Epigenetikai szabályozás

Átírás

1 Epigenetikai szabályozás 1. A Transzkripció epigenetikai szabályozása Dia 1 A kromatin szerkezete A sejtciklus S fázisában egyetlen sejtben kb 4x1 méter hosszúságú DNS található 4x23 darabra vágva (4N kromoszóma garnitúra ebben a fázisban). Ezeket a hosszú DNS fonalakat kell úgy összehajtogatni, hogy a kromoszómák szétválása az utódsejtekbe hibátlan legyen. Ezt a bonyolult feladatot zömében a hisztonok végzik. A kromoszómaképződés irányítása mellett, a hisztonok másik funkciója a DNS-ről történő transzkripció szabályozása. A kromatint DNS, hisztonok és ún. nem-hiszton fehérjék alkotják. A kromatin alapegysége a nukleoszóma, amely 146 bázispárnyi DNS-t és a hozzákapcsolódó hiszton oktamert tartalmazza. A nukleoszómákat a linker DNS kapcsolja össze, amely a 10 nm-es fonalakban nem tartalmaz hisztonokat. A hiszton oktamer két-két H2A, H2B, H3 és H4, tehát összesen 8 hiszton molekulából áll (oktamer). A H1 molekula szerepe a nukleoszómák összekötése. A nukleoszómák alkotta szálat a 10 nm-es fonalnak, az ettől összetekeredettebbet a 30 nm-es fonalnak nevezzük. Az ettől is kompaktabb kromatin szálak jóval vastagabbak. A hiszton fehérjék rendkívül konzervatívak, pl. az ember és a borsó H4 alegysége mindössze két aminosavban különbözik egymástól dacára annak, hogy a közös ősünk több mint egymilliárd évvel ezelőtt élt. A DNS ún. konstitutív heterokromatin régiója (főként a kromoszóma végek és a centromer környéke) erősen feltekeredett állapotú, s itt sohasem folyik transzkripció. A fakultatív heterokromatin sejttípustól függően transzkripcionálisan aktív lehet. Az eukromatin régió génekben rendszerint gazdag, enyhén fedett hisztonokkal, s vagy állandóan folyik róla az RNS-ek képződés, vagy indukció hatására. A hiszton metiláltsági állapota rendszerint (nem mindig) negatívan, az aciláltsági szintje pedig pozitívan befolyásolja a DNS transzkripciós aktivitását. A hiszton molekulákhoz kapcsolódhat még foszfát csoport, ubikvitin és az ún. SUMO peptid, melyek mind befolyásolják a hiszton kötődést, s így a transzkripciót. Nem csak a hiszton, hanem a DNS is metilálódhat. Az erősen metilált DNS szakaszok transzkripciós szintje alacsony. A hiszton-taszító kromatin domének nem kedveznek a hisztonok tapadásának, az ilyen szekvenciák környezetében a DNS szakaszok hisztonoktól mentesek, vagy jóval kevesebbet tartalmaznak ezekből a molekulákból, mint a szomszédos DNS régiók. 1 Dia 2 A kromatin módosítása A hiszton DNS kötődés szabályozása különböző kromatin állapotot eredményezhet (erősen vagy lazán kötött hiszton, hiszton-mentesség), amely a genetikai információ különböző szintű leolvasását teszi lehetővé. A kémiai módosításokat különféle enzimek (metilázok, acetilázok, stb.) végzik, melyek kifejeződését és hatását különféle fehérjék és nem-kódoló RNS-ek szabályozzák. A hiszton fehérjék acetilációja eltávolítja a pozitív töltéseket, ami által csökken a hiszton DNS-hez való affinitása, s így az RNS polimeráz és a transzkripciós faktorok könnyebben hozzáférnek a DNS szabályozó régióihoz, ami megnöveli az érintett génekről történő transzkripció végbemenetelének esélyét. A hiszton acetil transzferáz (HAT) enzim végzi az acetil csoportok (-COCH 3 ) hozzákapcsolását a hisztonok egyes lizin aminosavaihoz, míg a deacetilázok eltávolítják az acetil gyököket. A hisztonok metilációja metil gyök (-CH 3 ) hozzáadása az acetilációval rendszerint ellenkező hatású. A metilált hisztonok általában (nem mindig) erősebben kötődnek a DNS-hez. A metiláció célpontja a hisztonok N- terminálisán elhelyezkedő bázikus lizin és arginin aminosavak. A DNS is metilálódhat (de nem acetilálódhat!). A metilált DNSen is gátlódik a transzkripció, itt egyes citozinokhoz kapcsolódik a metil gyök, mely reakciót a DNS metil-transzferázok katalizálják. A de-metilázok ellenkezőleg hatnak: eltávolítják a metil csoportokat. A kromatin módosítást végző enzimek a transzkripciós faktorok DNS-hez

