbõl, szakember számára jól ismert, szokásos eljárásokkal, például guanídium-tiofenát-fenol-kloroform-extrakcióval. A JAK2-gén G1849T variánsa detektálható RNSvagy DNS-mintában, elõnyösen amplifikálást követõen. Például az izolált RNS¹t alávethetjük reverz transzkripciónak, majd amplifikációnak, például RT¹PCR-reakcióval, olyan oligonukleotidok alkalmazásával, amelyek a mutált helyre specifikusak, vagy amelyek lehetõvé teszik a mutációt tartalmazó régió amplifikálását, például a 12¹es exon, vagy a 3. vagy a 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciák alkalmazásával. A leírásban oligonukleotid kifejezés alatt olyan nukleinsavat értünk, amely legalább 10, elõnyösen 15 20, elõnyösen 100-nál kevesebb nukleotidot tartalmaz, és amely képes JAK2 genomiális DNS-hez, cdns-hez vagy mrns-hez hibridizálni. A találmány szerinti oligonukleotidok szakember számára jól ismert, bármely eljárással megjelölhetõk, mint például radioaktív, fluoreszcens vagy enzimatikus markerekkel. Adott, megjelölt oligonukleotid próbaként alkalmazható a JAK2-gén G1849T variánsa jelenlétének vagy hiányának a detektálására. Ennek megfelelõen a találmány szerint alkalmazott próbák és primerek olyanok, amelyek specifikusan hibridizálnak a JAK2-génhez az 1849¹es pozíció szomszédságában (a számozást a transzkripció kezdetét jelzõ ATG-tõl kezdve). A fentebb ismertetett eljárás szerint, a nukleinsavakat amplifikálhatjuk PCR-rel az allélikus variáció detektálását megelõzõen. Allélikus variációk detektálására alkalmas eljárásokat ismertetnek például a Molecular Cloning A Laboratory Manual, második kiadás, Sambrook, Fritsch és Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), a Laboratory Protocols for Mutation Detection, szerk. U. Landegren, Oxford University Press (1996) és PCR, második kiadás, Newton és Graham, BIOS Scientific Publishers Limited (1997) szakirodalmi helyek. 7

8 1 HU T2 2 Ebbõl a szempontból lehetséges amplifikációs lépés, majd azt követõ detektálási lépés kombinálása, amely lehetõvé teszi a minták elkülönítését a keresett variáns jelenléte vagy hiánya szerint. Erre a célra adaptált eljárásokat ismertet az EP számú közzétételi irat, amelyek lehetnek DNS-szekvenálás, SSCP, DGGE vagy TGGE hibridizációs szekvenálás, heteroduplex analízis, CMC, enzimatikus hasítás bázispárosítási hibánál ( mismatch ), hibridizációalapú szilárd fázisú hibridizáció ( hybridization based solid phase hybridization ), DNS-chipek ( DNA chips ), Taqman oldott fázisú hibridizáció (US és US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások), valamint az RFLP eljárás. A detektálás különbözõ alternatív eljárásokkal végezhetõ: FRET, fluoreszcenciakioltás, polarizált fluoreszcencia, kemilumineszcencia, elektrokemilumineszcencia, radioaktivitás és kolorimetria eljárásokkal. A találmány szerinti eljárás tartalmazhatja nukleinsav mintából történõ extrahálását. Amint azt fentebb ismertettük, az alkalmazott minta lehet az egyéntõl levett vér, vagy bármely más testfolyadék vagy szövet. A nukleinsav extrahálását és tisztítását követõen, a detektálási szignál erõsítésére a fentebb ismertetett primerek alkalmazásával PCR-amplifikációt végezhetünk. Ennek megfelelõen a találmány szerinti eljárás tartalmazhat amplifikációs lépést a fenti primerekkel, amelyet hibridizációs lépés követ legalább egy próbával, elõnyösen két próbával, amelyek erõsen stringens körülmények mellett hibridizálnak a fenti G1849T mutációs régiónak megfelelõ szekvenciákkal, és a fenti próbák markerei által kibocsátott szignál detektálásának a lépését. Közelebbrõl a találmány tárgyát képezi például in vitro eljárás a JAK2-gén G1849T variánsa jelenlétének vagy hiányának a meghatározására PV¹ben szenvedõ, vagy PV vagy bármely más mieloproliferatív szindróma gyanújának kitett beteg mintájából, amely eljárás tartalmazza a JAK2-gén G1849T variánsa jelenlétének vagy hiányának a detektálását adott nukleinsavmintában, a JAK2-gén G1849T mutációjára specifikus, egy vagy több SNP ( single nukleotid polymorphism ), elõnyösen a 17., 18., valamint a 23. és 24. azonosító számú szekvenciák alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy a G1849T variáns jelenléte PV vagy bármely más mieloproliferatív szindróma jelenlétére utal. Az SNP¹k alkalmazásával végzett detektálást Taq- Man technológiával végezhetjük, amely lehetõvé tesz allélikus megkülönböztetést. Az eljárás lényegében a JAK2 1849¹es alléljának arra specifikus fluoreszcens próbával, egyszálú DNS¹en történõ felismerésébõl áll, és tartalmaz PCR-reakciót (5 exonukleáz aktivitású polimerázzal), a hibridizált SNP allélokra specifikus fluoreszcenciakibocsátás detektálását, valamint a genotípus meghatározását a fluoreszcencia végpontban történõ leolvasásával (mutált homozigóta, heterozigóta és normál DNS-klaszterek képének megjelenítésével) A JAK2 V617F mutált protein detektálása A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a variáns közvetlenül detektálható a JAK2-proteinen belül. Ebbõl a célból, a találmány tárgyát képezi in vitro eljárás a JAK2 V617F variáns jelenlétének vagy hiányának a meghatározására PV¹ben szenvedõ, vagy PV vagy bármely más mieloproliferatív szindróma, elsõsorban eritrocitózis, thrombocitaemia és mielofibrózis gyanújának kitett beteg mintájából, amely eljárás tartalmazza: a JAK2 V617F variáns jelenlétének vagy hiányának a detektálását a beteg mintájában, azzal jellemezve, hogy a variáns jelenléte PV vagy bármely más mieloproliferatív szindróma fennállására utal. A fenti JAK2 V617F variáns a technika állása szerinti bármely megfelelõ eljárással detektálható. Még elõnyösebben az egyéntõl levett minta érintkeztethetõ a JAK2-protein V617F variánsára specifikus ellenanyaggal, például olyan ellenanyaggal, amely különbséget képes tenni a V617F variáns és a nem mutált JAK2-protein (és minden más protein) között. A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek monoklonális vagy poliklonális ellenanyagok, egyláncú vagy dupla láncú ellenanyagok, kiméra ellenanyagok, humanizált ellenanyagok vagy immunglobulinmolekulák fragmensei, amelyekrõl a technika állása szerint ismert, hogy antigénkötõ-fragmenseknek felelnek meg [humán fragmensek, humán F(ab ) és F(v) fragmensek]. Az ellenanyagok lehetnek immunkonjugáltak, például toxinnal vagy markerrel. Poliklonális ellenanyag elõállítására alkalmas eljárások szakember számára jól ismertek. Ilyen ellenanyagok általában elõállíthatók a JAK2 V617F variáns új¹zélandi fehér nyulakba történõ szubkután injektálásával, amelyekbõl elõzõleg preimmun szérumot vettünk le. Az antigént legfeljebb 100 l¹es adagokban injektáljuk, 6 különbözõ helyre. A nyulakat az elsõ injektálást megelõzõen elõkészítjük, majd idõszakonként stimuláljuk ugyanazzal az antigénnel, körülbelül háromszor, hat héten át. Ezt követõen, minden injektálás utáni 10. napon szérummintát veszünk. A poliklonális ellenanyagot ezt követõen affinitáskromatográfiás eljárással tisztítjuk, az ellenanyagok befogására JAK2 V617F-proteint alkalmazva. Nagyfokú specificitásuk miatt, a monoklonális ellenanyagok elõnyösebbek a poliklonális ellenanyagoknál. Monoklonális ellenanyagok elõállítására alkalmas eljárások szakember számára hozzáférhetõk, figyelembe véve, hogy a JAK2 V617F variáns 3D szerkezete eltér a vad JAK2-proteinétõl. A leírásban a monoklonális ellenanyag kifejezés olyan ellenanyagot jelöl, amely adott antigén egyetlen epitópját ismeri fel. Monoklonális ellenanyagokat úgy állíthatunk elõ, hogy emlõst, például egeret, patkányt vagy más emlõst tisztított JAK2 V617F variánssal immunizálunk. Az immunizált emlõsállat ellenanyagot termelõ sejtjeit izoláljuk, majd mielóma- vagy heteromielómasejtekkel fuzionáltatjuk, hogy hibridsejteket kapjunk (hibridómákat). 8

