Epigenetika. szomatikus sejt (emlőszövet sejt) magjának enukleált (magjától megfosztott) petesejtbe ültetésével hozták létre

Átírás

1 Epigenetika Dolly a klónbirka szomatikus sejt (emlőszövet sejt) magjának enukleált (magjától megfosztott) petesejtbe ültetésével hozták létre A sejtdifferenció a genomi ekvivalencia (genomi megegyezőség) megtartása mellett történik. A genom génjeinek differenciális expresszióján (eltérő kifejeződésén) alapul. A humán genom körülbelül 98%-a nem kódol fehérjét. Mi tehát a funkciója?.

2 A génkifejeződés szabályozásának szintjei Transzkripcionális szabályozás: milyen gének, mikor és hol íródjanak át RNS-sé. Szelektív RNS-érés és alternatív splicing: mely elsődleges transzkriptumok válnak mrns-é, valamint milyen mrns-ek alakulnak ki az elsődleges transzkriptumból. RNS-transzport szabályozás: mely érett mrns-ek jutnak ki a sejtmagból a citoplazmába. Transzlációs szabályozás: mely mrns-ek fordítódnak le a citoplazmában fehérjévé. mrns degradációs szabályozás: bizonyos mrns-molekulák szelektív módon lebontásra kerülhetnek. Fehérjeaktivitás szabályozása: fehérjemolekulák poszttranszlációs szabályozása (aktiváció, inaktiváció, kompartmentalizáció, degradáció).

3 Transzkripcionális szabályozás Eukariótákban a gének kifejeződése két tényezőtől függ: strukturális sajátságok: a DNS csomagoltságának mértéke transzkripcionális faktorok (transzkripciót szabályozó fehérjék) hatása

4

5

6 Az eukarióta transzkripció jellemzői a transzkripció és a transzláció egymástól elválasztva zajlik a kromatinszerkezet gátolja a transzkripciót háromféle RNS-polimeráz: pol-i, pol-ii, pol-iii van jelen a transzkripció szabályozása aktiváló jellegű: a promóter és az RNSpolimeráz önmagában nem elég a transzkripció elindításához transzkripciós egységenként egy fehérjekódoló szakasz jellemző (monocisztronos mrns), az operonok igen ritkák az mrns érési folyamatokon megy keresztül, mielőtt kijutna a sejtmagból

7 Cisz regulátor elemek: a promóter cisz módon ható szabályozó elemek: a szabályozásban részt vevő DNS-szakaszok Core (alap, minimál, mag) promóter konszenzus szekvenciái InR (iniciátor régió) a starthely körül, mindig jelen van, emellett és/vagy TATA-boksz DPE (downstream promóter elem) strathelytől nukleotid 3 irányban Önmagában nagyon gyenge, további cisz aktivátor elemek kellenek szabályozó promóter/ aktivátor szekvencia/ promóter proximális elem A magpromótertől upstream (5 irányban) kb. 500 bp-on belül. CAAT-boksz GC-boksz (GGGCGG szekvencia, sokszor több kópiában).

8 Távolból ható cisz regulátor elemek Enhancerek A transzkripció mértékét fokozzák A hozzá kötődő aktivátor fehérjék a DNS kihurkolódása révén kerülnek kapcsolatba az alap transzkripciós apparátussal, vagy a szabályzó promóterhez kötődő fehérjékkel. Környezetük minden promóterére képesek hatni, hatásukat azonban inzulátor szakaszok (határoló DNS-elemek) korlátozzák. Silencerek Gátolják a transzkripciót a rajtuk keresztül ható szabályozó fehérjék révén. A közösen szabályozott gének közös cisz szabályozó elemekkel rendelkeznek (válasz elemek, response elements, RE). hősokk válasz elem HRE ösztrogén válasz elem ERE glükokortikoid válasz elem GRE fém válasz elem MRE.

