AZ ELŐREJELZÉS LEHETŐSÉGEI AZ IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATOKBAN DALMADI BALÁZS

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA AZ ELŐREJELZÉS LEHETŐSÉGEI AZ IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATOKBAN Doktori (Ph.D.) értekezés DALMADI BALÁZS Témavezető: Dr. Tihanyi Károly, Ph.D. Richter Gedeon Rt. Budapest, 2005

2 Szigorlati Bizottság: Elnök: Prof. Dr. Tekes Kornélia, Ph.D. Tagok: Dr. Monostory Katalin, Ph.D. Dr. Tóthfalusi László, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Veres Zsuzsa, D.Sc. Dr. Antal István, Ph.D. 2

3 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK... 3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A gyógyszermetabolizmus és a citokróm P450 enzimrendszer A CYP katalitikus ciklusa Biomimetikus rendszerek Nagy áteresztőképpeségű szűrés (HTS) A nitrogén-monoxid szintézis és a citokróm P450 rendszer Az enzimpolimorfizmus In vitro metabolizmus vizsgálatok Az in vitro metabolizmus vizsgálatok modelljei Az enzimkinetika szerepe a metabolizmus-vizsgálatokban Kémiai gátlószerek Enzim specifikus gátló ellenanyagok Index reakció gátlás Korrelációs elemzés A tolperizon CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN Anyagok Kémiai-alapú szűrés és automatizálás Az indukált patkány máj mikroszóma készítése és az inkubálási körülmények A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA Anyagok Az inkubáló elegy összetétele és inkubálási körülmények A tolperizon Cl int meghatározása A tolperizon metabolizmus gátlása kémiai gátlószerekkel A tolperizon metabolizmus gátlása ellenanyagokkal Rekombináns enzimekkel végzett kísérletek CYP index reakciók gátlása tolperizonnal Kromatográfiás módszerek Az adatok elemzése EREDMÉNYEK NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA

4 A tolperizon intrinzik klirensze humán mikroszómán A humán mikroszómán képződött metabolitok azonosítása A tolperizon metabolizmus gátlása kémiai gátlószerekkel Gátló antitestek Rekombináns enzimekkel végzett kísérletek A tolperizon hidroxiláció enzimkinetikai jellemzése A relatív részvétel becslése a Relatív Aktivitási Faktor (RAF) felhasználásával MEGBESZÉLÉS NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AA ABT ADME BI BA Cl int CuOOH CYP EM ER FeTPPF 20 FMO GC/MS GLP HLM HPLC HTS Ig K i K m LC/MS MpTS MpTSO NADPH NO NHA ammónium-acetát 1-aminobenztriazol abszorpció, disztribúció, metabolizmus, exkréció 1-benzilimidazol biológiai hasznosíthatóság (bioavailability) intrinzik klirensz kumol-hidroperoxid citokróm P450 extenzív metabolizáló endoplazmatikus retikulum mezo-tetrakisz(pentafluoro-fenil)porfirin-vas(iii) klorid flavin-monooxigenáz gázkromatográfia tömegspektrometriás detektálással (gas chromatography/mass spectrometry) helyes laboratóriumi gyakorlat (good laboratory practice) humán máj mikroszóma (human liver microsomes) nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (high performance liquid chromatography) nagy áteresztőképességű szűrés (high throughput screening) immunoglobulin gátlási állandó Michaelis állandó folyadékkromatográfia tömegspektrometriás detektálással (liquid chromatography/mass spectrometry) metil-p-tolil-szulfid metil-p-tolil-szulfoxid redukált nikotinamid adenin dinukleotid foszfát nitrogén-monoxid N-hidroxiarginin 5

6 NOS NSAO PCR PK PM RAF RLM RT SNP UDPGT V max nitrogén-monoxid szintáz nikotinsav amidoxim polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) farmakokinetika(i) lassú metabolizáló (poor metabolizer) relatív aktivitási faktor patkány máj mikroszóma (rat liver microsomes) szobahőmérséklet (room temperaturte) single nucleotide polimorphism UDP-glükuronozil transzferáz az enzimreakció maximális sebessége 6

7 1. BEVEZETÉS A gyógyszeripar napjainkban az egyik legköltségigényesebb iparág. Ez a költségigény abból ered, hogy a majdani gyógyszer bevezetését megelőzően óriási összegeket kell a kutatás-fejlesztésre fordítani úgy, hogy tudjuk: a vizsgált, majd fejlesztésre kiválasztott molekulák jelentős részéből soha nem lesz gyógyszer, tehát soha nem hozza vissza a befektetett pénzt. Ez a kockázat és az egyre élesedő piaci verseny teremti meg az igényt, hogy a kutatás-fejlesztés minél korábbi szakaszában rendelkezzünk olyan adatokkal, amelyek segítségével a molekula tulajdonságai, viselkedése a későbbi fejlesztési fázisokban és a klinikai kipróbálás során megjósolhatók. A gyógyszerfejlesztés során a legfontosabb feladat, hogy egy új molekuláról eldöntsük: hatékony-e és biztonságos-e. A hatékonyság elengedhetetlen feltétele a megfelelő mértékű gyógyszerhatásnak, míg a biztonsági vizsgálatok az esetleges mellékhatások jellemzését és minimalizálását célozzák. Természetesen a két tényező nem független egymástól, hiszen minél hatékonyabb egy molekula, annál kisebb dózis elegendő a kívánt hatás eléréséhez és ezáltal természetesen a nem-mechanizmus alapú mellékhatásprofil is változik, csökken a kockázat. A farmakokinetikai (PK) és metabolizmus vizsgálatok részét képezik mind a hatékonysági, mind a biztonsági vizsgálatoknak, hiszen egy gyógyszer csak akkor képes a hatását kifejteni, ha eljutott a célterületre, tehát nem ürült ki, nem bomlott el, nem metabolizálódott a kelleténél gyorsabban. Másrészt e vizsgálatok alkalmasak arra, hogy a gyógyszerjelölt kinetikai interakciós tulajdonságait megbecsüljük, ezáltal e kölcsönhatásokból eredő mellékhatásokat és kockázatokat előrejelezzük. Ezekben a vizsgálatokban in vivo állatmodellek segítségével és in vitro módszerekkel kívánjuk jellemezni az adott gyógyszer/jelölt/ tulajdonságait. Az in vivo kísérletek sajnos nagyon munka- és időigényesek, valamint nem hagyhatók figyelmen kívül az állatvédelmietikai okok sem, ezért a gyógyszeriparban egyre érezhetőbb a törekvés az in vitro módszerek használatára. E módszerek segítségével szöveteken, sejteken, sejtfrakciókon [1, 2] vizsgálják a molekula sajátságait. Előnyük, hogy munka- és költséghatékonyak, valamint az emberi szövetek, sejtek hozzáférhetősége miatt lehetőség van közvetlenül 7