9 1 HU T2 2 A monoklonális ellenanyagokat termelõ hibridómákat az ellenanyag-termelés forrásaként alkalmazzuk. Az ellenanyagok elõállításának olyan technikái, amelyek nem igényelnek immunizálást, szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. Ilyen például a phage display eljárás. A JAK2 V617F variáns ellen irányuló ellenanyagok néhány esetben keresztreakciót mutathatnak a vad JAK2-proteinnel. Amennyiben ez történik, a V617F variánsra specifikus ellenanyagok szelekciója szükséges. Ilyenkor alkalmazható például affinitáskromatográfia a vad JAK2 protein alkalmazásával, hogy befogjuk (és eltávolítsuk) a vad JAK2-proteinnel keresztreagáló ellenanyagokat. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezik a JAK2 V617F variánst specifikusan felismerõ monoklonális ellenanyag, valamint az azt termelõ hibridómasejtvonalak. A találmány tárgyát képezi továbbá ELISA eljárás, amely a fenti ellenanyagot a JAK2 V617F variáns adott mintában való jelenlétének vagy hiányának a detektálására alkalmazza. Ellenanyagok alkalmazásának egyik alternatívája lehet haptamerek elõállítása és azonosítása, amelyek a molekulák olyan osztálya, amely specifikus molekuláris felismerést tesz lehetõvé. A haptamerek oligonukleotidok vagy oligopeptidek, amelyek bármely osztályba tartozó célmolekulákat képesek nagy affinitással és specificitással virtuálisan felismerni. Vizsgálati reagenskészletek Egy további nézõpont szerint, a találmány tárgyát képezik reagenskészletek annak meghatározására, hogy adott beteg szenved¹e PV¹ben vagy bármely, JAK2 V617F variánssal összefüggõ mieloproliferatív szindrómában. A találmány szerinti reagenskészlet tartalmazhat egy vagy több, fentebb ismertetett próbát vagy primert, amelyek alkalmasak a JAK2-génben bekövetkezett G1849T mutáció jelenlétének vagy hiányának a specifikus detektálására. A reagenskészlet tartalmazhat továbbá termorezisztens polimerázt a PCR-amplifikációhoz, egy vagy több, amplifikációhoz és/vagy hibridizációhoz alkalmazható oldatot, és a marker detektálására alkalmas bármely reagenst. Egy további megvalósítási mód szerint, a reagenskészlet tartalmaz bármely, a fentiek szerinti ellenanyagot. A találmány szerinti reagenskészletek tartalmazhatnak továbbá szilárd hordozón történõ hibridizációhoz vagy immunológiai reakcióhoz adaptált minden reagenst. Az eljárást és a detektálókészletet elõnyösen a betegek olyan szubpopulációján alkalmazzuk, amelynek a hematokritszintje magasabb mint 51%. Továbbá az eljárást és a detektálókészletet elõnyösen a betegek olyan szubpopulációján alkalmazzuk, amelynek a vérlemezkeszáma magasabb mint A találmány szerinti sirns A találmány negyedik szempontja szerint a találmány tárgyát képezik sirns¹ek, amelyek képesek a 617 pozícióban mutált JAK2, elõnyösen a JAK2 V617F expresszálódásának több mint 50, 75, 90, 95 vagy több mint 99%¹os csökkentésére. Ilyen sirns bejuttatható sejtekbe vagy szövetekbe lipofekcióval, transzdukcióval vagy elektroporálással. Alkalmazhatók a JAK2 V617F variánst kódoló mrns specifikus elpusztítására, ezáltal számos terápiás lehetõséget, elõnyösen a PV kezelésének lehetõségét rejtik magukban. sirns-eket ismertet az US 60/ számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (CARNEGIE). Az RNS¹t jellemzi, hogy egy régiója dupla szálú szerkezetet mutat ( double strand, ds). A gátlás specifikus a célszekvenciára, az RNS ds¹régió egyik szálának a nukleotidszekvenciája legalább 25 bázist tartalmaz, és identikus a célgén megfelelõ részével. Az RNS ds¹régió másik szálának a nukleotidszekvenciája komplementer az elsõ szállal és a célgén megfelelõ részével. Másfelõl, a WO 02/ számú nemzetközi közzétételi irat (MIT/MAX PLANCK INSTITUTE) dupla szálú RNS¹t ismertet (vagy azonos természetû, kémiailag szintetizált oligonukleotidokat), amelynek az egyes szálai nukleotid hosszúak, és amely RNS-interferencia révén képes specifikusan gátolni egy célgén transzkripciót követõ expresszálódását, abból a célból, hogy modulálja ezt a funkciót adott sejtben vagy szervezetben. Végül, a WO 00/44895 számú nemzetközi közzétételi irat (RIBOPHARMA) eukariótasejtbõl származó, adott célgén in vitro expresszálódásának a gátlását ismerteti, amely szerint két egyes szálból képzõdött dsrns¹t vittek be a sejtbe, a dsrns egyik szála a célgén komplementer-régiója volt, azzal jellemezve, hogy a komplementer-régió kevesebb mint 25 pár, egymást követõ nukleotidpárból állt. A találmány szerinti sirns elõállításához a fenti dokumentumok szakember számára a kitanítás részét képezik. Még elõnyösebben, a találmány tárgyát képezik körülbelül nukleotidot, elõnyösen nukleotidot vagy elõnyösebben körülbelül 19 nukleotidot tartalmazó, dupla szálú RNS¹ek, amelyek komplementerek (egyik szál), illetve azonosak (másik szál) a G1849T mutációt tartalmazó, 3. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciával. A találmány szerinti sirns¹ek 3 ¹végükön tartalmazhatnak továbbá egy TT vagy UU dinukleotidot. A találmány szerinti sirns¹ek tervezéséhez számos program férhetõ hozzá: sisearch Program : [ Improved and automated prediction of effective sir- NA, Cham1 AM, Wahlesdelt C és Sonnhammer ELL, Biochemical and Biophysical Research Communications (2004)]. SiDirect : [ Direct:highly effective, target-specific sirna design software for mammalian RNA interference, Yuki Naito és munkatársai: Nucleic Acids Res, 32, N Web Server Issue Oxford University Press (2004)]. 9