9 Enhancerek, silencerek

10 Enhancerek működése

11 Transz regulátor elemek: transzkripciós faktorok, silencerek A TF-ek száma emberben körülbelül kb. 10 génre jut egy TF. A transzkripció hatásfokát a génen ható összes TF együttes hatása szabja meg. A TF-ek kapcsolatba lépnek egymással (homo- vagy heterodimer TF-ek) és az RNSpolimerázzal. Az alábbi domének kombinációit hordozhatják DNS-kötő domén fehérjekötő domén (kapcsolat más TF-ekkel, vagy RNS-polimerázzal) a kromatinszerkezetet befolyásoló domén fiziológiai hatásokat érzékelő domén (pl. hormonkötő domén) Eukariótákban kifejezett represszorok nincsenek gátolják az aktivátor fehérjék hatását versenyeznek az aktivátor fehérjékkel a kötődésben destabilizálják a transzkripciós komplexet

12 Háztartási (housekeeping) gén Termékére minden sejtben szükség van, folyamatosan átíródnak Azonos promóter proximális elemekkel rendelkeznek, aktivátor fehérjéik minden sejttípusban jelen vannak. Más gének termékére viszont csak bizonyos sejtféleségekben, vagy a sejt életének meghatározott szakaszában, vagy a sejtet érő különféle hatások (hormon, stressz stb.) esetében van szükség. Egyedi szabályozó cisz elemekkel rendelkeznek.

13 Sejtmemória Morfogének: a génszabályozási kaszkád csúcsán álló TF-ek. Megteremtik a differenciálódás alapját. A petesejt citoplazmájában megoszlásuk gradiens szerű, ezért A morfogének koncentrációja már a néhány sejtes embrióban különböző lesz az egyes sejtekben. A sejtek egyedi, egymástól eltérő transzkripciós faktor populációval fognak rendelkezni. A TF-ek poszttranszkripciós/poszttranszlációs szabályozása alternatív splicing vezethet aktív vagy inaktív TF formákhoz foszforiláció defoszforiláció általi aktivitás-szabályozás

14 MUTÁCIÓK csoportosítása

15 Epigenetika A genomot érintő olyan jelenségekkel foglalkozik, melyek nem a DNS nukleotidsorrendjét érintik, de mitotikusan (vagy akár meiotikusan) átörökíthetőek (epi= felett, kívül ). A kromatin szerkezetét meghatározó hisztonmódosulások DNS-metilációs mintázatok

16 Kromatin szerkezet Kromatin: DNS + bázikus hiszton és nem-hiszton fehérjék A tömörülés mértéke változik A sejtciklus során: interfázisban laza, mitózis és meiózis során tömör DNS-régiónként: a heterokromatin régiók, az eukromatinnal szemben, az interfázisban is erősen kondenzált részek Az eukarióták DNS ének kromatinszerkezetbe szerveződése a gének működésére (a transzkripcióra) negatív hatással van. Az alapértelmezett állapot ezért a kikapcsolt állapot. Szükség van a kromatin szerkezet meghatározott területeken történő fellazítására.

17 A kromatinszerkezetet befolyásoló epigenetikai módosulások 1. hisztonváltozatok beépülése a nukleoszómákba 2. hisztonok kovalens módosítása Acetiláció Metiláció Foszforiláció 3. nukleoszómák átépítése 4. DNS metilációja

18 Hisztonvariánsok A nukleoszómák szerkezete a DNS-replikáció során alakul ki A nukleoszómák magját kialakító hisztonfehérjékből álló oktamer kanonikus tagjai: 2-2 darab H2A, H2B, H3, H4. Az alap hiszton fehérjék kicserélődhetnek hiszton változatokra. Hisztonok kovalens módosítása acetiláció és metiláció lizin amino-csoportján foszforiláció szerin hidroxil-csoportján hiszton-kód A hisztonacetiláció elősegíti a transzkripciót 1) lazítja a hiszton DNS kapcsolatot 2) befolyásolja a szabályozó fehérjék kötődését. A hiszton-acetiltranszferázok (HAT) fokozzák, a hiszton-deacetilázok (HDAT) pedig mérséklik a transzkripciót.

