Ellenanyag reagensek II.

Átírás

1 Ellenanyag reagensek II március 1. Prechl József poliklonális monoklonális savó v. aszcitesz lép v. nyirokcsomó +

2 Egér hibridóma technika hátrányai kísérletes munkában, diagnosztikában Antigén toxikus vagy lebomlik a szervezetben, nem immunogén nem lehet megfelelő moab-t előállítani A monoklonális ellenanyag esetenként nem fragmentálható, kicsi az affinitása, keresztreakciót mutat nem megfelelő gyorsaságú/áteresztőképességű/specificitású a hibridóma technika Egér monoklonális ellenanyagok hátrányai emberi terápiában HAMA (human anti-mouse antibodies) ellenanyagok jelennek meg a beadott egér ellenanyagok ellen > neutralizácó, allergia Más/jobb effektor funkciókra lenne szükség az egér moab nem vált ki megfelelő ADCC-t /komplement aktivációt

3 Rekombináns ellenanyagok Molekuláris genetikai módszerekkel létrehozott fehérjék Aminosavszintű manipuláció lehetséges Heterológ fehérjeexpresszió Orvosi célokra is alkalmas fehérjetermelés gének VDJ/VJ CH/CL Rekombináns ellenanyagok előállítása

4 Antigén kötődése CDR hurkok C1, MBL FcR kötődés Az antigéndeterminánsokkal kapcsolódó könnyű és nehézlánc szakaszok Mindkét lánc, de főként a nehézlánc CDR3 régiójának kitüntetett szerepe a variablitiás fokozásában

5 Mire van szükségünk egy adott specificitású rekombináns emberi ellenanyag előállításához? Variábilis régió gén: VH, VL - szekvencia ismeretlen Konstans régió gén: CH, CL - az emberi Ig konstans szekvenciák ismertek Megoldások emberi ellenanyagok előállítására Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)

6 Egér hibridóma alapján Emberi hibridóma fág könyvtárak TG egerek 1 2A 2B 2C Egér kiméra humanizált teljesen emberi Géntechnológia V régió klónozás CDR grafting Eukarióta expresszió fehérjetermelés gének Természetes génkészlet: emberi emberi/egér testi sejtek B-sejtek Csíravonal szekvencia (nincs VH/VL átrendeződés) Transzgenikus állatok 2B egér 2A 1 hibridóma VDJ/VJ Mesterséges génkészlet: ellenanyag [fág] könyvtárak 2C Emberi ellenanyagok előállítása

7 Megoldások emberi ellenanyagok előállítására Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C) A monoklonális ellenanyag előállítás menete Rekombináns ellenanyagok előállítása Naív repertoár antigén Immun repertoár lépsejtek mielómasejtek ellenanyag szelekció klónozás klónok felnövesztése Szelekció termelés VL,VH klónozása + CH, CL, stb hozzáadása Termelés megfelelő expressziós rendszerben

8 RT-PCR módszer az Ig variábilis régió gének izolálásához mrna kappa gamma L V J C L V DJ C RT mrnacdna PCR dsdna Megoldások emberi ellenanyagok előállítására Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)

9 Humán monoklonális Ea előállítása Hibridóma technológiával: immortalizált, emberi Ig-t termelő B-sejthez kell jutnunk, amely az adott antigént nagy affinitással felismerő ellenanyagot termel : In vivo immunizálás In vitro immunizálás (gyenge hatékonyság) In vivo immunizálás Ritkán: oltás az antigénnel Gyakrabban: Például tumort ellátó nyirokcsomókból izolálni sejteket Vagy vírussal fertőzött egyén véréből izolálni limfocitákat

10 További gondok Immortalizáció: Nehéz stabil emberi hibridómát előállítani - CpG oligonukleotidok + EBV (Epstein-Barr vírus) felhasználásával kivitelezhető In vitro nehéz izotípus váltást és affinitásérést kiváltani Megoldások emberi ellenanyagok előállítására Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)