2 való hozzáférhetőségét szabályozzák. Vannak olyan esetek, amikor maguk a transzkripciós faktorok távolítják el az epigenetikai módosításokat. Például, a glükokortikoid hormon/receptor komplex transzkripciós faktorként viselkedik, de közvetlen feladata a hiszton eltávolítása a szteroid hormonra reagáló gének enhanszer szekvenciájáról. Ez lehetővé teszi egy aktivációs doménnel rendelkező másik transzkripciós faktor kapcsolódását, ami végül elvégzi a kontrollált gének aktivációt. Dia 2 A kromatin szerkezeti és funkcionális doménjei Néhány gént és gén csoportot ún. nukleoszóma taszító szekvenciák fognak közre MAR (matrix attachment region), vagy egyetlen kópiában vannak jelen az LCR (locus control region) és a SAR (scaffold-associated region). Ezek a szekvenciák taszítják a hiszton fehérjéket, s ezért a környező gének szabadon leíródhatnak. A legkorábbról ismert LCR a - globin gének transzkripcióját szabályozza. Ennek az LCR szekvenciának a mutációja az ún. spanyol vérszegénységet (hispanic thalassemia) okozza. 2 Dia 3 A kromatin szerkezetét a különféle kémiai reakciók (acetiláció, metiláció, stb.) háromféleképpen módosítják: (1) lazítják vagy erősítik a nukleoszómák szerkezetét, (2) elmozdítják, vagy (3) eltávolítják a nukleoszómákat. E folyamatokat nevezik kromatin átalakításnak (chromatin remodeling). A hisztonok 20 aminosavból álló N-terminális vége kinyúlik a nukleoszómák felszínéből. Ennek az a jelentősége, hogy az N-terminális hiszton farok a célpontja lehet különféle módosító enzimeknek, amelyek a hiszton kötődés erősségét befolyásolják. A DNS negatív, míg a hisztonok pozitív töltésűek, s így a két molekulaféleség vonzza egymást. A hisztonok pozitív töltését elsősorban a lizin aminosavak okozzák. A hisztonok N-terminális farka sok lizint tartalmaz, s ez az aminosav a hiszton módosítást végző enzimek célpontja. A hiszton módosítás következményeként változik a hiszton kapcsolata (i) DNS-el, (ii) a szomszédos nukleoszómákkal, ill. (iii) a szabályozó fehérjékkel. A hiszton módosulás magában foglalja a nukleoszóma szerkezetének (lazább vagy szorosabb) változását, a nukleoszómák elmozdulását, ill. egyes nukleoszómák megszűnését (felbomlik a DNShiszton kötés). A nukleoszómák egyes darabjai, sőt az egész nukleoszóma is kicserélődhet más hisztonokból álló alegységekre. Ez utóbbi folyamatnak az értelme az, hogy a kicserélődő hisztonok más-más kémiai módosításokat tartalmaznak. A hiszton módosítások típusai a következők: acetiláció, metiláció, ubikvitináció, sumoyláció, és foszforiláció. Dia 4 A hiszton acetilációja során a hisztonok N-terminálisán lévő egyes lizin molekulák egyik H atomja acetil gyökre (COCH 3 ) cserélődik. E folyamat eredményeként a hiszton nettó pozitív töltése mérséklődik, s ezért a DNS-hez való affinitása csökken. Ezt a kémiai reakciót a hiszton acetil transzferáz (HAT) enzim katalizálja. Több, különböző HAT molekulaféleség létezik. A hiszton deacetiláz (HDAC) enzimek ellenkező hatásúak, eltávolítják az acetil gyököket a hisztonról, s ezáltal stabilizálják a hiszton-dns kölcsönhatást, s egyben gátolják a DNS-ről történő