19 Nukleoszóma-átépítés (remodeling) Az átépítés pontos mechanizmusa nem ismert DNS irányított elcsúsztatása a hiszton-oktamer körül? Adott nukleoszóma hisztonjainak eltávolítása? Mindkét modell szerint a nukleoszómába csomagolt target DNSszakasz hozzáférhetősége nő. A remodeling fehérjéket öt családba sorolják. Legismertebb az SWI/SNF komplex humán ortológjai tumor-szupresszor gének, hibájuk a sejtosztódás kontrolljának felborulásához vezet

20 DNS-metiláció Valószínűsíthetően gátolja a transzkripciót. A citozinmetiláció (5-metil-citozin) az egymás melletti CG nukleotidoknál történik DNS-metiltranszferáz (DNMT) által. Mivel az 5-metil-citozinok mutációs forrópontként viselkednek (dezaminációval timin keletkezik), CG szekvenciarészek az evolúció során kikoptak a genomokból, kivéve a gének szabályozó régióit - CpG-szigetek.

21 Táplálkozás epigenetika

22 Táplálkozás epigenetika

23 Mitózis: A DNS-metiláció Ha a szülői DNS-szál metilált egy CG helyen, akkor az újonnan szintetizált DNSszál citozinja is metilálódik az adott nukleotid párnál Meiózis: Az ivarsejtek kialakulásakor a genomon végigfut egy demetilációs hullám Az embrionális fejlődés során kialakul a de novo metilációs mintázat a sejtekben, a mitózisok során ún. fenntartó metilációval többnyire stabilan fennmarad A DNS-metiláció szerepet játszik a szülői imprintingben, az emlősök X-kromoszóma inaktivációjában, a centromer körüli kromatinrégiók kondenzált szerkezetének kialakításában. mozgó genetikai elemek (helyüket változtatni képes DNS-szakaszok) mozgásának visszaszorításában, a genomi átrendeződések megakadályozásában. Szabálytalan metilációs mintázat rákos sejtekben is gyakori Pl.1 tumorszupresszor gének promóterének de novo hipermetilációja a gén csendesítéséhez vezet (funkcióvesztéses mutáció). Pl.2 A centromer régió DNS-ének hipometilációja, szerkezetének megbomlása, a genom instabilitásához vezet.

24 MUTÁCIÓK

25 Szülői imprinting Adott gén aktivitása függ annak leszármazásától Anyai imprinting (maternally imprinted): csak az apai eredetű gén fejeződik ki egérben pl Igf2 Apai imprinting Pl. H19 gén Az imprintinget szenvedő génekre nézve az egyed hemizigótaként viselkedik. Bizonyos citozinbázisaikon metilcsoportok vannak, és egyébként a gén szekvenciája nem változott. Az imprintinget szenvedő gének száma az emberi genomban száz körüli. Néhány humán genetikai betegség hátterében is imprintinget szenvedő gének vannak.

26 Szülői imprinting Angelman-szindróma apai imprintinget mutat leírója Harry Angelman után, : gyakoriság boldog babák (jellemző tünet a nevetés, szaggatott járás). a 15. kromoszóma kb. 4 Mbp-os szakaszának deléciója az anyai allélon az ubikvitin-útvonalban részt vevő, UBE3A gén érintett

27 Szülői imprinting Prader Willi-szindróma anyai imprintinget mutat a betegek alacsonyak, enyhén szellemi fogyatékosak, izomtónusuk gyenge és kényszeres evők a 15. kromoszómán elhelyezkedő SNRPN gén funkcióvesztésének eredménye az apai génpéldányban. terméke az mrns-splicingban vesz részt

28 X kromoszóma inaktiváció Emlősöknél az X kromoszóma dóziskompenzációja A rajta lévő gének kifejeződése kiegyenlítődik a hímekével. A pszeudoautoszómális régió (az Y kromoszómával homológ szakasz) génjei mindkét X kromoszómán aktívak maradnak (az inaktív blokkban is vannak aktív gének). A fejlődés egy korai szakaszánban történik, és ezt az állapotát minden utódsejtbe továbbörökíti. A klonális természetű öröklődés miatt nagy, folyamatos szöveti szektorokban ugyanaz az X kromoszóma inaktív. Az inaktiváció nem mindig random. Az erszényeseknél mindig az apai X inaktiválódik. Bizonyos sejttípusokban nem véletlenszerű az inaktiváció: az extraembrionális sejtekben (amnion, korion, placenta) az apai X inaktiválódik, és csak a kb. 64 sejtes, szűk értelemben vett embrióban random az inaktiváció. Ovogenezis alatt reaktiválódik. Az inaktív kromoszóma jóval metiláltabb. Továbbá az inaktív X hisztonjai kevésbé acetiláltak. Egy speciális, fehérjét nem kódoló RNS (Xist) az inaktív X-en szintetizálódik, beburkolja az inaktív X-et.