10 1 HU T2 2 sirna Target Finder : Ambion, sirna design tool : Whitehead Institute of Biomedical Research, MIT, További programokat ismertetnek az alábbi helyek: NAs.htm. és Például a TATGGAGTATGTT I849 TCTGTGGAGA (12. azonosító számú szekvencia) szekvencia számára a megfelelõ szensz sirns az UGGAGUAUGUUU- CUGUGGAdTdT (13. azonosító számú szekvencia), megfelelõ antiszensz sirns az UCCACAGAAACAUA- CUCCAdTdT (14. azonosító számú szekvencia). A találmány egyik közelebbi megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti, fent ismertetett sirnseket teszteljük és szelektáljuk azon képességükre nézve, hogy specifikusan csökkentik, vagy akár blokkolják a JAK2 V617F variáns expresszálódását úgy, hogy a lehetõ legkisebb mértékben befolyásolják a vad típusú JAK2 protein expresszálódását. Például a találmány tárgyát képezik olyan sirns¹ek, amelyek lehetõvé teszik a JAK2 V617F expresszálódásának a 80, 90, 95 vagy 99%¹os csökkentését, míg a vad típusú JAK2 expresszálódását nem, vagy csak kevesebb mint 50, 25, 15, 10 vagy 5 vagy akár 1%¹ban csökkentik. Például a találmány szerinti sirns az alábbiak közül választott: UGGAGUAUGUUUCUGUGGA (29. azonosító számú szekvencia) GGAGUAUGUUUCUGUGGAG (30. azonosító számú szekvencia) GAGUAUGUUUCUGUGGAGA (31. azonosító számú szekvencia) Egy további megvalósítási mód szerint, a találmány tárgyát képezi olyan ddrnsi molekula, amelyet a WO 01/70949 számú nemzetközi közzétételi irat (Benitec) generikus módon ismertet, azonban amely ddrnsi molekula specifikusan a JAK2 V617F variánst célozza meg. A találmány szerinti ddrnsi lehetõvé teszi a JAK2 V617F variánst kódoló szekvencia kioltását, és tartalmaz (i) egy szekvenciát, amely identikus a 3., 4. vagy 11. azonosító számú szekvenciákkal; (ii) egy szekvenciát, amely komplementer az (i) szerinti szekvenciával; (iii) egy intront, amely elválasztja egymástól a fenti (i) és (ii) szekvenciákat; valamint tartalmazza a konstrukció bevitelét JAK2 V617F variáns expresszálódásának a módosítására képes RNS¹t produkáló sejtbe vagy szövetbe. A találmány tárgyát képezi továbbá genetikailag módosított, embertõl különbözõ állat, amely egy vagy több olyan genetikai konstrukciót hordozó sejtet tartalmaz, amely képes az állatban a JAK2 V617F expresszálódásának a blokkolására, késleltetésére vagy csökkentésére. Ilyen, genetikailag módosított állat elõállítására alkalmas eljárást ismertet a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi irat (Benitec) Szûrõeljárások Egy ötödik szempont szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás JAK2 V617F variánsra specifikus inhibitorokra történõ szûrés. A leírásban specifikus inhibitorok alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek esetében a JAK2¹re vonatkozó IC 50 -érték és a JAK2 V617F¹re vonatkozó IC 50 - érték egymáshoz viszonyított aránya magasabb mint 5, 10, 25 vagy akár 50. Például a vegyületnek a JAK2 V617F variánsra vonatkozó IC 50 -értéke kisebb, mint 1 mol/l, elõnyösen 100 nmol/l, míg a JAK2¹re vonatkozó IC 50 -értéke magasabb mint 5 mol/l vagy 10 mol/l. Az eljárás elvégezhetõ a találmány szerinti protein, a proteint tartalmazó membránfrakció, a proteint expresszáló sejt vagy a fentiek szerinti, embertõl különbözõ transzgenikus állat alkalmazásával. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi olyan teszt, amellyel meghatározható a JAK2 V617F egy vagy több vegyület által történõ specifikus gátlása, amely teszt tartalmazza egy vagy több vegyület érintkeztetését a fenti JAK2 V617F proteinnel, JAK2 V617F proteint tartalmazó membránfrakcióval vagy JAK2 V617F proteint expresszáló sejttel, olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik a JAK2 V617F protein kötõdését és a specifikus kötõdés és/vagy gátlásának a detektálását. Az eljárás tartalmazhatja továbbá a vad típusú JAK2-proteinen történõ kötõdés mérését. Az eljárás tartalmazhatja továbbá számos molekula egymást követõ tesztelését, valamint tartalmazhat egy szelekciós lépést olyan molekulák szûrésére, amelyek a JAK2 V617F proteinre nézve 1 mol/l¹nál kisebb, vagy elõnyösen 100 nmol/l¹nál kisebb IC 50 -értéket mutatnak. Az eljárás tartalmazhatja továbbá a fenti molekulák negatív szelekciós lépését, olyan molekulák kiszûrésére, amelyek a JAK2 vonatkozásában kisebb, mint 5 mol/l vagy 1 mol/l IC 50 -értéket mutatnak. A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb ismertetett in vitro szûrési eljárás, amely szerint a JAK2 V617F foszforilációjának a gátlását immunprecipitációval detektáljuk. A találmány tárgyát képezi továbbá CD34+ JAK2 V617F progenitorsejtek in vitro történõ szûrése, amelyek eritropoietin (Epo) nélkül képesek differenciálódni. Az ilyen sejteket PV¹ben szenvedõ betegekbõl izoláljuk. A CD34+ JAK2 V617F-sejtek SCF és IL 3 ágenseket tartalmazó tápközegben tenyészthetõk. A vegyületeket hozzáadjuk a tápközeghez, és meghatározzuk a sejtek azon képességét, hogy proliferálódnak és 36+/GPA sejtekké differenciálódnak. Azokat a vegyületeket választjuk ki, amelyek esetében a 36+/GPA klónok számának a csökkenése figyelhetõ meg. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi a fenti szûrési eljárás, eritropoietin nélkül differenciálódni képes CD+ JAK2 V617F primer progenitorsejtek vagy olyan sejtek alkalmazásával, amelyek a JAK2 V617F variáns bevitelével faktorfüggetlenné váltak. Ugyanez a típusú vizsgálat végezhetõ félig szilárd tápközegben CFU¹E típusú csontvelõtenyészeten, amelyben közvet- 10

11 1 HU T2 2 lenül teszteljük a vegyületnek spontán kolóniák növekedésére kifejtett gátlását. Alkalmazható továbbá bármely, fentebb ismertetett emlõssejtvonal, amely JAK2 V617F rekombináns variánst expresszál. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás potenciális gyógyhatású készítmények azonosítására, amely szerint a vegyületet beadjuk a fent ismertetett, JAK2 V617F variánst expresszáló, transzgenikus, embertõl különbözõ állatnak, amely állat PV¹ben szenved, vagy JAK2 V617F jelenlétével asszociált mieloproliferatív szindrómát mutat, abból a célból, hogy meghatározzuk a vegyület hatását, és olyan potenciális gyógyhatású készítményt szelektáljunk, amely PV esetében az eritroblasztok spontán proliferációjának a csökkenését vagy blokkolását vonja maga után, vagy a JAK2 V617F jelenlétével asszociált sejtproliferáció csökkenését okozza. Közelebbrõl, az eljárás K¹in JAK2 V617F variánst hordozó egér vagy K¹in JAK2 V617F variánst hordozó patkány alkalmazásával végezhetõ. Ilyen vegyületekre példák a mutált JAK2 12¹es exonját megcélzó, fent ismertetett sirns¹ek, elõnyösen a t 1849 ¹es pozícióban mutált nukleotidot tartalmazó 3., 4. és 11. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciákat megcélzó sirns¹ek. Egy további szempont szerint a találmány tárgyát képezi a fent ismertetett sirns vagy ddrnsi és a JAK2 V617F-variánst specifikusan gátló vegyületek alkalmazása gyógyhatású készítmény elõállítására. Az ilyen gyógyhatású készítmények alkalmasak elsõsorban vérrákok, elõnyösen a PV¹t, esszenciális thrombocitaemiát, mieloid splenomegaliát vagy primitív mielofibrózist és krónikus mieloid leukémiát ( leucémie myeloide chronique, LMC) magukban foglaló mieloproliferatív szindrómák kezelésére. A gyógyhatású készítmény alkalmas továbbá a JAK2 V617F mutációval asszociált, további malignus haemopathiák kezelésére, valamint adott esetben JAK2 V617F variánst expresszáló plasztikus tumorok, karcinómák, melanómák és neuroblasztómák kezelésére. A leírás további részéhez és a példákhoz utalunk az ábrákra, amelyek feliratait alább ismertetjük. Ábrák ismertetése 1. ábra: JAK2 szerepének a felfedezése PV¹ben. Alapállapotban, a JAK2 a BOKSZ 1¹hez fixált, nem foszforilált állapotban. Az EPO-hoz kapcsolódás módosítja a receptor konformációját és lehetõvé teszi a JAK2 transzfoszforilezését, amely viszont foszforilezi az R¹EPO intracitoplazmális csoportjait, és ezáltal összegyûjti a szignáltranszdukció különbözõ pozitív ( ) vagy negatív ( I) effektorait. 