Növekedést serkentő oligoszacharidok előállítása a paradicsomfeldolgozás hulladékából

Átírás

1 A KÖRNYEZETVÉDELEMBEN ÉS VÍZGAZDÁLKODÁSBAN ALKALMAZOTT BIOTECHNOLÓGIÁK Növekedést serkentő oligoszacharidok előállítása a paradicsomfeldolgozás hulladékából Tárgyszavak: élelmiszeripari hulladék; növekedésgyorsító; oligoszacharid; oligogalakturonsav; paradicsom. A paradicsomitalról köztudott, hogy magas likopin- és karotinoidtartalma következtében jótékony hatással van az egészségre, és csökkenti egyes betegségek, pl. a rák kialakulásának kockázatát. Japánban évente több mint 80 E t paradicsomitalt állít elő az élelmiszeripar. A paradicsom és más zöldséglevek termelése évről évre nő, ennek következtében a hulladék mennyisége is egyre nagyobb. A paradicsomital előállítása során a paradicsomot először összezúzzák, majd 70 C-ra melegítik és szűrik. A szűréskor nagy mennyiségű, főleg héjat és magot tartalmazó hulladék keletkezik. Japánban több ezer tonnára becsülik ennek mennyiségét. Jelenleg a hulladékkezelést kizárólag az igen költséges lerakás jelenti. Érthető tehát, ha a szakembereket foglalkoztatja e nagy menynyiségű hulladék hasznosításának kérdése. Az eddigi próbálkozások közé sorolható a csirketápként való hasznosítása, és a gyártási hulladék értékes anyagainak kinyerése. Az élelmiszeriparban színezékként alkalmazzák a likopint és karotinoidot, amelyet a hulladék szerves extrakciójával állítottak elő. Újabban szuperkritikus extrakcióval sikerült javítani a hozamát. A paradicsommagból kinyert olaj fizikai és kémiai jellemzői teljesen megegyeznek a hagyományos olajok tulajdonságaival. Mindezek ellenére egyik hasznosítási mód sem terjedt el Japánban, aminek több oka van: a hulladék keletkezése szezonális; nagy nedvességtartalmú, tartósítása nehezen oldható meg; alacsony tápértékű anyagokat tartalmaz (héj, mag) a likopin és karotinoid iránti kereslet csekély. Időközben a különböző oligoszacharidokról bebizonyosodott, hogy bizonyos növények növekedését serkentik. Mivel a paradicsomital-gyártás során keletkező hulladékban megtalálhatók ezek a vegyületek, felmerült az ilyen irányú hasznosítás lehetősége.

2 Módszerek Extrakció A paradicsomhulladékot (20 g nedves hulladék) 100 ml 70 C-os vízzel 4 órán át kezelték, majd szűrték és a szűrlet ph-ját 1 N NaOH-oldattal 7,0-re állították be. A mintát ezután vákuumban 40 C-on 20 ml-re párolták be, és azonos mennyiségű etil-acetáttal (EtOAc) háromszor kirázták. Az EtOAc frakció növekedést gátló hatást mutatott. A vizes frakciót vákuumban szárazra párolták, és ily módon egy szürke port kaptak. Ezt a frakciót vizes extraktumnak nevezték (WE). 20 g nedves hulladékot 100 ml 70 C-os 0,5 N HCl-lel 2, 4, 6 és 8 órán át áztatták, majd az előzőekkel azonos módon kezelték. Ezeket a frakciókat savas extraktumnak (AE) nevezték, és 2, 4, 6 ill. 8-cal jelölték. Szervetlenanyag-tartalom meghatározása A legnagyobb biológiai aktivitást mutató 4 órás savas extraktumot (4AE) izzítókemencében 525 C-on elhamvasztották és vízzel felvették. Az oldat szervetlenanyag-tartalmát induktív plazma atomemissziós spektroszkópos módszerrel határozták meg. A 4AE frakció tisztítása A paradicsomital előállítása során keletkező víztartalmú hulladék 500 g-ját 70 C-on 2,5 l 0,5 N HCl-lel 4 órán át áztatták, majd leszűrték. A szűrlet ph-ját 1 N NaOH-oldattal 7,0-ra állították be. A mintát vákuumban 40 C-on besűrítették, a sűrítményt azonos mennyiségű etil-acetáttal (EtOAc) háromszor kirázták. A vizes fázist összegyűjtötték és vákuumban szárazra párolás után kb. 300 g szürke port kaptak. A porból 100 g-ot 100 ml vízben feloldottak és anioncserélő oszlopon kromatografálták. Ezt a műveletet háromszor megismételték. A növekedést serkentő hatást Celosia argentea L. (kakastaréj) növényen vizsgálták, mivel ennek a növénynek a hajtása igen érzékeny a növekedést serkentő anyagokra. A 0,1% trifluor-ecetsavas (TFA) frakciókat összegyűjtötték és vákuumban 300 ml-re bekoncentrálták. A sűrítményhez ötszörös mennyiségű metanolt adtak és 10 percig 3000 ford/min sebességel centrifugálták. A csapadékot 100 ml vízben feloldották és ultraszűréssel négy frakcióra bontották: M r 10 5 feletti, , és 10 3 alatti frakció. Az M r frakciónak volt biológiai aktivitása. Ezt a frakciót liofilizálták, majd a liofilizált minta 25 mg-ját 25 ml vízben feloldották, és gélkromatográfiás módszerrel tisztították. A 60 és 120 min retenciós idejű frakciónak volt biológiai aktivitása, amelyet (16 mg fehér por) a további elemzéshez liofilizáltak.