29 Pozíciófüggő variegáció Drosophila mutáns, összetett szemében fehér és piros szektorok váltakoznak. Az X kromoszóma végi régió transzlokációval átkerült a centromer közelébe. Bizonyos sejtekben a centromert alkotó heterokromatin szerkezet kiterjed a szomszédos régiókra, így a white gént tartalmazó transzlokálódott szakaszra. A gén kifejeződése tehát nem mutáció hatására, hanem a kromoszómán elfoglalt pozíciójával változik meg.

30 Poszttranszkripcionális szabályozás mrns-érés 5' végére cap, 3' végére polia farok kerül Exonok kivágódása A differenciális (eltérő helyen történő) polia farok hozzáadás különféle mrns-eket eredményezhet. A splicing alternatív útjai szintén befolyásolják a géntermék funkcióját. A muslica ivarfejlődését alternatív splicing kaszkád határozza meg.

31 Poszttranszkripcionális szabályozás Egy transzkripciós faktor dimert alkot az X kromoszómán kódolt és egy autoszómán kódolt alegységekből véletlenszerűen. Csak az XX dimer aktív transzkripciós faktor (az XA és az AA inaktív), mely az Sxl (sex lethal) gén promóterét bekapcsolja. Ez akkor következik be, ha a muslicaembrió sejtjeiben két X kromoszóma van jelen. A Sxl fehérje egy másik gén, a tra (transformer) pre-mrns-ének splice faktora. Az Sxl fehérje hatására a tra gén termékéről aktív. A Tra fehérje maga is splice faktor, egy harmadik, a dsx (doublesex) gén termékének splicingját szabályozza. A Tra egy további gén (tra-2) termékével nőstényspecifikus Dsx fehérjét, Tra hiánya hím specifikus Dsx fehérje keletkezését eredményezi.

32 mrns degradáció A polia farkak nélkül az mrns-ek gyorsan degradálódnak. A polia farokhoz kapcsolódó PABP (polia binding protein) a cap-hez horgonyozza a polia farkat, és ezzel védi az mrns 5 végét. Az mrns-ek 3 UTR-ének szekvenciája befolyásolhatja annak féléletidejét.

33 kis RNS-ek Új! (Andrew Fire és Craig Mello : Nobel-díj) C. elegans géncsendesítés (gene silencing) az embrióba injektált dupla szálú RNS-sel (dsrns) in vitro szintetizálták A vad típusú féregembriók a mutánsokkal megegyező fenotípust mutatták Egy gén szekvenciájának megfelelő dupla szálú RNS az adott gén kifejeződését meggátolja. Jelenlegi tudásunk szerint ezek a szabályozó kis RNS-ek a gének kifejeződését az alábbi pontokon befolyásolhatják: transzláció gátlása mrns-ek degradációja transzkripció befolyásolása A humán gének 60%-a áll mirns-ek szabályozása alatt. A mirns-ek szerepe a daganatképződésben is nyilvánvalónak tűnik. Számos dagantféleségben megváltozott mirns-populációt írtak le.

34 kis RNS-ek Érett formájuk kb nukleotidból áll, dupla szálú transzkripciójában az RNS-polimeráz II vesz részt Először egy primer-mikro-rns (pri-mirns) keletkezik. A kettős szálú RNS-re specifikus endoribonukleáz, a Drosha nevű enzimkomplex hasítja a pri-mirns formát, létrehozva a prekurzor pre-mirns-t. Ez a forma jut ki a sejtmagból (az Exportin-5 által). Végső átalakítását a Dicer ribonukleáz végzi: eltávolításra kerül a terminális hurok, és az egyik szál lebontásra kerül, így kialakul az egyszálú érett mirns. A citoplazmában beépül a RISC (RNS indukálta silencing komplex) nevű komplexbe, létrehozva a mirisc ribonukleoprotein komplexet. Kötődése a cél-mrns-ekhez a RISC-kel kapcsoltan történik meg. Ha a mirns teljesen komplementer a cél-mrns egy szakaszával, akkor a cél-rns a RISC által lebontásra kerül A sirns-ek többnyire egyetlen mrns-re specifikusak, és tökéletesen komplementerek a célszekvenciával. A target mrns enzimatikus degradációját (slicer aktivitás) idézik elő. (RNSinterferencia jelensége). Ha csak részben komplementer, akkor a cél-mrns transzlációját gátolja. (Állati sejtekben gyakoribb).