2. ábra: Erithropoietin nélkül differenciálódni képes CD+ PV progenitorok tenyésztési modelljének a kivitelezése. 2A. tenyésztés EPO, SCF és IL3 jelenlétében 2B. tenyésztés EPO nélkül 3. ábra: A JAK-STAT, Pi3¹K és Src-kináz utak gátlása megakadályozza a spontán eritroid differenciálódást ábra: Protokoll a JAK2 gátlására PV progenitorokban. 5. ábra: A JAK2 PV progenitorokban történt gátlásának az eredménye. 5A. A 36+/gpa sejtek klónképzõ kapacitásának a csökkenése. J1 J6 tenyészet SCF-IL3 mellett, elektroporáció J5, válogatás J6 (morpho/36+/gpa ). Csak metil-scf. Számolás J13-nál (J7 válogatás után) 5B. A JAK2 szerkezete a V617F (12¹es exon) mutációval 6. ábra: SNP¹k genotípusanalízise JAK2 V617Fmutáció detektálására genomiális DNSben LightCycler és TaqMan eljárásokkal A és B: Mutáció detektálása LightCycler fúziós analízis görbével, FRET hibridizációs próbával. A: Vizsgálatok HEL DNS különbözõ hígításaival, TF¹1 DNS-ben. A JAK2 V617F (57 ) csúcs 1%¹os hígítás mellett még detektálható. B: Betegek reprezentatív mintáinak az eredményei (#1: homozigóta betegek; #2: heterozigóta betegek; #3: mérsékelt betegek; #4: nem mutált betegek). C: A mutáció detektálása TaqMan allélspecifikus amplifikálással. HEL DNS hígításokkal (HEL 100 1%: üres négyzetek; TF¹1 sejtek: üres körök), valamint néhány beteg reprezentatív mintáival végzett vizsgálatok (fekete keresztek). (#a: homozigóta betegek; #b: heterozigóta betegek; #c: mérsékelt betegek; #d: nem mutált betegek. 7. ábra: Eritrocitózis diagnózisára ajánlott diagnosztikai lap (azaz 51%¹os hematokritszint felett) A lap egyes stádiumaihoz tartozó betegek számát a tétel mellett tüntettük fel (n), csak olyan betegeket soroltunk ide, akiknek minden klinikai adata megvolt (n=81). A JAK2 V617F mutáció elsõ szándékbeli diagnosztizálásával 81¹bõl 58 beteg kerülte volna el PV típusú mieloproliferatív szindróma diagnosztizálására alkalmazott, egyéb vizsgálatok végzését. 8. és 9. ábra: A JAK2 V617F expresszálódása csökken HEL-sejtekben, 24 órával a JAK2 V617F-specifikus sirns-sel történt kezelést követõen (sirns #1, 3 és 4) 0 6: V617F Jak2 sirns-sel kezelt (1 6), és nem kezelt (0) HEL-sejtek. C+: V617F Jak2 RV vektorral transzfektált 293HEKsejtek. C : 293HEK. 10. ábra: A VT Jak2 expresszálódásának a szintje nem csökkent K562-sejtekben, 24 órával Jak2 V617-specifikus sirns-sel történt kezelés hatására. Je: VT Jak2 sirns-sel kezelt K562-sejtek. 0 6: V617F Jak2 sirns-sel kezelt K562-sejtek. C : 293HEK (nem expresszál JAK2¹t). 1. példa: A JAK2 V617F-mutáció azonosítása 43¹ból 39 betegben Patológiás progenitorok sejttenyésztési modelljének az összeállítása és biokémiai inhibitorok alkalmazása lehetõvé tették annak megállapítását, hogy a JAK2-11

12 1 HU T STAT5, P13-kináz és Src-kinázok anyagcsereútjai szükségesek a PV progenitorok Epo-tól független differenciálódásához (Ugo és munkatársai, 2004). Ezek az eredmények megerõsítették azt a hipotézisünket, hogy a PV¹t okozó elsõdleges molekuláris lézió egy kulcsprotein anomáliája, amely egy szignál-reakcióút deregulációjához vezet, például egy tirozinkináz konstitutív aktivitását érintõ mutáció. Mindamellett 43, PV¹ben szenvedõ beteg vizsgálata tette számunkra lehetõvé, hogy a JAK2-protein kulcsszerepét azonosítsuk, amely protein a különbözõ szignálutak leginkább korai szakaszán kap szerepet, és amely protein közös azon citokinreceptorok szignálútjával, amelyek anomáliáit PV esetében ismertették. Három, egymást kiegészítõ megközelítésben vizsgáltuk a JAK2 proteinkináz szerepét a PV kórélettanában: funkcionális megközelítés (JAK2 interferáló RNSsel történõ gátlása PV¹sejtekben), genomiális megközelítés (a gén 23 exonjának a szekvenálása) és biokémiai megközelítés JAK2 foszforilációs anomália keresésére, amely a konstitutív aktiválás oka. Az alkalmazott biológiai anyagok beleegyezésüket adó, poliglobuliában szenvedõ betegekbõl származtak, és az Hotel Dieu Központi Hematológiai Laboratóriumába (Laboratoire Central d Hématologie de l Hotel Dieu) küldött, diagnosztikai célból levett minták maradékai voltak, vagy terápiás érmetszésbõl származtak. 1.1 Funkcionális vizsgálat PV-ben szenvedõ betegek eritroblasztjaiban a JAK2 funkció vizsgálatát úgy végeztük, hogy a PV¹eritroblasztokat elektroporálással transzdukáltuk JAK2 szekvenciára (AMBION, Huntingdon, Anglia) specifikus sirns-sel, amely célként a JAK2 mrns-ének 15¹ös exonján található egyik szekvenciát ismeri fel. Kimutattuk, hogy a JAK2 gátlása erõsen csökkenti a PV¹progenitorok Epo nélkül mutatott klónképzõ kapacitását és spontán differenciálódását. SiRNS JAK2-vel transzfektált, normál eritroblaszt progenitorok klonogén potenciálja 70%-kal csökken kontroll sirns alkalmazásával összehasonlítva, amely megerõsíti a sirns JAK2- vel történt transzfektálás hatékonyságát. A JAK2 eritroblaszt progenitorokra kifejtett gátlásának a hatásait vizsgáltuk PV¹ben, Epo-mentes tenyésztési modellben, ami lehetõvé tette a malignus klón sejtjeinek a tanulmányozását. Összehasonlítottuk a PV¹eritroblaszt progenitorok klónképzõ potenciálját, apoptózisát és differenciálódást sirns JAK2-vel történt transzfektálást követõen, valamint egy kontroll sirns-sel történt transzfektálást követõen. Az Epo nélkül tenyésztett PV¹progenitorok klónképzõ potenciáljának a vizsgálata a kolóniák számának a jelentõs csökkenését mutatta sirns JAK2-vel történt transzfektálást követõen, szemben a kontroll sirns alkalmazásával. A sejtek apoptózisának áramlásos citometriával történõ vizsgálata az apoptózis jelentõs emelkedését mutatta a sirns JAK2-vel transzfektált sejtekben, szemben a nem releváns sirns alkalmazásával (70% versus 53%). A sirns JAK2 differenciálódásra kifejtett hatásának (Glikoforin A megjelenése, áramlásos citometriával detektálva) a vizsgálata csak mérsékelt eltérést mutatott a sirns JAK2-vel és a kontroll sirns-sel transzfektált progenitorok között. A sejtes vizsgálatok eredményei tehát azt mutatták, hogy a PV¹eritroid progenitorok Epo-tól független differenciálódásához szükség van JAK2¹re. A biokémiai vizsgálatok (immunprecipitáció) kezdeti eredményei a JAK2 elhúzódóbb foszforilezését mutatták, miután a PV¹eritroid progenitoroktól elvontuk a citokineket, szemben a normál sejtekkel. 