8 modellezni az emberi szervezetben zajló folyamatokat. A kísérletek általában nem GLP (good laboratory practice) körülmények között folynak, de egyre inkább elterjednek a konszenzuson alapuló módszerek, ez által növelve e kísérletek megbízhatóságát [3,4]. A gyógyszeriparban napjainkra egyre inkább elterjedt az a megközelítés, hogy a nagyszámú molekula szintézisét követő nagy áteresztőképességű szűréssel (High Throughput Screening, HTS) próbálják kiválasztani azt a molekula szerkezetet, amely potenciálisan egy új gyógyszer szerkezeti alapja lehet. A molekulák szintézise ezért gyakran nem a klasszikus módon, hanem úgynevezett kombinatorikus kémiai módszerekkel történik. A módszert alkalmazva lehetőség van rá, hogy rövid idő alatt nagyszámú molekulaváltozat álljon rendelkezésre olyan módon, hogy a további szűrést is a HTS rendszerben lehessen elvégezni, amennyiben a megfelelő automatizált/robotizált háttér és az alkalmas, validált teszt rendelkezésre áll. Természetesen a szűrés elvégezhető úgy is, hogy a külön-külön szintetizált molekulákat egyenként visszük fel a lemez lyukaira és már csak a kérdéses szűrőtesztet végezzük ezen a platformon. A HTS egyszerű és robusztus technikákat igényel, amelyek mind kémcsőben, mind a HTS rendszerben elterjedt különböző lyukszámú ( stb.) lemezen (well plate) megbízhatóan alkalmazhatók. Ennek a törekvésnek tettünk eleget, amikor NO-donor sajátosságra szűrtük a Richter Gedeon RT. vegyülettárából származó molekulákat egy biomimetikus, tehát enzimfehérjét nem tartalmazó, tisztán kémiai rendszer segítségével. Rendszerünk a CYP enzimek által végzett NO-termelést modellezte, az eredményeket mikroszomális frakció felhasználásával igazoltuk. Mind az in vitro metabolizmus, mind a biomimetikus rendszerekben végzett kísérletek modellként szolgálnak egy nagyobb, bonyolultabb rendszer vizsgálatához. Éppen ezért szem előtt kell tartanunk azokat a lehetőségeket és korlátokat, amelyek e modellrendszereken nyert adataink kiterjesztését megszabják. A végső kérdés a gyógyszerkutatásban az in vitro megközelítések alkalmazásakor persze mindig az, hogy mennyire jelzi előre a módszerünk az élő szervezetben zajló történéseket. Dolgozatomban e modelleknek két szintjét vizsgáltam egy-egy példán keresztül. Az első a már említett kémiai-biomimetikus szint: e kísérleteinkkel a májban lévő CYP enzimek katalitikus ciklusát, pontosabban e ciklus ún. peroxid sönt alternatív reakcióútját próbáltuk modellezni. A modellalkotás következő, biokémiai-biológiai szintjén a máj metabolizáló kapacitásáért döntő részben felelős mikroszomális 8

9 enzimeket használtunk annak megállapítására, hogy a tolperizon egy központi támadáspontú izomrelaxáns - milyen mértékben és mely enzimek hozzájárulásával metabolizálódik. Ez valójában egy retrospektív vizsgálat volt, hiszen a szakirodalomból ismert, hogy a tolperizon biológiai hasznosíthatósága viszonylag alacsony [5], valamint a farmakokinetikai paraméterek nagy egyedek közötti eltérést mutatnak. Kísérleteinkben ezen in vivo jelenségekre kerestünk magyarázatot in vitro technikákkal, továbbá alkalmaztunk egy meglehetősen új módszert, a relatív részvétel becslését a résztvevő CYP enzimek hozzájárulásának előrejelzésére IRODALMI ÁTTEKINTÉS A gyógyszermetabolizmus és a citokróm P450 enzimrendszer A szervezetbe kerülő testidegen anyagok (xenobiotikumok) zömmel apoláros jellegű, lipidoldékony molekulák [ 6 ]. A szervezet ezen anyagoktól igyekszik megszabadulni, ezért olyan enzimatikus átalakításoknak veti alá azokat, amelyek során az eredetileg apoláros molekulák polárosabbá válnak, ezáltal a testnedvekkel való kiürülésük nagyságrendekkel felgyorsul. A biotranszformációs folyamatokat hagyományosan két nagy fázisra osztjuk: az I. Fázis reakciói zömmel oxidatív átalakulások, amelyek növelik a molekula vízoldhatóságát a polaritást növelő funkciós csoport - leggyakrabban hidroxilcsoport - kialakításával, vagy dealkilálással. A II. Fázis reakciói során az így beépült, vagy a már eleve jelen lévő funkciós csoportok révén a xenobiotikumok konjugálódnak valamilyen endogén, poláros kismolekulával (glükuronid, szulfát, glutation). Az így kialakult konjugátum kiválasztása jelentősen felgyorsul. Meg kell jegyezni, hogy az I. Fázis reakciói nem feltétlenül szüntetik meg a gyógyszerhatást: gyakran előfordul, hogy farmakológiailag aktív, esetleg toxikus metabolit képződik. Ezzel szemben a II. Fázis enzimatikus átalakításai az esetek döntő többségében a hatás erős csökkenését vagy megszűnését eredményezik [7]. Az I. és II. Fázis enzimei és reakciói viszonylag régóta ismertek, szerepük a gyógyszermetabolizmusban többé-kevésbé tisztázott. Számos vegyület farmakokinetikai viselkedését azonban nem lehetett az ismert résztvevőkkel és mechanizmusokkal megmagyarázni. A sejt- és molekuláris biológiai kutatások 9

10 derítettek fényt a transzporter fehérjék fontosságára: ezek a karrier molekulák mind az endogén anyagok, mind a xenobiotikumok transzportjában szerepet játszanak és működésükkel jelentősen képesek befolyásolni egy adott gyógyszermolekula ADME (felszívódás, megoszlás, metabolizmus, kiválasztás) tulajdonságait. A rendszert a szakirodalomban III. Fázisnak is nevezik, utalva az első két Fáziséval megegyező jelentőségére. A gyógyszermetabolizmus legfontosabb és legjobban tanulmányozott enzimrendszere a citokróm P450 (CYP) rendszer. A CYP-ek a hem-tiolát enzimek családjába tartoznak, az élővilág mind az öt birodalmában (archebaktériumok, prokarióták, gombák, növények, állatok) megtalálhatók [8]. Emlősökben szinte minden szövetben jelen vannak, de legnagyobb mennyiségben a májban, a májsejtek endoplazmatikus retikulumában (ER) mutathatók ki [9]. A máj, mint fő metabolizáló szerv mellett másodlagos, de farmakokinetikailag mégis jelentős lehet a bél, a vese, a tüdő és a placenta metabolizáló kapacitása is. A kísérletekhez szükséges enzimek legnagyobb mennyiségben májsejtekből, differenciálcentrifugálással preparálhatók: az ily módon előállított mikroszóma frakció a májsejt ER-át és az abban lévő enzimeket tartalmazza. A CYP enzimekről szóló első közlemények 1958-ban jelentek meg [10,11], az elnevezés azonban csak később született meg, utalva a redukált pigment CO-dal alkotott komplexének 450 nm-nél mérhető elnyelési maximumára a differencia spektrumban [12,13]. A kutatások kezdetén úgy gondolták, hogy egyetlen citokrómról van szó, de hamarosan bebizonyosodott, hogy az enzim több változatban létezik: ma az osztályozás az egyes izoformák közötti homológia mértéke alapján történik [ 14, 15 ]. 40%-nál nagyobb aminosavszekvencia-homológia esetén azonos családba, 60%-nál nagyobb homológia esetén azonos alcsaládba soroljuk őket. A családok jelölése arab számmal (pl. CYP1, CYP2 stb), az alcsaládoké betűvel történik (pl. CYP1A, CYP2B stb.). Az egyedi enzimeket a betű utáni számmmal különböztetjük meg (pl. CYP1A1, CYP1A2, stb). A gyógyszermetabolizmusban a CYP1, CYP2 és CYP3 család enzimei vesznek részt, a többi család tagjai endogén folyamatokat katalizálnak (szteroid bioszintézis, zsírsav- és arachidonsav-anyagcsere) [14, 16]. Az 1. táblázat a gyógyszermetabolizmusban fontos szerepet játszó CYP-ek relatív mennyiségét és részvételük arányát mutatja: 10