3 HPAEC-PAD A gélkromatográfiával előállított biológiailag aktív frakciót ezután HPAEC- PAD nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel vizsgáltak. A detektálást pulzáló amperometriás detektorral (PAD) végezték arany elektród segítségével. Az áramlási sebesség 0,8 ml/min, 0 10 perc között alkalmazott lineáris gradiens víz 80% 0,5 M oxalát puffer, ph 6,0 volt, a perc közötti lineáris gradiens 80% 100% volt. A szénhidrátok kimutatásának elősegítése érdekében az eluátumhoz 0,5 ml/min sebességgel 500 mmólos NaOH-oldatot adagoltak. A HPAEC-PAD eluátum cukortartalmának meghatározása A HPAEC-PAD módszerrel tisztított eluátumot négy frakcióra bontották NaOH hozzáadása nélkül. A szénhidrát- és uronsavtartalmat kétféle módszerrel, fenol-h 2 SO 4 és m-hidroxi-bifenil módszerrel is meghatározták. Az eredményt a következő képlettel számították ki: Cukortartalom (mg/ml) = 92,2 x (A 490 0,464 x A 520 ) Uronsavtartalom (mg/ml) = 112,4 x (A 520 0,0272 x A 490 ) Az A 490 abszorpciós sáv a fenol-kénsavas módszer 490 nm-es sávjának, az A 520 a m-hidroxi-bifeniles módszer 520 nm-es sávjának felel meg. Cukorösszetétel meghatározása 10 µg mintát kémcsőbe téve 100 µl 4 mólos TFA-ban feloldottak. A kémcsövet légmentesen lezárták és 6 órán át 100 C-on tartották. Ezután a csövet szobahőmérsékletre lehűtötték és a TFA-t elpárologtatták. A száraz mintából és a cukor standardokból (Ara: arabinóz, Gal:galaktóz, GalUA: galakturonsav, Glc: glükóz, GlcUA: glükuronsav, Man: mannóz, xyl: xilóz) ABEE reagens segítségével végezték el a meghatározást. A reakció során keletkezett vegyületeket HPLC segítségével határozták meg 100 ml mintából 30 C-on. A kromatográfiás meghatározást izokratikus módban 0,2 mólos nátrium-borát puffer (ph 8,9)/acetonitril (=93:7) eleggyel 1,0 ml/min áramlási sebesség mellett végezték. Az ABEE-cukor származékok 305 nm-en jelentek meg. Biológiai aktivitás vizsgálata Nyolc kakastaréj (Celosia argentea L.) magot 33 mm-es Petri-csészébe 0,5 ml tesztoldattal megnedvesített szűrőpapírra helyeztek. A Petri-csészéket

4 4 napon át 25 C-on sötétben tartották, ezután megmérték a hajtás és a gyökér hosszát. Paradicsommal végzett kísérletben a magokat csak egy tálcára helyezett nedves szűrőpapírra tették, majd 3 napon át 25 C-on sötétben tartották. Az előcsíráztatás során nyolc egyenletesen csírázott magot a tesztoldattal átitatott rozsdamentes hálóra helyeztek, amelyet műanyag csészével fedtek le. A magokat 5 napon át fehér fénnyel megvilágították, majd megmérték a hajtás és gyökér hosszát. Eredmények Az 1. táblázatban látható a paradicsomital-gyártás hulladékából készített vizes extraktum hatása a paradicsom (Lycopersicon esculentum L.) és Celosia argentea L. hajtás- és gyökérnövekedésére. A Celosia argentea L. növénynél nem tapasztaltak növekedést serkentő hatást. 1. táblázat A paradicsomital-gyártás hulladékából kinyert WE frakció hatása a kakastaréj és paradicsom növekedésére Hossz (a kontroll %-ában) 100 ppm 300 ppm 500 ppm 1000 ppm Kakastaréj hajtás 109,6±10,2 115,3±8,0 125,6±7,7 123,7±9,5 gyökér 114,9±6,7 103,2±5,7 102,3±6,0 105,2±4,4 Paradicsom hajtás 105,2±12,4 112,4±11,4 125,3±12,7 126,5±13,2 gyökér 105,3±13,3 110,2±10,2 103,2±9,9 105,2±13,3 Az adatok középértékek ± szórás. Hőkezelés ideje (h) 2. táblázat A paradicsomital-gyártási hulladék savas extraktumának hatása a kakastaréj növekedésére Hossz (a kontroll %-ában) 100 ppm 300 ppm 500 ppm 1000 ppm 2 hajtás 130,8±7,4 141,4±3,7 166,4±5,3 172,7±6,1 gyökér 97,6±7,6 110,6±4,9 96,0±8,5 97,6±5,8 4 hajtás 135,0±5,2 155,8±6,6 170,4±10,9 200,8±7,6 gyökér 102,0±6,6 99,9±5,9 117,9±6,1 101,6±5,2 6 hajtás 125,0±7,0 130,5±7,1 139,0±7,0 141,9±5,3 gyökér 122,5±7,6 134,1±4,0 130,6±9,5 124,3±9,9 8 hajtás 109,5±8,8 116,2±8,6 130,6±5,8 137,5±9,3 gyökér 113,9±6,7 106,3±8,4 135,0±10,6 126,8±6,4 Az adatok középértékek ± szórás.

5 A 2. táblázat a paradicsomital-gyártási hulladék sósavas kezelésével előállított AE növekedést serkentő hatását mutatja. A Celosia argentea L. hajtásnövekedését legnagyobb mértékben a 4AE serkentette. Az is látható, hogy a 4 óránál hosszabb ideig tartó extrahálás csökkentette a biológiai aktivitást. A gyökér esetében nem észleltek növekedést serkentő hatást. Az aktív (szerves és szervetlen) vegyületek szerepének tisztázásához a 4AE frakcióból a következő elemanalízist végezték el: B, Na, Mg, Al, P, K, Ca, Fe, Ni, Cu és Zn. Az elemzést ICP emissziós spektrokémiai módszerrel végezték. A legnagyobb mennyiségben található elemek hatását ezután külön is megvizsgálták. Legnagyobb mennyiségben jelenlevő szervetlen elem a nátrium volt: 1000 ppm koncentrációjú 4AE oldatban 330 ppm. A leghatásosabb 1000 ppm koncentrációjú NaCl-oldattal végzett kísérletben a hajtás növekedése mindössze 123%-os volt. A többi elem koncentrációja 8 ppm alatt maradt, amiből következik, hogy a szervetlen elemek nem játszanak szerepet a növekedés serkentésben. Az 1. ábra a 4AE oldat hatását mutatja a paradicsommag növekedésére. A hajtásnövekedésre gyakorolt hatása a WE frakcióhoz képest javult. A kontroll növény növekedését 100%-nak véve, az 500 ppm koncentrációjú WE és a 4AE hatása 125%, ill. 188%-nak adódott. A gyökérzet növekedése 500 ppm 4AE hatására kb. ötszörös volt a kontrollhoz viszonyítva. A NaCl-lel végzett vizsgálattal összehasonlítva megállapítható, hogy a semlegesítéshez használt oldattal bekerülő só paradicsommag esetében nincs befolyással a növekedést serkentő hatásra. Ebből arra lehet következtetni, hogy egyes növekedést serkentő anyagok a hulladék savas hidrolízise során keletkeznek. A 4AE frakció hatóanyag-tartalmát úgy határozták meg, hogy 500 g nedves hulladékot 2,5 l 0,5 N HCl-ben 70 C-on 4 órán át áztatták. Az oldat ph-ját NaOH-oldattal 7,0-re állították be. Ezzel a módszerrel kb. 300 g száraz port állítottak elő. A savas kezelés hatására a nedves hulladék tömege kb. 60%-kal csökkent. A savas extraktumot négy lépésben frakcionálták. A frakcionálás anioncserélő kromatográfiával, kicsapással, ultraszűréssel és gélkromatográfiával történt. Minden egyes frakcióban kimutatták az oligoszacharidok jelenlétét, és ezek mind növekedést serkentő hatást mutattak a Celosia argentea L. hajtásnövekedésére. A gélkromatográfiás elválasztás során a retenciós idejű frakció (16 mg) mutatta a legnagyobb bioaktivitást. A 1000 ppm koncentrációjú frakció 166%-os hajtásnövekedés-gyorsítást eredményezett. A frakciót HPAEC-PAD módszerrel elemezték. A 2/a ábrán látható, hogy a frakció négy fő komponensből áll, amelyek a következő csúcsokkal jellemezhetők: Rt 2,5, 4,8, 7,5 és 8,4 11,0 tartomány csúcsaival. Az első három anyag igen jellegzetes csúcsot adott, de ezek nem adtak reakciót sem a fenol kénsavas meghatározásban, sem a m-hidroxi-bifeniles meghatározásban (2/b ábra). Ezzel szemben az Rt 8 11,0 csúcsok igen erős reakciókészséget mutatnak