1.2 A JAK2 genomiális vizsgálata Genomiális DNS-bõl kiindulva, PCR-vizsgálatot végeztünk egy egészséges egyén 23 exonján. Ezt követõen, PV¹ben szenvedõ 3 beteget vizsgáltunk, miután sejttenyésztést követõen, in vitro kapott eritroid sejtjeikbõl extraháltuk a genomiális DNS¹t. Azonosítottunk egy pontmutációt, amely a JAK2 12¹es exonján helyezkedik el, és amely a 3 vizsgált betegbõl 2 betegben jelen volt. Ez a mutáció a kódolószekvencia 1849¹es bázisát érinti [(a számozást ATG-tõl kezdve), GenBank NM_004972] és a JAK2 (V617F) protein 617¹es kodonját transzformálja. Normál 617¹es kodon: valint (V) kódoló gtc kód Mutált 617¹es kodon: fenil-alanint (F) kódoló ttc kód Az interneten közzétett adatbázisok alkalmazásával igazoltuk, hogy ez nem egy ismert polimorfizmus. Ezt követõen kibõvítettük a vizsgált csoportot (kohort). A mutációt eddig 39, PV¹ben szenvedõ betegben találtuk meg, 43 vizsgált esetbõl. Nem találtunk olyan kontrollbeteget (15 vizsgált esetbõl), vagy másodlagos poliglobuliában szenvedõ beteget (18 vizsgált esetbõl), aki a mutációt hordozta volna. Szekvenálás eredményei betegekben 39 mutáns/43 vizsgált PV 2/3 heterozigóta 13/39 homozigóta, azaz az esetek 30%¹a (ugyanolyan arány, mint a heterozigotizmusvesztés 9p¹nél) Kontrollok 0 mutált eset, 33 vizsgált kontrollban ide sorolva 15 egészséges egyént és 18 másodlagos poliglobuliás esetet (nem voltak spontán kolóniák). A JAK2 ezen anomáliájának a felismerése megmagyarázza a PV¹ben szerepet játszó számos növekedési faktor iránt mutatott túlérzékenységet (Epo, TPO, IL 3, IL 6, GM¹CSF és inzulin). Valójában a JAK2 olyan protein, amely szerepet játszik ezen citokinek receptorainak a szignalizációs útjaiban. Ezen túlmenõen a JAK2 asszociációja az R¹Epo-val annyiban egyedülálló, hogy a JAK2 konstitutív módon rögzül az R¹Epo-hoz: a Golgi-féle apparátusban kialakult JAK2/R¹Epo asszociáció szükséges ahhoz, hogy az R¹Epo az eritroblasztok membránjára processzálódjon. A JAK2 anomáliája, amely a JAK2 R¹Epo-val történõ asszociációjának módosulását okozza, magyarázhatja az eritroblasztvonal medulláris hiperpláziájának a predominanciáját, bár ez a protein számos szignálútban szerepet játszik. Másfelõl, Moliterno és munkatársai (Moliterno és munkatársai, 1998; Moliterno és Spivak, 1999) az mpl glikolezési defektussal összefüggõ, 12

13 1 HU T2 2 hibás membránexpresszálódását ismertették. Lehetséges, hogy a JAK2, az R¹Epo analógiája szerint, szükséges a c¹mpl processzálódásához. A JAK2 anomáliája ezek szerint magyarázhatja a c¹mpl hibás membránexpresszálódását, amely PV¹ben észlelhetõ. A JAK2 proximális, erõsen konzervált, Box2 doménjén kötõdik az R¹Epo-hoz. Epo-stimuláció hiányában a JAK2 konstitutív módon fixálódik az R¹Epo-hoz, azonban nem foszforilezett, tehát inaktív formában. Miután a receptort az Epo stimulálja, a két JAK2-molekula foszforilezõdik, majd ezt követõen foszforilezik az R¹Epo¹t, ami azután lehetõvé teszi a szignáltranszdukcióban szerepet játszó más proteinek, például a STAT5, Grb2 és P13K bevonását és foszforilezését. A JAK2 protein, mint minden JAK protein, egy funkcionális kináz-doménnel (JH1), egy tirozinkináz aktivitást nem mutató, pszeudokináz doménnel (JH2) és számos konzervált doménnel (JH3 JH7) rendelkezik, amelyek jellemzõek a JAK családra. Úgy tûnik, hogy a JAK2 tirozinkináz aktivitásának a szabályozásában a JH2-domén játszik szerepet. A hozzáférhetõ JAK2-protein-térkép adatai szerint (Lindauer, 2001), a 617¹es aminosav ebben a JH2-doménban helyezkedik el, és modellvizsgálatokat követõen, olyan régióban, amely kiemelten fontos a kinázaktivitás szabályozásában. A felismerés patofiziológiai vonatkozásán túlmenõen (a citokinektõl való függetlenség és a különbözõ SMP¹k lebomlásának a megértése), mutáció bizonyítása a betegnél elsõ ízben kínál olyan tesztet, amely alkalmas a diagnózis megerõsítésére. Orvosi diagnosztikai nézõpontból, a JAK2 mutációjának a keresése elvégezhetõ a vérben keringõ, a malignus klónhoz tartozó polinukleáris sejtekben. A találmány lehetõvé teszi továbbá specifikus terápia tervezését, a mutált proteinre nézve specifikus kináz-gátlás típusút, vagy génterápiát példa: JAK2 V617F mutáns detektálása eritrocitózis elsõ szándékú diagnosztizálására 2.1 Betegek, anyagok és módszerek Szekvenálás és két SNP genotipizáló eljárás összehasonlítása JAK2 V617F detektálására Betegekbõl származó sejtek Gyanított MPD-esetekbõl (azaz eritrocitózis, trombocitózis és hiperleukózis) származó, 119 mintát vizsgáltunk: 58 vérmintát vettünk le perspektív vizsgálatra, és 61 archív csontvelõmintát vizsgáltunk retrospektív módon. A perifériás granulocitákat sûrûség-grádiens eljárással izoláltuk, a gyártó (Eurobio, Franciaország) utasításai szerint. A csontvelõbõl a mononukleáris sejteket Ficoll sûrûség-grádiens centrifugálással izoláltuk. A genomiális DNS¹t szokásos eljárással extraháltuk. Hogy meghatározhassuk a LightCycler és TaqMan eljárások érzékenységét, olyan heterozigóta minta hígítási sorát adtuk normál DNS-hez, amely minimális reziduális vad típusú allélt tartalmazott. Sejtvonalak Homozigóta módon mutált (JAK2 V617F) humán eritroleukémia sejtvonalból származó DNS tovafutó hígításait (1, 0,5, 0,1, 0,05 és 0,01) állítottuk elõ (nem mutált) TF¹1 sejtvonal DNS-ében, és alkalmaztuk standard pozitív kontrollként. A sejtvonalakat magzati borjúszérummal kiegészített MEM-alfa tápközegben (Invitrogen) tenyésztettük. A mutáció detektálása LightCycler fúziós görbe analízisével, FRET hibridizációs próbákkal Primereket és próbákat terveztünk abból a célból, hogy amplifikálják a JAK2 12¹es exonjának célszekvenciáját és azzal hibridizálódjanak. A mutációs hely (1849G/T) pozícióját 3 ¹végén fluoreszceinnel jelölt, donor befogó próbával fedtük, a szomszédos befogadó horgony-próbát 5 ¹végén LightCycler Red 640 (LCRed640) festékkel jelöltük és 3 ¹végét foszforileztük, hogy elkerüljük az extenziót. Az amplifikációt és a fúziós görbe analízisét LightCycler berendezéssel végeztük (Roche Diagnostics, Meylan, Franciaország). A reakcióelegy végsõ térfogata 20 l volt és 10 ng DNS¹t, 14 l, 3 mmol/l MgCl 2 ¹t tartalmazó LightCycler FastStart DNA Master elegyet, 0,2 mol/l primert és az egyes próbák 0,075 mol/l koncentrációját alkalmaztuk. Röviden, a mintákat 10 percen át 95 C¹ra hevítettük, ezt követte 45 cikluson át végzett PCR-amplifikálás, egy denaturálási lépés, két hibridizálási lépés, majd egy fúziós görbe, amely 45 C és 70 C között fekvõ doménben helyezkedett el (0,1 C/mp). A Light- Cycler programon az analízist úgy végeztük, hogy a fluoreszcencia differenciálhányados görbéjét ábrázoltuk a hõmérséklettel szemben [2(dF12/F11)/dT) versus T]. A mutált csúcsok 57 C¹nál, a vad típusra (VT) jellemzõ csúcs 63 C¹nál volt megfigyelhetõ. A mutáció detektálása egy allél TaqMan eljárással történõ, specifikus amplifikálásával Két primert terveztünk, hogy SNP¹t magában foglaló, 92 bp terméket amplifikáljunk az 1849¹es pozíciónál. Két, eltérõ fluoreszcens színnel jelölt, fluorogén MGB-próbát terveztünk, egyik a VT allél ellen irányult, a másik a mutált allél ellen. A genotipizálást 96 vályulatú lemezen, TaqMan PCR eljárás szerint végeztük. A végsõ reakciótérfogat 12,5 l volt, amelyben 10 ng genomiális DNS¹t, 6,25 l TaqMan Universal Master Mix oldatot és 0,31 l 40X Assays-on-Demand SNP Genotyping Assay Mix (Applied Biosystems) oldatot alkalmaztunk. A lemezt 10 percen át 95 C¹ra hevítettük, ezt követte 40 denaturációs ciklus 92 C¹on, 12 másodpercen át, és párosítási/extenziós ( matching/extension ) lépés 60 C¹on, 1 percen át. A termociklusokat 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) berendezésen végeztük. Az analízist SDS program 1.3 verziójával végeztük. A diszkriminációs allél végpont-genotipizálását úgy végeztük, hogy a PCR¹t követõ fluoreszcencialeolvasásból származó, VT¹próbához tartozó fluoreszcencia (Rn) görbét szabad szemmel összehasonlítottuk a mutált JAK2 görbéjével. Eritrocitózisos betegek és minták gyûjtése Nyolcvannyolc olyan beteget értékeltünk, akiknek a hematokritszintje a diagnózis idején, minden kezelést megelõzõen, 51%-nál magasabb volt, és vizsgáltuk a WHO- és PVSG-kritériumok jelenlétét. A hematokritszint normálértékének a felsõ határát 51%-ban állapí- 13