11 Relatív mennyiség a májban (%) Relatív részvétel a gyógyszermetabolizmusban (%) CYP1A1 <1 2,5 CYP1A2 13 8,2 CYP2A6 4 2,5 CYP2B6 <1 3,4 CYP2C8, CYP2C ,8 CYP2C18, CYP2C19 1 8,3 CYP2D6 2,5 18,8 CYP2E1 7 4,1 CYP3A4, CYP3A ,1 1. táblázat. A gyógyszermetabolizmusban szerepet játszó CYP enzimek relatív mennyisége és a gyógyszermetabolizmusban betöltött szerepe. Az adatok hozzávetőleges értékek [17]. A farmakokinetikai és gyógyszerinterakciós szempontból szerepet játszó enzimcsaládok jelenleg 18 azonosított tagja közül is csupán 5-6 játszik igazán fontos szerepet a gyógyszermetabolizmusban (CYP3A4, CYP2D6, CYP2C8/9, CYP2C19, CYP1A2). A fenti táblázatből kitűnik továbbá, hogy míg bizonyos enzimek relatív mennyisége jól tükrözi jelentőségüket az ismert gyógyszerek metabolizmusában (pl. CYP1A2, CYP2C8 és 2C9, CYP3A4) addig pl. a CYP2D6 mennyisége elenyésző a fontosságához viszonyítva. Hozzá kell tenni azonban, hogy míg az egyes izoenzimek relatív mennyiségét illetően konszenzus van az irodalomban, addig a relatív részvétel mértéke még élénk vita tárgya [14] A CYP katalitikus ciklusa A dolgozatban tárgyalt biomimetikus rendszerek jobb megértéséhez szükséges röviden szólni a CYP enzimek katalitikus ciklusáról (1. ábra). 11

12 RH ROH 3+ Fe peroxid sönt Fe 3+ RH e XO ( Fe O) 3+ RH X Fe 2+ RH H 2 O O 2 + 2H Fe O RH Fe O 3+ 2 RH e 1. ábra. A CYP enzimek katalitikus ciklusa. A ciklus elején a központi vas III-as oxidációs állapotban megköti a szubsztrátot, majd egy elektron felvételével II-es oxidációs állapotba kerül. Ebben az állapotban kötődik a hemhez az O 2 molekula, majd még egy e - és egy H +, amelyek a NADPH-ról származnak a NADPH-P450 reduktáz enzim közreműködésével. Ebben az aktivált állapotban zajlik le a szubsztrát oxidációja. A korábban belépő O 2 másik atomja egy vízmolekulaként távozik a rendszerből. Ezt követően az oxidált termék leválik az enzimről és az enzim visszakerül alapállapotba, a ciklus elejére. A szubsztrát oxidációja végbemehet az ún. peroxid sönt útvonalon is, amelynek során a reakció nem fut végig a teljes cikluson: ebben az esetben a szubsztrát oxidálásához peroxidokat használ az enzim oxigén és e - donorként. A laboratóriumi gyakorlatban e katalitikus reakció oxigén és elektrondonoraként kumol-hidroperoxidot alkalmaznak [ 18, 19, 20 ]. A szubsztrát oxidáció e mechanizmusa ugyan kevéssé hatékony reakció, mégis jó modellje a CYP 12

13 katalízisnek, mivel nem befolyásolja a reduktázról történő elektrontranszfer sebességmeghatározó lépése Biomimetikus rendszerek Szintetikus metalloporfirinek napjainkban igen elterjedtek a különböző biológiai oxidációs reakciók modellezésében [21,22], mind a kutatásban, mind az ipari célú felhasználásban. Ez utóbbi területen olyan vegyületeket fejlesztenek, amelyek képesek bizonyos sztereo-, vagy regioszelektív oxidációs reakciókra, illetve alkalmasak bizonyos szennyező anyagok elbontására [23,24,25,26,27]. E biomimetikus modell rendszerek számos előnnyel bírnak, akár a biológiai alapú in vitro technikákhoz képest is [28]: a reakciók általában jól kézbentarthatók, robusztusak a metabolitok nagy mennyiségben állíthatók elő, így lehetőség nyílik azok tisztítására és további vizsgálatára kevésbé érintik a biológiai modellek inherens bizonytalanságai (pl változó enzimaktivitás, sejt életképesség) A CYP enzimek modellezésének szempontjából a biomimetikus rendszerek két nagy családját különböztetjük meg: az első rendszerben a metalloporfirin rész vasat, mangánt vagy krómot tartalmaz, oxigén donoroként pedig leggyakrabban H 2 O 2 -t, m- klórperbenzoesavat, jodozilbenzolt, NaOCl-ot, perjodátokat alkalmaznak. Az így létrehozott rendszer a citokróm P450 peroxid sönt mechanizmusához hasonló katalitikus viselkedést mutat [29, 30, 31, 32]. A másik típusú rendszer metalloporfirint, molekuláris oxigént és redukálószert (pl. NaBH 4, aszkorbinsav, Zn(Hg), kolloidális Pt/H 2 ) tartalmaz: működése a citokróm P450 enzim teljes ciklusát modellezi. A szintetikus metalloporfirinek működési sémája a 2. ábrán látható. 13

14 Oxidálószer N N FeIII N N O N N FeIV.+ N N X vagy O N N FeIV N N Szubsztrát Oxidatív termék(ek) 2. ábra. A szintetikus vas-porfirinek működési mechanizmusa [27]. Az alapállapotú, +3 oxidációs állapotú központi fématommal rendelkező metalloporfirin, a fentiekben leírt oxidálószer, illetve oxidatív rendszer hatására reaktív, magas oxidációs állapotú oxo-metalloporfirinné alakul [27, 33, 34 ]. Ez a reaktív termék oxidálja a rendszerben található szubsztrátot, miközben maga alapállapotba kerül. A szintetikus metalloporfirineket széles körben alkalmazzák a gyógyszermolekulák és növényvédőszerek (pl. fenciklidin [ 35 ], nikotin [ 36 ], acetaminophen [37], tiagabin [38], lidokain [39], karbofurán [40]) metabolizmusának tanulmányozására és modellezésére, nagy mennyiségű metabolit termelésére. Igen érdekes példája a CYP-en keresztül, a peroxid sönt útvonalon zajló, H 2 O 2 -mediált oxidációs reakció tanulmányozásának az a kísérlet, amelyben laboratóriumi evolúciós rendszert állítanak össze a CYP-mediált naftalin hidroxiláció modellezésére. A P450 cam enzimet mutációs PCR-nek (polimeráz láncreakció) vetik alá és az egyes változatokat expresszálják, majd a szubsztrát hozzáadásával tesztelik, hogy okozott-e javulást a mutáció a hidroxilációs lépés hatékonyságában [41]. 14