6 200 (A) hajtás hossza (a kontroll %-ában) gyökér hossza (a kontroll %-ában) (B) koncentráció (ppm) Az ábrán szereplő adatok átlagértékek, n = 16. A szórást ott tüntették fel, ahol az meghaladta a jel méretét. 1. ábra A 4 órás savas extrakció ( ), a NaCl ( ) és glükóz ( ) hatása: (A) a paradicsomhajtás növekedésére, (B) a paradicsomgyökér növekedésére. mindkét módszerrel (2/b ábra). Az Rt 8 11,0 csúcsokat adó vegyületek összege adta a frakció főtömegét (több mint 98%), vagyis a leghatásosabb növekedést serkentő vegyületek az Rt 8 11,0 frakcióban találhatók. A minőségi analí-

7 (A) PAD vizsgálattal kapott jel retenciós idő (min) 80.0 (B) koncentráció (mg/frakció) frakciószám ábra (A) A biológiailag legaktívabb frakció HPAEC-PAD kromatogramja. A nyilak a (DP 3 7) oligogalakturonsavakat jelölik. (B) Az egyes frakciók uronsav- és neutráliscukor-tartalma

8 zis alapján ezek a vegyületek szinte kizárólag uronsavak (2/b ábra). A 2/a ábrán látható nyilak az oligogalakturonsavak (DP 3 7) helyét mutatják. Ennek alapján ezek a vegyületek nagy valószínűséggel DP (6 12) értékkel jellemezhetők. A frakció cukorkomponenseit ABEE módszerrel határozták meg. Legnagyobb mennyiségben a GalUA (kb. 90%) fordult elő, kisebb mennyiségben Gal, Glc, GlcUA és két ismeretlen anyagot találtak. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a 4AE frakció legaktívabb biológiai komponense oligogalakturonsav (DP 6 12). Értékelés A paradicsomital-gyártás során keletkező hulladékból növekedést serkentő anyagot sikerült előállítani. A különböző frakciókkal végzett vizsgálatok alapján a savas extrakcióval nyert 4AE extraktum biológiai aktivitása volt a legnagyobb. A vizsgálatokat két tesztnövénnyel folytatták le: kakastaréjjal és paradicsommal, amelyben kiemelkedően nagy volt a paradicsomgyökér növekedését serkentő hatás. Ebből azt a következtetést vonták le, hogy a 4AE frakció olyan anyagokat tartalmaz, amelyek a paradicsomtermesztésben hasznosíthatók. A kísérletsorozatban sósavat és nátrium-hidroxidot használtak a savas extrakcióhoz és a semlegesítéshez. Más sav és lúg alkalmazásakor feltételezhető, hogy még aktívabb szervetlen vegyületek keletkezhetnek, amelyek a teljes anyagmennyiséget alkalmassá tehetik növényi műtrágyaként való felhasználásra. A 4AE frakció további részletes elemzésekor sikerült beazonosítani az igen nagy aktivitásért felelős anyagokat, amelyek (DP 6 12) savas oligoszacharidok voltak. Más szerzők vizsgálatai igazolták, hogy a növényi sejttöredékek növekedést serkentő hatásúak. Egyik ilyen allelopatikus anyagot nemrégen csíráztatott növényből sikerült előállítani, amelyet nátrium-2-oramnopiranozil-4-dezoxi-threo-hex-4-enopiranozid-uronátként (lepidimoid) azonosítottak. Erről a vegyületről kimutatták, hogy 3 mmólnál nagyobb koncentrációban szor aktívabb a gibberrelinsavnál. A lepidimoid valószínűleg pektin poliszacharidból liáz és endoramnozidáz hatására történő hasításkor keletkezik. Más szerzők arról számolnak be, hogy a galakturonsavak és a poligalakturonsav pektináz hatására bekövetkező bomlásakor keletkező anyagok a salátamag növekedését serkentik. Hasonló növekedést serkentő aktivitást találtak pl. alginátliáz-lizátban (ALL), ill. az ebből származó triszacharidban. Az enzimes bontáskor keletkező növényi sejttöredékek növekedést serkentő hatását már korábban felismerték. A szerzők érdeme az, hogy a paradicsomital-gyártás során keletkező hulladékban kimutatták az oligoszacharid jelenlétét és felismerték jelentőségét. A gyártási hulladékból enzimatikus úton is elő lehet állítani biológiailag aktív anyagokat, de ez költséges eljárás. Az