14 1 HU T2 2 tottuk meg [Pearson TC és munkatársai: A Polycythemia Vera Updated: Diagnosis, Pathobiology and Treatment. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program) (2000)]. Csontvelõsejteket vettünk le klónképzõdési vizsgálatok céljára, és a fölöslegben maradt sejtekbõl DNS¹t extraháltunk. A szérum-eritropoietin szinteket különbözõ laboratóriumokban mérték, és ennek megfelelõen, az esetben minõsítették azt alacsonynak, ha értéke alatta maradt az adott laboratóriumban megszokott normál domén alsó értékénél, normálnak vagy magasnak. Ugyanazon betegbõl származó perifériás granulocitákat a fentebb ismertetettek szerint tisztítottuk, mivel az egyes idõpontokhoz tartozó vérminták hozzáférhetõk voltak. A csontvelõ- és vérmintákat azt követõen vettük le, hogy a betegektõl tájékoztatott beleegyezési nyilatkozatot kaptunk. EEC vizsgálatok Az eritroid Epo-válasz jellegének in vitro vizsgálatát ugyanabban a laboratóriumban végeztük (Hôtel Dieu, Párizs), plazmaalvadék tenyésztési technikával, amint azt már korábban ismertették [Casadevall N, Dupuy E, Molho-Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P: Autoantibodies against erythropoietin in a patient with pure red-cell aplasia, N. Engl. J. Med. 334, (1996)]. Statisztikai analízis A markerek korrelációját Spearman rang-koefficiens (R) alkalmazásával végeztük. 2.2 Eredmények PCR¹en alapuló genotipizálási eljárások kivitelezhetõsége és érzékenysége a JAK2 V617Fmutáció detektálására Annak érdekében, hogy értékeljük a szekvenálás, a LightCycler és a TaqMan eljárások hatékonyságát a JAK2 V617F-mutáció detektálásában, 119 olyan mintában kerestük a mutáció jelenlétét, amelyek MPD gyanúját mutató betegbõl származtak, és a három eljárást párhuzamosan alkalmaztuk. Hatékonyan detektáltuk a JAK2 V617F-mutációt 119-bõl 83 mintában, és 35 minta nem mutatott mutációt egyik eljárással sem. Mindössze egy minta esetében, a szekvenálás nem volt képes detektálni a LightCycler és a TaqMan eljárásokkal kimutatott mutációt, ami arra utal, hogy ez utóbbiak érzékenyebbek. Azért, hogy értékeljük az eljárás érzékenységét, két különbözõ eljárást alkalmaztunk: vizsgáltuk homozigóta módon mutált HEL sejtvonal DNS-ének tovafutó hígításait nem mutált TF¹1 sejtvonal DNS-ében elegyítve, valamint a JAK2 V617F-mutációra nézve homozigóta beteg genomiális DNS-ének tovafutó hígításait normál DNS-ben elegyítve. A szekvenálás nem volt képes a TF¹1 sejtvonal DNS-ében hígított HEL sejtvonal DNS-ének 5% alatti szintjét, valamint a normál DNS-ben hígított, homozigóta módon mutált beteg DNS-ének 10% alatti szintjét detektálni. A LightCycler és a TaqMan eljárások azonos érzékenységet mutattak, valamivel érzékenyebbnek bizonyultak a szekvenálásnál, a TF¹1 sejtvonal DNS-ében hígított, HEL sejtvonal DNS-ének 0,5 1%¹os, és a normál DNS-ben hígított, homozigóta módon mutált beteg DNS-ének 2 4%¹os szintjét már detektálták (6. ábra). A diagnózis idõpontjában eritrocitózist mutató betegek jellemzõi A diagnózis idõpontjában 51%-nál magasabb hematokritértékeket mutató 88 beteg fõbb jellemzõit foglalja össze az 1. táblázat. 1. táblázat Betegek jellemzõi WHO kritériumok PVSG kritériumok WHO és PVSG kritériumok PV n=61 Idiopátiás eritrocitózis n=11 PV n=45 Idiopátiás eritrocitózis n=21 Másodlagos eritrocitózis n=5 Ht>50%, de nincs AE n=3 Nemek aránya (férfi/nõ) 38/23 11/0 28/17 18/3 4/1 3/0 Átlagéletkor (domén) 61 (23 92) 57 (24 81) 58 (23 92) 60 (53 81) 65 (55 77) 48,6 Átlag Ht (%) +/ 59+/ 4,6 54,6+/ 1,44 59,2+/ 4,5 57,8+/ 4,2 55,8+/ 3,1 53,3+/ 0,8 Átlag Hb (g/dl) +/ 19,2+/ 1,39 18,3+/ 0,34 19,3+/ 1,41 19+/ 1,0 18,9+/ 0,8 18,6+/ 0,5 Átlag WBC ( 10 9 ) +/ 12,2+/ 4,4 7,0+/ 2,5 13,5+/ 4,9 8,2+/ 2,5 8,8+/ 1,9 6,6+/ 0,4 Átlag vérlemezkeszám ( 10 9 ) +/ 463+/ / / / 60,4 212+/ / 19 Splenomegalia 16/55 0/11 14/39 0/21 0/5 0/3 EEC jelenléte 59/60 1/11 43/44 11/21 0/5 0/3 Alacsony Epo-szint 39/47 2/8 27/33 10/17 0/3 1/1 Normál Epo-szint 8/47 6/8 6/33 7/17 3/3 0/1 Citogenetikai anomáliák 7/32 0/3 6/23 0/7 nd 0/1 JAK2 V617F pozitív 57/61 0/11 43/45 8/21 0/5 0/3 14

15 1 HU T2 2 Ötvenegy %-nál magasabb hematokritértéket mutató, 88 beteget diagnosztizáltunk PVSG és WHO kritériumok szerint négy csoportba: PV, idiopátiás eritrocitózis, másodlagos eritrocitózis és abszolút eritrocitózis nélküli (nincs AE) csoportba, amely esetben a vörösvérsejt tömege nem emelkedett. Nyolc betegnek nem volt egyértelmû diagnózisa, mivel néhány klinikai leletük nem volt hozzáférhetõ. Ht: hematokrit; Hb: hemoglobin; WBC: fehérvérsejt; EEC: endogén eritroid kolóniák; Epo: eritropoietin; : standard deviáció. A betegek 4 fõ csoportba voltak sorolhatók WHO kritériumok [Pierre R és munkatársai szerk.: World Health Organization Classification of Tumors; Pathology and Genetics of Tumors of Hamatopoietic and Lymphoid Tissues, IARC Press, Lyon, (2001)] és PVSG kritériumok [Pearson TC, Messinezy M: The diagnostic criteria of polycythaemia rubra vera, Leuk Lymphoma 22, (1) (1996)] szerint: 61 és 45 beteg PV diagnózissal, 5 beteg másodlagos eritrocitózissal, 11 és 21 beteg idiopátiás eritrocitózissal és 3 beteg abszolút eritrocitózis nélkül (vörösvérsejtek tömege normális). Hét beteg esetében a klinikai adatok hiányosak voltak, ami magyarázza, hogy a diagnózist sem WHO, sem PVSG kritériumok alapján nem lehetett megerõsíteni. A két osztályozás A1 kritériumai közötti eltérés miatt, 6 beteg, akiknek vörösvérsejtjének tömegét egyáltalán nem mérték, a WHO kritériumok szerint besorolható volt, a PVSG kritériumok szerint nem. Egy beteg egyidejûleg hipoxiát és EEC¹t mutatott, ami megnehezítette a diagnózist. Citogenetikai vizsgálatot 35 betegnél végeztünk; 32 PV¹betegbõl (WHO kritériumok szerint) 7 mutatott citogenetikai anomáliát: 5 beteg 9¹es triszómiát, egy beteg 7q¹ anomáliát és egy beteg többletanyagot mutatott a 18¹as kromoszómán. A JAK2 V617F jelenléte megfelel a PVSG és WHO kritériumoknak A JAK2 V617F a PVSG kritériumok szerint diagnosztizált 45 PV¹betegbõl 43¹ban (96%), és a WHO kritériumok szerint diagnosztizált 61 PV¹betegbõl 57¹ben volt jelen (93%) (1. táblázat). Mégis, a PVSG kritériumok szerint nem PV¹ként besorolt 29 betegbõl 8 mutatta a mutációt, míg a WHO kritériumok szerinti 19, nem PV¹betegbõl egy sem; ezt a 8 beteget a PVSG kritériumok szerint IE¹nek tekintettük, a WHO kritériumok szerint PV¹nek. Sem a SE diagnózisú betegek, sem a normál vörösvérsejt-tömeget ( nincs AE ) mutató betegek nem hordozták a mutációt. A JAK2 V617F jelenléte vagy hiánya tehát a WHO kritériumok alkalmazása esetén 80 betegbõl 76¹ban felel meg a PV pozitív diagnózisának (95%, R=0,879, p<0,0001), míg a PVSG