15 Nagy áteresztőképpeségű szűrés (HTS) Az eredeti gyógyszerkutatásban az egyik legfontosabb tényező az idő: a molekuláris célpont (target) azonosítását követően a lehető leghamarabb rendelkezésre kell, hogy álljon az a vezérmolekula, amelyből a későbbi hatóanyag kifejleszthető, ellenkező esetben versenyhátrányba kerülünk és az adott témával ekkor már nem érdemes foglalkozni [42]. Természetesen a vezérmolekula még számos optimalizálási lépésen kell, hogy átessen a fejlesztési kandidátussá történő kiválasztásig. A kiválasztás hatékonysága jelentősen növelhető, ha megfelelő méretű és diverzitású molekulakönyvtár nagyteljesítményű szűrését valósítjuk meg, vagyis HTS módszert alkalmazunk. Ehez megfelelő automatizált és robotizált technológia és HTS-re kifejlesztett miniatürizált tesztrendszerek szükségesek. A tesztrendszerek fejlesztésének egyik lehetősége a már meglévő farmakológiai eljárás miniatürizálása és adaptálása az automatizált platformra. A másik lehetőség, hogy alapjaiban új, a HTS szempontjait figyelembe vevő módszert dolgozunk ki. E tesztek megfelelően robusztusak és megbízhatóan működnek 96/384 stb. lyukú tesztlemezeken is. A HTS eredménye a találat: ez olyan molekula, amely a vizsgált teszben a kívánt koncentrációban aktivitást mutat és ismert a szerkezete. A találatok kémiai szerkezetének optimalizálásával jutunk el a vezérmolekulához, amely alapja lehet egy új gyógyszerkutatási programnak [42] A nitrogén-monoxid szintézis és a citokróm P450 rendszer A nitrogén-monoxid (NO) szerepe az élő szervezetben szerteágazó: fontos szignálmolekula a sejtek közötti kommunikációban, az ideg-, kardiovaszkuláris-, izom-, és immunrendszerben egyaránt [43]. Termelődéséért a nitrogén monoxid szintázok (NOS) felelősek, amelyek a CYP-ekhez hasonlóan szintén hemoproteinek. Ezen enzimeknek 4 izoformája ismert, amelyből 3 konstitutív (neuronális nnos, endoteliális enos és mitokondriális mtnos) és egy citokinek által indukálható (inos). A NOS enzimek egy 5-elektronos oxidációs folyamatban oxidálják az arginint citrullinná és NO-dá, N-hidroxiarginin (NHA) köztiterméken keresztül (3. ábra). A reakció, a CYPekhez hasonlóan itt is NADPH-t és O 2 -t igényel. E kétlépéses folyamat első lépése a CYP enzimek teljes ciklusának megfelelő mechanizmus szerint zajlik, míg a második 15

16 lépés nem teljesen tisztázott, de feltételezik, hogy a NHA-ból történő NO képződés a CYP-ek peroxid sönt mechanizmusa szerint megy végbe [44, 45]. H 2 N + H 3 N NH NH 2 + NADPH O 2 O H 2 NADP+ OH HN + H 3 N NH NH 2 + H 2 N 0,5NADP+ 0,5NADPH 0,5 H + + O 2 O H 2 + H 3 N NH O COO- COO- COO- + NO L-Arginin N-Hidroxi-Arginin (NHA) Citrullin (CIT) 3. ábra. A NO bioszintézise [27] Az enzimpolimorfizmus Az enzimek és ezáltal a reakcióutak diverzitását tovább növeli a polimorfizmus, amelynek eredményeképpen az adott populációban egy adott gén és ebből kifolyólag az adott fehérje különböző változatokban van jelen. A polimorfizmus lehet ún. SNP (single nucleotide polimorphism), amikor egy nukleotidcsere vagy úgynevezett frameshift történik. A megváltozott triplet gyakran más aminosavat kódol, tehát az eredeti aminosav kicserélődik, ezáltal kevésbé aktív vagy teljesen inaktív fehérje expresszálódik [46]. A polimorfizmus megvalósulhat úgy is, hogy az adott enzimet kódoló gén hiányzik (deléció) vagy több kópiaszámban van jelen a genomban. A fenotípusban az SNP és a deléció általában az adott izoenzim csökkent működését vagy a működés teljes hiányát okozza, míg a génsokszorozódás eredménye az átírt enzim mennyiségének növekedése és ezáltal a megfelelő szubsztrátok gyorsabb eliminációja. A klinikai kép alapján nevezzük el az adott genotípusú populációkat gyors (extenzív) metabolizálóknak (EM), gyenge (poor) metabolizálóknak (PM) és ultragyors metabolizálónak (UM). Az extenzív metabolizálók jelentik az ún vad típust, mivel a DNS szekvenciában bekövetkező változás rendszerint az aktivitás csökkenésével jár; a PM fenotípusú egyedekben a csökkent működés oka leggyakrabban a mutáció, a rossz 16

17 splicing vagy a teljes génhiány. Az ultragyors metabolizálókban az adott enzimet kódoló szekvencia több kópiában fordul elő: ez fokozott expressziót eredményez, tehát ezekben az egyénekben megnövekedett enzimmennyiséggel kell számolnunk. Természetesen ezek a genomot érintő változások heterozigóta formában is jelen vannak a populációban: a szakirodalom intermediate metabolizer -nek (IM) nevezi ezt a csoportot: a mért enzimaktivitás-értékek a PM és az EM csoport értékei közé esnek. A gyógyszermetabolizmusban szerepet játszó enzimek legtöbbje polimorf formában van jelen a populációban (pl. CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, flavin-monooxigenáz (FMO), N-acetiltranszferáz, glutation S-transzferáz, UDPglukuronozil-transzferáz, P-glikoprotein, stb.) [46]. Az EM és PM fenotípus aránya enzimenként és rasszonként változik: pl. az egyik legfontosabb, polimorf enzim, a CYP2D6 esetében a kaukázusi populáció 5-10%-a PM fenotípusú, míg az ázsiai populációnak csupán 1-2 %-a érintett. A CYP2C19 esetében a kaukázusi populáció 3-5% -a míg az ázsiai 20 %-a tekinthető PM fenotípusúnak [47]. Az enzimpolimorfizmus vizsgálata a gyógyszerfejlesztés során azért fontos, mert a nagymértékben polimorf metabolizmust szenvedő molekulák PK paraméterei nagyon nagy variabilitást mutatnak. Egyrészt a PM fenotípusú egyedekben mérhető emelkedett gyógyszerkoncentráció toxikológiai problémákhoz vezethet, másrészt az EM egyedekben a gyógyszerszint esetleg el sem éri a terápiás koncentrációt. Ez a tény már a klinikai kipróbálás során megnehezíti a gyógyszeradagolást, éppen ezért a sikeres klinikai vizsgálatokhoz előzetesen genotipizált populációt kell beválogatni, valamint a terápiás gyógyszermonitorozás (therapeutic drug monitoring, TDM) is szükséges lehet In vitro metabolizmus vizsgálatok A gyógyszerjelöltek ADME/PK tulajdonságait célszerű a kutatás-fejlesztés minél korábbi szakaszában földeríteni, mivel ezen az alapon (pl. metabolikus stabilitás, enzimgátlás) hatékony szűrés valósítható meg. Ezt támasztja alá az a tény, hogy a klinikai kipróbálás során sikertelennek bizonyuló molekulák kb. 30 %-a a rossz ADME/PK, illetve biofarmáciai tulajdonságok miatt esik ki a fejlesztésből [48,49]. Az 17