9 ismertetett eljárással a hulladékból savas kezeléssel közvetlenül kinyerhetők ezek az anyagok. A savas extrakció előnyei: a módszerrel növényi növekedést serkentő anyagokat, oligogalakturonsavakat lehet előállítani; a módszer egyszerű; a módszer segítségével csökkenthető a hulladék víztartalma, ennek következtében csökken a mennyisége és javítható a tartósítása; az eljárás során keletkező másodlagos hulladék fűtőanyagként hasznosítható. A hulladékkezelés igen kézenfekvő módja a hulladék üzemen belüli ismételt felhasználása. Jó példa erre az itt ismertetett eljárás, amelyben savas extraktum és másodlagos hulladék keletkezik. A savas extraktum műtrágyaként alkalmazható a paradicsomtermesztésben, a másodlagos hulladék pedig fűtőanyagként hasznosítható üzemen belül. (Haidekker Borbála) Suzuki, T.; Tomita-Yokotani, K. stb.: Plant growth-promoting oligosaccharides produced from tomato waste. = Bioresource Technology, 81. k. 2. sz jan. p Sogi, D. S.; Kiran, J.; Bawa, A. S.: Characterization and utilization of tomato seed oil from tomato processing waste. = Journal of Food Science and Technology, 36. k. 3. sz p EGYÉB IRODALOM Deák T.: Az élesztőgombák élelmiszer-tudományi jelentősége. = Élelmezési Ipar, 56. k. 4. sz p Farkas J.: Élelmi anyagok és mikroorganizmusok DSC-termoanalitikai vizsgálata. = Élelmezési Ipar, 56. k. 4. sz p Dong, S.; Chen, Xu.: Some new aspects in biosensors. (A bioszenzorok egyes új szempontjai.) = Review in Molecular Biotechnology, 82. k. 4. sz febr. Michalowski, S.: The genomics revolution. (A genomikai forradalom.) = OECD Observer, /227. sz. p Niemeyer, C. H.: Semi-synthetic nucleic acid-protein conjugates: applications in life sciences and nanobiotechnology. (Félszintetikus nukleinsav-fehérje konjugátumok: alkalmazások az élettudományokban és a nano-biotechnológiában.) = Reviews in Molecular Biotechnology, 82. k. 1. sz nov. p Hernádi S.: Biotechnológia a cellulóz- és papíriparban. = Papíripar, 45. k. 6. sz p. 211.

10 HÍR A genetikailag módosított haszonnövények terjedése Kanadában a genetikai módszerekkel módosított repce pollenjeinek és magjainak jelentős mértékű szétszóródása következtében a szennyeződésektől mentes hagyományos törzsek termesztése egyre inkább fokozódó problémát jelent. A kísérleti eredményekből megállapítható, hogy a genetikai módszerekkel módosított repcéből származó pollen legalább 800 méteres távolságban szétszóródhat, és ez nyolcszor nagyobb a biztonsági követelményeket figyelembe vevő, hivatalosan engedélyezett 100 méteres távolságnál. A jelenség előfordulása az adott terménynövény szaporodásának folyamatától is függ. Az olyan növények, mint például a búza és a szójabab rendszerint önmagukat porozzák be, és ez bizonyos mértékben védelmet nyújt a szennyeződésekkel szemben. A repce megporzása azonban a környező területekről származó pollenekkel történik. A kanadai tapasztalatok az európai mezőgazdasági szakemberek számára is értékes tanulságot szolgáltatnak, miszerint bizonyos terménynövények géntechnikai módszerekkel módosított, ill. nem módosított, hagyományos változatait egymástól meghatározott távolságokra elhelyezkedő, elkülönített területeken kellene termeszteni. Egyes géntechnikai módszerekkel módosított növények évről évre túlélők maradhatnak, mivel más, szintén módosított törzsekkel történő kereszteződés következtében szerzett rezisztenciára tesznek szert több gyomirtóval szemben. Megfelelő szakmai háttér esetében az ilyen jellegű mesterségesen létrehozott rezisztencia más herbicidek vonatkozásában is könnyen kialakítható lehet. (New Scientist, 172. k sz nov. 24. p. 14.)

11

12 BIOTECHNOLÓGIÁK EGYÉB IPARÁGAKBAN Mikroorganizmusok által gyártott poliglutaminsav és lehetséges alkalmazásai Tárgyszavak: poli(glutaminsav); bioszintézis; ipari alkalmazás. Mi a poliglutaminsav? A poli γ-glutaminsav (γ-pga), amelynek szerkezetét az 1. ábra mutatja, egy természetben előforduló, szokatlan, anionos szerkezetű homo-poliamid, amely D- és L-glutamisav egységekből épül fel, és amelyben az amidkötés az α-amino és a γ-karboxilcsoportok között alakul ki. Magyar kutatók fedezték fel 1937-ben az Anthrax baktérium (Bacillus anthracis) tokanyagában, és az is régen ismert, hogy a japán tradicionális étel, a fermentált szójából készült natto kötőanyagát is poliglutaminsav és fruktán keveréke alkotja, amelyet a Bacillus natto állít elő. Azóta számos olyan baktériumfajt azonosítottak, amely a sejtek közötti térbe választ ki γ-pga-t. N H O n COOH 1. ábra A γ-pga kémiai szerkezete A γ-pga vízoldható, biodegradálható, ehető és nem toxikus sem az emberek, sem a környezet számára, ezért érthetően nagy érdeklődést mutat iránta az élelmiszer- és a kozmetikai ipar, a gyógyászat és a vízkezelő ipar. A lehetséges alkalmazási területeket az 1. táblázat foglalja össze. Az alábbi

13 γ-pga létrejöttének biokémiáját, ill. lehetséges alkalmazásait tekintik át, különös tekintettel a frissebb fejleményekre. 1. táblázat A γ-pga és származékainak lehetséges alkalmazási területei Víz- és szennyvíz kezelés fémkelátok vagy abszorbensek bioflokkulálószerek nehézfémek és radio-nuklidok eltávolítása poliakrilamid helyettesítők Élelmiszeripar sűrítők viszkozitásjavítás gyümölcsleveknél és sport-italoknál Gyógyászat Kozmetika fagyásgátlók keserű ízt elvevő anyagok öregedésgátlók vagy szerkezet-javítók állattápadalékok gyógyszerhordozók, elnyújtott felszívódású gyógyszerek térhálósítható biológiai ragasztó, vérzésgátló vagy gyógyászati kötözőanyag, sebvarró fonal nedvesítőszer fagyásgátlók fagyasztott ételekben elveszi az aminosavak, peptidek, kinin, koffein, ásványi anyagok stb. keserű ízét. pékárukban vagy tésztákban megelőzik az öregedést vagy javítják azok szerkezetét elősegítik az ásványi anyagok felszívódását, javítják a tojáshéj szilárdságát, csökkenti a zsírtartalmat stb. felhasználás génterápiában, rákgyógyszer fibrin pótlására Membrán abszorbens nehézfémek felvétele enantioszelektív anyag aminosavak enantioszelektív elválasztása Egyebek vízabszorbens poliakrilát-helyettesítő pelenkában diszpergálószer pigmentek és ásványi anyagok eloszaltása kozmetiku