11 Fágkönyvtárak szűrése scfv g3p Ismételt panning Fehérje + gén Kötődött klónok felszaporítása Jó klónok (Kd < 10-7 M) A fág szelekció és az immunválasz összehasonlítása ScFv fág könyvtár B-sejt repertoire Diverzitás eredete Szintetikus / szemiszintetikus Genetikai rekombinációs Információhordozó DNS DNS Ag-kötő molekula ScFv-fág Membrán Ig Ea termelés E. coli B-sejt Szelekció Panning in vitro Klonális szelekció Affinitás érés Mutátor E. coli törzsek Szomatikus tervezett módosítás hipermutáció

12 Megoldások emberi ellenanyagok előállítására Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C) Emberi Ig locus be ki Egér Ig locus

13 Emberi ellenanyagkönyvtár fágokon Emberi ellenanyagot termelő egerek Ismételt szelekciós ciklusok antigén B-sejtek izolálása szűrés Fúziós partner hibridóma szűrés Klónozás, transzfektálás fehérjetermelés gének Természetes génkészlet: emberi emberi/egér Testi sejtek B-sejtek Csíravonal szekvencia (nincs VH/VL átrendeződés) Transzgenikus állatok 2B egér 2A 1 hibridóma VDJ/VJ Mesterséges génkészlet: ellenanyag [fág] könyvtárak + CH, CL 2C Emberi ellenanyagok előállítása

14 Konstans domének beépítése Cél szerint választható izotípus itt tudjuk meghatározni milyen effektor funkciókat szeretnénk adni ellenanyagunknak Emberi Ig izotípusok/receptoraik IgG FcγR IgA FcαR IgM FcμR IgE FcεR Poly-IgR IgM, IgA

15 Az ellenanyagok általános funkciói Konstans domének beépítése felhasználás szerint választható izotípus IgG1 : ADCC, CDC IgG4 : neutralizálás

16 Rekombináns ellenanyag formátumok Teljes ellenanyag F(ab )2 Fab Fc scfv sd Ab nem kell emészteni! Az egyláncú antitestek(scfv) felépítése IgG Csak molekuláris genetikai úton hozható létre scfv VLVH CLCH1 CH2 CH3 IgG scfv Molekulasúly kb 150 kd kb 30 kd FcR kötõdés + - C1q kötés + - Szénhidrát csoport + - Diszulfid híd láncon belüli, láncok közti csak láncon belüli Ag kötõhelyek 2 1

17 Single-domain ellenanyagok Expressziós rendszerek in vitro transzláció Escherichia coli : scfv, Fab Pichia pastoris : scfv, Fab Rovarsejtek: scfv, Fab Emlőssejtek (COS, CHO, BHK, Sp2) : Ig transzgenikus növények : siga transzgenikus állatok(kecske) : tejbe kiválasztódó Ig

18 Rekombináns gének bejuttatása a termelő sejtekbe Sejtkultúra esetén -E.coli -Pichia pastoris -Rovarsejtek -Emlőssejtek -Növényi sejtek Transzgenikus állatok esetén: -ivarsejtek -megtermékenyített petesejt -embrionális őssejt -embrió fehérjetermelés gének Természetes génkészlet: Testi sejtek Csíravonal szekvencia (nincs VH/VL átrendeződés) Transzgenikus állatok Tehén, nyúl egér B-sejtek hibridóma Mesterséges génkészlet: ellenanyag [fág] könyvtárak) VDJ/VJ + CH, CL Transzgenikus élőlények (növények, állatok) Sejttenyészetek (E.coli, Pichia, rovarsejt, emlőss.), in vitro transzláció Poliklonális ellenanyag Monoklonális ellenanyag Emberi ellenanyagok előállítása

19 Összefoglalás Rekombináns technológiával előállíthatók - emberi ellenanyagok - ellenanyag fragmentumok - aminosav szintű tervezhető módosítások - fúziós fehérjék - transzgenikus, tervezett ellenanyagokat előállító élőlények