18 in vitro metabolizmus vizsgálatoknak számos előnyük van az in vivo kisérletekkel szemben: Munka- és költséghatékonyabbak Kevesebb élő állatra van szükség Humán sejteken és sejtfrakciókon is végezhetők kísérletek Ez utóbbi különösen fontos tényező, hiszen a kísérleti állat és az ember metabolikus útvonalai nagymértékben eltérhetnek egymástól mind mennyiségi, mind minőségi szempontból. Ezért az emberi eredetű sejteken illetve sejtfrakciókon (pl mikroszóma) végzett kísérletek adataiból megfelelő kiterjesztési ( scaling ) módszerek alkalmazásával - közvetlenül jósolhatók a klinikai történések. E módszereknek igen kiterjedt és exponenciálisan bővülő irodalma van, bár bizonyos területeken (pl. gyógyszerinterakciók) a tudományos közvélemény megosztott az előrejelzések használhatóságát illetően [50]. Az ADME szempontból ideális gyógyszerjelölt az alábbi tulajdonságokkal kell, hogy rendelkezzen: Jó oldhatóság Lineáris farmakokinetika Több eliminációs út az anyavegyület kiválasztása a vesén keresztül az anyavegyület kiválasztása az epével kevés, farmakológiailag inaktív metabolit az oxidatív metabolizmusban több CYP enzim vesz részt a metabolizmus nem kizárólag polimorf CYP enzimek részvételével zajlik nincs kémiailag reaktív metabolit a metabolizáló enzimeket és a transzportereket nem vagy csak gyengén gátolja vagy indukálja Kis mértékű first pass metabolizmus Széles terápiás index Az in vitro metabolizmus vizsgálatoknak három fő területe van: 1. az enzimgátlás és ezen keresztül a gyógyszerinterakciók becslése, 18

19 2. a metabolikus stabilitás mérése, metabolikus útvonalak, metabolitok és a metabolizmusban részt vevő enzimek - enzimprofil - meghatározása 3. enzimindukció vizsgálata Természetesen a három terület elválása nem ilyen éles, hiszen pl. az index reakciók gátlásával kapott eredmények nem csak a gyógyszerinterakciós potenciált jósolják, hanem a metabolizmusban szerepet játszó CYP enzimek relatív részvételét is előrejelzik. Ez a három fő irány jellemző a kísérleti oldalon, a modellek szintjén is: az enzimgátlás meghatározására elsősorban mikroszómát használnak [57], a metabolizmus vizsgálatokban a mikroszóma mellett a májsejtek is jelentős szerepet kapnak, az indukciós vizsgálatok pedig értelemszerűen élő sejteket, elsősorban primer májsejteket igényelnek [51, 52]. Az egyes területek jelentősége a későbbi klinikai történések, az esetleges gyógyszerinterakciók szempontjából nem egyforma: sokkal nagyobb súllyal esik latba az enzimgátlás okozta interakció, mint az indukció eredményeként létrejött kölcsönhatások. Ennek oka, hogy míg az indukció létrejöttéhez órák-napok kellenek, addig az enzimgátlás sokkal rövidebb idő alatt kialakul, és súlyosabb következményekkel jár. Az enzimprofil meghatározása szintén fontos része a preklinikai metabolizmusvizsgálatoknak. Egyrészt kimutatja a polimorf enzimek részvételét a metabolizmusban és ezáltal lehetőséget ad mind a farmakokinetikai paraméterek, mind az ebből következő gyógyszerkölcsönhatások becslésére. Másrészt ismerve a biotranszfomációban résztvevő enzimeket lehetőség van az esetleges enzimgátlás meghatározására. A szakirodalomban reaction phenotyping vagy enzyme mapping néven említik azt az összetett folyamatot, amelynek során meghatározzák, hogy mely metabolizáló enzimek vesznek részt egy adott gyógyszer(jelölt) átalakításában [14] Az in vitro metabolizmus vizsgálatok modelljei Az in vitro metabolizmus vizsgálatokat leggyakrabban a máj oxidatív metabolizáló kapacitásáért döntő részben felelős ER frakción végezzük, amelyet a májsejtből történt preparálás centrifugálás után mikroszómának nevezünk [57]. Ez valójában az ER membránt tartalmazó vezikulumokból áll, amelyek a CYP enzimeket, az FMO-t és a II fázis enzimei közül az UDPGT-t tartalmazzák. A mikroszóma előnye a 19

20 könnyű preparálhatóság és az, hogy az enzimek ºC-on tárolva hosszú ideig megőrzik aktivitásukat. Egyszerre nagyobb mennyiséget készíthetünk belőle, így lehetőség van egy hosszabb vizsgálatsorozatot is elvégezni ugyanazzal az sarzzsal. Mivel az egyes enzimek aktivitása egyénenként változik, gyakran használunk több donorból származó ún. mikroszóma pool-t. Ezáltal az egyedi különbségek kiegyenlítődnek, megfelelően sok egyedből összegyűjtött mikroszóma preparátum jól reprezentálja a populáció átlagára jellemző metabolikus történéseket. További előnye, hogy a NADPH-P450 reduktáz/cyp arány, a citokróm b5 mennyisége, továbbá a lipidösszetétel megegyezik az intakt májban lévő értékekkel. A mikroszómán alapuló in vitro módszerek széles körben elterjedtek, sőt napjainkban egyre több közlemény jelenik meg, amelyben konszenzuson alapuló technikákat javasolnak az adatok megbízhatósága és laboratóriumok közötti összehasonlíthatósága érdekében [3]. Szintén ER membránból állnak, tehát mikroszómának tekintendők a rekombináns enzimeket tartalmazó preparátumok. Ezeket úgy állítják elő, hogy az adott enzimet kódoló szekvenciát klónozzák és cdns-ként beépítik egy vektorba (pl. baculovírus), amely vektor a gazdasejtbe baktérium-, élesztő-, emlős-, esetünkben rovarsejt jutva a hordozott szekvenciát a gazdagenomba építi, ahonnan az kifejeződik. Nagy előnyük e modelleknek, hogy elkülönítve expresszálják az egyes CYP izoenzimeket, éppen ezért nem szükséges specifikus index szubszrát a mérésekhez. Hátrányuk, hogy a már említett NADPH-P450 reduktáz/cyp és citokróm b5/cyp arány változó és jelentősen eltérhet a máj mikroszóma megfelelő értékeitől, ami megváltozott átviteli számot (V max -ot) eredményezhet, NHA a K m érték a mikroszóma adott izoenzimje és a rekombináns CYP között általában hasonló. Ez utóbbi kitétel csak abban az esetben igaz, ha a mikroszómán is csak egy izoenzim vesz részt az adott metabolikus átalakításban [14]. Éppen ezért egy egyszerű, rekombináns enzimekkel végzett kísérlet nem ad választ arra a kérdésre, hogy milyen mértékben bontja az adott enzim a tesztvegyületet, valamint, hogy az enzimek egymáshoz viszonyított kapacitása ténylegesen milyen; csupán azt mondja meg, hogy egyáltalán részt vesz-e a kérdéses enzim a metabolizmusban. Ahhoz, hogy fiziológiásan is releváns mennyiségi adatokhoz jussunk úgynevezett kiterjesztési (scaling) módszereket kell alkalmaznunk. Ezek a módszerek az adott izoenzim mennyiségi vagy aktivitási arányát veszik alapul a rekombináns preparátumban, illetve a mikroszómában és ezzel az arányszámmal (RAF) 20