14 mokban és papírgyártásban A mikroorganizmusok által előállított γ-pga gyártása és alkalmazásai A γ-pga szerkezete lényegesen különbözik a polipeptidekétől, amennyiben γ-amidkötések alakulnak ki benne, tehát szintézisük nem a riboszómákon történik, és éppen ezért szintézisük megértéséhez nagy szükség van az előállításukat szabályzó gén(ek) azonosítására. A B. anthracis esetében a γ-pga gyártásáért felelős gén egy plazmid DNS-ben található, míg a B. subtilis (IFO 3336 törzs) esetében a DNS genom részét alkotják. Az utóbbi kinyerését megnehezítette a rendszer instabilitása, ezért E. coli klónokban kerestek és találtak egy olyan, három gént tartalmazó DNS-részletet, amelynek segítségével sejten kívül (extracellulárisan) elő lehet állítani γ-pga-t. Ez a géntöredék nagyrészt megegyezik a B. anthracis-ban talált részlettel. Ha megnövelték a D-glutamát mennyiségét és a glutamát-racemáz enzim egyidejű termelését, nőtt a γ-pga termelése, és további, jelentős növekedést lehetett elérni, ha a táptalajhoz Mg 2+ -ionok helyett Mn 2+ -ionokat adtak. Az ionok cseréje az E. coli klónokban előállított polimer térszerkezetét nem befolyásolta, szemben pl. a B. licheniformisban előállítottal. A bioszintézis enzimei A γ-pga előállítási hatásfokának javításához arra van szükség, hogy pontosabban megismerjük a bioszintézis útját, és az azt katalizáló enzimeket. A γ-pga-t előállító baktériumokból olyan transzglutamináz, illetve glutamiltranszamidáz enzimeket mutattak ki az 50-es években, amelyek az L-glutaminsav glutamilcsoportját képesek átvinni a glutaminsav bármelyik optikai izomerjére, illetve glutamil-peptidekre, és ugyanezekben az enzimpreparátumokban található olyan transzamidáz enzim is, amely glutamil-dipeptidek kapcsolódását segíti elő hosszabb láncú peptidekké, valamint egy alanin-racemáz enzim. Ezek az enzimek glutaminsav-racemáz távollétében is (amelyet sem a B. anthracisban, sem a B. licheniformisban nem sikerült kimutatni) lehetővé teszik a glutaminsav mindkét optikai izomerjének képződését (2. ábra). Hasonló indirekt átalakulást mutattak ki a B. anthracis-ban és a B. subtilis-ban is. Más későbbi vizsgálatok egyéb enzimeket mutattak ki, pl. olyan membránhoz kötődő enzimkomplexeket, amelyek ATP és Mg 2+ jelenlétében aktiválták, izomerizálták és polimerizálták a glutaminsavat. Ebben a preparátumban sem a fémiont, sem az ATP-t nem lehetett más komponensre kicserélni. Ismét mások olyan enzim-komplexet izoláltak ugyanabból a szervezetből, amelynek kofaktora Mn 2+ -ion volt (amelyet nem lehetett Mg 2+ -ionra cserélni), és az ATP mellett más nukleotid di- és trifoszfátok jelenlétében is működött. A későbbi vizsgálatokból kiderült, hogy a membránhoz kötődő szintézis más, független úton történik, nem a 2. ábrán vázolt módon.

15

16 L-glutaminsav + piroszőlősav (1) α-ketoglutársav + L-alanin L-alanin (2) D-alanin D-alanin + α-ketoglutársav (3) D-glutaminsav + piroszőlősav (1) L-glutaminsav: piroszőlősav-aminotranszferáz (2) alanin-racemáz (3) D-glutaminsav: piroszőlősav-aminotranszferáz 2. ábra Az L-glutaminsav indirekt konverziója D-glutaminsavvá a B. anthracisban és a B. licheniformisban Táptalajok, tenyésztési körülmények Sok kutatás folyt annak megállapítására, hogy milyen körülmények segítik elő a γ-pga nagyobb hatásfokú termelését, és hogyan befolyásolja a táptalaj a D/L részletek arányát. Az optimális táptalaj-összetétel függ az alkalmazott baktériumtörzstől is. Vannak olyan törzsek, amelyeknek ahhoz, hogy γ- PGA-t termeljenek, L-glutaminsav jelenlétére van szükségük a táptalajban, másoknak nincs szükségük erre a vegyületre. Az L-glutaminsav-függő baktériumokra példa a B. anthracis, a B. licheniformis ATCC 9945A, a B. subtilis IFO 3335, a B. subtilis F-201, az L-glutaminsav-függetlenekre a B. subtilis 5E, a B. subtilis TAM-4 és a B. licheniformis A35. A glutaminsav-független törzsek táptalajában C, N forrásként használhatunk pl. prolint, vagy glükózt és ammónium-kloridot stb. A növekedést a táptalaj összetétele mellett befolyásolja az ionerősség, a levegő mennyisége, a ph stb. Ipari szempontból ígéretesebbnek tűnik a glutaminsav-független törzsek tanulmányozása (de novo szintézis), de ezekről a baktériumokról viszonylag keveset tudunk. Eddig a legtöbb vizsgálatot a B. anthracis, a B. licheniformis ATCCC 9945A és B, valamint a B. subtilis IFO 3335 törzseken végezték. Néhány törzsre vonatkozóan az optimális táptalaj összetételét a 2. táblázat foglalja össze. Külön figyelmet fordítottak a szervetlen sók és a ph hatásának tanulmányozására.