transzkripciót. Mind HAT mind a HDAC enzimek több alegységből álló, ún. multiprotein komplexek. A hiperacetilált (sok acetil gyököt tartalmazó) hisztonok főként a transzkripcionálisan aktív DNS szakaszokra, míg a hipoacetilált (kevés acetil csoportot tartalmazó) hisztonok a nem transzkriptálódó DNS régiókra jellemzőek. Egyes transzkripciót aktiváló vagy gátló faktorok közvetlenül a hiszton acetilációt szabályozzák. Más faktorok pedig az acetilációt és a deacetilációt végző enzimekre vannak hatással (pl. foszforilálják azokat). Az acetiláció a kromatin szerkezetet kétféle módon befolyásolja: (1) csökkenti a hiszton pozitív töltését, s így annak kötődését a DNS-hez, ami elősegítheti a transzkripciót végző fehérjék DNS-hez való hozzáférését; (2) megváltoztatja a hiszton és a szomszéd hisztonok közötti kapcsolatot, ill. a hiszton és a szabályozó fehérjék közötti affinitást. Bizonyos betegségeket (pl. daganatok) a deacetiláció túlsúlya jellemez, mivel azt eredményezi, hogy a sejtciklust gátló fehérjék génjei inaktívak. Egyes tumor terápiás megközelítések a deacetilázok gyógyszeres blokkolásán alapulnak. Két különböző átalakító (remodeling) fehérje (HAT) szünteti meg a hisztonok traszkripciót gátló hatását: egyik a transzkripció iniciációs (kezdő), másik az elongációs (lánchosszabbítás) szakaszban. Az iniciációs szakaszban az átalakító fehérjék lehetővé teszik a transzkripciós

3 (pre-iniciációs) komplex DNS-hez való kötődését azáltal, hogy eltávolítják a transzkripció kezdőpontjától a nukleoszómát. Egy másik fehérje biztosítja a transzkripció haladását a DNS szálon (elongáció). Dia 5 A hiszton metilációja (5a) A metiláció célpontjai a lizin mellett a szintén pozitív töltésű arginin aminosavak. A metiláció eredményeként az aminosavak 1, 2 vagy 3 H atomja metilgyökre (CH 3 ) cserélődik, s így metil-lizin, dimetil-lizin, vagy trimetil-lizin molekulákat kapunk. Egy lizin molekulán az acetiláció és a metiláció kölcsönösen kizárja egymást. A metiláció nem a hiszton töltését befolyásolja, hanem megváltoztatja a hisztonok egymással és a szabályozó fehérjékkel való kapcsolatát. A metiláció rendszerint erősíti a hiszton-dns kapcsolódást, s így csökkenti (meg is szüntetheti) egy DNS szegmens transzkripciós aktivitását. Bizonyos esetekben, főként az arginin metilációja (némely liziné is!) nyitottabb kromatin szerkezetet eredményez, amely így pozitív hatással van a transzkripcióra. A metilációt specifikus hiszton-metiltranszferáz (HMT) enzimek végzik. Hasonlóan az acetilációhoz, a metiláció is reverzibilis (megfordítható), a CH 3 gyökök eltávolítását a hiszton farkak lizin és arginin aminosavairól a különféle hiszton demetiláz enzimek végzik. (5b) A HP1 (heterochromatin protein 1) protein a H3 Lys9-t (a H3 hiszton alegység 9. pozíciójában lévő lizint) ismeri fel, amennyiben az metilált. A felismerést követően, a HP1 odaverbuvál egy hiszton metil transzferáz enzimet, amely a szomszéd nukleoszóma H3 Lys9-ét metilálja. Magyarul, egy önerősítő folyamat indul be, amely, gátlás hiányában, egy erősen kondenzált kromatin régiót fog kialakítani. (5c) A sejtosztódás során a metilációs mintázat az utódsejtekben is öröklődni fog. Ennek oka az, hogy az új sejtek csak a fele annyi metilált nukleoszómát fognak tartalmazni ugyan, de ezek odavonzzák a metilációt végző enzimeket (HMT-ket), s az új nukleoszómák is metiláltak lesznek a DNS ugyanazon a régiójában. Mivel a nukleoszómák kapcsolódási mintázata határozza meg a sejt típusát és annak működését, ezért ez a mechanizmus az egyik módja annak, hogy egy sejtből két, az anyasejttel megegyező típusú sejt, keletkezzen. 