21 korrigálják a rekombináns rendszerben nyert adatokat [53, 54]. Az irodalom azonban inkább az utóbbi, tehát az aktivitás alapú RAF számolást fogadja el, mivel ez tükrözi a tényleges kapacitás arányt a metabolizmusban az expresszált enzim és a mikroszóma között [55]. Kevésbé elterjedtek, de említést érdemelnek a tisztított, rekonstituált enzimek, amelyek legfőbb előnye az egyszerű használat, a könnyű kezelhetőség [14]. E preparátumokat úgy készítik, hogy a tisztított CYP enzimeket megfelelő arányban keverik a NADPH- P450 reduktázzal és a citokróm b5-tel. Hátrányuk, hogy nem minden enzim hozzáférhető tisztított formában, valamint a rekonstituálás sem mindig reprodukálhatóan történik. Az említett enzim alapú modellek mellett a vizsgálatok másik nagy csoportját a sejt alapú modellek jelentik. Ezek a frissen preparált vagy mélyfagyasztott májsejtek és a májszeletek. Számos előnyük mellett pl. teljes metabolikus enzimkészlet rendelkezésre áll hátrányuk, hogy az enzimaktivitások jelentősen változhatnak a sejtkultúra körülményeitől függően, valamint, hogy egyéb tényezők, pl. a tesztanyag sejtekbe való bekerülésének módja jelentősen befolyásolhatják egy adott molekula enzimkinetikai tulajdonságait. Éppen ezért az enzimgátlás mértékének megállípítására kevésbé használatosak, inkább a metabolikus profil térképezésére és a metabolikus stabilitás számítására alkalmasak. Természetesen az enzimindukciós vizsgálatok mivel az indukció során a sejt teljes transzkripciós-transzlációs apparátusára szükség van - csak élő májsejteken végezhetők, erre a mikroszóma nem alkalmas. 21

22 Az enzimkinetika szerepe a metabolizmus-vizsgálatokban A gyógyszermetabolizmus in vitro tanulmányozása során a biotranszformáció jellemzésére gyakran használjuk az enzimkinetikai paramétereket [56]. E paramétereket a klasszikus enzimkinetikai analízisnek megfelelően növekvő szubsztrátkoncentráció mellett mért reakciósebességek ábrázolása után kapjuk, egy adott biotranszformációs útvonalon. Fontos tényező, hogy a reakció lineáris legyen mind az idő, mind a fehérjekoncentráció függvényében, valamint, hogy a szubsztrátfogyás ne haladja meg a 10 %-ot [14]. Meg kell azonban jegyezni, hogy mivel a mikroszomális közeg nem csak egy enzimet tartalmaz, tehát a tesztanyagunk több enzim által is metabolizálódhat többféle kinetikával, továbbá maguk a metabolitok is egy konszekutív lépés szubsztrátjai lehetnek, az ideális feltételeket gyakran nehéz teljesíteni. További korlátot jelent az analitika, vagyis, hogy az enzimreakció lineáris tartományában esetleg detektálhatatlanul kevés metabolit képződik. Az in vitro enzimkinetikai mérés tehát leggyakrabban kompromisszum eredménye, de természetesen a vezérelv mindezek mellett is a linearitásra való törekvés. A legegyszerűbb esetet feltételezve a szubsztrát metabolizmusáért egy enzim felel: ebben az esetben a reakció leírható a Michaelis- Menten egyenlettel : v Vmax [ S] K + m [ S] = (1) amelyben v az aktuális reakciósebesség, [S] a szubsztrátkoncentráció, V max az enzimreakció maximális sebessége és K m a Michaelis-állandó, vagyis az a szubsztrátkoncentráció, ahol a reakció sebessége V max /2 [57]. Az egy enzim -modellt igazolhatjuk az ún. Eadie-Hofstee ábrázolással, ahol az x tengelyen a v/[s] (reakciósebesség/szubsztrátkoncentráció) arányt, az y tengelyen a v-t ábrázoljuk. Amennyiben egy egyenest kapunk, valószínűsíthetjük, hogy az adott metabolit termelésért egy enzim a felelős (4. ábra, A és B). Ez az ún. egyfázisú kinetika nem jelenti feltétlenül azt, hogy csupán egy CYP enzim vesz részt a folyamatban. Ha a résztvevő enzimek hasonló kinetikai paraméterekkel bírnak, az egyes komponensek nem válnak szét az ábrázolás szintjén, vagyis úgy tűnik, mintha egyfázisú kinetikával működne az enzimreakció, mint a citaloprám [58] és a zolpidem [59] esetében. 22

23 v v [S] v/[s] v C v D [S] v/[s] v E v F [S] v/[s] v G v H [S] v/[s] 4. ábra. Az enzimkinetikai adatok Michaelis - Menten (A, C, E, G) és Eadie-Hofstee (B, D, F, H) ábrázolása. Az A és B ábra az egy enzim részvételét leíró kinetikát, a C és D ábra a két-enzim kinetikát, a E és F ábra a szubsztrátgátlás kinetikáját, a G és H ábra az allosztérikus aktiváció kinetikáját mutatja [57]. v: reakciósebesség, [S]: szubsztrátkoncentráció. 23

24 Leggyakrabban azonban az Eadie-Hofstee grafikon pontjai nem esnek egy egyenesbe: ilyenkor a görbe alakjának vizsgálata a különböző enzimkinetikai jellegzetességekre világíthat rá (4. ábra) [57]. Az egyszerű Michaelis-Menten összefüggéstől való eltérés oka lehet, hogy az enzim aktív helyén több szubsztrátkötő régió is található. Ezek a kötőhelyek befolyásolhatják egymás működését: az ún. szubsztrátgátlás esetén a nagy szubsztrátkoncentráció az enzimaktivitás csökkenéséhez vezet (4. ábra. E-F). Az allosztérikus aktivációnál a növekvő szubsztrátkoncentráció egy bizonyos küszöbérték fölött az enzim fokozott működését eredményezi. Így jön létre a jellegzetes S alakú görbe a Michaelis-Menten ábrázoláson. (4. ábra. G-H) [60]. A CYP3A4-ről közismert, hogy több szubsztrátkötő hellyel is rendelkezik ezért nem véletlen, hogy ezen enzim vizsgálatakor adódnak leggyakrabban az imént említett atipusos kinetikai profilok [61, 62 ]. Az atipusos kinetikai viselkedés megítélése még intenzív vita tárgya az irodalomban: sem a szubsztrát gátlás, sem az aktiváció in vivo jelentőségét nem támasztották alá meggyőző adatokkal; annyi mindenesetre bizonyos, hogy a tévesen értelmezett adatokból téves enzimkinetikai paraméterek számolhatók [63, 64]. Ha az adott metabolikus folyamathoz két enzim járul hozzá, akkor kétfázisú összefüggést kapunk, vagyis a két komponens jellemezhető egy-egy paraméterpárral (K m -V max ) [65]. v Vmax,1 [ S] Vmax,2 [ S] + K m,1 + [ S] K m,2 + [ S] = (2) Ilyenkor a kisebb K m -mel rendelkező összetevőt nagy affinitású komponensnek, a nagyobb K m -mel bíró összetevőt kis affinitású komponensnek nevezzük, bár a szintén használatos kis-k m enzim (low-k m enzyme) és a nagy-k m enzim (high-k m enzyme) elnevezést bizonyos szerzők pontosabbnak tartják. Az egyfázisú kinetikánál kifejtett okok miatt a kétfázisú kinetika is csak azt jelenti, hogy legalább két enzim vesz részt a metabolizmusban, de a mért értékek valójában lehetnek ún. hibrid paraméterek [66]. A K m nagyon hasznos paraméter a predikció szempontjából: az enzimek nettó hozzájárulását durván becsülni lehet a terápiás koncentráció és a K m -ek ismeretében: mivel a terápiás tartomány a legtöbb gyógyszer esetén jóval a kis affinitású enzim K m je alatt marad ezért azon enzimek szerepe kiemeltebb, amelyek már alacsony 24