17 2. táblázat A táptalaj összetétele néhány γ-pga termelő baktérium esetében. Törzs Tápanyag Tenyésztési körülmények B. licheniformis ATCC 9945 B. subtilis IFO 3335 B. subtilis TAM-4 B. licheniformis A35 B. subtilis F02-1 Hozam (g/l) Molekulatömeg a x10 5 glutaminsav (20 g/l) glicerin (80 g/l) citromsav (12 g/l) NH 4 Cl (7 g/l) 30 C, 4 nap ,4 9,8 glutaminsav (30 g/l) 37 C, 2 nap ,0 10 citromsav (20 g/l) fruktóz (75 g/l) 30 C, 4 nap glükóz (75 g/l) NH 4 Cl (8 g/l9 glutaminsav (70 g/l) glükóz (1 g/l) borjú infúziós közeg (20 g/l) B. subtilis (natto) maltóz (60 g/l) szója-szósz (70 g/l) nátrium glutamát (30 g/l) a A molekulatömeg függ a tenyésztés körülményeitől. 30 C, 3 5 nap C, 2 3 nap 50 1,2 40 C, 3 4 nap 35 B. licheniformis ATCC 9945 A B. licheniformis ATCC 9945 esetében pl. azt tapasztalták, hogy ha a Mn 2+ -ionok koncentrációját 1,54x10-7 M és 2,46x10-3 M között változtatták, a D-glutaminsav aránya a polimerben 38%-ról 86%-ig növekedett, a Ca 2+ koncentráció függvényében viszont nem volt változás, bár a Ca 2+ jelenlétére szükség volt a jó polimerhozam érdekében. A Mn 2+ -ionok jelenléte a sejtek életképességének megőrzésére szolgál hosszú tenyésztés esetében. Azt is megfigyelték, hogy a B. licheniformis ATCC 9945A esetében a kriogén fagyasztás megszünteti az erre a törzsre egyébként jellemző nagyfokú variabilitást és sokkal egységesebb növekedést eredményez. Ugyanennél a törzsnél azt észlelték, hogy a citrát vagy a glicerin megvonása a táptalajból sokkal jobban csökkenti a γ-pga termelést, mint a glutaminsavé. A ph-t 5,5 és 8,25 között változtatva azt találták, hogy a 6,5 ph-érték biztosít optimális körülményeket a citrátmetabolizmus számára. A citrát a polimertermelés prekurzora a trikarbonsav ciklus (TCA) révén. A ph változtatása azonban semmilyen hatással nem

18 volt a keletkezett polimer molekulatömegére, molekulatömeg-eloszlására és enantiomer-összetételére. Az oldat oxigéntartalmának növelése ugyancsak pozitív hatással volt a polimertermelésre. B. subtilis IFO 3335 A B. subtilis IFO 3335-t a tradicionális japán ételből, a nattoból (erjesztett szója) izolálták és megállapították, hogy megfelelő táptalajon (2. táblázat) képes nagy mennyiségű γ-pga-t termelni poliszacharid melléktermék nélkül is. Ha azonban a citromsav helyett más szénforrást, pl. glükózt, ecetsavat, maleinsavat, borkősavat vagy fumársavat alkalmaznak, a poliszacharidképződés válik döntővé, γ-pga alig keletkezik. Bár γ-pga csak L-glutaminsav jelenlétében képződött, az L-glutaminsav nem használódott fel a táptalajban, PGA glutaminsavja a citromsavból képződött, a táptalajban levő L-glutaminsav csak kofaktorként (aktivátorként) szolgált. Azt is megfigyelték, hogy ha L- glutaminsav helyett L-glutamint adnak a táptalajhoz (sokkal kisebb mennyiségben), akkor is jó hatásfokkal képződik a PGA polimer és poliszacharidok egyáltalán nem keletkeznek. Az ammónium-szulfát hozzáadása ugyancsak kritikusnak bizonyult a PGA-termelés és a PGA/poliszacharid arány szempontjából. Feltételezik, hogy a γ-pga a citromsavból és az ammóniumszulfátból keletkezik. γ-pga termelés glutaminsav-független baktériumtörzsekkel, aerob és anaerob tenyésztés A talajmintákból izolált B. subtilis TAM-4 segítségével cukrot és ammóniumsókat tartalmazó táptalajon is lehet jó hatásokkal γ-pga-t termelni aerob körülmények között. Ez a törzs nem mutat degeneratív hajlamokat, mint néhány más, γ-pga-t termelő baktérium, és nem termel poliszacharidokat sem. Ennél a baktériumtörzsnél a polimer D/L aránya nem változik s hosszú idejű tenyésztés folyamán sem. Az eddig felsorolt esetekben minden alkalommal aerob körülmények között végezték a tenyésztést, azaz oxigént használtak elektronakceptorként a sejtnövekedés energiaszükségletének biztosítására. Ahhoz, hogy az oxigén elég legyen a meglehetősen viszkózus közegben vagy a levegő oxigéntartalménak növelésére vagy igen intenzív keverésre, speciális impeller-konstrukcióra van szükség, és az eredmény így is nagyon érzékeny lesz az oxigéntartalom ingadozására. Sikerült izolálni egy olyan denitrifikáló baktériumot (B. licheniformis A35), amely nitrát elektronakceptorral is működik, anaerob körülmények között. Ez a baktérium bizonyos szacharidokat (glükóz, fruktóz, maltóz, laktóz, szukróz) igényel szénforrásként szerves savak helyett.