3 A hiszton ubikvitinációja Az ubikvitin egy 76 peptidből álló fehérje, amely a fehérjékhez hozzákapcsolódva azok degradációját idézi elő. A hisztonok ubikvitinációja azonban más célt szolgál. Az ubikvitin, hasonlóan az acetil gyökhöz csökkenti a hisztonok pozitív töltését azáltal, hogy kapcsolódásával megszűnik a lizin pozitív töltése. Továbbá, az ubikvitin maga is több negatív töltésű aminosavat tartalmaz. Az ubikvitin, ellentétben a metil és acetil csoportokkal csak a H2A 119. és a H2B 120. pozíciójában lévő lizinhez kapcsolódik. A H2B ubikvitinációja serkenti, a H2A-é viszont gátolja az érintett DNS szakasz transzkripcióját. A hiszton sumoylációja során egy kis, ubikvitinnel rokon peptid a SUMO (small ubiquitin-related modifier = kis ubikvitinnel rokon módosító) kapcsolódik a hiszton fehérjék lizin aminosavaihoz, ami a HDAC (hiszton deacetiláz) enzimeket odavonzza, s ezáltal acetil gyök vesztést okoz az adott hiszton molekulán. A hiszton foszforilációja A fehérjék foszforilációja (-PO 4 csoport hozzákapcsolása egy molekulához) a sejt legfontosabb eszköze az adott fehérje funkciójának a megváltoztatására. A foszforiláció a jelfolyamatok legtipikusabb kémiai reakciója, melyet a különféle kináz enzimek végeznek (a foszfatáz enzimek távolítják el a foszfát csoportot). A hiszton fehérjék esetében, szemben a többi kémiai módosítással, a foszforiláció nem a lizint, hanem a molekulák N-terminálisán elhelyezkedő szerin és treonin aminosavakat érinti. A H1-es hiszton is foszforilálódhat. A foszfát csoport, lévén negatív töltésű, csökkenti a hiszton nettó pozitív töltését, s így nyitottabb kromatint eredményez, tehát, serkentő hatással van a transzkipcióra. Dia 6 A DNS metilációja Nem csupán a hisztonok, hanem a DNS is metilálódhat, melynek funkciója a kompakt kromoszómaszerkezet kialakítása és a transzkripció gátlása. Ezt a kémiai reakciót a DNS metil transzferáz enzimek végzik, rendszerint a CpG dinukleotid citozin komponensén (a p azt jelzi, hogy a két nukleotid foszfodiészter kötéssel kapcsolódik egymáshoz). A DNS metiláció egyik funkciója a génexpresszió szabályozása. Az erősen metilált DNS-ek (pl. a heterokromatin régió, vagy egyes mobilis elemek) transzkripcionálisan inaktívak. A DNS metilációját két különböző mechanizmus végzi: (1) A fenntartó metiláció biztosítja, hogy a sejtosztódás során az utódsejtek DNS-ének metilációja ugyanaz maradjon, mint az anyasejtben. A Dnmt1 (DNS metiláz 1) metiláz a régi szál citozinján lévő metil csoportot ismeri fel, s egy másik metil csoportot rak a szemben lévő új szál citozinjára. Tehát, a Dnmt1 metiláz feladata a DNS metilációs mintázatának fenntartása a sejtosztódás során, melynek eredményeként egy sejt ugyanolyan típusú két sejtet produkál (pl. egy hámsejtből két

4 hámsejt lesz). (2) A de novo metiláció a DNS-hez való új metil csoportok kapcsolódását eredményezi; fő enzimjei a Dnmt-3a és Dnmt-3b metil-transzferázok. A DNS metiláció szintén a DNS transzkripcióját befolyásolja (negatívan). A MeCP2 fehérje felelős az erősen metilált DNS szakaszok (heterokromatin) kialakulásáért. Ez a fehérje metilált citozinokhoz kapcsolódik, s összetett protein komplexeket verbuvál maga körül. E fehérje komplex egyik komponense egy hiszton deacetiláz (HDAC), amely eltávolítja az acetil gyököket a hisztonokról, s így tömörebbé válik a kromatin. A MeCP2 fehérje mutációja emberben az ún. Rett szindrómát okozza, melynek fő tünete a szellemi visszamaradottság. A metilációs mintázat reverzibilis, bizonyos körülmények között a metil csoportokat a demetilációs enzimek eltávolíthatják. 