kritériumok szerint 74¹bõl 64 betegben (86,5%, R=0,717, p<0,0001). Ezen túlmenõen mivel a WHO kritériumok szerint nem PV¹ként diagnosztizált betegek közül egy sem hordozta a mutációt, abszolút eritrocitózis tekintetében a JAK2 V617F detektálása 100%¹os prediktív értékûnek bizonyult. Néhány szerzõ [Mossuz P és munkatársai: Diagnostic value of serum erythropoietin level in patients with absolute erythrocytosis, Haematologica 89, (2004)] a szérum eritropoietinszintjének mérését elsõ szándékú diagnosztikai tesztnek tekinti PV diagnózisára abszolút eritrocitózist mutató betegekben, 97%¹os specificitással és 97,8%¹os prediktív értékkel, ha az Epo szintje a normál tartomány alsó értéke alá esik. Vizsgálatainkban, az Epo szintje és a WHO kritériumok szerint diagnosztizált PV között 61¹bõl 50 betegben (82%, R=0,488, p=0,0002), míg a PVSG kritériumok szerint diagnosztizált PV esetében 56¹ból 39 betegben (70%, R=0,358, p=0,0067) volt megfigyelhetõ korreláció. Ezt követõen, összehasonlítottuk a szérum EPO-szinteket a JAK2 V617F jelenléte vagy hiánya mellett, és azt tapasztaltuk, hogy 68 betegbõl 52 (76%, R=0,416, p=0,0004) mutatott megfelelõ korrelációt. A JAK2 V617F mutáció jelenléte megfelel az EECképzõdés kapacitásnak. Három különbözõ munkacsoport kimutatta, hogy JAK2 V617F mutációval transzfektált, Epo-függõ sejtvonalak szaporodásukhoz Epo-függetlenné és Epo-hiperszenzitívvé válnak, ennek megfelelõen utánozzák a PV¹ben ismertetett eritroid progenitorok Epo-függetlenségét és Epo-hiperszenzitivitását. Következésképpen, feltételeztük, hogy a JAK2 V617F mutációt hordozó betegek szintén képeznek EEC¹t. Húsz olyan eritrocitózisos beteg közül, akik nem mutattak EEC-képzõdést, egy hordozta a mutációt, és ez kérdésessé tette a JAK2 V617F detektálásának pozitív prediktív értékét; azonban, bár ez a beteg nem mutatott EEC-képzõdést, számos WHO és PVSG pozitív kritériumnak megfelelt, amely mindkét osztályozás szerint lehetõvé tette a PV besorolást. Ez a beteg tehát inkább tekinthetõ téves EEC-negatívnak, mint téves JAK2-pozitívnak. Az EEC¹t mutató 67 beteg közül 62 hordozta a JAK2 V617F mutációt, 5 beteg esetében az érzékeny detektálási eljárások nem mutattak ki mutációt. Az 5 beteg közül a WHO kritériumok szerint 4, a PVSG kritériumok szerint 2 a PV csoportba volt sorolható. Összességében, a vizsgált 87 beteg esetében a JAK2 V617F mutáció jelenléte vagy hiánya 81 betegnél egyezett az EEC-képzõ kapacitással, vagy annak hiányával (93,1%, R=0,824, p<0,0001). A JAK2 V617F mutáció jelenléte a csontvelõ mononukleáris sejtjeiben (BMMC) megfelel a perifériás granulocitákban való jelenlétének. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk, hogy a diagnózis idõpontjában a perifériás vérbõl származó granulociták JAK2 V617F mutáció detektálására történõ alkalmazásával elkerülhetõ¹e a csontvelõ sejtjeinek a vizsgálata, a szekvenálás, LightCycler és TaqMan eljárások valamelyikével összehasonlítottuk 50 olyan beteg eredményét, akik esetében a diagnózis idõpontjában csontvelõ- és perifériás vérminta egyidejûleg hozzáférhetõ volt. A mutációt minden esetben (34 mutált, 16 nem mutált) azonos eredménnyel detektáltuk. III. Következtetések Ennek megfelelõen új PV diagnosztikai adatlapot javaslunk, amelyen a JAK2 granulocitákból és érzékeny eljárásokkal történõ detektálása az elsõ lépést képezi eritrocitózis diagnosztikájában, kivéve nyilvánvalóan másodlagos eritrocitózis esetében (7. ábra). Ez a megközelítés számos elõnnyel rendelkezik: elkerülhetõ a vörösvérsejtek tömegének izotópos eljárással történõ mérése, amely eljárás nem mindig hozzáférhetõ, és 15

16 1 HU T2 2 amelynek az eredménye néhány esetben ellentmondásos. Elkerülhetõ továbbá csontvelõ leszívása, valamint az EEC vizsgálat, amely idõigényes és kevéssé standardizált. Drasztikusan csökken a pozitív PV diagnózis költsége, mivel kizárólag az 51%-nál magasabb hematokritszintet mutató és JAK2 V617F negatív betegeket kell alávetni minden olyan vizsgálatnak, amely eritrocitózis jellemzéséhez valójában szükséges. Még akkor is, ha eritrocitózis vonatkozásában a JAK2 V617F detektálása önmagában alátámasztja a PV diagnózisát, a csontvelõ-biopszia hasznos lehet, mivel kimutathatja miofibrózis jeleit, vagy blasztsejtek jelenlétét, következésképpen megerõsítheti a PV leukémiás transzformációját. Mindamellett úgy tûnik, hogy csontvelõ-biopszia opcionális vizsgálatként elvégezhetõ, citogenetikai vizsgálattal kiegészítve. A JAK2 V617F mutációt detektáltuk továbbá ET esetek 30%-ában, IMF esetek 50%-ában és néhány, nem jellemzett MPD esetben, ami új MPD csoportot definiál, eltérõ klinikai tünetekkel. Az eltérések okai jelenleg még ismeretlenek, és egyelõre túl korai ezeket a betegségeket egyetlen, közös kóroktani eredetû és eltérõ fenotípusú mieloproliferatív betegségcsoportba sorolni. További precíz klinikai vizsgálatok szükségesek a JAK2 V617F mutációt hordozó PV, ET, IMF és más ritka MPD esetek közös tüneteinek a jellemzéséhez, elsõsorban abszolút eritrocitózis, Epo-szint, mielofibrózis és citogenetikai anomáliák tekintetében. Ennek megfelelõen javasoljuk a JAK2 V617F detektásának az alkalmazását kezdõ eszközként krónikus hiperleukózis, trombocitózis és eritrocitózis diagnosztizálása során. A JAK2 V617F jelenléte nemcsak egy új MPD csoport definiálását teszi lehetõvé, hanem minden bizonnyal specifikus, célzott terápiáknak az alapját képezi majd. 3. példa: A JAK2 V617F mutációra specifikus sirns gátolja a JAK2 V617F mutált proteint, de nem gátolja a JAK2 VT vad proteint A azonosító számú szekvenciák szerinti 1¹es, 3¹as és 4¹es sirns¹ek gátolják a HEL sejtvonal által expresszált JAK2 V617F mutált proteint anélkül, hogy gátolná a K562 sejtvonal által expresszált JAK2 vad proteint. Az eredményeket a 8., 9. és 10. ábrák mutatják Hivatkozások Andersson, P., LeBlanc, K., Eriksson, B. A., and Samuelsson, J. (1997). No evidence for an altered mrna expression or protein level of haematopoietic cell phosphatase in CD34+ bone marrow progenitor cells or mature peripheral blood cells in polycythaemia vera. Eur J Haematol 59, Asimakopoulos, F. A., Hinshelwood, S., Gilbert, J. G., Delibrias, C. C., Gottgens, B., Fearon, D. T., and Green, A. R. (1997). The gene encoding hematopoietic cell phosphatase (SHP¹1) is structurally and transcriptionally intact in polycythemia vera. Oncogene 14, Casadevall, N., Vainchenker, W., Lacombe, C., Vinci, J., Chapman, J., Breton-Gorius, J., and Varet, B. (1982). Erythroid progenitors in Polycythemia Vera. demonstration of their hypersensitivity to erythropoietin using serum-free cultures. Blood 59, Hess, G., Rose, P., Gamm, H., Papadileris, S., Huber, C., and Seliger, B. (1994). Molecular analysis of the erythropoietin receptor system in patients with polycythaemia vera. Br J Haematol 88, Kralovics, R., Guan, Y., and Prchal, J. T. (2002). Acquired uniparental disomy of chromosome 9p is a frequent stem cell defect in polycythemia vera. Exp Hematol 30, Le Couedic, J. P., Mitjavila, M. T., Villeval, J. L., Feger, F., Gobert, S., Mayeux, P., Casadevall, N., and Vainchenker, W. (1996). Missense mutation of the erythropoietin receptor is a rare event in human erythroid malignancies. Blood 87, Lindauer, K., Loerting, T., Liedl, K. R., and Kroemer, R. T. (2001). Prediction of the structure of human Janus kinase 2 (JAK2) comprising the two carboxy-terminal domains reveals a mechanism for autoregulation. Protein Eng 14, Means, R. T., Krantz, S. B., Sawyer, S., and Gilbert, H. (1989). Erythropoietin receptors in polycythemia vera. J Clin Invest 84, Moliterno, A. R., Hankins, W. D., and Spivak, J. L. (1998). Impaired expression of the thrombopoietin receptor by platelets from patients with Polycythemia Vera. N Engl J Med 338, Moliterno, A. R., and Spivak, J. L. (1999). Posttranslational processing of the thrombopoietin receptor is impaired in polycythemia vera. Blood 94, Pahl, H. L. (2000). Towards a molecular understanding of polycythemia rubra vera. Eur J Biochem 267, Pearson (2001). Evaluation of diagnostic criteria in polycythemia vera. Semin Hematol. 