19 Nagyléptékű γ-pga előállítás, tisztítás és molekulatömeg-beállítás Néhány literestől néhány 10 literesig terjedő térfogatú fermentorokkal sikerült g/l kitermeléssel γ-pga-t előállítani. Mivel a legtöbb baktérium extracellulárisan (sejten kívül) termeli a γ-pga-t, ennek elválasztása viszonylag egyszerű. A sejteket kiszűrik, a polimert alkoholokkal kicsapják a közegből és a kismolekulás szennyezőket dialízissel elválasztják. A terméket aminosavanalízissel, vékonyréteg-kromatográfiával és NMR-spektroszkópiával jellemzik. A molekulatömeg-eloszlás és az átlagos molekulatömeg meghatározására GPC-t használnak. Az átlagos molekulatömeg x10 6 között változik, a polidiszperzitási index általában 2 és 5 közti. Ez a molekulatömeg meglehetősen nagy, ami nagy viszkozitást eredményez. Ez hasznos akkor, ha viszkozitásnövelőként akarják használni, de reológiai szempontból szinte kezelhetetlen egyéb alkalmazásokban. Mivel γ-pga-t pl. gyógyszerhordozóként akkor lehetne jól használni, ha szabályozott molekulatömeggel lehetne előállítani, számos kísérlet történt arra, hogy enzimatikus úton vagy vegyszeres, esetleg ultrahangos degradációval csökkentsék a természetes polimerek molekulatömegét, esetleg a táptalaj összetételével befolyásolják a képződő polimerek molekulatömeg-eloszlását. Az ionerősség 1,8-szoros változtatásával pl. sikerül elérni, hogy a molekulatömeg ezzel kb. arányosan nőjön bár ennek mechanizmusáról szinte semmit nem tudunk. Ami az enzimatikus hidrolízist illeti, találtak egy fonalas gombát (Myrothecium TM-4222), amely képes γ-pga táptalajon nőni, és amely specifikusan hasítja a γ-glutamil-kötéseket. A 68 kdos depolimeráz enzim az eredetileg 500 kda-os γ-pga polimer mintegy 38%- át L-glutaminsav-tartalmú oligomerekké degradálta, míg a maradék 62%, amely főként D-glutaminsavat tartalmazott, ellenállt a lebontásnak. Némelyik γ-pga-t termelő baktérium depolimeráz enzimet is előállít, ami a tenyészetek viszkozitásának csökkenésében mutatkozik meg egy idő után. Bizonyos baktériumokban ez a depolimeráz a sejtmembránhoz kötött, vagy sejten belüli, más baktériumtörzseknél viszont kiürül a sejten kívüli térbe is. Vizsgálták a γ- PGA spontán hidrolízisét magasabb hőmérsékleten, nem pufferolt oldatban és az alkalikus hidrolízist enyhébb körülmények között, de ezekkel az a probléma, hogy nagyon nehéz ellenőrizni a keletkezett termék molekulatömegét és a polidiszperzitás a hidrolízis fokával általában nő. Jobb eredményeket értek el ultrahangos degradációval. A γ-pga szerkezete és alkalmazásai Az oldatokon végzett ORD (optikai rotációs diszperzió) és IV (infravörös spektroszkópia) mérésekből kiderült, hogy a töménységtől és a ph-tól és az ionerősségtől függően a γ-pga helix-szerű, β-redőzött és rendezetlen gom

20 bolyag konformációkban is előfordul. A biomolekulák koncentrációjának növelésével az intramolekuláris H-hidak szerepét (amelyek a helikális, rúdszerű szerkezetnek kedveznek) inkább átveszik az intermolekuláris H-hidak, amelyek a redőzött szerkezetnek kedveznek. A nagy ionerősség és a nagy ph inkább a rendezetlen gombolyag szerkezetnek kedvez az ionizált csoportok erős kölcsönhatása miatt. A konformációs változások természetesen befolyásolják a polimer fizikai viselkedését, viszkozitását vagy pl. fémmegkötő képességét. A γ-pga egyik alkalmazása a flokkulálás. Flokkulálószerként alkalmaznak szervetlen anyagokat (pl. Al-szulfát, Al-klorid), szintetikus polimereket (pl. poliakrilamid, poliakrilsav-származékok, polietilénimin) és természetes polimereket (kitozán, algin, és bakteriális polimerek, mint amilyen a γ-pga). A flokkulálószereket igen gyakran használják szennyvízkezelésre vagy ipari vizes rendszerek derítésére. Eddig leggyakrabban a szintetikus polimereket alkalmazták ezek olcsósága és hatékonysága miatt, de vannak hátrányaik is, pl. nem bonthatók le a természetben, vagy ha lebomlanak, monomerjeik toxikusak vagy karcinogének lehetnek. Ezért egyre népszerűbb lett a biológiailag lebontható flokkulálószerek (pl. proteinek, poliszacharidok, glikoproteinek) fejlesztése. A γ-pga 20 mg/l körüli koncentrációban mutatott legnagyobb flokkulációs hatékonyságot, különösen kétértékű (Mg, Ca, Fe) ionok egyidejű hozzáadása mellett. A γ-pga használható szervetlen (aktív szenes, savas agyag, talaj-, Ca és Mg-vegyület) és szerves (cellulóz, élesztő stb.) szuszpenziók flokkulálására. Kaolin szuszpenziók esetében háromértékű ionok (Al, Fe) hozzáadása és a ph semleges körülire való beállítása tovább fokozta a flokkuláció hatékonyságát. A várakozások szerint a háztartási szennyvizek kezelése mellett a γ-pga alkalmas lesz ivóvíz és élelmiszeripari szennyvizek kezelésére is. A modern környezetszennyezési problémák egyik része a nehézfémek és a radio-nuklidok felszaporodása a környezetben, többek között a talajban. A szennyezett vizek, talajok, üledékek helyreállítása (remediációja) egyike a mai környezetvédelem fontos feladatainak. A felszín alatti fémionok és radionuklidok immobilizációjában a baktériumok igen fontos szerepet játszanak. A γ-pga esetében kimutatták, hogy jó hatásfokkal köti meg a Ni 2+ -, Cu 2+ -, Mn 2+ -, Al 3+ -, Cr 3+ -ionokat. A vas esetében a háromértékű ionok kicsapódnak, a kétértékűek nem. Igen jó hatásfokú fémmegkötő mikroszűrő membránokat készítettek γ-pga felhasználásával. Sokféle olcsó, kovalensen kötött γ-pga-t tartalmazó membrán készítettek pl. cellulózból, amivel meglehetősen jó fémmegkötést értek el. Pb esetében pl. 2.5 mol fém/ismétlődési egység, Cd és Ni esetében kb. 0,8 mol fém/ismétlődési egység hatásfokot lehetett elérni. Nagy reményeket fűznek a kvarcalapú membránokhoz is, amelyek mechanikailag is szilárdabbak és jobban ellenállnak az oldószerek, ill. a híg savak és lúgok hatásának, mint a szerves membránok. A fémmegkötés mechanizmusa különbözik a hagyományos ioncserélőkétől, ezért nagyobb a megkötőképesség