4 Dia 7 Humán Epigenom Projekt (HEP) Több laboratórium összefogásával induló program, melynek célkitűzése a DNS metilációs mintázatának feltérképezése. Azért csak a DNS-é, mert ezt jóval könnyebb vizsgálni, mint a hisztonok metilációját. A közelmúltban (2009 október) közölték az első teljes eredményt: az emberi őssejtek és fibroblaszt sejtek epigenomját. Dia 8 Kromatin átalakító aktiváló fehérjék is képesek a kromatin módosítására a hisztonok közvetlen eltávolítása révén. Például az ún. hősokk gének esetében a hősokk faktor (HSF) kötőhelyét (HSE) hiszton fedi. Az ún. GAGA faktor bekapcsolódván a DNS megfelelő helyére (GAGA) elmozdítja a HSE-n lévő hisztont (megszünteti a nukleoszómát) és így a HSF kapcsolódhat. A hősokk gének a sejtet érő különféle stressz (pl. hő) hatására aktiválódnak. Mint látható, e gének szabályozó szekvenciája még a stressz folyamat előtt szabaddá válik bizonyos gyakorisággal. Más hősokk gének szabályozó régiója eleve nukleoszóma-mentes, így a hő által aktivált HSF akadály nélkül tud kötődni a megfelelő DNS szekvenciához. 2. Szöveti differenciálódás Dia 9 Sejttípus meghatározottság Az egyedfejlődés során vagy az őssejtekből való szöveti regeneráció eredményeként differenciált sejtek keletkeznek, melyek magukkal megegyező sejteket produkálnak az osztódás folyamán. Ennek mechanizmusát a hiszton módosulások és a DNS metilációs mintázatának fenntartása biztosítja. Tehát, annak ellenére, hogy minden sejttípus ugyanazt a genetikai információt hordozza, egy hámsejt mindig hámsejteket fog produkálni, s sohasem idegsejteket, vagy májsejteket. A differenciálódás során a nemdifferenciált sejtek különböző, egymást követő utasításokat kapnak, jelek formájában, hogy milyen irányba változzanak. Az idegsejtek kialakulásának első utasítása az őssejteknek szól, s valahogy így hangzik: légy olyan sejt, amiből később majd valamilyen idegsejt vagy glia sejt keletkezik. A következő utasítás arra vonatkozik, hogy ne agyi, hanem gerincvelő sejt legyen az adott sejt. Majd a glia sejtté válás lehetősége szűnik meg. Ezt követően axonok képzésére, majd idegi kapcsolatok kialakítására kap utasítás a sejt, végül, kész a gerincvelői motor neuron. Látható, hogy a sejt potenciája arra, hogy különféle irányokba változzon, egyre csökken a sejtdifferenciálódás során. Dia 10 Klónozás Mivel a sejtek differenciálódása epigenetikus folyamat (nincs DNS szekvenciabeli változás), a testi sejtek elvileg újraprogramozhatóak, s belőlük a zigótához hasonló totipotens (bármilyen sejtté differenciálódható) sejtek állíthatóak elő. Egy testi sejt (pl. hámsejt) magját egy sejtmagjától megfosztott petesejtbe téve, a sejtmag elfelejti, hogy hámsejt volt, totipotenssé válik, s az így előállított klónozott zigótából akár egy újszülött is kialakulhat. Jelenleg nagy az érdeklődés olyan lehetőség iránt, hogy epigenetikai módosítások által információkat vigyünk be az utódokba. Dia 11 A Hiszton Kód Hipotézis szerint a hiszton DNS-hez való kötődésének mintázata meghatározza a sejtben folyó molekuláris folyamatokat, ugyanúgy, mint a genetikai kódban az egyes tripletek aminosavakat (vagy stop kodont) határoznak meg, vagy a Morze ABC-ben a rövid és hosszú jelek a betűket. Dia 12 Epigenetikai kód nem csak a hiszton metilációját, hanem a kromatin összes epigenetikai állapotát (a hiszton egyéb módosulásait és a DNS metilációját) rendeli hozzá a sejt molekuláris folyamataihoz.