25 szubsztrátkoncentráció esetén is képesek működni, tehát a nagy affinitású enzimek jelentősége általában nagyobb. A gyakorlatban az említett paraméterek kiszámítására számos linearizált ábrázolás alkalmas (pl. Lineweaver-Burke (1/S-1/v); Eadie-Hofstee (v/s-v), Hanes (S- S/v)), a modern szoftverek azonban a Michaelis-Menten ábrázolásból egy lépésben, nemlineáris illesztéssel is megadják azokat Kémiai gátlószerek Egy adott molekula metabolizmusában részt vevő enzimek azonosításának egyik fontos lépése az izoenzim-specifikus kémiai gátlószerek alkalmazása. A kísérleteknél figyelembe kell azonban vennünk, hogy az egyes gátlószerek adott koncentrációtartományban specifikusak, valamint maguk is szubsztrátjai lehetnek vagy a gátolt, vagy egy másik izoenzimnek, továbbá, hogy a gátlószer metabolitja is gátol, esetenként erősebben, mint az anyavegyület. Általában minél magasabb az alkalmazott koncentráció, annál kevésbé szelektív a gátlószer az adott izoformára [ 67, 68 ]. Mindezen korlátok mellett a kémiai gátlószerek igen hasznos eszközei az in vitro metabolizmus vizsgálatoknak, mivel alkalmazásuk jelenti a legegyszerűbb és legolcsóbb megoldást a résztvevő enzimek azonosítására Enzim specifikus gátló ellenanyagok A kémiai gátlás sok esetben nem specifikus, valamint nagyon érzékeny a gátolt anyag és a gátlószer koncentráció arányára. Ezért célszerű olyan enzimgátlási módszert keresnünk, amely specificitása jóval nagyobb az említett vegyületekénél. Az utóbbi 1-2 évtizedben, az immunológia fejlódésével, az immunfolyamatok megértése révén számos igen hasznos eszköz került a kutatók kezébe. Ezek közül az in vitro metabolizmus vizsgálatok során elsősorban a gátló ellenanyagokat használjuk. A poliklonális ellenanyagokat úgy készítik, hogy a gátolni kívánt humán fehérjét, vagy annak valamilyen ortológ formáját megtisztítják és kísérleti állatot, általában nyulat, vagy kecskét immunizálnak vele, tehát antigénként alkalmazzák. Az antigén nem csak teljes, 25

26 tisztított fehérje lehet: gyakran használnak egy rövidebb polipeptid antigént, vagy a fehérje rekombináns DNS technikával előállított változatát [ 69 ]. Az immunválasz kialakulása után az immunizált állat szérumából megfelelő kromatográfiás eljárással pl. affinitáskromatográfia tisztítható az antigén specifikus immunoglobulin (Ig) frakció, vagy egyszerűen az immunszérumot használjuk. Ekkor természetesen egy nem immunizált állat vérsavóját is használnunk kell kontrolként. Az így nyert ellenanyagkeverék, mint azt a neve is mutatja, több epitopot is felismerő Ig molekulák elegye. Ezzel szemben a hibridóma technikával előállított monoklonális ellenanyag csak egyféle specifitású Ig-okat tartalmaz, mivel azokat egy meghatározott epitopra szelektált sejt klónjai termelik; ebben az esetben az ellenanyag alkalmas eljárással a sejtek felülúszójából tisztítható Index reakció gátlás Az egyes CYP izoenzimeknek léteznek ún. index reakcióik. Ezek olyan metabolikus átalakítások, amelyekről bizonyították, hogy döntően egy adott izoenzim katalizálja őket. A leggyakrabban használt index reakciókat a 2. táblázatban foglaltam össze. Tehát nem arról van szó, hogy adott szubsztrát csak egy adott enzim hatására bomlik, hanem, hogy egy adott metabolitképződési lépést egy adott enzim katalizál. Ez jelenti egyben a módszer hátrányát is: mivel több enzim vehet részt a metabolizmusban, a tényleges szubsztrátkoncentráció az inkubálási idő előrehaladtával lényegesen eltérhet a kiindulási koncentrációtól, azaz a nem vizsgált átalakulás is jelentős mértékű szubsztrátdepléciót okozhat. Ezért van szükség arra, hogy a szubsztrátfogyást kb. 10%- ban maximáljuk. A kísérletek során kromatográfiás vagy spektrometriás módszerrel detektáljuk az index szubsztrátból képződött metabolitot a növekvő szubsztrátkoncentráció függvényében és meghatározzuk az enzimkinetikai paramétereket a különböző koncentrációjú tesztvegyület, mint gátlószer jelenlétében. Ezt követően kiszámítjuk az ún. gátlási állandót (K i ). A K i egy koncentrációfüggetlen paraméter, ami az enzim-gátlószer komplex disszociációs állandója. Az indexreakciógátlás eredményeinek kinetikai elemzése alkalmas a gátlás típusának megállapítására is. 26

27 Enzim CYP1A1 Index reakció Etoxirezorufin O-deetiláció Fenacetin O-deetiláció CYP1A2 Etoxirezorufin O-deetiláció CYP2A6 Cumarin 7-hidroxiláció CYP2B6 (S)-mefenitoin N-demetiláció CYP2C8 Paclitaxel 6-hidroxiláció CYP2C9 Tolbutamide 4 -hydroxiláció Diclofenac hidroxiláció CYP2C19 (S)-mefenitoin 4 -hidroxiláció CYP2D6 Dextrometorfán O-demetiláció Bufuralol 1 -hidroxiláció Debrisoquine 4- hidroxiláció CYP2E1 p-nitrofenol- hidroxiláció Klórzoxazon 6-hidroxiláció CYP3A Midazolám 1-hidroxiláció Tesztoszteron 6ß- hidroxiláció Dextrometorfán N-demetiláció FMO Benzidamin N-oxidáció 2. táblázat. A legfontosabb CYP enzimek és index reakcióik. Leggyakrabban a direkt, vagy reverzibilis gátlási típusok, azon belül is az ún. kompetitív gátlás fordul elő, amikor a tesztanyagunk, mint gátlószer verseng az index szubsztráttal az enzim kötőhelyéért. Ebben a kitüntetett esetben a K i -t úgy is értelmezhetjük, mint az a szabad gátlószerkoncentráció, amely a Cl int et a felére csökkenti [14]. CL CL = I 1+ K int int, gátolt (3) amelyben I a gátlószer koncentrációja. A fenti összefüggésből kitűnik tehát, hogy nem elsősorban a K i az a paraméter, amely a gátlás erősségéről tájékoztatást ad, hanem a I/K i hányados. A kompetíció miatt, ha a szubsztrátot többszörös moláris feleslegben adjuk, i 27