21 is. A membránokon keresztüli konvektív áramlás kisebb ellenállást jelent, és a membránokat tokozással 380-ad részükre lehet összepréselni, ami jobb fémeltávolítási és tárolási hatásfokot eredményez, mint pl. ami fordított ozmózissal elérhető. Remélhető, hogy a megkötött (értékes) fémek visszanyerése is megoldható lesz. Fontos alkalmazási terület lehet a gyógyszerek bejuttatása. A paclitaxel (a Taxol hatóanyaga) pl. olyan természetes rákellenes anyag, amely számos rosszindulatú daganat (pl. emlőrák, petefészek rák) esetében sikeresen alkalmazható lenne, ha meg lehetne oldani a hatóanyag vízoldhatóságát. A taxol γ-pga-val képzett, kovalensen kötött komplexe sokkal hatékonyabb, mint a vízben nem oldható anyag. A vízoldható forma elősegíti az intravénás beadást is. A tumorok ötször olyan hatékonyan veszik fel a vízoldható formát, amely ott lebomlik, és lokálisan felszabadul a hatóanyag. A γ-pga-val vízoldhatóvá tett hatóanyagnak kevesebb a mellékhatása és nagyobb a maximális elviselhető dózis. Hasonló javulást tapasztaltak más rákellenes szerek esetében is. Kísérleteznek az E1 prosztaglandin (PGE1) vízoldhatóvá tételével is, amely perifériás érproblémáknál és sejtvédőként (pl. hepatitisz ellen) alkalmazható. Fejlesztés alatt állnak a poli(l-glutaminsav) és a poli(benzilglutaminsav) biodegradálható polimerjei, amelyek gyógyszerhordozóként vagy génterápiás célokra is alkalmazhatók lesznek. A sebek lezárásának leggyakrabban alkalmazott módja a varrás, amely azonban nem old meg bizonyos problémákat (vér szivárgása, légmentes vagy vízmentes zárás) és aortavágások kezelésére sem alkalmas. Jelenleg is számos félszintetikus bioragasztó áll ma is rendelkezésre (ciánakrilátok, uretánok, zselatin/ ezorcin/formaldehid rendszerek), de ezek bizonyos fokú sejttoxicitást mutatnak, nem degradálódnak és könnyen gyulladást okoznak. A fibrinalapú rendszerek biológiailag elfogadhatóbbak, de tapadásuk nem kielégítő. A humán fibrinogén esetében nem zárható ki teljesen a vírusfertőzés veszélye sem. A zselatin és a γ-pga kovalens összekötése (amelyek mindketten biodegradálhatók) megoldást kínálhat ezekre a problémákra. Ez a polimer rendszer könnyen és gyorsan térhálósítható vízoldható karbo-diimidek segítségével. A biodegradálhatóság miatt kisebb a veszélye a gyulladás kialakulásának. A kollagén és a γ-pga összekapcsolásával olyan bioragasztó alakítható ki, amely jobb légzáró tulajdonságú, mint a fibrinalapú rendszerek. A γ-pga észterezett származékaiból kitűnő, biodegradálható, hőre lágyuló műanyagok gyárthatók, pl. a benzilészterből hagyományos polimerfeldolgozási eljárásokkal nagy szilárdságú, rugalmas, átlátszó szálak, membránok készíthetők. Intenzíven folyik olyan hidrogélek fejlesztése is, amelyekből kontrollált gyógyszerkibocsátó rendszerek, enzimmegkötő vagy egyszerű nedveségmegkötő rendszerek alakíthatók ki. A γ-pga vizes oldatainak besugárzásával igen nagy vízmegkötő képességű hidrogéleket lehet előállítani. A megkötött víz mennyisége a száraz anyagénak több ezerszeresét is elérheti.

22 A vízmegkötő képesség változik a vizes közeg ph-jával és ionerősségével, ami jelzi a vízleadás és felvétel szabályozhatóságát. A biológiai rendszerekre (de az élelmiszerekre is) rossz hatással van a lefagyasztás. Megfigyelték, hogy a savas oldalcsoportokat tartalmazó természetes peptidek és fehérjék a vártnál sokkal erősebb fagyvédő tulajdonságokkal rendelkeznek. Mérésekkel kimutatták, hogy alatti móltömegű γ- PGA oligomerek erősebb fagyvédő tulajdonságokat mutatnak, mint az egyik legjobb ismert fagyvédő anyag, a glükóz. A fagyvédő tulajdonság nem függött az optikai izomer-összetételtől, a peptidkötés helyzetétől (α vagy γ), függött viszont a fémiontól (Na só = K só >> Ca só >> savas alak). A γ-pga ilyen alkalmazása azért lehet fontos, mert sokkal kevésbé van íze, mint az egyéb fagyvédő anyagoknak (szacharidoknak, aminosavaknak, sóknak), ezért nagyobb mennyiségben hozzáadható az élelmiszerekhez anélkül, hogy zavaró mellékízt okozna. Azt is kimutatták, hogy a megnövelt ásványianyag-tartalmú ételekben gyorsítja az ásványi anyagok felszívódását, miközben elnyomja azok ízét. Elképzelhető azonban számos más élelmiszeripari alkalmazás is. Megfigyelték pl., hogy a γ-pga számos anyag (pl. koffein, aminosavak, peptidek, kinin stb.) keserű ízét elveszi vagy csökkenti. Ha γ-pga-t vagy ennek valamilyen ehető sóját hozzáadják keményítőtartalmú élelmiszerekhez (pl. sütőipari termékekhez), azok öregedési jellemzői, méretstabilitása, szerkezete javulnak. Bizonyos italokba viszkozitás-szabályzó vagy ízjavító adalékként is használják. Állati tápokhoz adva javítja az ásványi anyagok felszívódását, javítja a foszforanyagcserét, csökkenti a zsírfelhalmozódást a szövetekben. Kozmetikai alkalmazásban kiderült, hogy Aloe vera kivonattal keverve kitűnő bőr-hidratáló hatása van. Használhatónak tűnik diszpergálószerként vizes vagy detergensoldatokban. A fentiek is azt mutatják, hogy bár 70 éve ismerjük a poliglutaminsavat, még sok a tisztázatlan kérdés vele kapcsolatban. A számos eddig bevált alkalmazás mellett továbbiak is várhatók, úgyhogy biztosak lehetünk benne, hogy ezzel a sokoldalú, környezetbarát, biológiailag lebontható polimerrel kapcsolatban még számos további kutató ejlesztő munkát fognak végezni a világ különböző laboratóriumaiban. (Bánhegyiné Dr. Tóth Ágnes) Shih, I.-L.; Van, Y.-T.: The production of poly-(γ-glutamic acid) from microorganisms and its various applications. = Bioresource Technology, 79. k. 3. sz szept. p

23