38, Roder S, S. C., Meinhardt G, Pahl HL. (2001). STAT3 is constitutively active in some patients with Polycythemia rubra vera. Exp Hematol 29, Silva, M., Richard, C., Benito, A., Sanz, C., Olalla, I., and Fernandez-Luna, J. L. (1998). Expression of Bcl¹x in erythroid precursors from patients with polycythemia vera. N Engl J Med 338, Temerinac, S., Klippel, S., Strunck, E., Roder, S., Lubbert, M., Lange, W., Azemar, M., Meinhardt, G., Schaefer, H. E., and Pahl, H. L. (2000). Cloning of PRV-1, a novel member of the upar receptor superfamily, which is overexpressed in polycythemia rubra vera. Blood 95, Ugo, V., Marzac, C., Teyssandier, I., Larbret, F., Lécluse, Y., Debili, N., Vainchenker, W., and Casadevall, N. (2004). Multiple signaling pathways are involved in erythropoietin-independant differentiation of erythroid progenitors in Polycythemia Vera. Experimental Hematology 32,

17 <210> 1 <211> 1132 <212> PRT <213> homo sapiens SZEKVENCIALISTA <223> JAK2 V617F változat <400> 1 Met Gly Met Ala Cys Leu Thr Met Thr Glu Met Glu Gly Thr Ser Thr Ser Ser Ile Tyr Gln Asn Gly Asp Ile Ser Gly Asn Ala Asn Ser Met Lys Gln Ile Asp Pro Val Leu Gln Val Tyr Leu Tyr His Ser Leu Gly Lys Ser Glu Ala Asp Tyr Leu Thr Phe Pro Ser Gly Glu Tyr Val Ala Glu Glu Ile Cys Ile Ala Ala Ser Lys Ala Cys Gly Ile Thr Pro Val Tyr His Asn Met Phe Ala Leu Met Ser Glu Thr Glu Arg Ile Trp Tyr Pro Pro Asn His Val Phe His Ile Asp Glu Ser Thr Arg His Asn Val Leu Tyr Arg Ile Arg Phe Tyr Phe Pro Arg Trp Tyr Cys Ser Gly Ser Asn Arg Ala Tyr Arg His Gly Ile Ser Arg Gly Ala Glu Ala Pro Leu Leu Asp Asp Phe Val Met Ser Tyr Leu Phe Ala Gln Trp Arg His Asp Phe Val His Gly Trp Ile Lys Val Pro Val Thr His Glu Thr Gln Glu Glu Cys Leu Gly Met Ala Val Leu Asp Met Met Arg Ile Ala Lys Glu Asn Asp Gln Thr Pro Leu Ala Ile Tyr Asn Ser Ile Ser Tyr Lys Thr Phe Leu Pro Lys Cys Ile Arg Ala Lys Ile Gln Asp Tyr His Ile Leu Thr Arg Lys Arg Ile Arg Tyr Arg Phe Arg Arg Phe Ile Gln Gln Phe Ser Gln Cys Lys Ala Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu Lys Tyr Leu Ile

18 Asn Leu Glu Thr Leu Gln Ser Ala Phe Tyr Thr Glu Lys Phe Glu Val Lys Glu Pro Gly Ser Gly Pro Ser Gly Glu Glu Ile Phe Ala Thr Ile Ile Ile Thr Gly Asn Gly Gly Ile Gln Trp Ser Arg Gly Lys His Lys Glu Ser Glu Thr Leu Thr Glu Gln Asp Leu Gln Leu Tyr Cys Asp Phe Pro Asn Ile Ile Asp Val Ser Ile Lys Gln Ala Asn Gln Glu Gly Ser Asn Glu Ser Arg Val Val Thr Ile His Lys Gln Asp Gly Lys Asn Leu Glu Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ser Phe Val Ser Leu Ile Asp Gly Tyr Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Ala His His Tyr Leu Cys Lys Glu Val Ala Pro Pro Ala Val Leu Glu Asn Ile Gln Ser Asn Cys His Gly Pro Ile Ser Met Asp Phe Ala Ile Ser Lys Leu Lys Lys Ala Gly Asn Gln Thr Gly Leu Tyr Val Leu Arg Cys Ser Pro Lys Asp Phe Asn Lys Tyr Phe Leu Thr Phe Ala Val Glu Arg Glu Asn Val Ile Glu Tyr Lys His Cys Leu Ile Thr Lys Asn Glu Asn Glu Glu Tyr Asn Leu Ser Gly Thr Lys Lys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Asp Leu Leu Asn Cys Tyr Gln Met Glu Thr Val Arg Ser Asp Asn Ile Ile Phe Gln Phe Thr Lys Cys Cys Pro Pro Lys Pro Lys Asp Lys Ser Asn Leu Leu Val Phe Arg Thr Asn Gly Val Ser Asp Val Pro Thr Ser Pro Thr Leu Gln Arg Pro Thr His Met Asn Gln Met Val Phe His Lys Ile Arg Asn Glu Asp Leu Ile Phe Asn Glu Ser Leu Gly Gln Gly Thr Phe Thr Lys Ile Phe Lys Gly Val Arg Arg Glu Val Gly Asp Tyr Gly Gln Leu His Glu Thr

19 Glu Val Leu Leu Lys Val Leu Asp Lys Ala His Arg Asn Tyr Ser Glu Ser Phe Phe Glu Ala Ala Ser Met Met Ser Lys Leu Ser His Lys His Leu Val Leu Asn Tyr Gly Val Cys Phe Cys Gly Asp Glu Asn Ile Leu Val Gln Glu Phe Val Lys Phe Gly Ser Leu Asp Thr Tyr Leu Lys Lys Asn Lys Asn Cys Ile Asn Ile Leu Trp Lys Leu Glu Val Ala Lys Gln Leu Ala Trp Ala Met His Phe Leu Glu Glu Asn Thr Leu Ile His Gly Asn Val Cys Ala Lys Asn Ile Leu Leu Ile Arg Glu Glu Asp Arg Lys Thr Gly Asn Pro Pro Phe Ile Lys Leu Ser Asp Pro Gly Ile Ser Ile Thr Val Leu Pro Lys Asp Ile Leu Gln Glu Arg Ile Pro Trp Val Pro Pro Glu Cys Ile Glu Asn Pro Lys Asn Leu Asn Leu Ala Thr Asp Lys Trp Ser Phe Gly Thr Thr Leu Trp Glu Ile Cys Ser Gly Gly Asp Lys Pro Leu Ser Ala Leu Asp Ser Gln Arg Lys Leu Gln Phe Tyr Glu Asp Arg His Gln Leu Pro Ala Pro Lys Trp Ala Glu Leu Ala Asn Leu Ile Asn Asn Cys Met Asp Tyr Glu Pro Asp Phe Arg Pro Ser Phe Arg Ala Ile Ile Arg Asp Leu Asn Ser Leu Phe Thr Pro Asp Tyr Glu Leu Leu Thr Glu Asn Asp Met Leu Pro Asn Met Arg Ile Gly Ala Leu Gly Phe Ser Gly Ala Phe Glu Asp Arg Asp Pro Thr Gln Phe Glu Glu Arg His Leu Lys Phe Leu Gln Gln Leu Gly Lys Gly Asn Phe Gly Ser Val Glu Met Cys Arg Tyr Asp Pro Leu Gln Asp Asn Thr Gly Glu Val Val Ala Val Lys Lys Leu Gln His Ser Thr Glu Glu His Leu Arg Asp Phe Glu

20 Arg Glu Ile Glu Ile Leu Lys Ser Leu Gln His Asp Asn Ile Val Lys Tyr Lys Gly Val Cys Tyr Ser Ala Gly Arg Arg Asn Leu Lys Leu Ile Met Glu Tyr Leu Pro Tyr Gly Ser Leu Arg Asp Tyr Leu Gln Lys His Lys Glu Arg Ile Asp His Ile Lys Leu Leu Gln Tyr Thr Ser Gln Ile Cys Lys Gly Met Glu Tyr Leu Gly Thr Lys Arg Tyr Ile His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Ile Leu Val Glu Asn Glu Asn Arg Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Thr Lys Val Leu Pro Gln Asp Lys Glu Tyr Tyr Lys Val Lys Glu Pro Gly Glu Ser Pro Ile Phe Trp Tyr Ala Pro Glu Ser Leu Thr Glu Ser Lys Phe Ser Val Ala Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Phe Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Lys Ser Pro Pro Ala Glu Phe Met Arg Met Ile Gly Asn Asp Lys Gln Gly Gln Met Ile Val Phe His Leu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Asn Gly Arg Leu Pro Arg Pro Asp Gly Cys Pro Asp Glu Ile Tyr Met Ile Met Thr Glu Cys Trp Asn Asn Asn Val Asn Gln Arg Pro Ser Phe Arg Asp Leu Ala Leu Arg Val Asp Gln Ile Arg Asp Asn Met Ala Gly 1130 <210> 2 <211> 5097 <213> homo sapiens <223> G18497 mutáció jak2 génben <400> 2 ctgcaggaag gagagaggaa gaggagcaga agggggcagc agcggacgcc gctaacggcc 60 tccctcggcg ctgacaggct gggccggcgc ccggctcgct tgggtgttcg cgtcgccact