35 A mirns működése

36 Transzlációs és poszttranszlációs szabályozás Az fehérje-termelés beindulása nem mindig igényel mrns szintézisfokozódást. Pl. A limfociták antitest-termelése antigén megjelenésének hatására. Pl. Az inzulin okozta fehérjeszintézis-fokozódás A folyamatot a transzláció-iniciációs faktorok hozzáférhetősége/ aktiválódása (pl. foszforilációval) szabályozza. Az eif2a iniciációs faktor számos stresszhatás (például oxidatív stressz, hipoxia, UPR unfolded protein response, éhezés) folyományaként foszforilálódik, ami a sejtben a transzláció globális leállításához vezet. A fehérjék aktivitása transzlációjuk után többféle módon szabályozódhat. acetiláció és foszforiláció polipeptidek közötti kölcsönhatások

37 Genetika és környezet Döntően a gének szabják meg azt, hogyan nézzen ki egy adott élőlény. Ez a genetikai determináltság. A környezethez való alkalmazkodás egy eleme, hogy a környezet befolyásolja a gének működését. Elméletileg két azonos genotípusú egyed fejlődhet különbözőképpen eltérő környezetben, illetve két eltérő genotípus fejlődhet azonos módon is a környezettől függően. A valóságban az egyedek általában sem génjeikben, sem környezetükben nem egyeznek teljes mértékben. A fenotípus kialakulásában némi szerep még a véletlennek is jut, ezt fejlődési zajnak nevezzük. Környezet és fenotípus viszonya számszerűsíthető, ennek grafikus ábrázolása a reakciónorma.

38 Genetika és környezet Genetikailag azonos egyedek különböző környezetben különbözővé fejlődnek. Talaj ph és virágszín Flamingók tollazaszíne és a táplálkozás Napon és árnyékban nőtt tölgylevelek

39 Genetika és környezet Rovarszín változik társaság hatására Hőmérséklet. Tirozináz enzim (melaninszintézis) testhőmérsékleten inaktív (fehér szőr) alacsonyabb hőmérsékleten működik (sötét szőr)

40 Reakciónorma A muslica összetett szemét alkotó facetták száma A vad típusú legyekben a tartási hőmérséklet függvényében (15-30 C) között változik. infrabar résszemű genotípus esetén a facettaszám között, az ultrabar résszemű genotípusnál között változik a hőmérséklet függvényében Fejlődési zaj: a vad Drosophila két szemében is lehet kisebb eltérés a facetták számában, holott azonos a genotípus és azonos a környezet.

41 Reakciónorma A közönséges cickafark (Achillea millefolium) dugványozással szaporított (genotípusuk azonos) növények háromféle környezetben (három különböző tengerszint feletti magasságban). A növények magasságát vizsgálták mint fenotípust.

42 Genetikai betegségek Egygénes: Duchenne féle muszkuláris disztrófia, fenilketonúria, cisztás fibrózis Multifaktoriális: többgénes + környezeti hatások Anyagcsere, keringési, mentális betegségek Változó expresszivitás és penetrancia Változó penetrancia Változó expresszivitás Változó penetrancia és expresszivitás

43 Változó penetrancia

44 Változó expresszivitás Pl Waardenburg szindróma, ősz hajtincs, nagyothallás, eltérő szemszín

45 Genetikai betegségek

46 Genetikai betegségek

47 Környezet és egészség Táplálkozás Vízminőség Fizikai aktivitás Levegőminőség Dohányzás Alkoholfogyasztás munkakörnyezet