5 Dia 13 Epigenetikai program Az egyedfejlődés során a sejtek differenciálódása egy előre meghatározott terv szerint megy végbe. E terv lényege az az algoritmus, amely a kromatin epigenetikai módosulásainak programozott időbeli változását okozza. Epigenetikai program pusztán a genetikai információ megnyilvánulásának mechanizmusa, legalábbis egyes vélemények szerint. Mások szerint, az epigenetikai és a genetikai program párhuzamosan futnak, tehát az epigenetikai folyamatok legalábbis részben, függetlenek a genetikai programtól. A kérdés az, hogy mi lehet a környezet szerepe a genetikai program megvalósulásának? Dia 14 Kanalizáció A tudomány nagy rejtélye jelenleg az, hogy hogyan határozza meg a DNS által kódolt genetikai információ az egyedfejlődést irányító epigenetikai programot, s hogy hogyan hat a környezet erre a folyamatra. Conrad Hall Waddinton vezette be az egyedfejlődés folyamatának magyarázatára a kanalizáció fogalmát. Szerinte az egyedfejlődés meghatározott útvonalakon zajlik, s egy útvonalon belül ellenáll a zavaroknak (mutáció, környezeti perturbáció), de kritikus időpontokban, erősebb hatásokra (ami lehet genetikailag programozott is) más úton indulhat el egy folyamat. Ma robusztusságnak nevezzük a perturbációkkal (zavarokkal) szembeni ellenállást. A férfi és női útvonal is egy-egy pálya lehet, s a nőiről a férfi útvonalra való áttérést a TDF (testis determining factor) végzi 5 Dia 15 A DNS és a környezet is hat az epigenetikai programra Az epigenetikai program megvalósulását alapvetően a DNS irányítja azáltal, hogy az epigenetikai folyamatokat közvetlenül kontrolláló faktorok megfelelő mennyiségű és megfelelő időben történő képződését szabályozza az egyes sejttípusokban más-más módon. A környezeti tényezők szintén az epigenetikai folyamatokra hatnak. A zongora azt a lehetőséget szimbolizálja, hogy a genom csak, hasonlóan a zongorához, csupán egy eszköz, melyre a az epigenetikai tényezők írják a dallamot. A férfi és a nő például, két különböző zenedarab ugyanazon a zongorán (genomon) játszva. 3. X kromoszóma inaktiváció Dia 16 Az X kromoszóma inaktiváció egy olyan folyamat, melynek során az X kromoszóma egyik példánya az emlős nőstényekben nem működik, csak néhány gén aktív az X kromoszómán (a pszeudo-autoszómális régióban). Az egyik X kromoszóma a DNS erőteljes metilációja következtében kerül inaktív állapotba. E folyamat eredményeként a nők sejtjeiben nincs kétszer annyi X kromoszóma által kódolt fehérje, mint a csak egy X kromoszómával rendelkező férfiak sejtjeiben; ez a dóziskompenzáció. A génexpresszió szintje ugyanis optimalizált, a generációnkénti dózisváltozásokat egy egyed nemigen élné túl. A magasabbrendű emlősöknél véletlenszerűen dől el, hogy melyik X kromoszóma (apai vagy anyai) inaktiválódik, de az utódsejteknél ez a döntés a későbbiek során is megmarad. Az erszényeseknél (pl. kenguru) mindig az apai X kromoszómák inaktiválódnak. Az inaktiváció folyamatát egy X kromoszómán kódolt, nagyméretű, fehérjét nem-kódoló RNS (XIST; X-inactive specific transcript) indítja be. A XIST RNS beborítja az inaktív X kromoszómát, amely így heterokromatizáción megy keresztül, így akadályozván annak aktivitását. Az aktív X kromoszómán a Xist gén szintén heterokromatinizáció révén gátlódik. Azok az X kromoszómák, amelyek nem képesek Xist gént kifejezni, nem képesek inaktiválódni sem. Érdekesség, hogy a Xist gén kifejeződésének fő szabályozója a gén komplementer száláról leíródó antiszensz RNS, melynek neve Tsix.

6 JEGYZETEIM: 6