28 képes teljesen leszorítani a kompetitív gátlószert az enzim aktív helyéről. Ezáltal a V max érték nem változik, viszont, a K m érték nő. A kompetitív gátlás mellett gyakran tapasztalunk nonkompetitív gátlást: ekkor a gátlószer nem a szubsztrátkötő helyen, hanem máshol kötődik az enzimhez. Mivel az enzim-szubsztrát kötődés erőssége nem változik, csak a katalizált reakció sebessége, ezért a K m érték változatlan marad, míg a V max csökkenése tapasztalható. Az unkompetitív gátlás esetében a gátlószer csak az enzim-szubsztrát komplexhez képes kötődni; a kötőhely lehet az aktív helyen, vagy azon kívül is. Ekkor mind a K m, mind a V max csökken. Az említett tiszta eseteken kívül gyakran találkozunk ún. kevert gátlással (mixed inhibition), ami a kompetitív és a nonkompetitív hatások eredőjeként jön létre és a K m növekedése mellett a V max csökkenésével jár [15]. A gátlószerek másik nagy csoportját alkotják a metabolizmus-függő gátlószerek: ekkor a gátlószer az enzim által történő átalakítást követően válik aktivvá és csak így fejti ki a gátlást, ami kvázi-irreverzibilis vagy irreverzibilis lehet. Az első esetben pl. makrolid antibiotikumok, alkilaminok, heterociklusos aminok esetében a kialakuló metabolit erősen kötődik az enzim hem részéhez. A kvázi-irreverzibilis gátlás igazolható az ún. metabolikus inhibitor komplex (MI) kimutatásával. Ez egy spektrofotometriásan detektálható komplexet eredményez, amely csak NADPH hozzáadására alakul ki, jelezve a szükséges metabolikus lépést. A spektrumon a komplex jellegzetes, általában nm körüli csúcsként jelentkezik, amely az inkubálási idővel egyre nő [70, 71]. Terminális kettős-, vagy hármas kötést tartalmazó molekulákból az oxidáció során reaktív gyökök képződnek, amelyek alkilálhatják mind a hemet, mind az apoproteint. Ebben az esetben irreverzibilis gátlásról beszélünk, mivel az enzimaktivitás visszaállításához de novo enzimszintézis szükséges. A kváziirreverzibilis és a reverzibilis gátlószereket mechanizmus-alapú gátlószereknek is nevezzük. A preklinikai metabolizmus-vizsgálatok során igen fontos, hogy a klinikai kandidátust megvizsgáljuk, hogy rendelkezik-e ilyen irreverzibilis gátló hatással, mivel gyakran előfordul, hogy ezek az anyagok viszonylag magas K i értékkel rendelkeznek, tehát gyenge gátlószernek tűnnek, in vivo gátló hatásuk azonban sokkal drasztikusabb lehet az említett okok miatt. A metabolizmus-kutató számára nem mellékes, hogy ezek a gátlószerek eredménnyel használhatók a laboratóriumi gyakorlatban izoforma specifikus vagy általános kémiai gátlószerként (pl. furafillin és ABT). 28

29 Korrelációs elemzés A résztvevő CYP enzimek azonosítására alkalmazható a korrelációs analízis is. A módszer lényege, hogy meghatározzuk az egyedi mikroszómák specifikus aktivitását egy kitüntetett index reakcióban, valamint az általunk vizsgált, szubsztrátként a tesztvegyületünket tartalmazó átalakulásban, és a kapott értékeket ábrázoljuk rendre a grafikon X és Y tengelyén. A módszer hátránya, hogy ha az aktivitási szélsőértékek között kevesebb, mint 5-szörös különbség adódik, akkor a korreláció felállítása nem megbízható [69]. Természetesen a módszer nem csak mikroszomális, hanem egyéb, pl. citoplazmatikus enzimek azonosítására is alkalmas [72] A tolperizon A tolperizon - 1-(4-metil-fenil)-2-metill-3-(1-piperidino)-1-propanon-hidroklorid (5. ábra)- egy központi támadáspontú izomrelaxáns [ 73 ], amelyet évtizedek óta használnak izomgörcsök és egyéb ortopédiai és reumatológiai megbetegedések kezelésére. CH 3 CH 3 C CH CH 2 N O HCl 5. ábra. A tolperizon szerkezeti képlete. Membránstabilizáló, helyi érzéstelenítő hatása révén gátolja a gerincvelői mono- és poliszinaptikus reflexeket. A szinaptikus Ca ++ beáramlás gátlásával feltehetően gátolja a transzmitter kiáramlást. Az agytörzsben a reticulospinalis reflexek facilitációját gátolja. Csökkenti a decerebrációs izomtónus-fokozódást, rigiditást az állatmodellek szerint. A perifériás véráramlást fokozza, ezáltal oldja az érgörcsöket, feltehetően perifériás 29

30 hatással. Szedációt nem okoz, az alkohol központi idegrendszeri hatását nem befolyásolja. Ono és munkatársai kimutatták, hogy a tolperizon lokális anesztetikumként viselkedik motoneuronokon és a primer afferenseken in vivo illetve a patkány perifériás idegein in vitro [ 74 ]. A tolperizon hatásában azonos a lidokainnal: mindketten feszültségfüggő nátrium-csatornákat gátolnak [75]. Pratzel és munkatársai hatékonynak találták a tolperizont fájdalmas izomgörcsök kezelésében [76]. Tolperizon tartalmú készítmény Mydeton néven (filmtabletta és injekció) van forgalomban Magyarországon. Adása amiotróf laterális szklerózisban (ALS), paralysis spinalis spasticában és szklerózis multiplexben szenvedő betegek részére, valamint stroke utáni centrális izomtónus fokozódással járó állapotokban javallott [77]. A tolperizon farmakokinetikai jellemzőiről található utalás az irodalomban, ám a molekula in vitro metabolizmusa és izoenzim profilja ezidáig még nem volt ismert. A hetvenes években végzett in vivo patkány vizsgálatok során GC/MS technikát alkalmaztak [78, 79] ben publikálta Miskolczi és munkatársai annak a humán vizsgálatnak az eredményeit, amelyben két tolperizon tartalmú készítmény, a Mydeton és a Mydocalm farmakokinetikai paramétereit határozták meg plazmából egy újonnan kifejlesztett és érzékeny kromatográfiás technikával [5]. E tanulmány alapján a tolperizon biológiai felezési ideje 1,55 ± 0,7 h, a teljestest klirensz 140,8 ± 33,8 l/h értéknek adódott. A biológiai hasznosíthatóság rendre 22,3 ± 6% és 16,7 ± 8,9% volt. 30

31 2. CÉLKITŰZÉSEK 1. Biomimetikus rendszer kifejlesztése és validálása potenciális nitrogénmonoxid (NO) donorok azonosítására. Célul tűztük ki, egy szintetikus metalloporfirint tartalmazó biomimetikus oxidációs rendszer kidolgozását, amely alkalmas potenciális NO donorok azonosítására, HTS módszerrel. Célom volt a biomimetikus rendszer összehasonlítása patkány mikroszomális CYP enzimekkel, vagyis annak igazolása, hogy a kémiai rendszer képes modellezni a biológiai, in vitro reakciókat és előrejelezni egy adott molekula NO donor sajátságát. Mivel a NO-ról köztudott, hogy erős értágító, simaizomlazító hatása van, a kísérletek megalapozhatják egy esetleges máj-szelektív NO donor sajátságú gyógyszer kifejlesztését a portális hipertenzió okozta elváltozások kezelésére. 2. A tolperizon in vitro metabolizmusában szerepet játszó mikroszomális enzimek azonosítása. Célunk volt, hogy humán máj mikroszóma frakció, és rekombináns humán mikroszomális enzimek felhasználásával azonosítsuk a tolperizon metabolizmusában szerepet játszó enzimeket és megállapítsuk, melyek azok, amelyek kulcsszerepet játszanak a biotranszformációban. E vizsgálatainkkal választ kívántunk adni arra a kérdésre, hogy miért alacsony a tolperizon biológiai hasznosíthatósága annak ellenére, hogy jól felszívódik. A kísérletekben a klasszikus CYP reakció-fenotípus meghatározás (CYP reaction phenotyping) módszereit kívántuk használni. 3. A tolperizon hidroxiláció enzimkinetikai jellemzése. Célunk volt, hogy humán mikroszóma és rekombináns enzimek felhasználásával jellemezzük a tolperizon legfontosabb metabolikus átalakulását, továbbá meghatározzuk az egyes izoenzimek relatív részvételét a relatív aktivitási faktor (RAF) alkalmazásával. Ez az eljárás lehetővé teszi, hogy a rekombináns enzimek felhasználásával nyert adatokat mikroszomális rendszerre is kiterjesszük, és így becsülni tudjuk a résztvevő metabolikus enzimek hozzájárulásának mértékét. 31